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Gebiet der
Erfindung
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Diese Erfindung betrifft pharmazeutisch
wirksame Verbindungen, die den Vitronektin-Rezeptor hemmen und nützlich sind
zur Behandlung von Entzündung,
Krebs und kardiovaskulären
Störungen,
wie Atherosklerose und Restenose, und von Krankheiten, in denen
die Knochenresorption ein Faktor ist, wie Osteoporose.
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Hintergrund der Erfindung
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Integrine sind eine Überfamilie
der Zelladhäsionsrezeptoren,
die Transmembran-Glycoproetine sind, die an einer Vielzahl von Zellen
exprimiert werden. Diese Zelloberflächen-Adhäsionsrezeptoren schließen gpIIb/IIIa
(den Fibrinogen-Rezeptor) und αvβ3 (den Vitronektin-Rezeptor) ein. Der Fibrinogen-Rezeptor
gpIIb/IIIa wird an der Blutplättchenoberfläche exprimiert
und vermittelt die Blutplättchenaggregation
und die Bildung eines hämostatischen
Pfropfens an der Stelle einer blutenden Wunde. Philips et al., Blood,
1988, 71, 831. Der Vitronektin-Rezeptor αvβ3 wird
an einer Anzahl von Zellen exprimiert, einschließlich Endothel-, glatten Muskel-, Osteoklasten-
und Tumorzellen, und hat daher eine Vielzahl von Funktionen. Der
an der Membran der Osteoklastenzellen exprimierte αvβ3-Rezeptor
vermittelt die Adhäsion
von Osteoklasten an der Knochenmatrix, ein Schlüsselschritt im Knochenresorptionsprozeß. Ross
et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703. Eine durch übermäßige Knochenresorption
gekennzeichnete Krankheit ist Osteoporose. Der an menschlichen glatten
Muskelzellen der Aorta exprimierte αvβ3-Rezeptor
vermittelt deren Migration in die Neointima, ein Prozeß, der zu Restenose
nach perkutaner Koronarangioplastie führen kann. Brown et al., Cardiovascular
Res., 1994, 28, 1815. Zusätzlich
haben Brooks et al., Cell, 1994, 79, 1157 gezeigt, daß ein αvβ3-Agonist
die Tumorregression durch Induzieren von Apoptose der angiogenen
Blutgefäße fördern kann.
Daher wären
Mittel, die den Vitronektin-Rezeptor blockieren; nützlich in
der Behandlung von Krankheiten wie Osteoporose, Restenose und Krebs.
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Der Vitronektin-Rezeptor ist jetzt
dafür bekannt,
sich auf drei unterschiedliche Integrine zu beziehen, die als αvβ1, αvβ3 und αvβ5 bezeichnet
werden. Horton et al., Int. J. Exp. Pathol. 1990, 71, 741. αvβ1 bindet
Fibronektin und Vitronektin. αvβ3 bindet eine große Vielzahl von Liganden, einschließlich Fibrin,
Fibrinogen, Laminin, Thrombospondin, Vitronektin, von Willebrand-Faktor,
Osteopontin und Knochen-Sialoprotein I. αvβ5 binde Vitronektin.
Es wurde gezeigt, daß der
Vitronektin-Rezeptor αvβ5 an der Zelladhäsion einer Vielzahl von Zelltypen
beteiligt ist, einschließlich
mikrovaskulären
Endothelzellen (Davis et al., J. Cell. Biol., 1993, 51, 206), und seine
Rolle in der Angiogenese wurde bestätigt. Brooks et al., Science,
1994, 264, 569. Dieses Integrin wird an Blutgefäßen in menschlichem Wundgranulationsgewebe
exprimiert, aber nicht in normaler Haut.
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Der Vitronektin-Rezeptor ist dafür bekannt,
an Knochmatrixproteine zu binden, die das Tripeptid-Motiv Arg-Gly-ASp
(oder RGD) enthalten. So offenbaren Horten et al., Exp. Cell Res.
1991, 195, 368, daß RGD-haltige
Peptide und ein Anti-Vitronektinrezeptor-Antikörper (23C6) die Dentin-Resorption und Zellausbreitung durch
Osteoklasten hemmen. Zusätzlich
offenbaren Sato et al., J. Cell. Biol. 1990, 111, 1713, daß Echistatin, ein
Schlangengift-Peptid, das die RGD-Sequenz enthält, ein wirksamer Inhibitor
der Knochenresorption in der Gewebekultur ist und die Anhaftung
von Osteoklasten am Knochen hemmt.
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Es wurde jetzt gefunden, daß bestimmte
Verbindungen wirksame Inhibitoren der αvβ3-
und αvβ5-Rezeptoren sind. Insbesondere wurde gefunden,
daß solche
Verbindungen wirksamere Inhibitoren des Vitronektin-Rezeptors als des
Fibrinogen-Rezeptors sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Diese Erfindung umfaßt Verbindungen
wie hier nachfolgend beschrieben, die eine pharmakologische Aktivität für die Hemmung
des Vitronektin-Rezeptors
aufweisen und nützlich
sind in der Behandlung von Entzündung,
Krebs und kardiovaskulären
Störungen,
wie Atherosklerose und Restenose, und von Krankheiten, in denen
die Knochenresorption ein Faktor ist, wie Osteoporose.
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Diese Erfindung ist ebenfalls eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die Verbindungen wie hier nachfolgend
beschrieben und einen pharmazeutischen Träger umfaßt.
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Diese Erfindung ist ebenfalls ein
Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die durch den Vitronektin-Rezeptor
vermittelt werden. In einem besonderen Aspekt sind die Verbindungen
dieser Erfindung nützlich zur
Behandlung von Atherosklerose, Restenose, Entzündung, Krebs und Krankheiten,
in denen die Knochenresorption ein Faktor ist, wie Osteoporose.
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Ausführliche Beschreibung
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Diese Erfindung umfaßt neue
Verbindungen, die wirksamere Inhibitoren des Vitronektin-Rezeptors
als des Fibrinogen-Rezeptors sind. Die neuen Verbindungen umfassen
einen Dibenzocyclohepten-Kern, in dem ein stickstoffhaltiger Substituent
an einem der aromatischen 6-gliedrigen Ringe des Dibenzocycloheptens
vorhanden ist und ein aliphatischer Substituent, der eine saure
Einheit enthält,
am 7-gliedrigen Ring des Dibenzocycloheptens vorhanden ist. Es wird
angenommen, daß das
Dibenzocyclohepten-Ringsystem die Seitenkettensubstituenten an den
6- und 7-gliedrigen Ringen orientiert, so daß sie vorteilhaft mit dem Vitronektin-Rezeptor
Wechselwirken können.
Es ist bevorzugt, daß ca.
12 bis 14 dazwischenliegende kovalente Bindungen über den
kürzesten
intramolekularen Weg zwischen der sauren Gruppe am aliphatischen
Substituenten des 7-gliedrigen Rings des Dibenzocycloheptens und
dem Stickstoff des stickstoffhaltigen Substituenten an einem der
aromatischen 6-gliedrigen Ringe des Dibenzocycloheptens existieren.
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Spezifische Verbindungen dieser Erfindung
sind:
(±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure;
(±)-10,11-Dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure; und
(±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure;
oder
pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
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In Fällen, in denen die Verbindungen
dieser Erfindung ein oder mehrere chirale Zentren aufweisen können, schließt diese
Erfindung, wenn nichts anderes angegeben ist, jede einzelne nicht-racemische
Verbindung ein, die synthetisiert und durch herkömmliche Techniken aufgetrennt
werden kann.
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Die Verbindungen dieser Erfindung
hemmen die Bindung von Vitronektin und anderen RGD-haltigen Peptiden
an den Vitronektin-Rezeptor. Die Hemmung des Vitronektin-Rezeptors
an Osteoklasten hemmt die osteoklastische Knochenresorption und
ist nützlich
in der Behandlung von Krankheiten, in denen die Knochenresorption
mit einem Krankheitszustand verbunden ist, wie Osteoporose und Osteoarthritis.
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In einem anderen Aspekt ist diese
Erfindung ein Verfahren zur Stimulierung der Knochenbildung, welches
das Verabreichen einer Verbindung umfaßt, die eine Zunahme der Osteocalcin-Freisetzung
verursacht. Eine erhöhte
Knochenproduktion ist ein deutlicher Nutzen bei Krankheitszuständen, in
denen ein Mangel von mineralisierter Knochenmasse besteht oder die
Umgestaltung von Knochen erwünscht
ist, wie Bruchheilung und die Vorbeugung von Knochenbrüchen. Krankheiten
und Metabolismusstörungen,
die in einem Verlust von Knochenstruktur resultieren, würden ebenfalls
einen Nutzen aus einer solchen Behandlung ziehen. z. B. Hyperparathyreoidismus,
Ostitis deformans, Hypercalcämie
eines bösartigen
Tumors, osteolytische Schädigungen,
die durch Knochenmetastase erzeugt werden, Knochenverlust aufgrund
von Immobilisierung oder Geschlechtshormonmangel, Behcet-Syndrom,
Osteomalacie, Hyperostose und Osteopetrose könnten von der Verabreichung
einer Verbindung dieser Erfindung profitieren.
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Da die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung Vitronektin-Rezeptoren an einer Anzahl unterschiedlicher
Zelltypen hemmen, wären
die Verbindungen zusätzlich
nützlich
in der Behandlung von entzündlichen Störungen,
wie von rheumatoider Arthritis und Psoriasis, und von kardiovaskulären Krankheiten;
wie Atherosklerose und Restenose Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können
nützlich
zur Behandlung oder Vorbeugung von anderen Krankheiten sein, die
einschließen
aber nicht beschränkt
sind auf thromboembolische Störungen,
Asthma, Allergien, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Implantatgegen-Wirt-Erkrankung,
Organtransplantationsabstoßung,
septischer Schock, Ekzem, Kontaktdermatitis, entzündliche
Darmerkrankung und andere Autoimmunkrankheiten. Die Verbindungen
der Erfindung können
ebenfalls nützlich
zur Wundheilung sein.
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Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung sind ebenfalls nützlich
zur Behandlung, einschließlich Vorbeugung,
von angiogenen Störungen.
Der Begriff angiogene Störungen
wie hier verwendet schließt
Zustände
ein, die eine abnormale Neovaskularisierung beinhalten. Wenn das
Wachstum neuer Blutgefäße die Ursache
für die
mit einer Krankheit verbundene Pathologie ist oder dazu beiträgt, wird
die Hemmung der Angiogenese die nachteiligen Wirkungen der Krankheit
reduzieren. Ein Beispiel für
ein solches Krankheitsziel ist die diabetische Retinopathie. Wenn
das Wachstum neuer Blutgefäße das Wachstum
eines nachteiligen Gewebes unterstützen muß, wird die Hemmung der Angiogenese
die Blutzufuhr zum Gewebe reduzieren und dadurch zur Reduzierung
der Gewebemasse auf der. Basis der Blutzufuhrerfordernisse beitragen.
Beispiele schließen
das Wachstum von Tumoren ein, wenn Neovaskularisierung ein fortwährendes
Erfordernis ist, damit der Tumor wächst; und das Entstehen von
festen Tumormetastasen. Somit hemmen die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung die Tumorgewebeangiogenese, um dadurch Tumormetastase
und Tumorwachstum zu verhindern.
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So kann gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung die Hemmung der Angiogenese unter Verwendung der Verbindungen
der vorliegenden Erfindung die Symptome der Krankheit lindern und
in manchen Fällen
die Krankheit heilen.
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Ein weiteres therapeutisches Ziel
für die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Augenkrankheiten, die
durch Neovaskularisierung gekennzeichnet sind. Solchen Augenkrankheiten
schließen
neovaskuläre
Störungen
der Hornhaut ein, wie Hornhauttransplantation, hepatische Keratitis,
luetische Keratitis, Pterygium und neovaskulären Pannus, der mit der Verwendung
von Kontaktlinsen verbunden ist. Zusätzliche Augenkrankheiten schließen ebenfalls
altersbedingte Makuladegeneration, mutmaßliche Augenhistoplasmose, Prematuren-Retinopathie
und neovaskuläres
Glaukom ein.
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Ein Verfahren zur Herstellung einer
Verbindung der Formel(I):
welches die Reduktion einer
Verbindung der Formel (II) umfaßt:
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Ein Verfahren zur Herstellung einer
Verbindung der Formel (II):
umfaßt die Cyclisierung einer Verbindung
der Formel (III):
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Wie hier verwendet soll C1-6-Alkyl Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl,
n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, n-Pentyl, Isopentyl, Neopentyl
und Hexyl und die einfachen aliphatischen Isomere davon einschließen.
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Bestimmte Reagenzien werden hier
abgekürzt.
DCC bezeichnet Dicyclohexylcarbodiimid, DMAP bezeichnet Dimethylaminopyridin,
DIEA bezeichnet Diisopropylethylamin, EDC bezeichnet N-Ethyl-N'(dimethylaminopropyl)carbodiimid.
HOBt bezeichnet 1-Hydroxybenzotriazol, THF bezeichnet Ethylacetat,
DMF bezeichnet Dimethylformamid, NBS bezeichnet N-Bromsuccinimid,
Pd/C bezeichnet Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator, DPPA bezeichnet
Diphenylphosphorylazid, BOP bezeichnet Benzotriazol-lyloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat,
HF bezeichnet Fluorwasserstoffsäure,
PPA bezeichnet Polyphosphorsäure,
TEA bezeichnet Triethylamin, TFA bezeichnet Trifluoressigsäure, PCC
bezeichnet Pyridiniumchlorochromat.
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Verbindungen der vorliegenden Erfindung
werden durch die Verfahren hergestellt, die beschrieben werden in
Bondinell et al., PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 97/01540 (internationale Anmeldung Nr. PCT/US96/11108), veröffentlicht
am 16. Januar 1997, dessen gesamte Offenbarung hier durch Verweis
eingeführt
wird.
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Zusätzlich werden Verbindungen
dieser Erfindung durch Verfahren hergestellt, die analog zu den
in den nachfolgend ausführlich
dargestellten Schemata beschriebenen sind. Schema
1
a) Tf
2O, 2,6-Lutidin;
CH
2Cl
2; b) Allyltributylzinn,
LiCl, (Ph
3P)
2PdCl
2, DMF; c) RuCl
3,
H
5IO
6, CCl
4, CH
3CN, H
2O; d) PPA; e) EtOAc/LiHMDS, THF;
f) H
2, 10% Pd/C,
konz. HCl, AcOH; g) EtSH, AlCl
3, CH
2Cl
2; h) Tf
2O, 2,6-Lutidin,
CH
2Cl
2; i) CO, Pd(OAc)
2, KOAc, dppf, DMSO.
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2-Benzyl-4-methoxyphenol (J. Am.
Chem. Soc. 1949, 71, 64) wird zum entsprechenden Trifluormethansulfonatester,
Verbindung 2 – Schema
1 (z. B. 1–2),
durch Reaktion mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid(Tf2O)
in Gegenwart einer geeigneten Base, z. B. 2,6-Lutidin, in einem
inerten Lösungsmittel,
allgemein CH2Cl2,
umgewandelt. Reaktion von 1–2
mit Allyltributylzinn in Gegenwart von LiCl und einem Palladium-Katalysator,
z. B.
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Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid
((Ph3P)2PdCl2), in einem inerten Lösungsmittel wie DMF durch das
von Tilley beschriebene Verfahren (J. Org. Chem. 1990, 55, 906,)
liefert 1–3.
Oxidative Spaltung des Olefins in 3-Schema 1, um direkt die Carbonsäure 1–4 zu ergeben,
kann durch Reaktion mit einem geeigneten Oxidationsmittel, klassischerweise
KMnO4, in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel,
wie wäßrigem Aceton
oder wäßriger Essigsäure, erreicht
werden. Bevorzugt wird die oxidative Spaltung des Olefins in 1–3 jedoch,
um die Carbonsäure
1–4 direkt
zu ergeben, gemäß dem allgemeinen
Verfahren von Sharpless durchgeführt
(J. Org. Chem. 1981, 46, 3936; J. Org. Chem. 1985, 50, 1560, Fußnote 4),
in dem RuO4 in situ durch Reaktion von RuCl3 oder RuO2 mit NaIO4 oder H5IO6 in einem Losungsmittelgemisch aus CCl4, CH3CN und H2O erzeugt wird. Alternativ könnte die
Oxidation in zwei Schritten durchgeführt, werden, die im ersten
Schritt eine oxidative Spaltung des Olefins zum entsprechenden Aldehyd
beinhaltet, was durch den Fachleuten wohlbekannte Verfahren erreicht
werden kann, gefolgt von Oxidation des Aldehyds zur Carbonsäure unter
Verwendung von z. B. NaClO2, wie beschrieben
von Pinnick (Tetrahedron 1981, 37, 2091) oder von Dalcanale und Montanari
(J. Org. Chem. 1986, 51, 567) Cyclisierung von 1–4 zu 1–5 kann unter Verwendung von
Polyphosphorsäure
gemäß dem von
Proctor, Renfrew und Savage beschriebenen Verfahren erreicht werden
(J. Chem. Soc. (C) 1969, 1000). Alternativ kann 1–4 zu 1–5 über das
entsprechende Säurechlorid
von 1–4
umgewandelt werden, das durch den Fachleuten wohlbekannte Verfahren
hergestellt werden kann. Behandlung dieses Säurechlorids mit einem geeigneten
Friedel-Crafts-Katalysator, wie AlCl3 oder
SnCl4, in einem inerten Lösungsmittel,
wie CH2Cl2 oder
CS2, liefert das cyclische Keton 1–5. Reaktion
von 1–5
in einer Aldol-Reaktion mit den Enolat von Ethylacetat, das aus
Ethylacetat bei Kontakt mit einer geeigneten Amid-Base erzeugt werden
kann, z. B. Lithiumdüsopropylamid
(LDA) oder Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (LiHMDS), ergibt 1–6. Häufig. ist
THF das Lösungsmittel
der Wahl für
eine Aldol-Reaktion, obwohl THF in Gegenwart verschiedener Additive,
z. B. HMPA oder TMEDA, häufig
verwendet wird. Reduktion von 1–6,
um 1–7
zu ergeben, kann durch Hydrogenolyse über einem geeigneten Katalysator,
z. B. Palladiummetall an aktivierten Kohlenstoff (Pd/C), in einem
geeigneten Lösungsmittel
wie Essigsäure
in Gegenwart einer Mineralsäure
wie HCl erreicht werden. Alternativ kann diese Reduktion durch Behandlung
von 1–6
mit Triethylsilan in Gegenwart von Bortrifluoridetherat durch das
allgemeine Verfahren von Orphanopoulos und Smonu erreicht werden
(Synth. Commun. 1988, 833). Entfernung des Methylethers von 1-7,
um 1–8
zu ergebem, kann mit BBr3 in einem inerten
Lösungsmittel,
z. B. CH2C12, oder
durch Reaktion mit Ethanthiol und AlCl3 in
einem inerten Lösungsmittel,
bevorzugt CH2Cl2,
erreicht werden. Andere nützliche
Verfahren zur Entfernung eines Methylethers werden in Greene beschrieben,
"Protective Groups in Organic Synthesis" (veröffentlicht von John Wiley and
Sons). 1–9,
der Trifluormethansulfonatester von 1–8, hergestellt durch das früher beschriebene
Verfahren für
die Umwandlung von 1–1
zu 1–2,
reagiert mit Kohlenmonoxid in Gegenwart von Kaliumacetat, 1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocen
(ddpf) und einem Palladium-Katalysator, z. B. Palladiumacetat (Pd(OAc)2), in einem geeigneten Lösungsmittel, bevorzugt DMSO,
gemäß dem von
Cacci und Lupi beschriebenen allgemeinen Verfahren (Tet. Lett. 1992;
33, 3939), um 1–10
zu ergeben.
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Schema 2 ist illustrativ für ein Kupplungsverfahren
für die
Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungsbildung, das zur Bildung einer Ether-Verknüpfung verwendet
werden kann. Schema
2
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- a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid, DEAD, (Ph)3P, DMF;
- b) Cyclohexen, 10% Pd/C, 2-Propanol; c) 1,0 N NaOH, EtOH, dann
Ansäuerung.
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Verbindung 1 aus Schema 2 (2–1) wird
mit 2-[(3-Hydroxy-1propyl)amino]pyridin-N-oxid in einer Kupplungsreaktion
vom Mitsunobu-Typ umgesetzt (Organic Reactions 1992, 42, 335–656; Synthesis
1981, 1–28), um
2–2 zu
liefern. Die Reaktion wird durch den zwischen Diethylazodicarboxylat
und Triphenylphosphin gebildeten Komplex vermittelt und wird in
einem aprotschen Lösungsmittel,
z. B. THF, CH2Cl2 oder
DMF, durchgeführt.
Die Pyridin-N-oxid-Einheit von 2-2 wird zum entsprechenden Pyridin
2-3 unter Transferhydrierungsbedingungen unter Verwendung eines
Palladium-Katalysators, bevorzugt Palladiummetall auf Aktivkohle,
in einem inerten Lösungsmittel,
z. B. Methanol, Ethanol oder 2-Propanol, reduziert. Cyclohexen,
1,4-Cyclohexadien,
Ameisensäure
und Salze der Ameisensäure,
wie Kaliumformiat oder Ammoniumformiat, werden üblicherweise als Wasserstoffüberträger in diesem
Reaktionstyp verwendet. Der Ethylester von 2–3 wird wie in Schema 1 beschrieben
verseift, um 2–4
zu liefern.
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Alternative Verfahren zur Herstellung
bestimmter hier zuvor beschriebener intermediärer Verbindungen wurden wie
nachfolgend in den Schemata 3 und 4 gezeigt erreicht. Schema
3
a) 10% Pd/C, HOAc; b) SOCl
2,
Toluol; c) AlCl
3, CH
2Cl
2.
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Schema 3 faßt ein alternatives Verfahren
zur Herstellung von Verbindungen aus Schema 1, Formel 5 (1–5) zusammen.
Gemäß diesem
Schema wird 3–1
(J. Med. Chem., 1981, 24, 99,8) über
einer Atmosphäre aus
Wasserstoffgas bei einem geeigneten Druck, z. B. 50 psi, in Gegenwart
eines Palladium-Katalysators, z. B. 10% Pd/C, in einem geeigneten
Lösungsmittel,
z. B. Eisessig, bei einer geeigneten Temperatur z. B. 25°C, hydriert,
um 3–2
zu ergeben. Cyclisierung von 3–2
zu 3–3
wird erreicht, indem zuerst 3-2 zum entsprechenden Säurechlorid
in Gegenwart eines geeigneten Chlorierungsmittels, z. B. Thionylchlorid,
in einem geeigneten Lösungsmittel,
z. B.
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Benzol, bei einer geeigneten Temperatur,
z. B. 85°C,
umgewandelt wird. Die Behandlung dieses Säurechlorids mit einem geeigneten
Friedel-Crafts-Katalysator,
z. B. AlCl
3, in einem geeigneten Lösungsmittel,
z. B. CH
2Cl
2, bei
einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, ergibt 6–3. Schema
4
a) LiN(TMS)
2, Ethylbromacetat;
b) Jones-Reagens, OsO
4; c) H
2,
10% Pd/C, HOAc; d) C
2O
2Cl
2, DMF; e) AlCl
3, CH
2Cl
2, RT; f) H
2, 10% Pd/C, HOAc.
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Schema 4 faßt ein alternatives Verfahren
zur Herstellung von Verbindungen von Schema 1, Formel 7 (1–7) zusammen.
Gemäß diesem
Schema wird 4–1.
(J. Med. Chem. 1981, 24, 998.) mit Ethylbromacetat in Gegenwart
einer geeigneten Base, z. B. LiN(TMS)2, in einem geeigneten Lösungsmittel,
z. B. THF, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. –78°C, umgesetzt,
um 4–2
zu ergeben. 4-2 wird oxidativ in Gegenwart einer geeigneten Mischung
aus Oxidationsmitteln, z. B. OsO4/Jones-Reagens,
in einem geeigneten Lösungsmittel,
z. B. Aceton, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, gespalten, um
4–3 zu
gergeben (J. Org. Chem., 1993, 58, 4745). 4–3 wird weiter über einer
Atmosphäre
aus Wasserstoffgas bei einem geeigneten Druck, z. B. 50 psi, in
Gegenwart eines Palladium-Katalysators, z. B. 10% Pd/C, in einem
geeigneten Lösungsmittel,
z. B. Eisessig, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, hydriert,
um 4–4
zu ergeben. Cyclisierung von 4–4
zu 4–5 wird
erreicht, indem zuerst 4–4
zum entsprechenden Säurechlorid
in Gegenwart eines geeigneten Chlorierungsmittels, z. B. Oxalylchlorid,
in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Additivs, z. B. DMF,
in einem geeignete Lösungsmittel,
z. B. CH2Cl2, bei
einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, umgewandelt wird. Behandlung
dieses Säurechlorids
mit einem geeigneten Friedel-Crafts-Katalysator, z. B. AlCl3, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. CH2Cl2, bei einer geeigneten
Temperatur, z. B. 25°C,
ergibt 4–5.
4–5 wird
weiter über einer
Atmosphäre
aus Wasserstoffgas bei einem geeigneten Druck, z. B. 50 psi, in
Gegenwart eines Palladium-Katalysators, z. B. 10% Pd/C, in einem
geeigneten Lösungsmittel,
z. B. Eisessig, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, hydriert,
um 4–6
zu ergeben.
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Säureadditionssalze
der Verbindungen werden in einer Standardweise in einem geeigneten
Lösungsmittel
aus der Stammverbindung und einem Überschuß einer Säure hergestellt, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure oder
Methansulfonsäure.
Bestimmte Verbindungen bilden innere Salze oder Zwitterionen, die
annehmbar sein können.
Kationische Salze werden durch Behandeln der Stammverbindung mit
einem Überschuß eines
alkalischen Mittels, wie mit einem Hydroxid, Carbonat, oder Alkoxid,
das das entsprechende Kation enthält; oder mit einem entsprechenden
organischen Amin hergestellt. Kationen wie Li+, Na+, K+, Ca++, Mg++ und NH4
+ sind spezifische
Beispiele für
Kationen, die in pharmazeutisch akzeptablen Salzen vorliegen.
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Diese Erfindung stellt ebenfalls
eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung wie
hier beschrieben und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt. Entsprechend
können
die Verbindungen dieser Erfindung in der Herstellung eines Medikaments
verwendet werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Verbindungen
dieser Erfindung, hergestellt wie hier zuvor beschrieben, können als
Lösungen
oder lyophilisierte Pulver zur parenteralen Verabreichung formuliert
werden. Pulver können
durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder eines anderen
pharmazeutischen akzeptablen Trägers
vor der Verwendung rekonstituiert werden. Die flüssige Formulierung kann eine
gepufferte, isotonische, wäßrige Lösung sein.
Beispiele für
geeignete Verdünnungsmittel
sind normale isotonische Kochsalzlösung, 5%ige Standarddextrose
in Wasser oder gepufferte Natriumoder Ammoniumacetat-Lösung. Eine
solche Formulierung ist speziell geeignet zur parenteralen Verabreichung,
aber kann ebenfalls zur oralen Verabreichung verwendet werden oder
in einem Dosierinhalator oder Vernebler zur Insufflation enthalten
sein. Es kann wünschenswert
sein, Exzipienten hinzuzugeben, wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine,
Hydroxycellulose, Gummi arabicum, Polyethylenglycol, Mannit, Natriumchlorid
oder Natriumcitrat.
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Alternativ können diese Verbindungen zur
oralen Verabreichung verkapselt, tablettiert oder in einer Emulsion
oder einem Sirup hergestellt werde. Pharmazeutisch akzeptable feste
oder flüssige
Träger
können hinzugegeben
werden, um die Zusammensetzung zu verbessern oder zu stabilisieren,
oder um die Herstellung der Zusammensetzung zu erleichtern. Feste
Träger
schließen
Stärke,
Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Kaolin, Magnesiumstearat oder Stearinsäure, Talkum,
Pectin, Gummi arabicum, Agar oder Gelatine ein. Flüssige Träger schließen Sirup,
Erdnußöl, Olivenöl, Kochsalzlösung und
Wasser ein. Der Träger
kann ebenfalls ein Material zu anhaltenden Freisetzung ("sustained
relase") einschließen,
wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit
einem Wachs. Die Menge des festen Trägers variiert, aber wird bevorzugt.
zwischen ca. 20 mg und ca. 1 g pro Dosierungseinheit liegen. Die
pharmazeutischen Zubereitungen werden unter Befolgen der herkömmlichen
Techniken der Pharmazie hergestellt, die Mahlen, Mischen, Granulieren
und Verpressen, wenn erforderlich, für Tablettenformen beinhalten;
oder Mahlen, Mischen, und Einfüllen
für Hartgelatinekapselformen.
Wenn ein flüssiger
Träger
verwendet wird, wird die Zubereitung in Form eines Sirups, eines Elixiers,
einer Emulsion oder einer wäßrigen oder
nicht-wäßrigen Suspension
sein. Eine solche flüssige
Formulierung kann direkt p.o. verabreicht oder in eine Weichgelatinekapsel
gefüllt
werden.
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Zur rektalen Verabreichung können die
Verbindungen dieser Erfindung ebenfalls mit Exzipienten wie Kakaobutter,
Glycerin, Gelatine oder Polyethylenglycolen kombiniert und zu einem
Suppositorium geformt werden.
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Die hier beschriebenen Verbindungen
sind Antagonisten des Vitronektin-Rezeptors und sind nützlich zur
Behandlung von Krankheiten, in denen die zugrundeliegende Pathologie
Liganden oder Zellen zuweisbar ist, die mit dem Vitronektin-Rezeptor
Wechselwirken. z. B. sind diese Verbindungen nützlich zur Behandlung von Krankheiten,
in denen ein Verlust der Knochenmatrix die Pathologie schafft. Daher
sind die vorliegenden Verbindungen nützlich zur Behandlung von Osteoporose,
Hyperparathyreoidismus, Paget-Krankheit, Hypercalcämie eines
bösartigen
Tumors, osteolytischen Schädigungen,
hervorgerufen Knochenmetastase, Knochenverlust aufgrund von Immobilisierung
oder Geschlechtshormonmangel. Es wird angenommen, daß die Verbindungen
dieser Erfindung ebenfalls einen Nutzen als Antitumormittel, antiangiogene
Mittel, entzündungshemmende
Mittel und Antimetastatika haben und nützlich in der Behandlung von
Atherosklerose und Restenose sind.
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Die Verbindung wird entweder oral
oder parenteral an den Patienten in einer Weise verabreicht, so
daß die
Konzentration des Arzneistoffs ausreichend ist, um die Knochenresorption
oder eine andere solche Indikation zu hemmen. Die pharmazeutische
Zusammensetzung, die die Verbindung enthält, wird mit einer oralen Dosis
zwischen ca. 0,1 und ca. 50 mg/kg in einer mit dem Zustand des Patienten übereinstimmenden
Weise verabreicht. Bevorzugt würde
die orale Dosis ca. 0,5 bis ca. 20 mg/kg sein. Zur akuten Therapie
ist die parenterale Verabreichung bevorzugt. Eine intravenöse Infusion
des Peptids in 5%iger Dextrose in Wasser öder normaler Kochsalzlösung oder
eine ähnliche
Formulierung mit geeigneten Exzipienten ist am wirksamsten, obwohl
eine intramuskuläre
Bolusinjektion ebenfalls nützlich
ist. Typischerweise wird die parenteräle Dosis ca. 0,01 bis 100 mg/kg
sein; bevorzugt zwischen 0,1 und 20 mg/kg. Die Verbindungen werden
ein- bis viermal täglich
in einer Menge verabreicht, um eine tägliche Gesamtdosis von ca.
0,4 bis 400 mg/kg/Tag zu erreichen. Die präzise Menge und das präzise Verfahren,
durch die die Verbindungen verabreicht werden, wird leicht durch einen
Durchschnittsfachmann durch Vergleich des Blutspiegels des Mittels
mit der erforderlichen Konzentration, um eine therapeutische Wirkung
aufzuweisen, bestimmt.
-
Diese Erfindung stellt ferner ein
Verfahren zur Behandlung von Osteoporose oder zur Hemmung von Knochenverlust
bereit, welches das Verabreichen, schrittweise oder in physikalischer
Kombination, einer Verbindung dieser Erfindung und eines anderen
Inhibitors für
die Knochenresorption, wie Bisphosphonate (d.h. Allendronat), Hormonersatztherapie,
Antiöstrogene
oder Calcitonin umfaßt.
Zusätzlich
stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung unter Verwendung
einer Verbindung dieser Erfindung und eines anabolen Mittels bereit,
wie das morphogene Knochenprotein, Iproflavon, das nützlich in
der Verhinderung von Knochenverlust und/oder zur Erhöhung der
Knochenmasse ist.
-
Zusätzlich stellt diese Erfindung
ein Verfahren zur Hemmung von Tumorwächstum bereit, welches das Verabreichen,
schrittweise oder in physikalischer Kombination, einer Verbindung
dieser Erfindung und eines antineoplastischen Mittels umfaßt. Verbindungen
der Klasse der Camptothecin-Analoga, wie Topotecan, Irinotecan und
9-Aminocamptothecin, und Platin-Koordinationskomplexe, wie Cisplatin,
Ormaplatin und Tetraplatin sind wohlbekannte Gruppen von antineoplastischen
Mitteln. Verbindungen der. Klasse der Camptothecin-Analoga werden
beschrieben in US-PSen Nrn. 5 004 758, 4 604 463, 4 473 692, 4 545
880,4 342 776, 4 513.138, 4 399 276, EP-A-0 418 099 und EP-A-0 088
642, Wani et al., J, Med. Chem., 1986, 29, 2358, Wani et al., J. Med.
Chem., 1980, 23, 554, Wani et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1774
und Nitta et al., Proc. 14th International Congr. Chemotherapy,
1985, Anticancer Section 1, 28, deren gesamte Offenbarung hier durch
Verweis. eingeführt
wird. Der Platin-Koordinationskomplex, Cisplatin, ist unter der
Bezeichnung Platinol® von Bristol Myers-Squibb
Corporation erhältlich.
Nützliche
Formulierungen für
Cisplatin werden in den US-PSen Nrn. 5 562 925 und 4 310 515 beschrieben,
deren gesamte Offenbarung hier durch Verweis angeführt wird.
-
Im Verfahren der Hemmung von Tumorwachstum,
welches das Verabreichen, schrittweise oder in physikalischer Kombination,
einer Verbindung dieser Erfindung und eines antineoplastischen Mittels
umfaßt,
kann die Platin-Koordinationsverbindung,
z. B. Cisplatin, unter Verwendung einer langsamen intravenösen Infusion verabreicht
werden. Der bevorzugte Träger
ist eine Dextrose/Kochsalzlösung,
die Mannit enthält.
Das Dosisschema für
die Platin-Koordinationsverbindung kann auf der Basis von ca. 1
bis ca. 500 mg pro Quadratmeter (mg/m2)
Körperoberfläche pro
Behandlungsverlauf sein. Infusionen der Platin-Koordinationsverbindung
können
ein- bis zweimal wöchentlich
gegeben werden, und die wöchentlichen
Behandlungen können
mehrere Male wiederholt werden. Unter Verwendung einer Verbindung
der Klasse der Camptothecin-Analoga in einer parenteralen Verabreichung
ist der allgemein eingesetzte Therapieverlauf ca. 0,1 bis ca. 300,0
mg/m2 Körperoberfläche pro
Tag für
ca. fünf
aufeinanderfolgende Tage. Am meisten bevorzugt ist der für Topotecan
eingesetzte Therapieverlauf ca. 1,0 bis ca. 2,0 mg/m2 Körperoberfläche pro
Tag für
ca. fünf
aufeinanderfolgende Tage. Bevorzugt wird der Therapieverlauf wenigstens
einmal in einem Intervall von ca. 7 Tagen bis ca. 28 Tagen wiederholt.
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Die pharmazeutische Zusammensetzung
kann sowohl mit der Verbindung dieser Erfindung als, auch mit dem
antineoplastischen Mittel im gleichen Behälter formuliert werden, aber
die Formulierung in unterschiedlichen Behältern ist bevorzugt. Wenn beide
Mittel in Lösungsform
bereitgestellt werden, können
sie in einem Infusions/Injektionssystem zur simultanen Verabreichung
oder in einer Tandemanordnung enthalten sein.
-
Zur zweckmäßigen Verabreichung der Verbindung
dieser Erfindung und des antineoplastischen Mittels zu gleichen
oder zu unterschiedlichen Zeiten wird ein Kit hergestellt, das in
einem einzelnen Behälter,
wie in einem Kasten, einem Karton oder anderen Behälter, individuelle
Flaschen, Beutel, Ampullen oder andere Behälter, die jeweils eine effektive
Menge der Verbindung dieser Erfindung zur parenteralen Verabreichung
wie oben beschrieben aufweisen, und eine effektive Menge des antineoplastischen
Mittels zur parenteralen Verabreichung wie oben beschrieben umfaßt. Ein
solches Kit kann z. B. sowohl pharmazeutische Mittel in separaten
Behältern
oder im gleichen Behälter,
gegebenenfalls als lyophilisierte Klumpen, und Behälter für Lösungen zur
Rekonstituierung umfassen. Eine Variation davon ist der Einschluß der Lösung zur
Rekonstituierung und des lyophilisierten Klumpens, in zwei Kammern
eines einzelnen Behälters,
die vor der Verwendung zum Vermischen gebracht werden. Mit einer
solchen Anordnung können
das antineoplastische Mittel und die Verbindung dieser Erfindung
separat, wie in zwei Behältern,
oder lyophilisiert zusammen als Pulver verpackt und in einem einzelnen
Behälter
bereitgestellt werden.
-
Wenn beide Mittel in Lösungsform
bereitgestellt werden, können
sie in einem Infusions/Injektionssystem zur simultanen Verabreichung
oder in einer Tandemanordnung enthalten sein. z. B. kann die Verbindung dieser
Erfindung in einer i.v. injizierbaren Form oder in einem Infusionsbeutel
sein, der in Reihe über
Schläuche mit
dem antineoplastischen Mittel in einem zweiten Infusionsbeutel verbunden
ist. Unter Verwendung eines solchen Systems kann ein Patient eine
anfängliche
Injektion oder Infusion vom Bolus-Typ der Verbindung dieser Erfindung
erhalten, gefolgt von einer Infusion des antineoplastischen Mittels.
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Die Verbindungen können in
einem aus verschiedenen biologischen Untersuchungen getestet werden,
um die Konzentration der Verbindung zu bestimmen, die erforderlich
ist, um einen gegebenen pharmakologischen Effekt zu zeigen.
-
Hemmung der
Vitronektin-Bindung
-
Festphasen-[3H]-SK&F-107260-Bindung
an αvβ3: αvβ3 aus menschlicher Pläzenta oder menschlichen Blutplättchen (0,1–0,3 mg/ml)
in Puffer T (der 2 mM CaCl2 und 1% Octylglucosid
enthält)
wurde mit Puffer T verdünnt,
der 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2,
1 mM MgCl2 (Puffer A) und 0,05% NaN3 enthielt, und dann unverzüglich zu
ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning, New York, NY) mit 0,1
ml pro Vertiefung gegeben. 0,1–0,2 μg αvβ3 wurde
pro Vertiefung hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert.
Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Vertiefungen einmal mit
Puffer A gespült
und mit 0,1 ml 3,5%igem Rinderserumalbumin im gleichen Puffer für 1 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Im Anschluß an
die Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und zweimal
mit 0,2 ml Puffer A gespült.
-
Verbindungen wurden in 100% DMSO
gelöst,
um eine 2 mM Vorratslösung
zu ergeben, die mit Bindungspuffer (15 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100
mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2,
1 mM MgCl2) auf eine Verbindungsendkonzentration
von 100 μM
verdünnt
wurde. Diese Lösung
wird dann auf die erforderliche Verbindungsendkonzentration verdünnt. Verschiedene
Konzentrationen unmarkierter Antagonisten (0,001–100 μM) wurden zu den Vertiefungen
in 3-facher Ausführung
zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5,0 nM [3H]-SK&F-107260 (65–86 Ci/mmol).
-
Die Platten wurden für 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden
die Vertiefungen vollständig
abgesaugt und einmal mit 0,2 ml eiskaltem Puffer A in einer Weise
von Vertiefung zu Vertiefung gespült. die Rezeptoren wurden mit
0,1 ml 1%igem SDS solubilisiert, und das, gebundene [3H]-SK&F-107260 wurde
durch Flüssig-Szintillationszählung unter
Zugabe von 3 ml Ready Safe in einem Beckman LS Liquid Scintillation
Counter mit 40%igem Wirkungsgrad bestimmt. Die nichtspezifische
Bindung von [3H]- SK&F-107260 wurde in Gegenwart von 2 μM SK&F-107260 bestimmt
und war durch- gehend weniger als 1% des Gesamtradioliganden-Eingangs.
Der IC50-Wert (Konzentration des Antagonisten
zur Hemmung von 50% Bindung von [3H]-SK&F- 107260) wurde
durch eine nicht-lineare Kurvenanpassungsroutine der kleinsten Fehlerquadrate
bestimmt, die aus dem LUNDON-2-Programm modifiziert wurde. Der Kii-Wert (Dissoziationskonstante des Antagonisten)
wurde gemäß der Gleichung:
Ki = IC50/(l + L/Kd) bestimmt, worin L und Kd die
Konzentrations- bzw. die Dissoziationskonstante von [3H]-SK&F-107260 waren:
-
Verbindungen dieser Erfindung wurden
ebenfalls auf die in-vitro- und in-vivo-Knochenresorption in Untersuchungen
getestet, die standardmäßig auf
diesem Gebiet zur Auswertung der Hemmung der Knochenbildung sind,
wie der "Pit Formation"-Test, offenbart in EP 528 587, der ebenfalls
unter Verwendung von menschlichen Osteoklasten anstelle von Ratten-Osteoklasten
durchgeführt
werden kann, und wie im Modell der ovariektomierten Ratte, beschrieben
von Wronski et al., Cells and Materials 1991, Sup. 1, 69–74.
-
Migrationstest
der glatten Gefäßmuskelzellen
-
Glatte Muskelzellen der Aorta von
Ratte oder Mensch wurden verwendet. Die Zellmigration wurde in einer
Transwell-Zellkulturkammer unter Verwendung einer Polycarbonat-Membran
mit Poren von 8 μm (Costar) überwacht.
Die untere Oberfläche
des Filters war mit Vitronektin beschichtet. Zellen wurden in DMEM suspendiert,
ergänzt
mit 0,2% Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 2,5–5,0 × 106 Zellen/ml, und wurden mit Testver bindung
in unterschiedlichen Konzentrationen für 20 min bei 20°C vorbehandelt.
Das Lösungsmittel
allein wurde a1s Kontrolle verwendet. 0,2 ml der Zellsuspension
wurde in das obere Abteil der, Kammer gegeben. Das untere Abteil
enthielt 0,6 ml DMEM, ergänzt
mit 0,2% Rinderserumalbumin. Die Inkubation wurde bei 37°C in einer
Atmosphäre
von 95% Luft/5% CO2 für 24 h durchgeführt. Nach
der Inkubation wurden die nicht-migrierten Zellen auf. der oberen
Oberfläche
des Filters durch vorsichtiges Schaben entfernt. Der Filter wurde
dann in Methanol fixiert und mit 10% Giemsa-Anfärbelösung angefärbt. Die Migration wurde entweder
durch a) Zählender
Anzahl von Zellen, die zur unteren Oberfläche des Filters migriert waren,
oder durch b) Extrahieren der angefärbten Zellen mit 10%iger Essigsäure, gefolgt
von Bestimmung der Extinktion bei 600 nm gemessen.
-
Modell der Ratte mit entfernten
Nebenschilddrüsen
-
Jede experimentelle Gruppe bestand
aus 5 bis 6 ausgewachsenen männlichen
Sprague-Dawley-Ratten (250–400
g Körpergewicht).
Den Ratten werden 7 Tage vor der Verwendung die Nebenschilddrüsen entfernt
(durch den Verkäufer,
Taconic Farms). Alle Ratten erhalten eine Ersatzdosis von Thyroxin
alle 3 Tage. Beim Empfang der Ratten werden Kreislaufspiegel von
ionisiertem Calcium im Vollblut direkt nach Entnahme durch Schwanzvenenpunktur
in heparinisierte Röhrchen
gemessen. Ratten werden eingeschlossen, falls der iönisierte
Ca-Spiegel (gemessen mit einem Calcium-pH-Analysator Ciba-Corning
Modell 634) < 1,2
mM/1 ist. Jede Ratte wird mit einem venösen und arteriellen Verweilkatheter
für die Übertragung
von Testmaterial bzw. zur Blutprobenentnahme versehen. Die Ratten
werden dann auf eine Diät
mit calciumfreier Nahrung und entionisiertem Wasser gesetzt. Basislinien-Ca-Spiegel werden gemessen,
und jeder Ratte wird entweder Kontrollträger oder menschliches Nebenschilddrüsenhormon
1-34 Peptid (hPTH1-34, Dosis 1,25 μg/kg/h in Kochsalzlösung/0,1%
Rinderserumalbumin, Bachem, Ca) oder eine Mischung aus hPTH1-34
und Testmaterial durch kontinuierliche intravenöse Infusion über den
venösen
Katheter unter Verwendung einer externen Spritzenpumpe verabreicht.
Die calcämische
Reaktion jeder Ratte wird in zweistündlichen Intervallen während des
Infusionszeitraums von 6 bis 8 Stunden gemessen.
-
Menschliche Osteoklastenresorption-
und -adhäsions-Tests
-
Vertiefungsresorptions- und -adhäsions-Tests
wurden entwickelt und unter Verwendung normaler menschlicher Osteoklasten,
die aus Knochenmarksarkomgewebe stammten, standardisiert. Test 1
wurde zur Messung der Osteöklasten-Vertiefungsvolumina
("pit volume") durch konfokale Lasermikroskopie entwickelt. Test
2 wurde als höhere
Durchsatzdurchmusterung entwickelt, in der Collagen-Fragmente (während der
Resorption freigesetzt)durch kompetitiven ELISA gemessen werden.
-
Test 1 (unter Verwendung
von konfokaler Lasermikroskopie)
-
- – Teilmengen
von aus menschlichem Knochenmarksarkom stammenden Zellsuspensionen
werden aus der Lagerung in flüssigem
Stickstoff entfernt, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640-Medium durch
Zentrifugieren gespült
(1000 U/min, 5 min bei 4°C).
- – Das
Medium wird abgesaugt und gegen Maus-Anti-HLA-DR-Antikörper ausgetauscht
und dann 1 : 3 in RPMI-1640-Medium verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten
auf Eis inkubiert und häufig
gemischt.
- – Die
Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-164,0 gewaschen, gefolgt von
Zentrifugieren (1000 U/min, 5 min bei 4°C), und die Zellen werden dann
in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl mononuklärer Zellen
wird in einer verbesserten Neubauer-Zählkammer gezählt.
- – Ausreichend
magnetische Perlen (5/mononukleäre
Zelle), beschichtet mit Ziege-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck,
NY), werden aus ihrer Vorratsflasche entfernt und in 5 ml frisches
Medium gegeben (dies spült das
toxische Azid-Konservierungsmittel ab). Das Medium wird. durch Immobilisieren
der Perlen an einem Magnet entfernt und wird gegen frisches Medium
ausgetauscht.
- – Die
Perlenwerden mit, den Zellen vermischt, und die Suspension wird
für 30
Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig gemischt:
- – Die
perlenbeschichteten Zellen werden an einem Magnet mmobilisiert,
und die verbleibenden Zellen (Osteoklasten-reiche Fraktion) werden
in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
- – Frisches
Medium wird zu den perlenbeschichteten Zellen hinzugegeben, um etwaige
gefangene Osteoklasten abzustreifen. Dieses Spülverfahren wird 10-mal wiederholt.
Die perlenbeschichteten Zellen werden verworfen.
- – Die
lebensfähigen
Osteoklasten werden in einer Zählkammer
unter Verwendung von Fluoresceindiacetat gezählt, um lebende Zellen zu markieren.
Eine Einweg-Kunststoffpasteurpipette mit großer Bohrung wird verwendet,
um die Probe in die Kammer zu geben.
- – Die
Osteoklasten werden durch Zentrifugieren pelletiert und die Dichte
auf die entsprechende Anzahl in EMEM-Medium (die Anzahl der Osteoklasten
variiert von Tumor zu Tumor) eingestellt, ergänzt mit 10% Kalbfötusserum
und 1,7 g/l Natriumbicarbonat.
- – 3
ml-Teilmengen der Zellsuspension (pro Verbindungsbehandlung) werden
in 15 ml Zentrifugenröhrchen dekantiert.
Die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert.
- – Zu
jedem Röhrchen
werden 3 ml der entsprechenden Verbindungsbehandlung hinzugegeben
(verdünnt auf
50 μM im
EMEM-Medium). Ebenfalls eingeschlossen werden entsprechende Trägerkontrollen,
eine positive Kontrolle (Anti-Vitronektin-Rezeptor monoklonaler
Antikörper
der Maus [87MEml], verdünnt
auf 100 μg/ml)
und eine Isotypenkontrolle (IgG2a verdünnt auf
100 μg/ml).
Die Proben werden. bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert.
- – 0,5
ml-Teilmengen der Zellen werden auf sterile Dentinscheiben in einer
Platte mit 48 Vertiefungen übergeimpft
und bei 37°C
für 2 Stunden
inkubiert. Jede Behandlung wird 4-fach durchmustert.
- – Die
Scheiben werden in sechs Wechseln von warmem PBS (10 ml/Vertiefung
in einer Platte mit 6 Vertiefungen) gespült und dann in frisches Medium
gegeben, das die Verbindungsbehandlung oder Kontrollproben enthält. Die
Proben werden bei 37°C
für 48
Stunden inkubiert.
-
Verfahren der Tartrat-resistenten
sauren Phosphatase (TRAP) (selektive Anfärbung für. Zellen der Osteoklasten-Linie).
-
- – Die
Knochenscheiben, die die anhaftenden Osteoklasten enthalten, werden
in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gespült und in 2% Glutaraldehyd
(in 0,2 M Natriumcacodylat) für
5 Minuten fixiert.
- – Sie
werden dann in Wasser gespült
und für
4 Minuten in TRAP-Puffer
bei 37°C
inkubiert (0,5 mg/ml Naphthol AS-BI-Phosphat, gelöst in N,N-Dimethylformam
d und vermischt mit 0,25 M Citratpuffer (pH 4,5), enthaltend 10
mM Natriumtartrat.
- – Im
Anschluß an
Spülen
in kaltem Wasser werden die Scheiben in kalten Acetatpuffer (0,1
M, pH 6,2), der 1 mg/ml Fast Garnet enthält, getaucht und bei 4°C für 4 Minuten
inkubiert.
- – Überschüssiger Puffer
wird abgesaugt, und die Scheiben werden nach Spülen in Wasser luftgetrocknet.
- – Die
TRAP-positiven Osteoklasten (ziegelrot/violetter Niederschlag) werden
durch Hellfeldmikroskopie gezählt
und werden dann von der Oberfläche
des Dentins durch Ultraschallbehandlung entfernt.
- – Vertiefungsvolumina
werden unter Verwendung des konfokalen Mikroskops Nikon/Lasertec
ILM21W bestimmt.
-
Test 2 (unter Verwendung
von ELISA-Auslesung)
-
Die menschlichen Osteoklasten werden
angereichert und zur Verbindungsdurchmusterung wie in den ersten
neun Schritten von Test 1 beschrieben vorbereitet. Der Klarheit
halber werden diese Schritte nachfolgend wiederholt.
-
- – Teilmengen
von aus menschlichem Knochenmarksarkom stammenden Zellsuspensionen
werden aus der Lagerung in flüssigem
Stickstoff entfernt, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640-Medium durch
Zentrifugieren gespült
(1000 U/min, 5 min bei 4°C).
- – Das
Medium wird abgesaugt und gegen Maus-Anti-HLA-DR-Antikörper ausgetauscht
und dann 1 : 3 in RPMI-1640-Medium verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten
auf Eis inkubiert und häufig
gemischt.
- – Die
Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, gefolgt von
Zentrifugieren (1000 U/min, 5 min bei 4°C), und die Zellen werden dann
in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl mononukleärer Zellen
wird in einer verbesserten Neubauer-Zählkammer gezählt.
- – Ausreichend
magnetische Perlen (5/mononukleäre
Zelle), beschichtet mit Ziege-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck,
NY), werden aus ihrer Vorratsflasche entfernt und in 5 ml frisches
Medium gegeben (dies spült das
toxische Azid-Konservierungsmittel ab). Das Medium wird durch. Immobilisieren
der Perlen an einem Magnet entfernt und wird gegen frisches Medium
ausgetauscht.
- – Die
Perlen werden mit den Zellen vermischt, und die Suspension wird
für 30
Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig gemischt.
- – Die
perlenbeschichteten Zellen werden an einem Magnet immobilisiert,
und die verbleibenden Zellen (Osteoklasten-reiche Fraktion) werden
in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
- – Frisches
Medium wird zu den perlenbeschichteten Zellen hinzugegeben, um etwaige
gefangene Osteoklasten abzustreifen. Dieses Spülverfahren wird 10-mal wiederholt.
Die perlenbeschichteten Zellen werden verworfen.
- – Die
lebensfähigen
Osteoklasten werden in einer Zählkammer
unter Verwendung von Fluoresceindiacetat gezählt, um lebende Zellen zu markieren.
Eine Einweg-Kunststoffpasteurp pette mit großer Bohrung wird verwendet,
um die Probe in die Kammer zu geben.
- – Die
Osteoklasten werden durch Zentrifugieren pelletiert und die Dichte
auf die entsprechende Anzahl in EMEM-Medium (die Anzahl der Osteoklasten
variiert von Tumor zu Tumor) eingestellt, ergänzt mit 10% Kalbfötusserum
und 1,7 g/l Natriumbicarbonat.
-
Im Gegensatz zum oben in Test 1 beschriebenen
Verfahren werden die Verbindungen in vier Dosen durchmustert, um
einen IC50-Wert wie nachfolgend umrissen
zu erhalten:
- – Die Osteoklastenzubereitungen
werden für
30 Minuten bei 37°C
mit Testverbindung (4 Dosen) oder Kontrollen vorinkubiert.
- – Sie
werden dann auf kortikale Rinderknochenscheiben in Vertiefungeneiner
Gewebekulturplatte mit 48 Vertiefungen übergeimpft und für weitere
2 Stunden bei 37°C
inkubiert.
- – Die
Knochenscheiben werden in sechs Wechseln von warmer Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung (PBS)
gespült,
um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen, und werden dann in die
Vertiefungen einer Platte mit 48 Vertiefungen rücküberführt, die frische Verbindung
oder Kontrollen enthält.
- – Die
Gewebekulturplatte wird dann für
48 Stunden bei 37°C
inkubiert.
- – Die Überstände aus
jeder Vertiefung werden in individuelle Röhrchen abgesaugt und in einem
kompetitiven ELISA durchmustert, der das c-Telopeptid von Typ I-Collagen
nachweist, das während
des Resorptionsverfahrens freigesetzt wird. Dies ist ein handelsüblicher
ELISA (Osteometer, Dänemark),
der einen Kaninchen-Antikörper
enthält,
der spezifisch mit einer 8-Aminosäuresequenz (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg)
reagiert, die im Carboxy-terminalen Telopeptid der al-Kette von Typ I-Collagen
vorhanden ist. Die Ergebnisse werden als prozentuale Hemmung der
Resorption im Vergleich zu einer Trägerkontrolle ausgedrückt.
-
Menschlicher Osteoklasten-Adhäsionstest
-
Die menschlichen Osteoklasten werden
angereichert und zur Verbindungsdurchmusterung wie oben in den ersten
neun Schritten von Test 1 beschrieben vorbereitet. Der Klarheit
halber werden diese Schritte nachfolgend wiederholt.
-
- – Teilmengen
von aus menschlichem Knochenmarksarkom stammenden Zellsuspensionen
werden aus der Lagerung in flüssigem
Stickstoff entfernt, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640-Medium durch
Zentrifugieren gespült
(1000 U/min, 5 min bei 4°C).
- – Das
Medium wird abgesaugt und gegen Maus-Anti-HLA-DR-Antikörper ausgetauscht
und dann 1 : 3 in RPMI-1640-Medium verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten
auf Eis inkubiert und häufig
vermischt.
- – Die
Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, gefolgt von
Zentrifugieren (1000 U/min, 5 min bei 4°C), und die Zellen werden dann
in ein steriles 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl mononuklärer Zellen
wird in einer verbesserten Neubauer-Zählkammer gezählt.
- – Ausreichend
magnetische Perlen (5/mononukleäre
Zelle), beschichtet mit Ziege-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck,
NY), werden aus ihrer Vorratsflasche entfernt und in 5 ml frisches
Medium gegeben (dies spült das
toxische Azid-Konservierungsmittel ab). Das Medium wird durch Immobilisieren
der Perlen an einem Magnet entfernt und wird gegen frisches, Medium
ausgetauscht.
- – Die
Perlen werden mit den Zellen vermischt; und die Suspension wird
für 30
Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig vermischt.
- – Die
perlenbeschichteten Zellen werden an einem Magnet immobilisiert,
und die verbleibenden Zellen (Osteoklasten-reiche Fraktion) werden
in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
- – Frisches
Medium wird zu den perlenbeschichteten Zellen hinzugegeben, um etwaige
gefangene Osteoklasten abzustreifen. Dieses Spülverfahren wird 10-mal wiederholt.
Die perlenbeschichteten Zellen werden verworfen.
- – Die
lebensfähigen
Osteoklasten werden in einer Zählkammer
unter Verwendung von Fluoresceindiacetat gezählt, um lebende Zellen zu markieren.
Eine Einweg-Kunststoffpasteurpipette mit großer Bohrung wird verwendet,
um die Probe in die Kammer zu geben.
- – Die
Osteoklasten werden durch Zentrifugieren pelletiert und die Dichte
auf die, entsprechende Anzahl in EMEM-Medium (die Anzahl der Osteoklasten
variiert von Tumor zu Tumor) eingestellt, ergänzt mit 10 % Kalbfötusserum
und 1,7 g/1 Natriumbicarbonat.
- – Aus
Knocheninarksarkom stammende Osteoklasten werden mit Verbindung
(4 Dosen) oder Kontrollen bei 37°C
für 30
Minuten vorinkubiert.
- – Die
Zellen werden dann auf Osteopontin-beschichtete Objektträger übergeimpft
(Osteopontin von Mensch oder Ratte, 2,5 μg/ml) und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
- – Nichtanhaftende
Zellen werden durch kräftiges
Spülen
der Objektträger
in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung entfernt, und die auf
den Objektträgern
verbleibenden Zellen werden in Aceton fixiert.
- – Die
Osteoklasten werden auf Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP),
einen selektiven Marker für Zellen
dieses Phänotyps
(siehe Schritte 15–17),
angefärbt
und durch Lichtmikroskopie gezählt.
Die Ergebnisse werden als prozentuale Hemmung der Adhäsion im
Vergleich zu einer Trägerkontrolle
ausgedrückt.
-
Zelladhäsionstest
-
Zellen und Zellkultur
-
Menschliche Embryo-Nierenzellen (HEK293-Zellen)
wurden von ATCC erhalten (Katalog-Nr. CRL 1573). Die Zellen wurden
in essentiellem Earl-Minmalmedium
(EMEM) gezüchtet,
das Earlsches Salz, 10% Rinderfötusserum,
i% Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.
-
Konstrukte und Transfektionen
-
Ein 3,2 kb EcoRI-KpnI-Fragment der αv-Untereinheit
und 2,4 kb XbaI-XhoI-Fragment
der β3-Untereinheit wurden in die EcoRI-EcoRV-Klonierungsstelle
des pCDN-Vektors (Aiyar et al., 1994), der einen CMV-Promotor und
einen selektierbaren G418-Marker enthält, durch stumpfendiges Ligieren
inseriert. Zur stabilen Expression wurden 80 × 106 HEK
293-Zellen mit αvβ3-Konstrukten
(20 μg DNA
jeder Untereinheit) unter Verwendung eines Gene Pulser (Hensley
et al., 1994) elektrotransformiert und in 100 mm-Platten plattiert
(5 × 105-Zellen/Platte). Nach 48 Stunden wurde das
Wachstumsmedium mit 450 μg/ml
Geneticin (G418-Sulfat, GIBCO-BRL, Bethesda; MD) ergänzt. Die
Zellen wurden im Selektionsmedium gehalten, bis die Kolonien groß genug
für den
Test waren.
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Immunocytochemische Analyse
der transfizierten Zellen
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Zur Bestimmung, ob die HEK 293-Transfektanten
den Vitronektin-Rezeptor
exprimierten-, wurden die Zellen auf Mikroskopie-Glasobjektträgern durch
Zentrifugieren, immobilisiert, in Aceton für 2 Minuten bei Raumtemperatur
fixiert und luftgetrocknet. Spezifische Reaktivität mit 23C6,
einem für
den αvβ3-Komplex spezifischen monoklonalen Antikörper, wurde
unter Verwendung eines indirekten Standard-Immunofluoreszenzverfahrens
gezeigt.
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Zelladhäsionsuntersuchungen
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ELISA-Platten von Corning mit 96
Vertiefungen wurden über
Nacht bei 4°C
mit 0,1 ml menschlichem Vitronektin (0,2 μg/ml in RPMI-Medium) vorbeschichtet.
Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Platten einmal mit RPMI-Medium
gespült
und mit 3,5% BSA in RPMI-Medium für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Transfizierte
293-Zellen wurden in RPMI-Medium, ergänzt mit 20 mM Hepes, pH 7,4
und 0,1% BSA, mit einer Dichte von 0,5 × 106 Zellen/ml
resuspendiert. 0,1 ml Zellsuspension wurde in, jede Vertiefung gegeben
und für 1
Stunde bei 37°C
inkubiert, in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener avβ3-Antagonisten. Im Anschluß an die
Inkubation wurde 0,025 ml einer 10%igen Formaldehyd-Lösung, pH
7,4, hinzugegeben, und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten
fixiert. Die Platten wurden dreimal mit 0,2 ml RPMI-Medium gespült, und
die anhaftenden Zellen wurden mit 0,1 ml 0,5 % Toluidinblau für 20 Minuten
bei Raumtemperatur. angefärbt. Überschüssige Anfärbung wurde
durch ausgiebiges Spülen
mit entionisiertem Wasser entfernt. Das in die Zellen eingebaute
Toluidinblau wurde durch Zugabe von 0,1 ml 50%igem Ethanol, das
50 mM HCl enthielt, eluiert. Die Zelladhäsion wurde bei einer optischen
Dichte von 600 nm an einem Mikrotiterplatten-Auslesegerät quantifiziert
(Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).
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Festphäsen-αvβ5-Bindungstest
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Der Vitronektin-Rezeptor αvβ5 wurde
aus menschlicher Plazenta gereinigt. Die Rezeptorzubereitung wurde
mit 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2,
1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (Puffer
A) verdünnt und
wurde unverzüglich
zu ELISA-Platten mit, 96 Vertiefungen mit 0,1 ml pro Vertiefung
gegeben. 0,1–0,2 μg ανβ3 wurde
pro Vertiefung hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert.
Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Vertiefungen einmal mit
Puffer A gespült
und wurden mit 0,1 ml 3,5% . Rinderserumalbumin im gleichen Puffer
für 1 h
bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden
die Vertiefungen vollständig
abgesaugt und zweimal mit 0,2 ml Puffer A gespült.
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In einem kompetitiven [3H]-SK&F-107260-Test
wurden verschiedene Konzentrationen unmarkierter Antagonisten (0,001–100 μM) in die
Vertiefungen gegeben, gefolgt von der Zugabe von 5,0 nM [3H]-SK&F-107260.
Die Platten würden
für 1 h
bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden
die Vertiefungen vollständig
abgesaugt und einmal mit 0,2 ml eiskaltem Puffer A in einer Weise
von Vertiefung zu Vertiefung gespült. Die Rezeptoren wurden mit
0,1 ml 1% SDS solubilisiert, und das gebundene [3H]-SK&F-107260 wurde
durch Flüssig-Szintillationszählung bei
Zugabe von 3 ml Ready Safe in einem Beckman LS 6800 Liquid Scintillation
Counter mit 40%igem Wirkungsgrad bestimmt. Die nicht-spezifische
Bindung von [3H]-SK&F-107260 wurde in Gegenwart von 2 μM SK&F-107260 bestimmt
und war durchgehend weniger als 1% des Gesamtrad oliganden-Eingangs.
Der IC50-Wert
(Konzentration des Antagonisten zur Hemmung von 50% Bindung von
[3H]-SK&F-107260) wurde
durch eine nicht-lineare Kurvenanpassungsroutine der kleinsten Fehlerquadräte bestimmt,
die aus dem LUNDON-2-Programm modifiziert wurde. Der Ki-Wert
(Dissoziationskonstante des Antagonisten) wurde gemäß der Cheng-Prusoff-Gleichung
berechnetr Ki = IC50/(1
+ L/Kd), worin L und Kd die
Konzentration bzw, die Dissoziationskonstante von [3H]-SK&F-10T260 waren.
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Hemmung der RGD-vermittelten
GPIIb-IIIa-Bindung
-
Reinigung von GPIIb-IIIa
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10 Einheiten von zeitlich abgelaufenen,
gespülten
menschlichen Blutplättchen
(erhalten vom Roten Kreuz) wurden durch vorsichtiges Rühren in
3% Octylglucosid, 2-0 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2 bei 4°C
für 2 h
lysiert. Das Lysat wurde mit 100 000 g für 1 h zentrifugiert. Der erhaltene Überstand
wurde auf eine 5 ml Lentil-Lectin-Sepharose-4B-Säule
(E.Y. Labs) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM
NaCl, 2 mM CaCl2, 1% Octylglucosid (Puffer
A) voräquilibriert
worden war. Nach 2 h Inkubation wurde die Säule mit 50 ml kaltem Puffer
A gespült.
Das Lectin-zurückgehaltene
GPIIb-IIIa wurde mit Puffer A eluiert, der 10 % Dextrose enthielt.
Alle Arbeitsgänge
wurden bei 4°C
durchgeführt.
Das erhaltene GPIIb-IIIa war > 95% rein,
wie durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese gezeigt wird.
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Aufnahme von GPIIb-IIIa
in Liposomen
-
Eine Mischung aus Phosphatidylserin
(70%) und Phosphatidylcholin (30%) (Avanti Polar Lipids) wurde an
die Wände
eines Glasröhrchens
unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Gereinigtes GPIIb-IIIa wurde
auf. eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt und mit den Phospholipiden
in einem Protein:Phospholipid-Verhältnis von 1 : 3 (G:G) vermischt.
Die Mischung wurde resuspendiert und in einem Ultraschallbad für 5 min ultraschallbehandelt.
Die Mischung wurde dann über
Nacht unter Verwendung von Dialyseschläuchen mit einer Molekulargewichtskante
von 12,000 bis 14 000 gegen einen 1000-fachen Überschuß von 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,
100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (mit 2 Wechseln)
dialysiert. Die GPIIb-IIIa-enthaltenden Liposome wurden mit 12 000
g für 15
min zentrifugiert und im Dialysepuffer mit einer Protein-Endkonzentration
von ca. 1 mg/ml resuspendiert. Die Liposomen wurden bis zum Bedarf
bei –70°C gelagert.
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Rompetitive Bindung an GPIIb-IIIa
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Die Bindung an den Fibrinogen-Rezeptor
(GPIIb-IIIa) wurde durch ein indirektes kompetitives Bindungsverfahren
unter Verwendung von [3H]-SK&F-107260 als Ligand
vom RGD-Typ untersucht. Der Bindungstest wurde in einem Filtrationsplattenaufbau
mit 96 Vertiefungen (Millipore Corporation, Bedford, MA) unter Verwendung
von hydrophilen 0,22 μm
Durapore-Membranen durchgeführt.
Die Vertiefungen wurden mit 0,2 ml 10 μg/ml Polylysin (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) bei Raumtemperatur für 1 h vorbeschichtet, um die nicht-spezifische
Bindung zu blockieren. Verschiedene Konzentrationen unmarkierter
Benzazepine wurden in die Vertiefungen in 4-facher Ausführung gegeben.
[3H]-SK&F-107260
wurde auf jede Vertiefung in einer End konzentration von 4,5 nM angewendet,
gefolgt von der Zugabe von 1 μg
der gereinigten GPIIb-IIIa-enthaltenden Blutplättchenliposomen. Die Mischungen
wurden für
1 h bei Raumtemperatur nkubiert. Das GPIIb-IIIa-gebundene (3H]-SK&F-107260 wurde
vom ungebundenen durch Filtration unter Verwendung eines Millipore-Filtrationsverteilers
abgetrennt, gefolgt von Spülen
mit eiskaltem Puffer (zweimal, jeweils 0,2 ml). Auf den Filtern verbleibende,
gebundene Radioaktivität
wurde in 1,5 ml Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA)
in einem Beckman Liquid Scintillation Counter (Modell LS6800) mit
40%igem Wirkungsgrad gezählt.
Die nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 2 μM unmarkiertem
SK&F-107260 bestimmt
und war durchgehend weniger als 0,14% der gesamten, zu den Proben
hinzugegeben Radioaktivität.
Alle Datenpunkte sind der Mittelwert von Bestimmungen in 4-facher
Ausführung.
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Die kompetitiven Bindungsdaten wurden
durch ein nicht-lineares Kurvenanpassungsverfahren der kleinsten
Fehlerquadrate analysiert. Dieses Verfahren liefert-den IC50-Wert der Antagonisten (Konzentration des
Antagonisten, die die spezifische Bindung von [3H]-SK&F-1-07260 um 50%
im Gleichgewicht hemmt). Der IC50-Wert steht
mit Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Ki) des Antagonisten auf
der Basis der Cheng-Prusoff-Gleichung in Verbindung: Ki = IC50/(1+L/Kd), worin L die im kompetitiven
Bindungstest verwendete Konzentration von [3H]-SK&F-107260 ist (4,5
nM) und Kd die Dissoziationskonstante von [3H]-SK&F-107260 ist, die
durch Scatchard-Analyse
bestimmt 4,5 nM beträgt.
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Bevorzugte Verbindungen dieser Erfindung
haben eine Affinität
für den
Vitronektin-Rezeptor relativ zum Fibrinogen-Rezeptor von mehr als
10 : 1. Die am meisten bevorzugten Verbindungen haben ein Aktivitätsverhältnis von
größer als
100 : 1.
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Die Wirksamkeit der Verbindungen
dieser Erfindung allein oder in Kombination mit einem antineoplastischen
Mittel kann unter Verwendung verschiedener Modelle von transplantierbarem
Maustumor bestimmt. werden. Siehe US-PSen 5 004 758 und 5 633 016
für Einzelheiten
dieser Modelle.
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Die Beispiele sollen keineswegs den
Umfang dieser Erfindung beschränken,
sondern werden zur Erläuterung
bereitgestellt, wie die Verbindungen dieser Erfindung hergestellt
und verwendet werden. Viele andere Ausführungsformen werden den Fachleuten
leicht ersichtlich sein.
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Beispiele
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Allgemein
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Kernresonanzspektren wurden bei entweder
250 oder 400 MHz unter Verwendung eines Spektrometers Bruker AM
250 bzw. Bruker AC 400 auf gezeichnet. CDCl3 ist
Deuterochloroform, DMSO-d6 ist Hexadeuterodimethylsulfoxid,
und CD3OD ist Tetradeuteromethanöl. Chemische
Verschiebungen werden in Teilen pro Million (δ) feldabwärts vom internen: Standard
Tetramethylsilan angegeben. Abkürzungen
für NMR-Daten
sind wie folgt: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett,
m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletts, dt = Dublett von Tripletts,
app = scheinbar, br = breit. J gibt die in Hertz gemessene NMR-Kopplungskonstante
an. Dauerstrich-Infrarot-(IR)-Spektren wurden an einem Perkin-Eimer
6,83-lnfrarotspektrometer aufgezeichnet, und Fouriertransforrn-Infrarot-(FTIR)-Spektren
wurden an einem Nicolet Impact 400D Infrarot-Spektrometer aufgezeichnet.
IR- und FTIR-Spektren wurden im Transmissionsmodus aufgezeichnet,
und Bandenpositionen werden in reziproken Wellenzahlen (cm-1) angegeben. Massenspektren wurden entweder
an einem VG 70 FE, PE Syx API III oder VG ZAB HF-Instrument unter
Verwendung der Fast Atom Bombardment (FAB) oder Elektrospray-(ES)-Ionisationstechniken
aufgenommen. Elementaranalysen wurden unter Verwendung eines Perkin-Eimer
240C Elementaranalysators erhalten. Schmelzpunkte wurden an einem
Thomas-Hoover-Schmelzpunkt-Bestimmungsapparat
aufgenommen und sind unkorrigiert. Alle Temperaturen werden in Grad
Celsius angegeben.
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Analtech Silica Gel GF und E. Merck
Silica Gel 60 F-254 Dünnschichtplatten
wurden für
die Dünnschichtchromatographie
verwendet. Sowohl Flashals auch Schwerkraft-Chromatograph e wurden
an E. Merck Kieselgel 60 (230-400
mesh) durchgeführt.
Analytische und präparative
HPLC wurden an Raininoder Beckman-Chromatographen durchgeführt. ODS
bezeichnet einen Octadecylsilyl-derivatisierten chromatographischen
Kieselgelträger.
5 μm Apex-ODS
gibt einen Octadecylsilyl-derivatisierten chromatographischen Kieselgelträger mit
einer Teilchen-Nenngröße von 5 μm an, hergestellt
von Jones Chromatography, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ® ist
ein chromatographischer ODS-Träger
und ist ein eingetragenes Warenzeichen von YMC Co. Ltd. Kyoto, Japan.
PRP-1® ist
eine polymerer (Styrol-Divinylbenzol) chromatographischer Träger und ist
ein eingetragenes Warenzeichen von Hamilton Co., Reno, Nevada. Celite® ist,
eine aus säuregewaschener Diatomeenerde
zusammengesetzter Filterhilfsstoff und ist ein eingetragenes Warenzeichen
von Manville Corp., Denver, Colorado.
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Herstellung 1
-
Herstellung von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-carboxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat
-
a) 3-Benzyl-4-(trifluormethansulfonyloxy)anisol
-
Trifluormethansulfonsäureanhydrid
(10,0 ml, 60 mmol) wurde während
3 min zu einer Lösung
aus 2-Benzyl-4-methoxyphenol (10,71 g, 50 mmol, hergestellt gemäß J. Am.
Chem. Soc. 1949, 71, 64) und wasserfreiem 2,6-Lutidin (12,0 ml,
100 mmol) in wasserfreiem CH2Cl2 (250
ml) bei –78°C unter Argon
gegeben. Die Reaktion wurde bei –78°C für 0,5 h gerührt und dann auf RT erwärmt. Nach
1 h wurde die Reaktion mit Hexan (250 ml) verdünnt und nacheinander mit 1,0
N HCl (2 × 100
ml), 1,0 N NaOH (2 × 50
ml), H2O (100 ml) und Kochsalzlösung (50
ml) gewaschen. Trocknen (Na2SO4),
Aufkonzentrieren und Kieselgel-Chromatographie (10% EtOAc/Hexan)
ergab die Titelverbindung als hellgelben Feststoff (16,65 g, 96%):
DC
Rf 0,51 (10% EtOAc/Hexan);
1H-NMR (250. MHz, CDCl3) δ 7,10 – 7,40 (m,
6H), 6,77 (dd, J = 9,0, 3,1Hz, 1H); 6,66 (d; J = 3,1Hz, 1H), 4,03 (s,
2H), 3,73 (s, 3H);
FTIR (CCl4) 1492,
1423, 1405, 1249, 1216, 1161, 1144, 1039, 869 cm–1;
MS,(ES)
m/e 369 (M + Na)+, 364,0 (M + NH4)+, 347,0 (M + H)+.
-
b) 4-Allyl-3-benzylanisol
-
LiCh (3,08 g, 72,8 mmol) in einem
Rundkolben wurde im Hochvakuum feuergetrocknet, und man ließ das System
unter Argon auf RT, abkühlen.
3-Benzyl-4-(trifluormethansulfonyloxy)anisol (21,0 g, 60,6 mmol), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid
(2,13 g, 3,0 mmol), wasserfreies DMF (150 ml) und Allyltributylzinn (22,6
ml, 72,8 mmol) wurden hinzugegeben, und die Mischung wurde mit Argon
durch drei Zyklen von Evakuierung/Argonspülung gespült. Die Mischung wurde in einem
auf 95°C
voreingestellten Ölbad
erwärmt,
was eine gelbe homogene Lösung
lieferte. Nach 1,5 h wurde die dunkle Mischung an einem Rotationsverdampfer (Hochvakuum)
aufkonzentriert, und der Rückstand
wurde aus Xylolen erneut auf konzentriert. Der resultierende Rückstand
wurde in Et2O (12-0 ml) aufgenommen und
kräftig
mit l0%igem KF (120 ml) für
0,5 h gerührt.
Die Schichten wurden getrennt, und. die wäßrige Schicht wurde mit Et2O (2 × 120
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Anteile wurden durch
Celite® zur
Entfernung der unlöslichen
Feststoffe filtriert, und das Filtrat wurde nacheinander mit H2O (60 ml) und Kochsalzlösüng (60 ml) gewaschen. Trocknen
(MgSO4) und Aufkonzentr eren ließ ein trübes gelbes Öl zurück. Chromatographie
(Kieselgel, 5% EtOAC/Hexan) ergab die Titelverbindung als hellgelbes Öl (14,21
g, 98%):
DC Rf 85% (5% EtOAc/Hexan)
0,51;
1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,03–7,31 (m,
6H), 6,74 (dd, J = 8,3, 2,7Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,7Hz, 1H), 5,79–5,98 (m,
1H), 4,89–5,07
(m, 2H), 3,97 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,21–3,33 (m, 2H); FTIR (CCl4) 1610, 1496, 1256, 1046, 914 cm -1;
MS (ES) m/e 239,2 (M + H)+.
-
c) 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure
-
Eine Lösung aus H5IO6 (23,83 g, 104,5 mmol) in H2O
(56 ml) wurde zu einer Lösung
aus 4-Allyl-3-benzylanisol (5,30 g, 22,24 mmol) in CCl4 (28
ml ), und CH3CN (28 ml) gegeben, und die
gut gerührte
Mischung wurde sorgfältig
auf 0°C
gekühlt.
RuCl3 (231 mg, 1,11 mmol) wurde hinzugegeben,
und die Reaktion wurde kräftig
bei 0°C
für 4 Stunden
gerührt
und dann bei RT für
45 min. Die Mischung wurde durch Celite® filtriert, und
das Filterkissen wurden mit CH2Cl2 (120 ml) und dann mit H2O
(120 ml) gewaschen. Die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht
wurde mit CH2Cl2 extrahiert
(3 × 120
ml). Trocknen (Na2SO4)
und Aufkonzentrieren ließ ein
braunes Öl
zurück.
Dieses wurde zwischen Et2O (90 ml) und 0,25
N NaOH (90 ml)-partitioniert, und die Schichten wurden getrennt.
Die Et2O-Schicht wurde mit 0,25 N NaOH extrahiert
(2 × 10
ml), und die vereinigten wäßrigen Schichten
wurden mit konzentriertem HCl angesäuert (pH 2). CH2Cl2-Extraktion, Trocknen (Na2SO4) und Aufkonzentrieren ergab die Titelverbindung
als gelbes Öl,
das sich zu einem gelben Feststoff verfestigte (4,19 g, 74%):
1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,05–7,35 (m,
6H), 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,7Hz, 1H), 4,00
(s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (s, 2H);
FTIR (CCl4)
2300–3500
(breit), 1710, 1611, 1502, 1496, 1285, 1257, 1045 cm -1;
MS
(ES} m/e 279,0 (M + Na)+, 274 (M + NH4)+, 257,0 (M + H)+.
-
d) 3-Methoxy-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-10(11H)-on
-
Feingepulverte 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure (3,26
g, 12,72 mmol) wurde zu gut gerührter
Polyphosphorsäure
(165 g) bei 100–110°C gegeben.
Nach 15 Minuten wurde die Reaktion auf Eis (330 g) gegossen. Et2O (330 ml) wurde hinzugegeben, und die Mischung
wurde kräftig
für 15
min gerührt.
Die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit Et2O (330 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen
Schichten wurden mit 5%igem NaHCO3 (2 × 80 ml),
dann mit Kochsalzlösung
(80 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und
auf konzentriert. Der Rückstand
wurde aus Toluol erneut aufkonzentriert und dann chromatographiert
(Kieselgel, 20% EtOAc/Hexan). Die Titelverbindung wurde als gelber
Feststoff erhalten (1,44 g, 48%):
DC Rf (20%
EtOAc/Hexan) 0,46; 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,07–8,15 (m,
1H), 7,39–7,49
(m, 1H), 7,25–7,48
(m, 2H), 7,19 (d, J = 8,3Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,71
(dd, J = 8,3, 2,6Hz, 1H), 4,21 (s, 2H), 4,11 (s, 2H), 3,77 (s, 3H);
FTIR
(CCl4) 1680, 1501, 1282, 1270 cm-1;
MS (ES) m/e 261 (M + Na)+, 256,0 (M + NH4)+, 239,0 (M + H)+.
-
e) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-l0-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cycloheptten-10-acetat
-
Wasserfreies EtOAc (0,58 ml, 6,6
mmol) wurde zu einer Lösung
aus Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (1,0 M in THF, 6 ml, 6 mmol)
in trockenem THF (24 ml) in einem feuergetrocknetem Kolben bei –78°C unter Argon ge-
tropft. Die gelbe Lösung
wurde bei –78°C für 0,5 h
gerührt,
dann wurde eine Lösung
aus 3-Methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10(11H)-on (715 mg, 3 mmol)
in trockenem THF (3 ml) während
3 min hinzugetropft. Zusätzliches
trockenes THF (0,4 ml) wurde bei der Übertragung verwendet. Nach
0,5 h bei –78°C wurde die Reaktion
mit gesättigtem
NH4Cl (15 ml)-gelöscht, auf RT erwärmt und
mit EtOAc extrahiert (2 × 30
ml). Trocknen (MgSO4), Aufkonzentrieren
und Chromatographie (Kieselgel, 10% EtOAc/Hexan (400 ml), dann 20% EtOAc/Hexan)-ergab
gewonnenes 3-Methoxy-6H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10(11H)on (305,4
mg, 43 %) als gelben Feststoff, gefolgt von der Titelverbindungals
hellgelbes Öl
(531,9 mg, 54%):
DC Rf 0,37 (20% EtOAc/Hexan);
1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,63 (d,
J = 7,7Hz, 1H), 7,00–7,30
(m, 4H), 6,80 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,69 (dd, J = 8,2, 2,6Hz, 1H),
3,95–4,35
(m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 1H), 3,64 (d, J =
14,2Hz, 1H), 3,35 (d, J = 14,2Hz, 1H), 2,79 (d, J = 16,0Hz, 1H),
2,66 (d, J = 16,0Hz, 1H), 1,22 (t, J = 7,2Hz, 3H);
FTIR (CCl4) 3580 (scharf), 3509 (breit), 1735, 1715,
1503, 1261, 1198, 1156, 1044 cm-1;
MS
(ES)m/e 675,2 (2M + Na)+, 653,2 (2M + H)+.
-
f) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat.
-
10% Pd/C (242 mg, 0,23 mmol) wurde
zu einer Lösung
aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
(741,1 mg, 2,27 mmol) und konz. HCl (0,19 ml, 2,27 mmol) in Eisessig
(23 ml) gegeben, und die Mischung wurde auf einer Parr-Vorrichtung
bei RT unter H2 (50 psi) geschüttelt. Nach
6 h wurde die Reaktion durch Celite® filtriert,
und das Filterkissen wurde mit EtOAc gewaschen. Das Filtrat wurde
auf konzentriert, und der Rückstand
wurde aus Toluol erneut auf konzentriert. Der resultierende schwachgelbe ölige Rückstand
wurde chromatographiert (Kieselgel, 20% EtOAc/Hexan), um die Titelverbindung
als farbloses Öl
zu ergeben (643,6 mg, 91%):
DC Rf 0,57
(20% EtOAc/Hexan);
1H-NMR (250 MHz,
CDCl3) δ 7,05–7,22 (m,
4H), 7,01 (d, 1 = 8,2Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,7Hz, 1H), 6,67 (dd,
J = 8,2, 2,7Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,0Hz, 1H), 4,11–4,25 (m,
2H), 3,85 (d; J = 15,0Hz, 1H), 3,70–3,90 (m, 1H), 3,77 (s, 3H),
3,31 (dd, J = 15,0, 4,1Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2Hz, 1H),
2,64 (dd, J = 15,6, 5,0Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,3Hz, 1H),
1,27 (t, J = 7,1Hz, 3H);
FTIR (CCl4)
1734, 1611, 1504, 1285, 1263, 1155, 1044 cm -1;
MS
(ES)m/e 333,0 (M + Na)+, 328,0 (M + NH4)+, 311,0 (M + H)+, 265,0 (M + H - EtOH)+.
-
g) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Wasserfreies AlCl3 (1,38
g, 10,35 mmol) wurde auf einmal zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (643,6 mg,
2,07 mmol) in wasserfreiem CH2Cl2 (21 ml) bei 0°C unter Argon gegeben. Die gelbe
Lösung
wurde auf RT erwärmt
und für
3 h gerührt,
dann auf 0°C
abgekühlt
und mit kaltem 3 N HCl (10 ml) gelöscht. Die Schichten wurden
getrennt; und die wäßrige Schicht
wurde mit CH2Cl2 extrahiert.
Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO4) und aufkonzentriert: Kieselgel-Chromatographie
(25% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als fast farbloses Öl (611,7 mg,
100%):
DC Rf 0,26 (20% EtOAc/Hexan);
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,03–7,22 (m,
4H), 6,93 (d, J = 8,1Hz, 1H), 6,69 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,58 (dd,
J = 8,1, 2,6Hz, 1H), 5,00 (s, 1H), 4,25 (d; J = 14,9Hz, 1H), 4,11–4,25 (m,
2H), 3,73–3,88
(m, 1H), 3,79 (d, J = 14,9Hz, 1H), 3,28 (dd, J = 15,0, 4,1Hz, 1H),
2,91 (dd, J = 15,0, 9,3Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,6, 4,9Hz, 1H),
2,53 (dd, J = 15,6, 9,5Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H);
FTIR
(CCl4) 3611 (scharf), 3447 (breit), 1734,
1504, 1291, 1272, 1176, 1152 cm-1;
MS
(ES) m/e 314,2 (M + NH4)+,
297,2 (M + H)+.
-
h) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-(trifluormethansulfonyloxy)-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat
-
Trifluormethansulfonsäureanhydrid
(0,45 ml, 2,68 mmol) wurde zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat (611,7 mg,
2,06 mmol) und 2,6-Lutidin (0,48 ml, 4,12 mmol) in wasserfreiem
CH2Cl2 (10,3 ml)
bei –78°C unter Argon
getropft. Nach 0,5 h wurde die Reaktion auf RT erwärmt und
für 1 h
gerührt.
Die gelbe Lösung
wurde mit Et2O (50 ml) verdünnt und
nacheinander mit 1,0 N HCl (5 ml), 5%igem NaHCO3 (5
ml) und Kochsalzlösung
(5 ml) gewaschen. Trocknen (MgSO4), Aufkonzentrieren
und Kieselgel-Chromatographie (20% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung
als farbloses Öl
(808,9 mg, 92%}.
DC Rf(20% EtOAc/Hexan)
0,58;
1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 6,98–7,30 (m,
7H), 4,35 (d, J = 15,2Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1Hz, 2H), 3,91 (d,
J = 15,2Hz, 1H), 3,78–3,95
(m, 1H), 3,37 (dd, J = 15,2, 4,1Hz, (H), 3,02 (dd, J = 15,2, 9,6Hz,
1H), 2,70 (dd, J = 15,8, 4,8Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,6Hz,
1H), 1,27 (t, J = 7,1Hz, 3H);
FTIR (CCl4)
1735, 1493; 1427, 1250, 1215, 1144, 961, 856 cm-1;
MS
(ES) m/e 451,1 (M + Na)+, 446,2 (M + NH4)+, 429,2 (M + H)+.
-
i) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-carboxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-(trifluormethansulfonyloxy)-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat
(808,9 mg, 1,89 mmol), KOAc (742 mg, 7,56 mmol), Pd(OAc)2 (21,2 mg, 0,095 mmol), 1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocen
(210 mg, 0,38 mmol) und wasserfreiem DMSO (11 ml) wurde mit Kohlenmonoxid gespült (drei
Zyklen von Evakuierung/CO-Spülung, gefolgt
von Durchblasen von CO durch die Mischung für 5 min), dann wurde unter
einem CO-Ballon in einem auf 70°C
eingestellten Ölbad
gerührt.
Nach 3,5 h wurde die Reaktion mit H2O (11
ml) verdünnt,
auf 0°C
abgekühlt
und mit 1,0 N HCl (ca. 8 ml) angesäuert. CH2Cl2-Extraktion (3 × 30 ml), Trocknen (Na2SO4), Aufkonzentrieren
und erneutes Aufkonzentrieren aus Toluol ließ eine rötlich orangefarbene Flüssigkeit
zurück
(2–3 ml).
Chromatographie (Kieselgel, 3 : 2 : 0,1, EtOAc/Toluol/AcOH; gemischte
Fraktionen erneut mit 1 : 1 : 0,1 EtOAc/Toluol/AcOH) ergab die Tite1verbindung
(581,9 mg, 95%) als viskoses gelbes Öl, das im Hochvakuum bei 40°C teilweise
kristallisierte:
DC Rf (3 : 2 : 0,1 EtOAc/Toluol/AcOH) 0,60;
1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,95 (d;
J = 1,5Hz, 1H), 7,87 (dd, J = 7,8, 1,5Hz, 1H), 7,00–7,35 (m,
5H), 4,40 (d, J = 15, 2Hz, 1h), 4,19 (q, J = 7,1Hz, 2H), 3,97 (d,
J = 15,2Hz, 1H), 3,82–4,00
(m, 1H), 3,43 (dd, J = 15,3, 4,0Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 15,3, 9,5Hz,
1H), 2,69 (dd, J = 15,8, 4,8Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,5Hz,
1H), 1,28 (t, J = 7,1Hz, 3H);
FTIR (CCl4)
2357–3378
(breit), 1735, 1692, 1280 cm-1;
MS
(ES) m/e 342,2 (M + NH4)+,
325,2 (M + H)+, 307,2 (M + H-H2O)+.
-
Herstellung 2
-
Herstellung von Ethyl-2-carboxy-10,11-dihydro-5H=dibenzo[a,d]cycloheptenyl-10-acetat
-
a) Methyl-2-benzoyl-5-methoxyphenylacetat
-
Methyl-3-methoxy-phenylacetat wurde
mit Benzoylchlorid und Aluminiumchlorid wie in J. Chem. Soc., Perkin
Trans I, 1991, 171 beschrieben behandelt, um die Titelverbindung
zu ergeben.
-
b) Methyl-2-benzyl-5-methoxyphenylacetat
-
Die Verbindung der Herstellung 2(a)
wird mit Natriumborhydrid und Trifluoressigsäure in Dichlormethan gemäß dem allgemeinen
Verfahren von Synthesis 1978, 763 behandelt, um die Titelverbindung
zu ergeben.
-
c) 2-Benzyl-5-methoxyphenylessigsäure
-
Die Verbindung der Herstellung 2(b)
wird mit wäßrigem Natriumhydroxid
und Methanol behandelt und gerührt.
Die Mischung wird auf konzentriert und mit verdünnter Salzsäure behandelt, um die Titelverbindung zu
ergeben.
-
d) 5,11-Dihydro-2-methoxy-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
Die Verbindung aus Herstellung 2(c)
wird zu einer Mischung aus Phosphorsäure und Phosphorpentoxid gegeben,
gerührt
und auf 80°C
erwärmt
gemäß dem allgemeinen
Verfahren von
US-PS 3 567
730 , um die Titelverbindung zu ergeben.
-
e) 5,11-Dihydro-2-hydroxy-l0H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
Die Verbindung aus Herstellung 2(d)
wird mit Ethanthiol und Aluminiumchlorid gemäß dem allgemeinen Verfahren
von Tetrahedron Letters 1978, 5211 behandelt, um die Titelverbindung
zu ergeben.
-
f) 5,11-Dihydro-2-(trifluormethansulfonyl)oxy-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
Die Verbindung aus Herstellung 2(e)
wird mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid
gemäß dem allgemeinen
Verfahren von J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 904 behandelt,
um die Titelverbindung zu ergeben:
-
g) 5,11-Dihydro-2-methoxycarbonyl-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
Die Verbindung aus Herstellung 2(f)
wird mit Kohlenmonoxid, Methanol, Palladiumacetat und 1,3-Bis(diphenylphosphino)propan
in Dimethylsulfoxid gemäß dem allgemeinen
Verfahren von J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 904 behandelt,
um die Titelverbindung au ergeben.
-
h) 5,11-Dihydro-2-carboxy-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
Die Verbindung aus Herstellung 2(g)
wird mit verdünntem
wäßrigem Natriumhydroxid
behandelt. Die Mischung wird mit verdünnter Salzsäure behandelt, um die Titelverbindung
zu ergeben.
-
i) 5,11-Dihydro-2-tert-butoxycarbonyl-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
Die Verbindung aus Herstellung 2(h)
wird mit N,N-Dimethylformam d-ditert-butylacetal gemäß dem allgemeinen
Verfahren von Synthesis 1983, 2, 135 behandelt, um die Titelverbindung
zu ergeben.
-
j) Ethyl-2-tert-butoxycarbonyl-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Die Verbindung aus Herstellung 2(i)
wird mit Zinkpulver und Ethylbromacetat gemäß dem allgemeinen Verfahren
von Org. Reactions 1947, 1, 1 und J. Am. Chem. Soc., 1938, 60, 2947
behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
-
k) Ethyl-2-carboxy-5H-dibenzo[a,d]cyalohepten-10-acetat
-
Die Verbindüng aus Herstellung 2(j) wurde
mit Trifluoressigsäure
in Dichlormethan behandelt und gerührt. Die Mischung wird auf
konzentriert, um die Titelverbindüng zu ergeben.
-
Herstellung 3
-
Herstellung von 2-[(2-Aminoethyl)aminoppyridindihydrochlorid
-
a) Mono-Boc-1,2-ethylendiamin
-
Eine Lösung aus Di-tert-butyldicarbonat
(10,91 g, 50 mmol) in CH2Cl2 (50
ml) wurde während
30 min zu einer kräftig
gerührten
Lösung
aus 1,2-Ethylendiamin (33 ml, 500 mmol) in CH2Cl2 (250 ml) bei 0°C unter Argon getropft. Während der
Zugabe trennte sich eine Ausfällung
ab. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktion auf RT erwärmt, für 1 h gerührt und
am Rotationsverdampfer auf konzentriert. Der Rückstand wurde in H2O
(100 ml) aufgenommen und filtriert, um eine kleine Menge von unlöslichem
Material zu entfernen. Das Filtrat wurde mit CH2Cl2 gewaschen (3 × 100 ml), und die vereinigten
organischen Anteile wurden getrocknet (MgSO4)
und auf konzentriert, um die Titelverbindung (6,00 g, 75%) als trübe Flüssigkeit
zu ergeben:
1H-NMR (250,CDCl3) δ 4,75–5,00 (m,
1h}, 3,05–3,25
(m, 2H), 2,65 – 2,85
(m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,12 (br s, 2H),
-
b) 2-[[2-(Boc-amino)ethyl]amino]pyridin-N-oxid
-
Eine Mischung aus Mono-Boc-1,2-Ethylendiamin
(5,83 g, 36,39 mmol), 2-Chlorpyridin-N-oxidhydrochlorid (7,25 g,
43,67 mmol), NaHCO3 (15,29 g, 182 mmol)
und tert-Amylalkohol (36 ml) wurde zum Rückfluß erwärmt. Nach 47 h wurde die dunkelbraune
Mischung abgekühlt,
mit CH2Cl2 (100
ml) verdünnt
und abgenutscht, um unlösliche
Stoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde auf konzentriert und aus
Toluol erneut aufkonzentriert. Kieselgel-Chromatographie (10% MeOH/CHCl3) ergab unreine Titelverbindung (8,23 g,
89%) als gelben Feststoff, der ohne weitere Reinigung verwendet
wurde:
DC (10% MeOH/CHCl3) Rf 0,42;
1H-NMR
(250, CDCl3) δ 8,16 (dd, J = 6,5, 1,3Hz, 1H),
7,05–7,30
(m, 2H), 6,68 (br d, J = 8,6Hz, 1H), 6,50–6,65 (m, 1H), 5,70–5,95 (m,
1H), 3,25–3,60
(m, 4H), 1,44 (s, 9H);
MS (ES) m/e 254 (M + H)+.
-
c) 2-[[2-(Boc-amino)ethyl]amino]pyridin
-
10% Pd/C (106,4 mg, 0,10 mmol) wurde
zu einer Lösung
aus 2-[[2-(Bocamino)ethyl]amino]pyridin-N-oxid (126,7 mg, 0,5 mmol)
und Cyclohexen 0,25 ml, 0,25 mmol) in absolutem Ethanol (5 ml )
gegeben, und die Mischung. wurde zum Rückfluß erwärmt. Nach 16 h wurde die Reaktion
durch Celite® filtriert,
und das Filtrat wurde aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit dem aus einer
separaten Herstellung (Maßstab
0,5 mmol) erhaltenen Rückstand
vereinigt, und die vereinigten Stoffe wurden durch Kieselgel-Chromatographie (5%
MeOH/CHCl3) gereinigt. Die Titelverbindung
(148,4 mg; 63% auf Basis von 1 mmol 2-[[2-(Boc-aminö)ethyl]amino]pyridin-N-oxid)
wurde als gelbes Öl
erhalten:
DC (5% MeOH/CHCl3) Rf 0,43;
1H-NMR
(400, CDCl3) δ 8,05–8,12 (m, 1H), 7,37–7,46 (m,
1H), 6,53–6,61
(m, 1H), 6,41 (d, J = 8,3Hz; 1H), 5,12 (br s, 1H), 4,86 (br s, 1h),
3,26 = 3,51 (m, 4H), 1,44 (s, 9H);
MS (ES) m/e 238 (M + H)+.
-
d) 2-[(2-Aminoethyl)amino]pyridindihydrochlorid
-
4N HCl in Dioxan (3,2 ml) wurde in
einem Strom zu einer Lösung
aus 2-[[2-(Boc-amino)ethyl]amino]pyridin (148,4 mg, 0,63 mmol) in
wasserfreiem CH2Cl2 (3,2
ml) bei 0°C
gegeben, dann wurde die Reaktion auf RT erwärmt. Nach 2 h wurde die Mischung
abgenutscht, um den ausgefällten
Feststoff aufzusammeln, der mit wasserfreiem Et2O
gewaschen und getrocknet wurde, um die Titelverbindung (132,8 mg,
quantitativ) als gelben Feststoff zu, ergeben:
1H-NMR
(400, CD3OD) δ 7,99–8,07 (m, 1H), 7,92–7,98 (m,
1H), 7,19 (d, J = 9,1Hz, 1H), 6,98–7,04 (m, 1H), 3,76 (t, J =
6,2Hz, 2H), 3,27 (t, J = 6,2Hz, 2H, teilweise verdeckt durch Restlösungsmittel-Signal);
MS
(ES) m/e 138 (M + H)+.
-
Herstellung 4
-
Herstellung von 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
-
a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
-
Eine Mischung aus 2-Chlorpyridin-N-oxid
(16,6 g, 0,1 mol), 3-Amino-1-propanol (15,3 ml, 0,2 mol), NaHCO3 (42 g, 0,5 mol) und tert-Amylalkohol (100
ml) wurde zum Rückfluß erwärmt. Nach
21 h wurde die Reaktion abge kühlt,
mit CH2Cl2 (300
ml) verdünnt
und abgenutscht, um unlösliche
Stoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde auf konzentriert und erneut
aus Toluol aufkonzentriert, wobei ein gelbes Öl zurückblieb. Kieselgel-Chromatographie
(20% MeOH/CHCl3) ergab die Titelverbindung
(15,62 g, 93%) als gelben Feststoff:
DC (20% MeOH/CHCl3) Rf 0,48;
1H-NMR (250, CDCl3) δ 8,07 (dd,
J = 6,6, 1,2Hz, 1H), 7,34 (br t, 1H), 7,10–7,30 (m, 1H), 6,64 (dd, J
= 8,5, 1,4Hz, 1H), 6,40–6,60
(m, 1H), 4,49 (br s, 1H), 3,65–3,90
(m, 2H), 3,35–3,60
(m, 2H), 1,75–2,00,(m,
2H);
MS (ES) m/e 169 (M + H)+.
-
Herstellung 5
-
Herstellung von 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid
-
a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid
-
Gemäß dem Verfahren von Herstellung
12, außer
daß 2-Chlorpyridin-Noxidhydrochlorid
gegen 2-Chlor-4-nitropyridin-N-oxid ausgetauscht wurde (siehe Ja
n, P.C.; Catterjee, S.K.; Anand, N., Indian Journal of Chemistry
1966, 403), wurde die Titelverbindung als orangefarbener Feststoff
hergestellt:
MS (ES) m/e 214,2 (M + H)+.
-
Herstellung 6
-
Herstellung von 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid
-
a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid
-
Gemäß dem Verfahren von Herstellung
12, außer
daß 2-Chlorpyridin-Noxidhydrochlorid
gegen 2-Chlor-4-methylpyridin-N-oxid ausgetauscht wurde (siehe Brown,
E.V., J. Amer. Chem. Soc. 1957, 79, 3565), wurde die Titelverbindung
als cremefarbener Feststoff hergestellt:
MS (ES) m/e 183 (M
+ H)+.
-
Herstellung 7
-
Herstellung von 2-(Ethylamino)-6-pyridylethanol
-
a) 2-(N-Boc-amino)-6-picolin
-
Zu einer gerührten Lösung aus 2-Amino-6-picolin
(4,33 g, 40 mmol), Et3N (6,2 ml, 40 mmol)
und CH2Cl2 (50 ml)
bei 0°C
wurde Di-tert-butyldicarbonat (9,6 g, 44 mmol) gegeben. Nach Rühren über RT über Nacht
wurde die Reaktionsmischung im Vakuum auf konzentriert, mit H2O verdünnt
und mit CH2C12 (2 × 50 ml)
extrahiert. Trocknen (MgSO4) und Aufkonzentrieren
ergab die Titelverbindung als farbloses Öl: MS (ES) m/e 209 (M + H)+.
-
b) 2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-picolin
-
Zu einer Suspension aus NaH (60%ige
Dispersion in Mineralöl,
1,15 g, 29,5 mmol) in DMF (50 ml) bei 0°C wurde eine Lösung aus
2-(N-Boc-amino)-6-picolin
in DMF (30 ml) gegeben. Die Reaktion wurde bei 0°C für 15 min gerührt; dann
wurde Ethyliodid (4,6 g, 30 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung
wurde bei RT über
Nacht gerührt;
dann wurde sie im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit H2O verdünnt und
mit CH2Cl2 (3 × 50 ml)
extrahiert. Trockenen (MgSO4), Aufkonzentrieren
und Kieselgel-Chromatographie (20%
EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als farbloses Öl:
MS
(ES) m/e 237 (M + H)+.
-
c) Ethyl-2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-pyridylacetat
-
LDA (0,018 mol) wurde in THF (30
ml) hergestellt, auf –78°C gekühlt und
mit 2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-picolin (3,5 g, 15 mmol) versetzt,
wodurch eine tiefrote Lösung
gebildet wurde. Nach 15 min wurde Diethylcarbonat (2,2 ml, 17,9
mmol) hinzugegeben, die burgunderfarbene Lösung wurde bei –78°C für weitere
15 min gerührt,
dann wurde die Reaktion mit gesättigtem
NH4Cl gelöscht. Die Mischung wurde, auf
RT erwärmt und
mit EtOAc extrahiert (3 × 30
ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen,
getrocknet (MgSO4) und aufkonzentriert.
Kieselgel-Chromatographie
(10% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als farbloses Öl:
MS
(ES) m/e 309 (M + H}+.
-
d) Ethyl-2-(ethylamino)-6-pyridylacetat
-
Eine Lösung aus Ethyl-2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-pyridylacetat
(1,5 g, 4,87 mmol) und 4 M HCl/Dioxan (5 ml, 20 mol) wurde bei RT über Nacht
gerührt
und dann aufkonzentriert. Erneutes Aufkonzentrieren aus Toluol ergab
die Titelverbindung als weißen
Feststöff:
MS
(ES) m/e 209 (M + H)+.
-
e) 2-(Ethylamino)-6-pyridylethanol
-
Zu einer mechanisch gerührten Lösung aus
LiAlH4 in THF (1,0 M, 20 ml, 20,4 mmol)
wurde eine Lösung
aus Ethyl-2-(ethylamino)-6-pyridylacetat (1 g, 4,1 mmol) in THF
(30 ml) getropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung
zum Rückfluß erwärmt. Nach
5 h wurde die Reaktion auf 0°C
abgekühlt und
mit 10%iger NaOH-Lösung
gelöscht.
Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt, und das Filtrat
wurde im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in CH2Cl2 gelöst, und
die Lösung
wurde getrocknet (MgSO4) und aufkonzentriert.
Erneutes Aufkonzentrieren aus Toluol (3x) ergab die Titelverbindung
als farbloses Öl:
MS
(ES) 167 (M + H)+.
-
Herstellung 8
-
Herstellung von 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
a) 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure
-
Eine Lösung aus 2-Benzoyl-4-methoxyphenylessigsäure (13,0
g, 0,048 mol), hergestellt durch das Verfahren von J. Med. Chem.
1981, 24, 998, in Eisessig (600 ml) wurde unter Argon mit 4,3 g
10% Pd/C behandelt und bei 50 psi für 17 Stunden hydriert. Die
Mischung wurde unter Verwendung von Celite® filtriert,
und das Filtrat wurde auf konzentriert und erneut aus Toluol und
Methylenchlorid auf konzentriert, um 14,2 g der Titelverbindung
zu ergeben:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3,52
(s, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,0 (s, 3H.), 6,7 (m, 2A), 7,15 (m, 6H).
-
b) 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
-
Eine Lösung aus 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure (14,2
g, 0,055 mol) in Benzol (120 ml) und Thionylchlorid (28 ml) wurde
für 1 Stunde
zum Rückfloß erwärmt und
auf konzentriert. Das Säurechlorid
wurde in trockenem Methylenchlor d (40 ml) gelöst, und die Lösung wurde
unter Argon zu einer Lösung
aus AlCl3(14,7 g, 0,11 mol) in Methylenchlorid
(600 ml) getropft. Die Reaktion wurde unter einer Argonatmosphäre für 2,5 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt
und dann mit Eiswasser (200 ml) gelöscht. Die Schichten wurden
getrennt, und die organische Phase wurde nacheinander mit 10%iger
NaOH-Lösung,
Wasser und verdünntem HCl
gewaschen. Die resultierende Lösung
wurde mit Ether (200 ml) verdünnt, über MgSO4 getrocknet und auf konzentriert. Der feste
Rückstand
wurde mit Ether/Hexan (1 : 1) verrieben, und 9,35 g der Titelverbindung
wurden durch Filtration aufgefängen:
Smp. 105-106°Cp
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3,72 (s,
3H), 4,1 (s, 2H); 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, 1H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (m,
4H), 8,1 (d, 1H).
-
Herstellung 9
-
Herstellung von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
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a) Ethyl-(±)-3-(3-methoxyphenyl)indenacetat
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Zu einer kalten Lösung aus 3-(3-Methoxyphenyl)inden
(4 g, 18 mmol), hergestellt durch das Verfahren von J. Med. Chem.
1981, 24, 998, in THF (15 ml) bei 0°C wurde eine Lösung aus
LiN(TMS)2 (20 ml, 1 M in THF) während 5
min getropft. Die resultierende Lösung wurde zu einer Lösung aus
Ethylbromacetat (3,34 g, 20 mmol) in THF (15 ml) bei –78°C während 30
min getropft. Nach 2,5 h wurde die Mischung mit gesättigter Ammoniumchlorid- Lösung gelöscht, und die Schichten wurden
getrennt. Die organische Schicht wurde über MgSO4,
getrocknet und aufkonzentriert, um das Rohprodukt zu ergeben, das
durch Säulenchromatographie gereinigt
wurde (Sio2/2–4%
EtOAc/Hexan), um die Titelverbindung (1,1 g) zu ergeben:
1H-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ 1,30 (t, 3H), 2,50 (m, 1H),
2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 6,6 (s, 1H),
6,9 (m, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 6H).
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b) Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzoyl)]phenylsuccinat
-
Eine Lösung aus Ethyl-(±)-3-(3-methoxyphenyl)indenacetat
(1,1 g, 3,6 mmol) in Aceton (30,ml) wurde mit 4%iger wäßriger Osmiumtetroxid-Lösung (0,5
ml) behandelt, gefolgt von tropfenweiser Zugabe von 1,2 M Jones-Reagens (5 ml, 6
mmol) gemäß dem Literaturverfahren
(J. Org. Chem. 1993, 58, 4745}. Nach Rühren Über Nacht bei Raumtemperatur
wurde die dunkle Reaktionsmischung mit Isopropanol (2,5 ml) gelöscht, gefolgt
von Natriumbisulfit (0,9 g) und Wasser (30 ml). Das Produkt wurde
mit Ethylacetat extrahiert, mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und auf konzentriert, um einen
festen Rückstand
zu ergeben. Verreiben mit 1 : 1 Ether/Hexan ergab 0,76 g der Titelverbindung:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,18 (t,
3H), 2,90 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,1
(q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m, 6H).
-
c) Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzyl)]phenylsuccinat
-
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzoyl)]phenylsuccinat
(0,76 g, 2,1 mmol) und 10% Pd/C (0,6 g) in Eisessig (35 ml) wurde
bei 50 psi für
17 Stunden hydriert: Die Mischung wurde unter Verwendung von Celite® filtriert,
und das Filterkissen wurde mit Essigsäure gewaschen. Das Filtrat
wurde aufkonzentriert und erneut aus Toluol und Methylenchlorid
aufkonzentriert, um 0,65 g der Titelverbindung zu ergeben:
1H-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ 1,20 (t, 3H), 2,20 (m, 1H),
3,0 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H),
6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).
-
d) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-11-oxo-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Zu einer magnetisch gerührten Lösung aus
Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzyl)]phenylsuccinat
(0,65 g, 1,9 mmol) in trockenem Methylenchlorid (10 ml) wurden DMF
(0,2 ml) und Oxalylchlorid (0,2 ml, 2,28 mmol) gegeben. Nach 1,5
h. wurde die Lösung
zu einer Suspension aus Aluminiumchlorid (0,6 g, 4,5 mmol) in trockenem
Methylenchlorid (15 ml) getropft. Die Mischung wurde nach 2 h mit
Eiswasser gelöscht,
die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit Methylenchlorid
extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über MgSO4 getrocknet und aufkonzentriert. Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatographie
gereinigt (SiO2/2–4% EtOAc/Hexan), um die Titelverbindung
(0,3 g) zu ergeben:
1H-NMR (400 MHz,
CDCl3) δ 1,28
(t, 3H), 2,88 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,88 (d, 1H),
4,18 (q, 2H), 4,85, (d, 1H), 4,95 (m, 1H), 5,8, (m, 2H), 7,22 (m,
4H), 8,1 (s, 1H).
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e) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-3H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
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Eine Mischung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-11-oxo-5Hd
benzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (0,3 g, 0,93 mmol) und 10% Pd/C
(0,3 g) in Eisessig (25 ml) wurde bei 50 psi für 18 Stunden hydriert. Die
Mischung wurde unter Verwendung von Celite® filtriert
und mit Essigsäure
gewaschen. Das Filtrat wurde aufkonzentriert und erneut aus Toluol
und Methylenchlorid aufkonzentriert, um 0,25 g der Titelverbindung
zu ergeben:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,28
(t, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,80 (s, 3H),
3,85 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,30 (d, 1H), 6,70 (m, 2H), 7,0 (d,
1H), 7,22 (m, 4H).
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Die folgenden Verbindungen erläutern Verfahren
zur Herstellung der biologisch aktiven Verbindungen dieser Erfindung
aus Zwischenverbindungen, wie sie in den vorhergehenden Herstellungen
beschrieben wurden.
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Referenzbeispiel 1
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Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
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a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Eine Lösung aus 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
(1,94 g, 11,55 mmol) und D ethylazodicarobxylat (1,8 ml, 11,55 mmol)
in wasserfreiem DMF (58 ml) wurde während 10 min zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
(1,37 g, 4,62 mmol) und Triphenylphosphin (3,27 g, 12,47 mmol} in
wasserfreiem DMF (23 ml) bei RT unter Argon getropft. Nach 23,5
h wurde die Reaktion am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, und
der Rückstand
würde aus
Xylolen zur Entfernung von verbleibendem DMF aufkonzentriert. Kieselgel-Chromatographie
(30% EtOAc/Hexan (0,5 l), dann EtOAc (1 l); dann 5% MeOH/CHCl3) ergab wiedergewonnenes Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
(298,1 mg, 22%), dann die Titelverbindung (1,54 g, 75%) als gelbes Öl:
1H-NMR (250 MHz; CDCl3) δ 8,10 (dd,
J = 6,6, 1,3Hz, 1H), 6,85–7,30
(m; 7H); 6,78 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,68 (dd, J
= 8,2, 2,6Hz, 1H), 6,61 (dd, J = 8,5, 1,6Hz, 1H), 6,456,57 (m, 1h),
4,29 (d, J = 15,1Hz, 1H); 4,10–4,25
(m, 2H), 4,06 (t, J = 5,7Hz, 2H), 3,84 (d, J = 15,1Hz, 1H), 3,70–3,92 (m,
1H), 3,49 (q; J = 6,5Hz, 2H), 3,30 (dd, J = 15,0, 4,2Hz, 1H), 2,93
(dd, J = 15,0, 9,3Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,6, 5,0Hz, 1H), 2,51
(dd, J = 15,6, 9,4Hz, 1H), 2,05–2,25
(m, 2H); 1,27 (t, J = 7,1Hz, 3H);
MS (ES) m/e 447 (M + H)+.
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b) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(.2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-100,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,b]cyclohepten-10-acetat
(1,54 g, 3,45 mmol), 10% Pd/C (0,73 g, 0,69 mmol); Cyclohexen (7
ml, 6,9 mmol) und Isopropanol(35 ml) wurde im Rückfluß für 2 h erwärmt, dann wurde der Katalysator
durch Filtration durch Celite® entfernt. Auf konzentrieren
ließ ein
gelbes Öl
zurück,
das erneut den Reaktionsbedingungen unterworfen wurde. Nach 17 h
wurde die Reaktion wie zuvor aufgearbeitet, und der gelbe Rückstand
wurde erneut den Reaktionsbedingungen unterworfen, wobei 1 : 1 EtOAc/Isopropanol
(35 ml) anstelle von Isopropanol als Lösungsmittel verwendet wurde.
Die Mischung wurde für
5 h zum Rückfluß erwärmt, Pd-Schwarz (73 mg, 0,69 mmol)
wurde hinzugegeben, und der Rückfluß wurde
für weitere
18,5 h fortgesetzt. Aufarbeitung wie zuvor, gefolgt von Kieselgel-Chromatographie (1
: 1 EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung (0,94 g, 63%) als hellgelbes Öl:
DC
Rf (1 : 1 EtOAc/Hexan) 0,38;
1H-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ 8,02–8,11 (m, 1H), 7,33–7,42 (m,
1H), 7,02–7,20
(m, 4H), 7,00 (d, J = 8,2Hz, 1H), 6,77 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,67
(dd, J = 8,2, 2,6Hz, 1H), 6,50 – 6,60
(m, 1H), 6,39 (d, J = 8,5Hz, 1H), 4,69 (br t, 1H), 4,29 (d, J =
15,0Hz, 1H), 4,11 – 4,25
(m; 2H), 4,05 (t, J = 5,8Hz, 2H), 3,84 (d, J = 15,0Hz, 1H), 3,75–3,90 (m,
1H), 3,48 (app. q, 2H), 3,30 (dd, J = 15,0, 4,1Hz, 1H), 2,93 (dd,
J = 15,0, 9,2Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 4,8Hz, 1H), 2,52 (dd,
J = 15,6, 9,5Hz, 1H), 2,02–2,15
(m, 2H), 1,27 (t, J = 7,2Hz, 3H);
MS (ES) m/e 431 (M + H)+.
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c) (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
-
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
(0,94, g, 2,18 mmol) und 1,0 N NaOH (2,6 ml, 2,62 mmol) in absolutem
EtOH (19,2 ml) wird in einem auf 50°C eingestellten Ölbad erwärmt. Nach
28,5 h wurde die Reaktion am Rotationsverdampfer aufkonzentriert,
und der Rückstand
wurde durch ODS-Chromatographie
(1:1 MeOH/H2O) gereinigt. Auf konzentrieren
hinterließ eine
trübe wäßrige Lösung, die
durch Zugabe von etwas 1,0 N NaOH homogen gemacht wurde. Der pH
wurde auf 7 mit 1,0 N HCl eingestellt, und der feste Niederschlag
wurde aufgefangen und mit H2O gewaschen.
Die Mutterlaugen wurden auf konzentriert und der Rückstand
in ähnlicher
Weise behandelt, um eine kleine zweite Ausbeute zu liefern. Die
vereinigten Materialien wurden im Hochvakuum bei 40°C getrocknet,
um die Titelverbindung (0,70 g, 79%) als beinahe farblosen Feststoff
zu liefern: HPLC (Hamilton PRP-1®, 40%
CH3CN/H2O enthaltend
0,1% TFA) k' = 1,2;
1H-NMR (400 MHz,
DMSO-d6) δ 7,94
(d, J = 4,4Hz, 1H); 7,32–7,41
(m, 1H), 7,03–7,22
(m, 4H), 6,97 (d, J = 8,4Hz, 1H), 6,83 (d; J = 2,4Hz, 1H), 6,60–6,74 (m,
2H), 6,41–6,50
(m, 2H), 4,20 (d, J = 14,7Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,2Hz, 2H), 3,88
(d, J = 14,7Hz, 1H), 3,60–3,70
(m, 1H), 3,26–3,40
(m, 2H, teilweise durch Restlösungsmittel-Signal
verdeckt), 3,20 (dd, J = 15,1, 4,3Hz, 1H), 2,83 (dd J = 15,1, 10,3Hz,
1H), 2,60 (dd, J = 15,9, 5,3Hz, 1H), 2,50 (dd, 1H, teilweise durch
Restlösungsmittel-Signal
verdeckt), 1,88 – 2,00
(m, 2H);
MS (ES) m/e 403 (M + H)+.
Analyse:
berechnet für
C25H26N2O3·0,25
H2O: C, 73,78; H, 6,56; N, 6,88
gefunden:
C, 73,85; H, 6,47; N, 6,75.
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Beispiel 2
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Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
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a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4-nitro-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclöhepten-10-acetat
-
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel
1(a), außer
daß 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
gegen 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid ausgetauscht wurde,
wurde die Titelverbindung im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie
(Gradient: 2:1 EtOAc/Hexan, dann EtOAc, dann 5% MeOH in 1 : 1 EtOAc/CHCl3) erhalten:
MS (ES) m/e 492 (M + H)+.
-
b) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel
1(b), außer
daß Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
gegen Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4- nitro-N-oxopyr dyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
ausgetauscht wurde, wurde die Titelverbindüng im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie (20%
MeOH/CHCl3) erhalten:
(ES) m/e 446
(M + H)+.
-
c) (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-Essigsäure
-
1,0 N LiOH (0,74 ml, 0,74 mmol) würde auf
einmal zu einer Lösung
aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
(216,3 mg, 0,49 mmol) in THF (2,5ml) und H2O
(1,8 ml) bei RT gegeben. Die zweiphasige Mischung wurde für 1 h in
einem auf 40°C eingestellten Ölbad erwärmt, dann
wurde absolutes EtOH (ca. 1 ml) zur Vereinigung der Phasen hinzugegeben.
Die Reaktion wurde für
19,5 h auf 40°C
gehalten und dann aufkonzentriert, und der Rückstand wurde in 1 : 1 CH3CN/H2O (5 ml) gelöst. Die
Lösung
wurde mit TFA (0,11 ml, 1,47 mmol) angesäuert und aufkonzentriert. ODS-Chromatographie
(40% CH3CN/H2O,
enthaltend 0,1% TFA), gefolgt von Aufkonzentrieren zur Entfernung von
CH3CN hinterließ eine ölige wäßrige Lösung, die durch Zugabe von
etwas CH3CN homogen gemacht wurde. Der pH
wurde mit 1,0 NaOH auf 7 eingestellt, und ein öliger halbfester Stoff fiel
aus. Die Mischung wurde zur Entfernung des CH3CN
aufkonzentriert, und der resultierende Feststoff. wurde aufgefangen.
Dieser wurde in wäßrigem NaOH
gelöst,
und der pH wurde auf 7 eingestellt. Der Feststoff wurde aufgefangen,
mit viel H2O gewaschen und im Hochvakuum
bei 45°C
getrocknet, um die Titelverbindung (133,3 mg, 61%) als cremefarbenen
Feststoff zu liefern. HPLC (Hammilton PRP-1®, 35%
CH3CN/H2O enthaltend
0,1% TFA) k' = 3,0;
1H-NMR (400 MHz,
DMSO-d6) δ 7,48
(d, J = 6,3Hz, 1H), 7,04–7,22
(m, 4H), 6,95 (d, J = 8,2Hz, 1H), 6,88–7,02 (m, 1H), 6,82 (d, J =
2,4Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,4Hz, 1H), 6,27 (br s, 2H), 5,95
(dd, 1H), 5,65 (schmal d, 1H), 4,18 (d, J = 14,7Hz, 1H), 4,00 (t,
J = 6,1Hz, 2H); 3,88 (d, J = 14,7Hz, 1H), 3,59–3,10 (m, 1H), 3,13–3,30 (m,
3H}, 2,82 (dd, J = 15,2, 10,0Hz, 1H), 2,46 (dd, J = 15,8, 8,8Hz,
1H, teilweise durch Restlösungsmittel-Signal verdeckt),
2,58 (dd, J = 15,8, 5,2Hz, 1H), 1,86–2,01 (m, 2H);
MS (ES)
m/e 418 (M + H)+.
Analyse:
berechnet
für C25H27N3O3·1,67
H2O: C, 67,09; H, 6,83; N, 9,39
gefunden:
C, 66,99; H, 6,59; N, 9,34.
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Beispiel 3
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Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-(3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäüre
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a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4-methyl-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
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Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel
1(a), außer
daß das
2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
gegen 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid ausgetauscht
wurde, wurde die Titelverbindung als blaßgelbes Öl im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie
(Gradient: 30, 50, 100% EtOAc in Hexan, dann 1–5% MeOH in CHCl3)
erhalten
MS (ES) m/e 461,3 (M + H)+.
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b) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
-
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel
1(b), außer
daß Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
gegen Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4-methyl-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat ausgetauscht wurde,
wurde die Titelverbindung im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie
(Gradient: 30–50%
EtOAc in Hexan) erhalten:
MS (ES) m/e 445,3 (M + H)+.
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c) (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
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1,0 N NaOH (0,144 ml, 0,144 mmol)
wurde zu einer Lösung
aus Ethyl(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
(35 mg, 0,08 mmol) in EtOH (5 ml) bei RT gegeben. Die Mischung wurde über Nacht
in einem auf 32°C
eingestellten Ölbad
erwärmt
und dann auf konzentriert. Der Rückstand
wurde in H2O (3 ml) gelöst, und die Lösung wurde
mit 20%igem TFA angesäuert. ODS-Chromatographie (5–10% CH2CN/H2O, enthaltend
0,1% TFA), gefolgt von Aufkonzentrieren und Gefriertrocknung ergab
die Titelverbindung als weißes
Pulver:
MS (ES) m/e 417,3 (M + H)+.
Analyse:
berechnet
für C26H28N2O3·2,0
TFA·1,0
H2O: C, 54,38; H, 4,87; N, 4,23
gefunden:
C, 54,66; H, 4,53; N, 4,32.
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Beispiel 4
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Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-[2-(6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
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a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]eyclohepten-10-acetat
-
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel
1(a), außer
daß das
2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
gegen 2-(Ethylamino)-6-pyridylethanol ersetzt wurde, wurde die Titelverbindung
als farbloses Öl
im Anschluß an
Kieselgel-Chromatographie (5% MeOH/CH2Cl2) erhalten:
MS (ES) 445 (M + H)+.
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b) (±)-10,11-Dihydro-3-(2-(6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
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Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure (80
mg, 0,18 mmol) wurde in MeOH (3 ml) gelöst, und 1,0 N NaOH (0,22 ml,
0,22 mmol) wurde hinzugegeben. Die Lösung wurde bei RT über Nacht
gerührt
und dann im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in H2O
(3 ml) gelöst,
und die Lösung
wurde mit 20%igem TFA angesäuert.
Chromatographie an C-18 Bond Elute (30% CH3CN/H2O, enthaltend 0,1% TFA) ergab die Titelverbindung
als weißen
Feststoff:
MS (ES) 417 (M + H)+.
Analyse:
berechnet
für C26H28N2O3·1,3
CF3CO2H: C, 60,83;
H, 5,23; N, 4,96
gefunden: C, 60,64; H, 5,26; N, 4,26.
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Die obige Beschreibung offenbart
vollständig,
wie die vorliegende Frfindung gemacht und verwendet wird. Jedoch
ist die vorliegende Erfindung nicht auf die hier oben beschriebenen,
besonderen Ausführungsformen
beschränkt,
sondern schließt
alle Modifikationen davon im Umfang der folgendert Patentansprüche ein. Die
verschiedenen Verweise auf Journale, Patente und andere Veröffentlichungen,
die hier zitiert werden, umfassen den Stand der Technik und werden
hier durch Verweis eingeführt,
als ob sie vollständig
aufgeführt
werden.