DE69812602T2

DE69812602T2 - Antagonisten des vitronectin-rezeptors

Info

Publication number: DE69812602T2
Application number: DE69812602T
Authority: DE
Inventors: H. William MILLER; E. William BONDINELL; Wen Thomas KU
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-01-08
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2018-01-09
Also published as: DZ2395A1; PE44799A1; NZ336560A; HUP0001945A2; TR199901575T2; EP0977735A1; AU5912798A; ID23168A; MA26462A1; OA11076A; BR9806852A; ZA9896B; WO1998030542A1; NO993350L; AR010873A1; EP0977735A4; CA2276738A1; PL334499A1; BG103548A; IL130760A0

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft pharmazeutisch wirksame Verbindungen, die den Vitronektin-Rezeptor hemmen und nützlich sind zur Behandlung von Entzündung, Krebs und kardiovaskulären Störungen, wie Atherosklerose und Restenose, und von Krankheiten, in denen die Knochenresorption ein Faktor ist, wie Osteoporose.
Hintergrund der Erfindung
Integrine sind eine Überfamilie der Zelladhäsionsrezeptoren, die Transmembran-Glycoproetine sind, die an einer Vielzahl von Zellen exprimiert werden. Diese Zelloberflächen-Adhäsionsrezeptoren schließen gpIIb/IIIa (den Fibrinogen-Rezeptor) und α_vβ₃ (den Vitronektin-Rezeptor) ein. Der Fibrinogen-Rezeptor gpIIb/IIIa wird an der Blutplättchenoberfläche exprimiert und vermittelt die Blutplättchenaggregation und die Bildung eines hämostatischen Pfropfens an der Stelle einer blutenden Wunde. Philips et al., Blood, 1988, 71, 831. Der Vitronektin-Rezeptor α_vβ₃ wird an einer Anzahl von Zellen exprimiert, einschließlich Endothel-, glatten Muskel-, Osteoklasten- und Tumorzellen, und hat daher eine Vielzahl von Funktionen. Der an der Membran der Osteoklastenzellen exprimierte α_vβ₃-Rezeptor vermittelt die Adhäsion von Osteoklasten an der Knochenmatrix, ein Schlüsselschritt im Knochenresorptionsprozeß. Ross et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703. Eine durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnete Krankheit ist Osteoporose. Der an menschlichen glatten Muskelzellen der Aorta exprimierte α_vβ₃-Rezeptor vermittelt deren Migration in die Neointima, ein Prozeß, der zu Restenose nach perkutaner Koronarangioplastie führen kann. Brown et al., Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815. Zusätzlich haben Brooks et al., Cell, 1994, 79, 1157 gezeigt, daß ein α_vβ₃-Agonist die Tumorregression durch Induzieren von Apoptose der angiogenen Blutgefäße fördern kann. Daher wären Mittel, die den Vitronektin-Rezeptor blockieren; nützlich in der Behandlung von Krankheiten wie Osteoporose, Restenose und Krebs.
Der Vitronektin-Rezeptor ist jetzt dafür bekannt, sich auf drei unterschiedliche Integrine zu beziehen, die als α_vβ₁, α_vβ₃ und α_vβ₅ bezeichnet werden. Horton et al., Int. J. Exp. Pathol. 1990, 71, 741. α_vβ₁ bindet Fibronektin und Vitronektin. α_vβ₃ bindet eine große Vielzahl von Liganden, einschließlich Fibrin, Fibrinogen, Laminin, Thrombospondin, Vitronektin, von Willebrand-Faktor, Osteopontin und Knochen-Sialoprotein I. α_vβ₅ binde Vitronektin. Es wurde gezeigt, daß der Vitronektin-Rezeptor α_vβ₅ an der Zelladhäsion einer Vielzahl von Zelltypen beteiligt ist, einschließlich mikrovaskulären Endothelzellen (Davis et al., J. Cell. Biol., 1993, 51, 206), und seine Rolle in der Angiogenese wurde bestätigt. Brooks et al., Science, 1994, 264, 569. Dieses Integrin wird an Blutgefäßen in menschlichem Wundgranulationsgewebe exprimiert, aber nicht in normaler Haut.
Der Vitronektin-Rezeptor ist dafür bekannt, an Knochmatrixproteine zu binden, die das Tripeptid-Motiv Arg-Gly-ASp (oder RGD) enthalten. So offenbaren Horten et al., Exp. Cell Res. 1991, 195, 368, daß RGD-haltige Peptide und ein Anti-Vitronektinrezeptor-Antikörper (23C6) die Dentin-Resorption und Zellausbreitung durch Osteoklasten hemmen. Zusätzlich offenbaren Sato et al., J. Cell. Biol. 1990, 111, 1713, daß Echistatin, ein Schlangengift-Peptid, das die RGD-Sequenz enthält, ein wirksamer Inhibitor der Knochenresorption in der Gewebekultur ist und die Anhaftung von Osteoklasten am Knochen hemmt.
Es wurde jetzt gefunden, daß bestimmte Verbindungen wirksame Inhibitoren der α_vβ₃- und α_vβ₅-Rezeptoren sind. Insbesondere wurde gefunden, daß solche Verbindungen wirksamere Inhibitoren des Vitronektin-Rezeptors als des Fibrinogen-Rezeptors sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung umfaßt Verbindungen wie hier nachfolgend beschrieben, die eine pharmakologische Aktivität für die Hemmung des Vitronektin-Rezeptors aufweisen und nützlich sind in der Behandlung von Entzündung, Krebs und kardiovaskulären Störungen, wie Atherosklerose und Restenose, und von Krankheiten, in denen die Knochenresorption ein Faktor ist, wie Osteoporose.
Diese Erfindung ist ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Verbindungen wie hier nachfolgend beschrieben und einen pharmazeutischen Träger umfaßt.
Diese Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die durch den Vitronektin-Rezeptor vermittelt werden. In einem besonderen Aspekt sind die Verbindungen dieser Erfindung nützlich zur Behandlung von Atherosklerose, Restenose, Entzündung, Krebs und Krankheiten, in denen die Knochenresorption ein Faktor ist, wie Osteoporose.
Ausführliche Beschreibung
Diese Erfindung umfaßt neue Verbindungen, die wirksamere Inhibitoren des Vitronektin-Rezeptors als des Fibrinogen-Rezeptors sind. Die neuen Verbindungen umfassen einen Dibenzocyclohepten-Kern, in dem ein stickstoffhaltiger Substituent an einem der aromatischen 6-gliedrigen Ringe des Dibenzocycloheptens vorhanden ist und ein aliphatischer Substituent, der eine saure Einheit enthält, am 7-gliedrigen Ring des Dibenzocycloheptens vorhanden ist. Es wird angenommen, daß das Dibenzocyclohepten-Ringsystem die Seitenkettensubstituenten an den 6- und 7-gliedrigen Ringen orientiert, so daß sie vorteilhaft mit dem Vitronektin-Rezeptor Wechselwirken können. Es ist bevorzugt, daß ca. 12 bis 14 dazwischenliegende kovalente Bindungen über den kürzesten intramolekularen Weg zwischen der sauren Gruppe am aliphatischen Substituenten des 7-gliedrigen Rings des Dibenzocycloheptens und dem Stickstoff des stickstoffhaltigen Substituenten an einem der aromatischen 6-gliedrigen Ringe des Dibenzocycloheptens existieren.
Spezifische Verbindungen dieser Erfindung sind:
(±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure;
(±)-10,11-Dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure; und
(±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure;
oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
In Fällen, in denen die Verbindungen dieser Erfindung ein oder mehrere chirale Zentren aufweisen können, schließt diese Erfindung, wenn nichts anderes angegeben ist, jede einzelne nicht-racemische Verbindung ein, die synthetisiert und durch herkömmliche Techniken aufgetrennt werden kann.
Die Verbindungen dieser Erfindung hemmen die Bindung von Vitronektin und anderen RGD-haltigen Peptiden an den Vitronektin-Rezeptor. Die Hemmung des Vitronektin-Rezeptors an Osteoklasten hemmt die osteoklastische Knochenresorption und ist nützlich in der Behandlung von Krankheiten, in denen die Knochenresorption mit einem Krankheitszustand verbunden ist, wie Osteoporose und Osteoarthritis.
In einem anderen Aspekt ist diese Erfindung ein Verfahren zur Stimulierung der Knochenbildung, welches das Verabreichen einer Verbindung umfaßt, die eine Zunahme der Osteocalcin-Freisetzung verursacht. Eine erhöhte Knochenproduktion ist ein deutlicher Nutzen bei Krankheitszuständen, in denen ein Mangel von mineralisierter Knochenmasse besteht oder die Umgestaltung von Knochen erwünscht ist, wie Bruchheilung und die Vorbeugung von Knochenbrüchen. Krankheiten und Metabolismusstörungen, die in einem Verlust von Knochenstruktur resultieren, würden ebenfalls einen Nutzen aus einer solchen Behandlung ziehen. z. B. Hyperparathyreoidismus, Ostitis deformans, Hypercalcämie eines bösartigen Tumors, osteolytische Schädigungen, die durch Knochenmetastase erzeugt werden, Knochenverlust aufgrund von Immobilisierung oder Geschlechtshormonmangel, Behcet-Syndrom, Osteomalacie, Hyperostose und Osteopetrose könnten von der Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung profitieren.
Da die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Vitronektin-Rezeptoren an einer Anzahl unterschiedlicher Zelltypen hemmen, wären die Verbindungen zusätzlich nützlich in der Behandlung von entzündlichen Störungen, wie von rheumatoider Arthritis und Psoriasis, und von kardiovaskulären Krankheiten; wie Atherosklerose und Restenose Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nützlich zur Behandlung oder Vorbeugung von anderen Krankheiten sein, die einschließen aber nicht beschränkt sind auf thromboembolische Störungen, Asthma, Allergien, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Implantatgegen-Wirt-Erkrankung, Organtransplantationsabstoßung, septischer Schock, Ekzem, Kontaktdermatitis, entzündliche Darmerkrankung und andere Autoimmunkrankheiten. Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls nützlich zur Wundheilung sein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls nützlich zur Behandlung, einschließlich Vorbeugung, von angiogenen Störungen. Der Begriff angiogene Störungen wie hier verwendet schließt Zustände ein, die eine abnormale Neovaskularisierung beinhalten. Wenn das Wachstum neuer Blutgefäße die Ursache für die mit einer Krankheit verbundene Pathologie ist oder dazu beiträgt, wird die Hemmung der Angiogenese die nachteiligen Wirkungen der Krankheit reduzieren. Ein Beispiel für ein solches Krankheitsziel ist die diabetische Retinopathie. Wenn das Wachstum neuer Blutgefäße das Wachstum eines nachteiligen Gewebes unterstützen muß, wird die Hemmung der Angiogenese die Blutzufuhr zum Gewebe reduzieren und dadurch zur Reduzierung der Gewebemasse auf der. Basis der Blutzufuhrerfordernisse beitragen. Beispiele schließen das Wachstum von Tumoren ein, wenn Neovaskularisierung ein fortwährendes Erfordernis ist, damit der Tumor wächst; und das Entstehen von festen Tumormetastasen. Somit hemmen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Tumorgewebeangiogenese, um dadurch Tumormetastase und Tumorwachstum zu verhindern.
So kann gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung die Hemmung der Angiogenese unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Symptome der Krankheit lindern und in manchen Fällen die Krankheit heilen.
Ein weiteres therapeutisches Ziel für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Augenkrankheiten, die durch Neovaskularisierung gekennzeichnet sind. Solchen Augenkrankheiten schließen neovaskuläre Störungen der Hornhaut ein, wie Hornhauttransplantation, hepatische Keratitis, luetische Keratitis, Pterygium und neovaskulären Pannus, der mit der Verwendung von Kontaktlinsen verbunden ist. Zusätzliche Augenkrankheiten schließen ebenfalls altersbedingte Makuladegeneration, mutmaßliche Augenhistoplasmose, Prematuren-Retinopathie und neovaskuläres Glaukom ein.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel(I):
welches die Reduktion einer Verbindung der Formel (II) umfaßt:
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II):
umfaßt die Cyclisierung einer Verbindung der Formel (III):
Wie hier verwendet soll C_1-6-Alkyl Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, n-Pentyl, Isopentyl, Neopentyl und Hexyl und die einfachen aliphatischen Isomere davon einschließen.
Bestimmte Reagenzien werden hier abgekürzt. DCC bezeichnet Dicyclohexylcarbodiimid, DMAP bezeichnet Dimethylaminopyridin, DIEA bezeichnet Diisopropylethylamin, EDC bezeichnet N-Ethyl-N'(dimethylaminopropyl)carbodiimid. HOBt bezeichnet 1-Hydroxybenzotriazol, THF bezeichnet Ethylacetat, DMF bezeichnet Dimethylformamid, NBS bezeichnet N-Bromsuccinimid, Pd/C bezeichnet Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator, DPPA bezeichnet Diphenylphosphorylazid, BOP bezeichnet Benzotriazol-lyloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat, HF bezeichnet Fluorwasserstoffsäure, PPA bezeichnet Polyphosphorsäure, TEA bezeichnet Triethylamin, TFA bezeichnet Trifluoressigsäure, PCC bezeichnet Pyridiniumchlorochromat.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden durch die Verfahren hergestellt, die beschrieben werden in Bondinell et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/01540 (internationale Anmeldung Nr. PCT/US96/11108), veröffentlicht am 16. Januar 1997, dessen gesamte Offenbarung hier durch Verweis eingeführt wird.
Zusätzlich werden Verbindungen dieser Erfindung durch Verfahren hergestellt, die analog zu den in den nachfolgend ausführlich dargestellten Schemata beschriebenen sind. Schema 1
a) Tf₂O, 2,6-Lutidin; CH₂Cl₂; b) Allyltributylzinn, LiCl, (Ph₃P)₂PdCl₂, DMF; c) RuCl₃, H₅IO₆, CCl₄, CH₃CN, H₂O; d) PPA; e) EtOAc/LiHMDS, THF; f) H₂, 10% Pd/C, konz. HCl, AcOH; g) EtSH, AlCl₃, CH₂Cl₂; h) Tf₂O, 2,6-Lutidin, CH₂Cl₂; i) CO, Pd(OAc)₂, KOAc, dppf, DMSO.
2-Benzyl-4-methoxyphenol (J. Am. Chem. Soc. 1949, 71, 64) wird zum entsprechenden Trifluormethansulfonatester, Verbindung 2 – Schema 1 (z. B. 1–2), durch Reaktion mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid(Tf₂O) in Gegenwart einer geeigneten Base, z. B. 2,6-Lutidin, in einem inerten Lösungsmittel, allgemein CH₂Cl₂, umgewandelt. Reaktion von 1–2 mit Allyltributylzinn in Gegenwart von LiCl und einem Palladium-Katalysator, z. B.
Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid ((Ph₃P)₂PdCl₂), in einem inerten Lösungsmittel wie DMF durch das von Tilley beschriebene Verfahren (J. Org. Chem. 1990, 55, 906,) liefert 1–3. Oxidative Spaltung des Olefins in 3-Schema 1, um direkt die Carbonsäure 1–4 zu ergeben, kann durch Reaktion mit einem geeigneten Oxidationsmittel, klassischerweise KMnO₄, in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel, wie wäßrigem Aceton oder wäßriger Essigsäure, erreicht werden. Bevorzugt wird die oxidative Spaltung des Olefins in 1–3 jedoch, um die Carbonsäure 1–4 direkt zu ergeben, gemäß dem allgemeinen Verfahren von Sharpless durchgeführt (J. Org. Chem. 1981, 46, 3936; J. Org. Chem. 1985, 50, 1560, Fußnote 4), in dem RuO₄ in situ durch Reaktion von RuCl₃ oder RuO₂ mit NaIO₄ oder H₅IO₆ in einem Losungsmittelgemisch aus CCl₄, CH₃CN und H₂O erzeugt wird. Alternativ könnte die Oxidation in zwei Schritten durchgeführt, werden, die im ersten Schritt eine oxidative Spaltung des Olefins zum entsprechenden Aldehyd beinhaltet, was durch den Fachleuten wohlbekannte Verfahren erreicht werden kann, gefolgt von Oxidation des Aldehyds zur Carbonsäure unter Verwendung von z. B. NaClO₂, wie beschrieben von Pinnick (Tetrahedron 1981, 37, 2091) oder von Dalcanale und Montanari (J. Org. Chem. 1986, 51, 567) Cyclisierung von 1–4 zu 1–5 kann unter Verwendung von Polyphosphorsäure gemäß dem von Proctor, Renfrew und Savage beschriebenen Verfahren erreicht werden (J. Chem. Soc. (C) 1969, 1000). Alternativ kann 1–4 zu 1–5 über das entsprechende Säurechlorid von 1–4 umgewandelt werden, das durch den Fachleuten wohlbekannte Verfahren hergestellt werden kann. Behandlung dieses Säurechlorids mit einem geeigneten Friedel-Crafts-Katalysator, wie AlCl₃ oder SnCl₄, in einem inerten Lösungsmittel, wie CH₂Cl₂ oder CS₂, liefert das cyclische Keton 1–5. Reaktion von 1–5 in einer Aldol-Reaktion mit den Enolat von Ethylacetat, das aus Ethylacetat bei Kontakt mit einer geeigneten Amid-Base erzeugt werden kann, z. B. Lithiumdüsopropylamid (LDA) oder Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (LiHMDS), ergibt 1–6. Häufig. ist THF das Lösungsmittel der Wahl für eine Aldol-Reaktion, obwohl THF in Gegenwart verschiedener Additive, z. B. HMPA oder TMEDA, häufig verwendet wird. Reduktion von 1–6, um 1–7 zu ergeben, kann durch Hydrogenolyse über einem geeigneten Katalysator, z. B. Palladiummetall an aktivierten Kohlenstoff (Pd/C), in einem geeigneten Lösungsmittel wie Essigsäure in Gegenwart einer Mineralsäure wie HCl erreicht werden. Alternativ kann diese Reduktion durch Behandlung von 1–6 mit Triethylsilan in Gegenwart von Bortrifluoridetherat durch das allgemeine Verfahren von Orphanopoulos und Smonu erreicht werden (Synth. Commun. 1988, 833). Entfernung des Methylethers von 1-7, um 1–8 zu ergebem, kann mit BBr₃ in einem inerten Lösungsmittel, z. B. CH₂C1₂, oder durch Reaktion mit Ethanthiol und AlCl₃ in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt CH₂Cl₂, erreicht werden. Andere nützliche Verfahren zur Entfernung eines Methylethers werden in Greene beschrieben, "Protective Groups in Organic Synthesis" (veröffentlicht von John Wiley and Sons). 1–9, der Trifluormethansulfonatester von 1–8, hergestellt durch das früher beschriebene Verfahren für die Umwandlung von 1–1 zu 1–2, reagiert mit Kohlenmonoxid in Gegenwart von Kaliumacetat, 1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocen (ddpf) und einem Palladium-Katalysator, z. B. Palladiumacetat (Pd(OAc)₂), in einem geeigneten Lösungsmittel, bevorzugt DMSO, gemäß dem von Cacci und Lupi beschriebenen allgemeinen Verfahren (Tet. Lett. 1992; 33, 3939), um 1–10 zu ergeben.
Schema 2 ist illustrativ für ein Kupplungsverfahren für die Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungsbildung, das zur Bildung einer Ether-Verknüpfung verwendet werden kann. Schema 2

a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid, DEAD, (Ph)₃P, DMF;
b) Cyclohexen, 10% Pd/C, 2-Propanol; c) 1,0 N NaOH, EtOH, dann Ansäuerung.

Verbindung 1 aus Schema 2 (2–1) wird mit 2-[(3-Hydroxy-1propyl)amino]pyridin-N-oxid in einer Kupplungsreaktion vom Mitsunobu-Typ umgesetzt (Organic Reactions 1992, 42, 335–656; Synthesis 1981, 1–28), um 2–2 zu liefern. Die Reaktion wird durch den zwischen Diethylazodicarboxylat und Triphenylphosphin gebildeten Komplex vermittelt und wird in einem aprotschen Lösungsmittel, z. B. THF, CH₂Cl₂ oder DMF, durchgeführt. Die Pyridin-N-oxid-Einheit von 2-2 wird zum entsprechenden Pyridin 2-3 unter Transferhydrierungsbedingungen unter Verwendung eines Palladium-Katalysators, bevorzugt Palladiummetall auf Aktivkohle, in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Methanol, Ethanol oder 2-Propanol, reduziert. Cyclohexen, 1,4-Cyclohexadien, Ameisensäure und Salze der Ameisensäure, wie Kaliumformiat oder Ammoniumformiat, werden üblicherweise als Wasserstoffüberträger in diesem Reaktionstyp verwendet. Der Ethylester von 2–3 wird wie in Schema 1 beschrieben verseift, um 2–4 zu liefern.
Alternative Verfahren zur Herstellung bestimmter hier zuvor beschriebener intermediärer Verbindungen wurden wie nachfolgend in den Schemata 3 und 4 gezeigt erreicht. Schema 3
a) 10% Pd/C, HOAc; b) SOCl₂, Toluol; c) AlCl₃, CH₂Cl₂.
Schema 3 faßt ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Verbindungen aus Schema 1, Formel 5 (1–5) zusammen. Gemäß diesem Schema wird 3–1 (J. Med. Chem., 1981, 24, 99,8) über einer Atmosphäre aus Wasserstoffgas bei einem geeigneten Druck, z. B. 50 psi, in Gegenwart eines Palladium-Katalysators, z. B. 10% Pd/C, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Eisessig, bei einer geeigneten Temperatur z. B. 25°C, hydriert, um 3–2 zu ergeben. Cyclisierung von 3–2 zu 3–3 wird erreicht, indem zuerst 3-2 zum entsprechenden Säurechlorid in Gegenwart eines geeigneten Chlorierungsmittels, z. B. Thionylchlorid, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B.
Benzol, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 85°C, umgewandelt wird. Die Behandlung dieses Säurechlorids mit einem geeigneten Friedel-Crafts-Katalysator, z. B. AlCl₃, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. CH₂Cl₂, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, ergibt 6–3. Schema 4
a) LiN(TMS)₂, Ethylbromacetat; b) Jones-Reagens, OsO₄; c) H₂, 10% Pd/C, HOAc; d) C₂O₂Cl₂, DMF; e) AlCl₃, CH₂Cl₂, RT; f) H₂, 10% Pd/C, HOAc.
Schema 4 faßt ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Verbindungen von Schema 1, Formel 7 (1–7) zusammen. Gemäß diesem Schema wird 4–1. (J. Med. Chem. 1981, 24, 998.) mit Ethylbromacetat in Gegenwart einer geeigneten Base, z. B. LiN(TMS)2, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. THF, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. –78°C, umgesetzt, um 4–2 zu ergeben. 4-2 wird oxidativ in Gegenwart einer geeigneten Mischung aus Oxidationsmitteln, z. B. OsO₄/Jones-Reagens, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Aceton, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, gespalten, um 4–3 zu gergeben (J. Org. Chem., 1993, 58, 4745). 4–3 wird weiter über einer Atmosphäre aus Wasserstoffgas bei einem geeigneten Druck, z. B. 50 psi, in Gegenwart eines Palladium-Katalysators, z. B. 10% Pd/C, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Eisessig, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, hydriert, um 4–4 zu ergeben. Cyclisierung von 4–4 zu 4–5 wird erreicht, indem zuerst 4–4 zum entsprechenden Säurechlorid in Gegenwart eines geeigneten Chlorierungsmittels, z. B. Oxalylchlorid, in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Additivs, z. B. DMF, in einem geeignete Lösungsmittel, z. B. CH₂Cl₂, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, umgewandelt wird. Behandlung dieses Säurechlorids mit einem geeigneten Friedel-Crafts-Katalysator, z. B. AlCl₃, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. CH₂Cl₂, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, ergibt 4–5. 4–5 wird weiter über einer Atmosphäre aus Wasserstoffgas bei einem geeigneten Druck, z. B. 50 psi, in Gegenwart eines Palladium-Katalysators, z. B. 10% Pd/C, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Eisessig, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 25°C, hydriert, um 4–6 zu ergeben.
Säureadditionssalze der Verbindungen werden in einer Standardweise in einem geeigneten Lösungsmittel aus der Stammverbindung und einem Überschuß einer Säure hergestellt, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure oder Methansulfonsäure. Bestimmte Verbindungen bilden innere Salze oder Zwitterionen, die annehmbar sein können. Kationische Salze werden durch Behandeln der Stammverbindung mit einem Überschuß eines alkalischen Mittels, wie mit einem Hydroxid, Carbonat, oder Alkoxid, das das entsprechende Kation enthält; oder mit einem entsprechenden organischen Amin hergestellt. Kationen wie Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ und NH₄ ⁺ sind spezifische Beispiele für Kationen, die in pharmazeutisch akzeptablen Salzen vorliegen.
Diese Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung wie hier beschrieben und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt. Entsprechend können die Verbindungen dieser Erfindung in der Herstellung eines Medikaments verwendet werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Verbindungen dieser Erfindung, hergestellt wie hier zuvor beschrieben, können als Lösungen oder lyophilisierte Pulver zur parenteralen Verabreichung formuliert werden. Pulver können durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder eines anderen pharmazeutischen akzeptablen Trägers vor der Verwendung rekonstituiert werden. Die flüssige Formulierung kann eine gepufferte, isotonische, wäßrige Lösung sein. Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel sind normale isotonische Kochsalzlösung, 5%ige Standarddextrose in Wasser oder gepufferte Natriumoder Ammoniumacetat-Lösung. Eine solche Formulierung ist speziell geeignet zur parenteralen Verabreichung, aber kann ebenfalls zur oralen Verabreichung verwendet werden oder in einem Dosierinhalator oder Vernebler zur Insufflation enthalten sein. Es kann wünschenswert sein, Exzipienten hinzuzugeben, wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose, Gummi arabicum, Polyethylenglycol, Mannit, Natriumchlorid oder Natriumcitrat.
Alternativ können diese Verbindungen zur oralen Verabreichung verkapselt, tablettiert oder in einer Emulsion oder einem Sirup hergestellt werde. Pharmazeutisch akzeptable feste oder flüssige Träger können hinzugegeben werden, um die Zusammensetzung zu verbessern oder zu stabilisieren, oder um die Herstellung der Zusammensetzung zu erleichtern. Feste Träger schließen Stärke, Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Kaolin, Magnesiumstearat oder Stearinsäure, Talkum, Pectin, Gummi arabicum, Agar oder Gelatine ein. Flüssige Träger schließen Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Kochsalzlösung und Wasser ein. Der Träger kann ebenfalls ein Material zu anhaltenden Freisetzung ("sustained relase") einschließen, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs. Die Menge des festen Trägers variiert, aber wird bevorzugt. zwischen ca. 20 mg und ca. 1 g pro Dosierungseinheit liegen. Die pharmazeutischen Zubereitungen werden unter Befolgen der herkömmlichen Techniken der Pharmazie hergestellt, die Mahlen, Mischen, Granulieren und Verpressen, wenn erforderlich, für Tablettenformen beinhalten; oder Mahlen, Mischen, und Einfüllen für Hartgelatinekapselformen. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird die Zubereitung in Form eines Sirups, eines Elixiers, einer Emulsion oder einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Suspension sein. Eine solche flüssige Formulierung kann direkt p.o. verabreicht oder in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden.
Zur rektalen Verabreichung können die Verbindungen dieser Erfindung ebenfalls mit Exzipienten wie Kakaobutter, Glycerin, Gelatine oder Polyethylenglycolen kombiniert und zu einem Suppositorium geformt werden.
Die hier beschriebenen Verbindungen sind Antagonisten des Vitronektin-Rezeptors und sind nützlich zur Behandlung von Krankheiten, in denen die zugrundeliegende Pathologie Liganden oder Zellen zuweisbar ist, die mit dem Vitronektin-Rezeptor Wechselwirken. z. B. sind diese Verbindungen nützlich zur Behandlung von Krankheiten, in denen ein Verlust der Knochenmatrix die Pathologie schafft. Daher sind die vorliegenden Verbindungen nützlich zur Behandlung von Osteoporose, Hyperparathyreoidismus, Paget-Krankheit, Hypercalcämie eines bösartigen Tumors, osteolytischen Schädigungen, hervorgerufen Knochenmetastase, Knochenverlust aufgrund von Immobilisierung oder Geschlechtshormonmangel. Es wird angenommen, daß die Verbindungen dieser Erfindung ebenfalls einen Nutzen als Antitumormittel, antiangiogene Mittel, entzündungshemmende Mittel und Antimetastatika haben und nützlich in der Behandlung von Atherosklerose und Restenose sind.
Die Verbindung wird entweder oral oder parenteral an den Patienten in einer Weise verabreicht, so daß die Konzentration des Arzneistoffs ausreichend ist, um die Knochenresorption oder eine andere solche Indikation zu hemmen. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung enthält, wird mit einer oralen Dosis zwischen ca. 0,1 und ca. 50 mg/kg in einer mit dem Zustand des Patienten übereinstimmenden Weise verabreicht. Bevorzugt würde die orale Dosis ca. 0,5 bis ca. 20 mg/kg sein. Zur akuten Therapie ist die parenterale Verabreichung bevorzugt. Eine intravenöse Infusion des Peptids in 5%iger Dextrose in Wasser öder normaler Kochsalzlösung oder eine ähnliche Formulierung mit geeigneten Exzipienten ist am wirksamsten, obwohl eine intramuskuläre Bolusinjektion ebenfalls nützlich ist. Typischerweise wird die parenteräle Dosis ca. 0,01 bis 100 mg/kg sein; bevorzugt zwischen 0,1 und 20 mg/kg. Die Verbindungen werden ein- bis viermal täglich in einer Menge verabreicht, um eine tägliche Gesamtdosis von ca. 0,4 bis 400 mg/kg/Tag zu erreichen. Die präzise Menge und das präzise Verfahren, durch die die Verbindungen verabreicht werden, wird leicht durch einen Durchschnittsfachmann durch Vergleich des Blutspiegels des Mittels mit der erforderlichen Konzentration, um eine therapeutische Wirkung aufzuweisen, bestimmt.
Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Behandlung von Osteoporose oder zur Hemmung von Knochenverlust bereit, welches das Verabreichen, schrittweise oder in physikalischer Kombination, einer Verbindung dieser Erfindung und eines anderen Inhibitors für die Knochenresorption, wie Bisphosphonate (d.h. Allendronat), Hormonersatztherapie, Antiöstrogene oder Calcitonin umfaßt. Zusätzlich stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung unter Verwendung einer Verbindung dieser Erfindung und eines anabolen Mittels bereit, wie das morphogene Knochenprotein, Iproflavon, das nützlich in der Verhinderung von Knochenverlust und/oder zur Erhöhung der Knochenmasse ist.
Zusätzlich stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Hemmung von Tumorwächstum bereit, welches das Verabreichen, schrittweise oder in physikalischer Kombination, einer Verbindung dieser Erfindung und eines antineoplastischen Mittels umfaßt. Verbindungen der Klasse der Camptothecin-Analoga, wie Topotecan, Irinotecan und 9-Aminocamptothecin, und Platin-Koordinationskomplexe, wie Cisplatin, Ormaplatin und Tetraplatin sind wohlbekannte Gruppen von antineoplastischen Mitteln. Verbindungen der. Klasse der Camptothecin-Analoga werden beschrieben in US-PSen Nrn. 5 004 758, 4 604 463, 4 473 692, 4 545 880,4 342 776, 4 513.138, 4 399 276, EP-A-0 418 099 und EP-A-0 088 642, Wani et al., J, Med. Chem., 1986, 29, 2358, Wani et al., J. Med. Chem., 1980, 23, 554, Wani et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1774 und Nitta et al., Proc. 14th International Congr. Chemotherapy, 1985, Anticancer Section 1, 28, deren gesamte Offenbarung hier durch Verweis. eingeführt wird. Der Platin-Koordinationskomplex, Cisplatin, ist unter der Bezeichnung Platinol^® von Bristol Myers-Squibb Corporation erhältlich. Nützliche Formulierungen für Cisplatin werden in den US-PSen Nrn. 5 562 925 und 4 310 515 beschrieben, deren gesamte Offenbarung hier durch Verweis angeführt wird.
Im Verfahren der Hemmung von Tumorwachstum, welches das Verabreichen, schrittweise oder in physikalischer Kombination, einer Verbindung dieser Erfindung und eines antineoplastischen Mittels umfaßt, kann die Platin-Koordinationsverbindung, z. B. Cisplatin, unter Verwendung einer langsamen intravenösen Infusion verabreicht werden. Der bevorzugte Träger ist eine Dextrose/Kochsalzlösung, die Mannit enthält. Das Dosisschema für die Platin-Koordinationsverbindung kann auf der Basis von ca. 1 bis ca. 500 mg pro Quadratmeter (mg/m²) Körperoberfläche pro Behandlungsverlauf sein. Infusionen der Platin-Koordinationsverbindung können ein- bis zweimal wöchentlich gegeben werden, und die wöchentlichen Behandlungen können mehrere Male wiederholt werden. Unter Verwendung einer Verbindung der Klasse der Camptothecin-Analoga in einer parenteralen Verabreichung ist der allgemein eingesetzte Therapieverlauf ca. 0,1 bis ca. 300,0 mg/m2 Körperoberfläche pro Tag für ca. fünf aufeinanderfolgende Tage. Am meisten bevorzugt ist der für Topotecan eingesetzte Therapieverlauf ca. 1,0 bis ca. 2,0 mg/m² Körperoberfläche pro Tag für ca. fünf aufeinanderfolgende Tage. Bevorzugt wird der Therapieverlauf wenigstens einmal in einem Intervall von ca. 7 Tagen bis ca. 28 Tagen wiederholt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann sowohl mit der Verbindung dieser Erfindung als, auch mit dem antineoplastischen Mittel im gleichen Behälter formuliert werden, aber die Formulierung in unterschiedlichen Behältern ist bevorzugt. Wenn beide Mittel in Lösungsform bereitgestellt werden, können sie in einem Infusions/Injektionssystem zur simultanen Verabreichung oder in einer Tandemanordnung enthalten sein.
Zur zweckmäßigen Verabreichung der Verbindung dieser Erfindung und des antineoplastischen Mittels zu gleichen oder zu unterschiedlichen Zeiten wird ein Kit hergestellt, das in einem einzelnen Behälter, wie in einem Kasten, einem Karton oder anderen Behälter, individuelle Flaschen, Beutel, Ampullen oder andere Behälter, die jeweils eine effektive Menge der Verbindung dieser Erfindung zur parenteralen Verabreichung wie oben beschrieben aufweisen, und eine effektive Menge des antineoplastischen Mittels zur parenteralen Verabreichung wie oben beschrieben umfaßt. Ein solches Kit kann z. B. sowohl pharmazeutische Mittel in separaten Behältern oder im gleichen Behälter, gegebenenfalls als lyophilisierte Klumpen, und Behälter für Lösungen zur Rekonstituierung umfassen. Eine Variation davon ist der Einschluß der Lösung zur Rekonstituierung und des lyophilisierten Klumpens, in zwei Kammern eines einzelnen Behälters, die vor der Verwendung zum Vermischen gebracht werden. Mit einer solchen Anordnung können das antineoplastische Mittel und die Verbindung dieser Erfindung separat, wie in zwei Behältern, oder lyophilisiert zusammen als Pulver verpackt und in einem einzelnen Behälter bereitgestellt werden.
Wenn beide Mittel in Lösungsform bereitgestellt werden, können sie in einem Infusions/Injektionssystem zur simultanen Verabreichung oder in einer Tandemanordnung enthalten sein. z. B. kann die Verbindung dieser Erfindung in einer i.v. injizierbaren Form oder in einem Infusionsbeutel sein, der in Reihe über Schläuche mit dem antineoplastischen Mittel in einem zweiten Infusionsbeutel verbunden ist. Unter Verwendung eines solchen Systems kann ein Patient eine anfängliche Injektion oder Infusion vom Bolus-Typ der Verbindung dieser Erfindung erhalten, gefolgt von einer Infusion des antineoplastischen Mittels.
Die Verbindungen können in einem aus verschiedenen biologischen Untersuchungen getestet werden, um die Konzentration der Verbindung zu bestimmen, die erforderlich ist, um einen gegebenen pharmakologischen Effekt zu zeigen.
Hemmung der Vitronektin-Bindung
Festphasen-[³H]-SK&F-107260-Bindung an α_vβ₃: α_vβ₃ aus menschlicher Pläzenta oder menschlichen Blutplättchen (0,1–0,3 mg/ml) in Puffer T (der 2 mM CaCl₂ und 1% Octylglucosid enthält) wurde mit Puffer T verdünnt, der 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (Puffer A) und 0,05% NaN₃ enthielt, und dann unverzüglich zu ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning, New York, NY) mit 0,1 ml pro Vertiefung gegeben. 0,1–0,2 μg α_vβ₃ wurde pro Vertiefung hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Vertiefungen einmal mit Puffer A gespült und mit 0,1 ml 3,5%igem Rinderserumalbumin im gleichen Puffer für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und zweimal mit 0,2 ml Puffer A gespült.
Verbindungen wurden in 100% DMSO gelöst, um eine 2 mM Vorratslösung zu ergeben, die mit Bindungspuffer (15 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂) auf eine Verbindungsendkonzentration von 100 μM verdünnt wurde. Diese Lösung wird dann auf die erforderliche Verbindungsendkonzentration verdünnt. Verschiedene Konzentrationen unmarkierter Antagonisten (0,001–100 μM) wurden zu den Vertiefungen in 3-facher Ausführung zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5,0 nM [³H]-SK&F-107260 (65–86 Ci/mmol).
Die Platten wurden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und einmal mit 0,2 ml eiskaltem Puffer A in einer Weise von Vertiefung zu Vertiefung gespült. die Rezeptoren wurden mit 0,1 ml 1%igem SDS solubilisiert, und das, gebundene [³H]-SK&F-107260 wurde durch Flüssig-Szintillationszählung unter Zugabe von 3 ml Ready Safe in einem Beckman LS Liquid Scintillation Counter mit 40%igem Wirkungsgrad bestimmt. Die nichtspezifische Bindung von [³H]- SK&F-107260 wurde in Gegenwart von 2 μM SK&F-107260 bestimmt und war durch- gehend weniger als 1% des Gesamtradioliganden-Eingangs. Der IC₅₀-Wert (Konzentration des Antagonisten zur Hemmung von 50% Bindung von [³H]-SK&F- 107260) wurde durch eine nicht-lineare Kurvenanpassungsroutine der kleinsten Fehlerquadrate bestimmt, die aus dem LUNDON-2-Programm modifiziert wurde. Der Ki_i-Wert (Dissoziationskonstante des Antagonisten) wurde gemäß der Gleichung: K_i = IC₅₀/(l + L/K_d) bestimmt, worin L und K_d die Konzentrations- bzw. die Dissoziationskonstante von [³H]-SK&F-107260 waren:
Verbindungen dieser Erfindung wurden ebenfalls auf die in-vitro- und in-vivo-Knochenresorption in Untersuchungen getestet, die standardmäßig auf diesem Gebiet zur Auswertung der Hemmung der Knochenbildung sind, wie der "Pit Formation"-Test, offenbart in EP 528 587, der ebenfalls unter Verwendung von menschlichen Osteoklasten anstelle von Ratten-Osteoklasten durchgeführt werden kann, und wie im Modell der ovariektomierten Ratte, beschrieben von Wronski et al., Cells and Materials 1991, Sup. 1, 69–74.
Migrationstest der glatten Gefäßmuskelzellen
Glatte Muskelzellen der Aorta von Ratte oder Mensch wurden verwendet. Die Zellmigration wurde in einer Transwell-Zellkulturkammer unter Verwendung einer Polycarbonat-Membran mit Poren von 8 μm (Costar) überwacht. Die untere Oberfläche des Filters war mit Vitronektin beschichtet. Zellen wurden in DMEM suspendiert, ergänzt mit 0,2% Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 2,5–5,0 × 10⁶ Zellen/ml, und wurden mit Testver bindung in unterschiedlichen Konzentrationen für 20 min bei 20°C vorbehandelt. Das Lösungsmittel allein wurde a1s Kontrolle verwendet. 0,2 ml der Zellsuspension wurde in das obere Abteil der, Kammer gegeben. Das untere Abteil enthielt 0,6 ml DMEM, ergänzt mit 0,2% Rinderserumalbumin. Die Inkubation wurde bei 37°C in einer Atmosphäre von 95% Luft/5% CO₂ für 24 h durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die nicht-migrierten Zellen auf. der oberen Oberfläche des Filters durch vorsichtiges Schaben entfernt. Der Filter wurde dann in Methanol fixiert und mit 10% Giemsa-Anfärbelösung angefärbt. Die Migration wurde entweder durch a) Zählender Anzahl von Zellen, die zur unteren Oberfläche des Filters migriert waren, oder durch b) Extrahieren der angefärbten Zellen mit 10%iger Essigsäure, gefolgt von Bestimmung der Extinktion bei 600 nm gemessen.
Modell der Ratte mit entfernten Nebenschilddrüsen
Jede experimentelle Gruppe bestand aus 5 bis 6 ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten (250–400 g Körpergewicht). Den Ratten werden 7 Tage vor der Verwendung die Nebenschilddrüsen entfernt (durch den Verkäufer, Taconic Farms). Alle Ratten erhalten eine Ersatzdosis von Thyroxin alle 3 Tage. Beim Empfang der Ratten werden Kreislaufspiegel von ionisiertem Calcium im Vollblut direkt nach Entnahme durch Schwanzvenenpunktur in heparinisierte Röhrchen gemessen. Ratten werden eingeschlossen, falls der iönisierte Ca-Spiegel (gemessen mit einem Calcium-pH-Analysator Ciba-Corning Modell 634) < 1,2 mM/1 ist. Jede Ratte wird mit einem venösen und arteriellen Verweilkatheter für die Übertragung von Testmaterial bzw. zur Blutprobenentnahme versehen. Die Ratten werden dann auf eine Diät mit calciumfreier Nahrung und entionisiertem Wasser gesetzt. Basislinien-Ca-Spiegel werden gemessen, und jeder Ratte wird entweder Kontrollträger oder menschliches Nebenschilddrüsenhormon 1-34 Peptid (hPTH1-34, Dosis 1,25 μg/kg/h in Kochsalzlösung/0,1% Rinderserumalbumin, Bachem, Ca) oder eine Mischung aus hPTH1-34 und Testmaterial durch kontinuierliche intravenöse Infusion über den venösen Katheter unter Verwendung einer externen Spritzenpumpe verabreicht. Die calcämische Reaktion jeder Ratte wird in zweistündlichen Intervallen während des Infusionszeitraums von 6 bis 8 Stunden gemessen.
Menschliche Osteoklastenresorption- und -adhäsions-Tests
Vertiefungsresorptions- und -adhäsions-Tests wurden entwickelt und unter Verwendung normaler menschlicher Osteoklasten, die aus Knochenmarksarkomgewebe stammten, standardisiert. Test 1 wurde zur Messung der Osteöklasten-Vertiefungsvolumina ("pit volume") durch konfokale Lasermikroskopie entwickelt. Test 2 wurde als höhere Durchsatzdurchmusterung entwickelt, in der Collagen-Fragmente (während der Resorption freigesetzt)durch kompetitiven ELISA gemessen werden.
Test 1 (unter Verwendung von konfokaler Lasermikroskopie)

– Teilmengen von aus menschlichem Knochenmarksarkom stammenden Zellsuspensionen werden aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff entfernt, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640-Medium durch Zentrifugieren gespült (1000 U/min, 5 min bei 4°C).
– Das Medium wird abgesaugt und gegen Maus-Anti-HLA-DR-Antikörper ausgetauscht und dann 1 : 3 in RPMI-1640-Medium verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert und häufig gemischt.
– Die Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-164,0 gewaschen, gefolgt von Zentrifugieren (1000 U/min, 5 min bei 4°C), und die Zellen werden dann in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl mononuklärer Zellen wird in einer verbesserten Neubauer-Zählkammer gezählt.
– Ausreichend magnetische Perlen (5/mononukleäre Zelle), beschichtet mit Ziege-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck, NY), werden aus ihrer Vorratsflasche entfernt und in 5 ml frisches Medium gegeben (dies spült das toxische Azid-Konservierungsmittel ab). Das Medium wird. durch Immobilisieren der Perlen an einem Magnet entfernt und wird gegen frisches Medium ausgetauscht.
– Die Perlenwerden mit, den Zellen vermischt, und die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig gemischt:
– Die perlenbeschichteten Zellen werden an einem Magnet mmobilisiert, und die verbleibenden Zellen (Osteoklasten-reiche Fraktion) werden in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
– Frisches Medium wird zu den perlenbeschichteten Zellen hinzugegeben, um etwaige gefangene Osteoklasten abzustreifen. Dieses Spülverfahren wird 10-mal wiederholt. Die perlenbeschichteten Zellen werden verworfen.
– Die lebensfähigen Osteoklasten werden in einer Zählkammer unter Verwendung von Fluoresceindiacetat gezählt, um lebende Zellen zu markieren. Eine Einweg-Kunststoffpasteurpipette mit großer Bohrung wird verwendet, um die Probe in die Kammer zu geben.
– Die Osteoklasten werden durch Zentrifugieren pelletiert und die Dichte auf die entsprechende Anzahl in EMEM-Medium (die Anzahl der Osteoklasten variiert von Tumor zu Tumor) eingestellt, ergänzt mit 10% Kalbfötusserum und 1,7 g/l Natriumbicarbonat.
– 3 ml-Teilmengen der Zellsuspension (pro Verbindungsbehandlung) werden in 15 ml Zentrifugenröhrchen dekantiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert.
– Zu jedem Röhrchen werden 3 ml der entsprechenden Verbindungsbehandlung hinzugegeben (verdünnt auf 50 μM im EMEM-Medium). Ebenfalls eingeschlossen werden entsprechende Trägerkontrollen, eine positive Kontrolle (Anti-Vitronektin-Rezeptor monoklonaler Antikörper der Maus [87MEml], verdünnt auf 100 μg/ml) und eine Isotypenkontrolle (IgG_2a verdünnt auf 100 μg/ml). Die Proben werden. bei 37°C für 30 Minuten inkubiert.
– 0,5 ml-Teilmengen der Zellen werden auf sterile Dentinscheiben in einer Platte mit 48 Vertiefungen übergeimpft und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Jede Behandlung wird 4-fach durchmustert.
– Die Scheiben werden in sechs Wechseln von warmem PBS (10 ml/Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen) gespült und dann in frisches Medium gegeben, das die Verbindungsbehandlung oder Kontrollproben enthält. Die Proben werden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert.

Verfahren der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) (selektive Anfärbung für. Zellen der Osteoklasten-Linie).

– Die Knochenscheiben, die die anhaftenden Osteoklasten enthalten, werden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gespült und in 2% Glutaraldehyd (in 0,2 M Natriumcacodylat) für 5 Minuten fixiert.
– Sie werden dann in Wasser gespült und für 4 Minuten in TRAP-Puffer bei 37°C inkubiert (0,5 mg/ml Naphthol AS-BI-Phosphat, gelöst in N,N-Dimethylformam d und vermischt mit 0,25 M Citratpuffer (pH 4,5), enthaltend 10 mM Natriumtartrat.
– Im Anschluß an Spülen in kaltem Wasser werden die Scheiben in kalten Acetatpuffer (0,1 M, pH 6,2), der 1 mg/ml Fast Garnet enthält, getaucht und bei 4°C für 4 Minuten inkubiert.
– Überschüssiger Puffer wird abgesaugt, und die Scheiben werden nach Spülen in Wasser luftgetrocknet.
– Die TRAP-positiven Osteoklasten (ziegelrot/violetter Niederschlag) werden durch Hellfeldmikroskopie gezählt und werden dann von der Oberfläche des Dentins durch Ultraschallbehandlung entfernt.
– Vertiefungsvolumina werden unter Verwendung des konfokalen Mikroskops Nikon/Lasertec ILM21W bestimmt.

Test 2 (unter Verwendung von ELISA-Auslesung)
Die menschlichen Osteoklasten werden angereichert und zur Verbindungsdurchmusterung wie in den ersten neun Schritten von Test 1 beschrieben vorbereitet. Der Klarheit halber werden diese Schritte nachfolgend wiederholt.

– Teilmengen von aus menschlichem Knochenmarksarkom stammenden Zellsuspensionen werden aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff entfernt, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640-Medium durch Zentrifugieren gespült (1000 U/min, 5 min bei 4°C).
– Das Medium wird abgesaugt und gegen Maus-Anti-HLA-DR-Antikörper ausgetauscht und dann 1 : 3 in RPMI-1640-Medium verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert und häufig gemischt.
– Die Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, gefolgt von Zentrifugieren (1000 U/min, 5 min bei 4°C), und die Zellen werden dann in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl mononukleärer Zellen wird in einer verbesserten Neubauer-Zählkammer gezählt.
– Ausreichend magnetische Perlen (5/mononukleäre Zelle), beschichtet mit Ziege-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck, NY), werden aus ihrer Vorratsflasche entfernt und in 5 ml frisches Medium gegeben (dies spült das toxische Azid-Konservierungsmittel ab). Das Medium wird durch. Immobilisieren der Perlen an einem Magnet entfernt und wird gegen frisches Medium ausgetauscht.
– Die Perlen werden mit den Zellen vermischt, und die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig gemischt.
– Die perlenbeschichteten Zellen werden an einem Magnet immobilisiert, und die verbleibenden Zellen (Osteoklasten-reiche Fraktion) werden in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
– Frisches Medium wird zu den perlenbeschichteten Zellen hinzugegeben, um etwaige gefangene Osteoklasten abzustreifen. Dieses Spülverfahren wird 10-mal wiederholt. Die perlenbeschichteten Zellen werden verworfen.
– Die lebensfähigen Osteoklasten werden in einer Zählkammer unter Verwendung von Fluoresceindiacetat gezählt, um lebende Zellen zu markieren. Eine Einweg-Kunststoffpasteurp pette mit großer Bohrung wird verwendet, um die Probe in die Kammer zu geben.
– Die Osteoklasten werden durch Zentrifugieren pelletiert und die Dichte auf die entsprechende Anzahl in EMEM-Medium (die Anzahl der Osteoklasten variiert von Tumor zu Tumor) eingestellt, ergänzt mit 10% Kalbfötusserum und 1,7 g/l Natriumbicarbonat.

Im Gegensatz zum oben in Test 1 beschriebenen Verfahren werden die Verbindungen in vier Dosen durchmustert, um einen IC₅₀-Wert wie nachfolgend umrissen zu erhalten:

– Die Osteoklastenzubereitungen werden für 30 Minuten bei 37°C mit Testverbindung (4 Dosen) oder Kontrollen vorinkubiert.
– Sie werden dann auf kortikale Rinderknochenscheiben in Vertiefungeneiner Gewebekulturplatte mit 48 Vertiefungen übergeimpft und für weitere 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
– Die Knochenscheiben werden in sechs Wechseln von warmer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen, und werden dann in die Vertiefungen einer Platte mit 48 Vertiefungen rücküberführt, die frische Verbindung oder Kontrollen enthält.
– Die Gewebekulturplatte wird dann für 48 Stunden bei 37°C inkubiert.
– Die Überstände aus jeder Vertiefung werden in individuelle Röhrchen abgesaugt und in einem kompetitiven ELISA durchmustert, der das c-Telopeptid von Typ I-Collagen nachweist, das während des Resorptionsverfahrens freigesetzt wird. Dies ist ein handelsüblicher ELISA (Osteometer, Dänemark), der einen Kaninchen-Antikörper enthält, der spezifisch mit einer 8-Aminosäuresequenz (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) reagiert, die im Carboxy-terminalen Telopeptid der al-Kette von _Typ I-Collagen vorhanden ist. Die Ergebnisse werden als prozentuale Hemmung der Resorption im Vergleich zu einer Trägerkontrolle ausgedrückt.

Menschlicher Osteoklasten-Adhäsionstest
Die menschlichen Osteoklasten werden angereichert und zur Verbindungsdurchmusterung wie oben in den ersten neun Schritten von Test 1 beschrieben vorbereitet. Der Klarheit halber werden diese Schritte nachfolgend wiederholt.

– Teilmengen von aus menschlichem Knochenmarksarkom stammenden Zellsuspensionen werden aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff entfernt, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640-Medium durch Zentrifugieren gespült (1000 U/min, 5 min bei 4°C).
– Das Medium wird abgesaugt und gegen Maus-Anti-HLA-DR-Antikörper ausgetauscht und dann 1 : 3 in RPMI-1640-Medium verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert und häufig vermischt.
– Die Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, gefolgt von Zentrifugieren (1000 U/min, 5 min bei 4°C), und die Zellen werden dann in ein steriles 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl mononuklärer Zellen wird in einer verbesserten Neubauer-Zählkammer gezählt.
– Ausreichend magnetische Perlen (5/mononukleäre Zelle), beschichtet mit Ziege-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck, NY), werden aus ihrer Vorratsflasche entfernt und in 5 ml frisches Medium gegeben (dies spült das toxische Azid-Konservierungsmittel ab). Das Medium wird durch Immobilisieren der Perlen an einem Magnet entfernt und wird gegen frisches, Medium ausgetauscht.
– Die Perlen werden mit den Zellen vermischt; und die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig vermischt.
– Die perlenbeschichteten Zellen werden an einem Magnet immobilisiert, und die verbleibenden Zellen (Osteoklasten-reiche Fraktion) werden in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
– Frisches Medium wird zu den perlenbeschichteten Zellen hinzugegeben, um etwaige gefangene Osteoklasten abzustreifen. Dieses Spülverfahren wird 10-mal wiederholt. Die perlenbeschichteten Zellen werden verworfen.
– Die lebensfähigen Osteoklasten werden in einer Zählkammer unter Verwendung von Fluoresceindiacetat gezählt, um lebende Zellen zu markieren. Eine Einweg-Kunststoffpasteurpipette mit großer Bohrung wird verwendet, um die Probe in die Kammer zu geben.
– Die Osteoklasten werden durch Zentrifugieren pelletiert und die Dichte auf die, entsprechende Anzahl in EMEM-Medium (die Anzahl der Osteoklasten variiert von Tumor zu Tumor) eingestellt, ergänzt mit 10 % Kalbfötusserum und 1,7 g/1 Natriumbicarbonat.
– Aus Knocheninarksarkom stammende Osteoklasten werden mit Verbindung (4 Dosen) oder Kontrollen bei 37°C für 30 Minuten vorinkubiert.
– Die Zellen werden dann auf Osteopontin-beschichtete Objektträger übergeimpft (Osteopontin von Mensch oder Ratte, 2,5 μg/ml) und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
– Nichtanhaftende Zellen werden durch kräftiges Spülen der Objektträger in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung entfernt, und die auf den Objektträgern verbleibenden Zellen werden in Aceton fixiert.
– Die Osteoklasten werden auf Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP), einen selektiven Marker für Zellen dieses Phänotyps (siehe Schritte 15–17), angefärbt und durch Lichtmikroskopie gezählt. Die Ergebnisse werden als prozentuale Hemmung der Adhäsion im Vergleich zu einer Trägerkontrolle ausgedrückt.

Zelladhäsionstest
Zellen und Zellkultur
Menschliche Embryo-Nierenzellen (HEK293-Zellen) wurden von ATCC erhalten (Katalog-Nr. CRL 1573). Die Zellen wurden in essentiellem Earl-Minmalmedium (EMEM) gezüchtet, das Earlsches Salz, 10% Rinderfötusserum, i% Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.
Konstrukte und Transfektionen
Ein 3,2 kb EcoRI-KpnI-Fragment der α_v-Untereinheit und 2,4 kb XbaI-XhoI-Fragment der β₃-Untereinheit wurden in die EcoRI-EcoRV-Klonierungsstelle des pCDN-Vektors (Aiyar et al., 1994), der einen CMV-Promotor und einen selektierbaren G418-Marker enthält, durch stumpfendiges Ligieren inseriert. Zur stabilen Expression wurden 80 × 10⁶ HEK 293-Zellen mit α_vβ₃-Konstrukten (20 μg DNA jeder Untereinheit) unter Verwendung eines Gene Pulser (Hensley et al., 1994) elektrotransformiert und in 100 mm-Platten plattiert (5 × 10⁵-Zellen/Platte). Nach 48 Stunden wurde das Wachstumsmedium mit 450 μg/ml Geneticin (G418-Sulfat, GIBCO-BRL, Bethesda; MD) ergänzt. Die Zellen wurden im Selektionsmedium gehalten, bis die Kolonien groß genug für den Test waren.
Immunocytochemische Analyse der transfizierten Zellen
Zur Bestimmung, ob die HEK 293-Transfektanten den Vitronektin-Rezeptor exprimierten-, wurden die Zellen auf Mikroskopie-Glasobjektträgern durch Zentrifugieren, immobilisiert, in Aceton für 2 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und luftgetrocknet. Spezifische Reaktivität mit 23C6, einem für den α_vβ₃-Komplex spezifischen monoklonalen Antikörper, wurde unter Verwendung eines indirekten Standard-Immunofluoreszenzverfahrens gezeigt.
Zelladhäsionsuntersuchungen
ELISA-Platten von Corning mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 0,1 ml menschlichem Vitronektin (0,2 μg/ml in RPMI-Medium) vorbeschichtet. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Platten einmal mit RPMI-Medium gespült und mit 3,5% BSA in RPMI-Medium für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Transfizierte 293-Zellen wurden in RPMI-Medium, ergänzt mit 20 mM Hepes, pH 7,4 und 0,1% BSA, mit einer Dichte von 0,5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. 0,1 ml Zellsuspension wurde in, jede Vertiefung gegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener a_vβ₃-Antagonisten. Im Anschluß an die Inkubation wurde 0,025 ml einer 10%igen Formaldehyd-Lösung, pH 7,4, hinzugegeben, und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixiert. Die Platten wurden dreimal mit 0,2 ml RPMI-Medium gespült, und die anhaftenden Zellen wurden mit 0,1 ml 0,5 % Toluidinblau für 20 Minuten bei Raumtemperatur. angefärbt. Überschüssige Anfärbung wurde durch ausgiebiges Spülen mit entionisiertem Wasser entfernt. Das in die Zellen eingebaute Toluidinblau wurde durch Zugabe von 0,1 ml 50%igem Ethanol, das 50 mM HCl enthielt, eluiert. Die Zelladhäsion wurde bei einer optischen Dichte von 600 nm an einem Mikrotiterplatten-Auslesegerät quantifiziert (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).
Festphäsen-α_vβ₅-Bindungstest
Der Vitronektin-Rezeptor α_vβ₅ wurde aus menschlicher Plazenta gereinigt. Die Rezeptorzubereitung wurde mit 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (Puffer A) verdünnt und wurde unverzüglich zu ELISA-Platten mit, 96 Vertiefungen mit 0,1 ml pro Vertiefung gegeben. 0,1–0,2 μg α_νβ₃ wurde pro Vertiefung hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Vertiefungen einmal mit Puffer A gespült und wurden mit 0,1 ml 3,5% . Rinderserumalbumin im gleichen Puffer für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und zweimal mit 0,2 ml Puffer A gespült.
In einem kompetitiven [³H]-SK&F-107260-Test wurden verschiedene Konzentrationen unmarkierter Antagonisten (0,001–100 μM) in die Vertiefungen gegeben, gefolgt von der Zugabe von 5,0 nM [³H]-SK&F-107260. Die Platten würden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und einmal mit 0,2 ml eiskaltem Puffer A in einer Weise von Vertiefung zu Vertiefung gespült. Die Rezeptoren wurden mit 0,1 ml 1% SDS solubilisiert, und das gebundene [³H]-SK&F-107260 wurde durch Flüssig-Szintillationszählung bei Zugabe von 3 ml Ready Safe in einem Beckman LS 6800 Liquid Scintillation Counter mit 40%igem Wirkungsgrad bestimmt. Die nicht-spezifische Bindung von [³H]-SK&F-107260 wurde in Gegenwart von 2 μM SK&F-107260 bestimmt und war durchgehend weniger als 1% des Gesamtrad oliganden-Eingangs. Der IC₅₀-Wert (Konzentration des Antagonisten zur Hemmung von 50% Bindung von [³H]-SK&F-107260) wurde durch eine nicht-lineare Kurvenanpassungsroutine der kleinsten Fehlerquadräte bestimmt, die aus dem LUNDON-2-Programm modifiziert wurde. Der K_i-Wert (Dissoziationskonstante des Antagonisten) wurde gemäß der Cheng-Prusoff-Gleichung berechnetr K_i = IC₅₀/(1 + L/K_d), worin L und K_d die Konzentration bzw, die Dissoziationskonstante von [³H]-SK&F-10T260 waren.
Hemmung der RGD-vermittelten GPIIb-IIIa-Bindung
Reinigung von GPIIb-IIIa
10 Einheiten von zeitlich abgelaufenen, gespülten menschlichen Blutplättchen (erhalten vom Roten Kreuz) wurden durch vorsichtiges Rühren in 3% Octylglucosid, 2-0 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ bei 4°C für 2 h lysiert. Das Lysat wurde mit 100 000 g für 1 h zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde auf eine 5 ml Lentil-Lectin-Sepharose-4B-Säule (E.Y. Labs) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1% Octylglucosid (Puffer A) voräquilibriert worden war. Nach 2 h Inkubation wurde die Säule mit 50 ml kaltem Puffer A gespült. Das Lectin-zurückgehaltene GPIIb-IIIa wurde mit Puffer A eluiert, der 10 % Dextrose enthielt. Alle Arbeitsgänge wurden bei 4°C durchgeführt. Das erhaltene GPIIb-IIIa war > 95% rein, wie durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese gezeigt wird.
Aufnahme von GPIIb-IIIa in Liposomen
Eine Mischung aus Phosphatidylserin (70%) und Phosphatidylcholin (30%) (Avanti Polar Lipids) wurde an die Wände eines Glasröhrchens unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Gereinigtes GPIIb-IIIa wurde auf. eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt und mit den Phospholipiden in einem Protein:Phospholipid-Verhältnis von 1 : 3 (G:G) vermischt. Die Mischung wurde resuspendiert und in einem Ultraschallbad für 5 min ultraschallbehandelt. Die Mischung wurde dann über Nacht unter Verwendung von Dialyseschläuchen mit einer Molekulargewichtskante von 12,000 bis 14 000 gegen einen 1000-fachen Überschuß von 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ (mit 2 Wechseln) dialysiert. Die GPIIb-IIIa-enthaltenden Liposome wurden mit 12 000 g für 15 min zentrifugiert und im Dialysepuffer mit einer Protein-Endkonzentration von ca. 1 mg/ml resuspendiert. Die Liposomen wurden bis zum Bedarf bei –70°C gelagert.
Rompetitive Bindung an GPIIb-IIIa
Die Bindung an den Fibrinogen-Rezeptor (GPIIb-IIIa) wurde durch ein indirektes kompetitives Bindungsverfahren unter Verwendung von [³H]-SK&F-107260 als Ligand vom RGD-Typ untersucht. Der Bindungstest wurde in einem Filtrationsplattenaufbau mit 96 Vertiefungen (Millipore Corporation, Bedford, MA) unter Verwendung von hydrophilen 0,22 μm Durapore-Membranen durchgeführt. Die Vertiefungen wurden mit 0,2 ml 10 μg/ml Polylysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei Raumtemperatur für 1 h vorbeschichtet, um die nicht-spezifische Bindung zu blockieren. Verschiedene Konzentrationen unmarkierter Benzazepine wurden in die Vertiefungen in 4-facher Ausführung gegeben. [³H]-SK&F-107260 wurde auf jede Vertiefung in einer End konzentration von 4,5 nM angewendet, gefolgt von der Zugabe von 1 μg der gereinigten GPIIb-IIIa-enthaltenden Blutplättchenliposomen. Die Mischungen wurden für 1 h bei Raumtemperatur nkubiert. Das GPIIb-IIIa-gebundene (³H]-SK&F-107260 wurde vom ungebundenen durch Filtration unter Verwendung eines Millipore-Filtrationsverteilers abgetrennt, gefolgt von Spülen mit eiskaltem Puffer (zweimal, jeweils 0,2 ml). Auf den Filtern verbleibende, gebundene Radioaktivität wurde in 1,5 ml Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA) in einem Beckman Liquid Scintillation Counter (Modell LS6800) mit 40%igem Wirkungsgrad gezählt. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 2 μM unmarkiertem SK&F-107260 bestimmt und war durchgehend weniger als 0,14% der gesamten, zu den Proben hinzugegeben Radioaktivität. Alle Datenpunkte sind der Mittelwert von Bestimmungen in 4-facher Ausführung.
Die kompetitiven Bindungsdaten wurden durch ein nicht-lineares Kurvenanpassungsverfahren der kleinsten Fehlerquadrate analysiert. Dieses Verfahren liefert-den IC₅₀-Wert der Antagonisten (Konzentration des Antagonisten, die die spezifische Bindung von [³H]-SK&F-1-07260 um 50% im Gleichgewicht hemmt). Der IC₅₀-Wert steht mit Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Ki) des Antagonisten auf der Basis der Cheng-Prusoff-Gleichung in Verbindung: Ki = IC₅₀/(1+L/Kd), worin L die im kompetitiven Bindungstest verwendete Konzentration von [³H]-SK&F-107260 ist (4,5 nM) und Kd die Dissoziationskonstante von [³H]-SK&F-107260 ist, die durch Scatchard-Analyse bestimmt 4,5 nM beträgt.
Bevorzugte Verbindungen dieser Erfindung haben eine Affinität für den Vitronektin-Rezeptor relativ zum Fibrinogen-Rezeptor von mehr als 10 : 1. Die am meisten bevorzugten Verbindungen haben ein Aktivitätsverhältnis von größer als 100 : 1.
Die Wirksamkeit der Verbindungen dieser Erfindung allein oder in Kombination mit einem antineoplastischen Mittel kann unter Verwendung verschiedener Modelle von transplantierbarem Maustumor bestimmt. werden. Siehe US-PSen 5 004 758 und 5 633 016 für Einzelheiten dieser Modelle.
Die Beispiele sollen keineswegs den Umfang dieser Erfindung beschränken, sondern werden zur Erläuterung bereitgestellt, wie die Verbindungen dieser Erfindung hergestellt und verwendet werden. Viele andere Ausführungsformen werden den Fachleuten leicht ersichtlich sein.
Beispiele
Allgemein
Kernresonanzspektren wurden bei entweder 250 oder 400 MHz unter Verwendung eines Spektrometers Bruker AM 250 bzw. Bruker AC 400 auf gezeichnet. CDCl₃ ist Deuterochloroform, DMSO-d₆ ist Hexadeuterodimethylsulfoxid, und CD₃OD ist Tetradeuteromethanöl. Chemische Verschiebungen werden in Teilen pro Million (δ) feldabwärts vom internen: Standard Tetramethylsilan angegeben. Abkürzungen für NMR-Daten sind wie folgt: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletts, dt = Dublett von Tripletts, app = scheinbar, br = breit. J gibt die in Hertz gemessene NMR-Kopplungskonstante an. Dauerstrich-Infrarot-(IR)-Spektren wurden an einem Perkin-Eimer 6,83-lnfrarotspektrometer aufgezeichnet, und Fouriertransforrn-Infrarot-(FTIR)-Spektren wurden an einem Nicolet Impact 400D Infrarot-Spektrometer aufgezeichnet. IR- und FTIR-Spektren wurden im Transmissionsmodus aufgezeichnet, und Bandenpositionen werden in reziproken Wellenzahlen (cm^-1) angegeben. Massenspektren wurden entweder an einem VG 70 FE, PE Syx API III oder VG ZAB HF-Instrument unter Verwendung der Fast Atom Bombardment (FAB) oder Elektrospray-(ES)-Ionisationstechniken aufgenommen. Elementaranalysen wurden unter Verwendung eines Perkin-Eimer 240C Elementaranalysators erhalten. Schmelzpunkte wurden an einem Thomas-Hoover-Schmelzpunkt-Bestimmungsapparat aufgenommen und sind unkorrigiert. Alle Temperaturen werden in Grad Celsius angegeben.
Analtech Silica Gel GF und E. Merck Silica Gel 60 F-254 Dünnschichtplatten wurden für die Dünnschichtchromatographie verwendet. Sowohl Flashals auch Schwerkraft-Chromatograph e wurden an E. Merck Kieselgel 60 (230-400 mesh) durchgeführt. Analytische und präparative HPLC wurden an Raininoder Beckman-Chromatographen durchgeführt. ODS bezeichnet einen Octadecylsilyl-derivatisierten chromatographischen Kieselgelträger. 5 μm Apex-ODS gibt einen Octadecylsilyl-derivatisierten chromatographischen Kieselgelträger mit einer Teilchen-Nenngröße von 5 μm an, hergestellt von Jones Chromatography, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ^® ist ein chromatographischer ODS-Träger und ist ein eingetragenes Warenzeichen von YMC Co. Ltd. Kyoto, Japan. PRP-1^® ist eine polymerer (Styrol-Divinylbenzol) chromatographischer Träger und ist ein eingetragenes Warenzeichen von Hamilton Co., Reno, Nevada. Celite^® ist, eine aus säuregewaschener Diatomeenerde zusammengesetzter Filterhilfsstoff und ist ein eingetragenes Warenzeichen von Manville Corp., Denver, Colorado.
Herstellung 1
Herstellung von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-carboxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat
a) 3-Benzyl-4-(trifluormethansulfonyloxy)anisol
Trifluormethansulfonsäureanhydrid (10,0 ml, 60 mmol) wurde während 3 min zu einer Lösung aus 2-Benzyl-4-methoxyphenol (10,71 g, 50 mmol, hergestellt gemäß J. Am. Chem. Soc. 1949, 71, 64) und wasserfreiem 2,6-Lutidin (12,0 ml, 100 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (250 ml) bei –78°C unter Argon gegeben. Die Reaktion wurde bei –78°C für 0,5 h gerührt und dann auf RT erwärmt. Nach 1 h wurde die Reaktion mit Hexan (250 ml) verdünnt und nacheinander mit 1,0 N HCl (2 × 100 ml), 1,0 N NaOH (2 × 50 ml), H₂O (100 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen. Trocknen (Na₂SO₄), Aufkonzentrieren und Kieselgel-Chromatographie (10% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als hellgelben Feststoff (16,65 g, 96%):
DC R_f 0,51 (10% EtOAc/Hexan);
¹H-NMR (250. MHz, CDCl₃) δ 7,10 – 7,40 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 9,0, 3,1Hz, 1H); 6,66 (d; J = 3,1Hz, 1H), 4,03 (s, 2H), 3,73 (s, 3H);
FTIR (CCl₄) 1492, 1423, 1405, 1249, 1216, 1161, 1144, 1039, 869 cm^–1;
MS,(ES) m/e 369 (M + Na)⁺, 364,0 (M + NH₄)⁺, 347,0 (M + H)⁺.
b) 4-Allyl-3-benzylanisol
LiCh (3,08 g, 72,8 mmol) in einem Rundkolben wurde im Hochvakuum feuergetrocknet, und man ließ das System unter Argon auf RT, abkühlen. 3-Benzyl-4-(trifluormethansulfonyloxy)anisol (21,0 g, 60,6 mmol), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (2,13 g, 3,0 mmol), wasserfreies DMF (150 ml) und Allyltributylzinn (22,6 ml, 72,8 mmol) wurden hinzugegeben, und die Mischung wurde mit Argon durch drei Zyklen von Evakuierung/Argonspülung gespült. Die Mischung wurde in einem auf 95°C voreingestellten Ölbad erwärmt, was eine gelbe homogene Lösung lieferte. Nach 1,5 h wurde die dunkle Mischung an einem Rotationsverdampfer (Hochvakuum) aufkonzentriert, und der Rückstand wurde aus Xylolen erneut auf konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in Et₂O (12-0 ml) aufgenommen und kräftig mit l0%igem KF (120 ml) für 0,5 h gerührt. Die Schichten wurden getrennt, und. die wäßrige Schicht wurde mit Et₂O (2 × 120 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Anteile wurden durch Celite^® zur Entfernung der unlöslichen Feststoffe filtriert, und das Filtrat wurde nacheinander mit H₂O (60 ml) und Kochsalzlösüng (60 ml) gewaschen. Trocknen (MgSO₄) und Aufkonzentr eren ließ ein trübes gelbes Öl zurück. Chromatographie (Kieselgel, 5% EtOAC/Hexan) ergab die Titelverbindung als hellgelbes Öl (14,21 g, 98%):
DC R_f 85% (5% EtOAc/Hexan) 0,51;
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7,03–7,31 (m, 6H), 6,74 (dd, J = 8,3, 2,7Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,7Hz, 1H), 5,79–5,98 (m, 1H), 4,89–5,07 (m, 2H), 3,97 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,21–3,33 (m, 2H); FTIR (CCl₄) 1610, 1496, 1256, 1046, 914 cm ^-1;
MS (ES) m/e 239,2 (M + H)⁺.
c) 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure
Eine Lösung aus H₅IO₆ (23,83 g, 104,5 mmol) in H₂O (56 ml) wurde zu einer Lösung aus 4-Allyl-3-benzylanisol (5,30 g, 22,24 mmol) in CCl₄ (28 ml ), und CH₃CN (28 ml) gegeben, und die gut gerührte Mischung wurde sorgfältig auf 0°C gekühlt. RuCl₃ (231 mg, 1,11 mmol) wurde hinzugegeben, und die Reaktion wurde kräftig bei 0°C für 4 Stunden gerührt und dann bei RT für 45 min. Die Mischung wurde durch Celite^® filtriert, und das Filterkissen wurden mit CH₂Cl₂ (120 ml) und dann mit H₂O (120 ml) gewaschen. Die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert (3 × 120 ml). Trocknen (Na₂SO₄) und Aufkonzentrieren ließ ein braunes Öl zurück. Dieses wurde zwischen Et₂O (90 ml) und 0,25 N NaOH (90 ml)-partitioniert, und die Schichten wurden getrennt. Die Et₂O-Schicht wurde mit 0,25 N NaOH extrahiert (2 × 10 ml), und die vereinigten wäßrigen Schichten wurden mit konzentriertem HCl angesäuert (pH 2). CH₂Cl₂-Extraktion, Trocknen (Na₂SO₄) und Aufkonzentrieren ergab die Titelverbindung als gelbes Öl, das sich zu einem gelben Feststoff verfestigte (4,19 g, 74%):
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7,05–7,35 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,7Hz, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (s, 2H);
FTIR (CCl₄) 2300–3500 (breit), 1710, 1611, 1502, 1496, 1285, 1257, 1045 cm ^-1;
MS (ES} m/e 279,0 (M + Na)⁺, 274 (M + NH₄)⁺, 257,0 (M + H)⁺.
d) 3-Methoxy-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-10(11H)-on
Feingepulverte 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure (3,26 g, 12,72 mmol) wurde zu gut gerührter Polyphosphorsäure (165 g) bei 100–110°C gegeben. Nach 15 Minuten wurde die Reaktion auf Eis (330 g) gegossen. Et₂O (330 ml) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde kräftig für 15 min gerührt. Die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit Et₂O (330 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 5%igem NaHCO₃ (2 × 80 ml), dann mit Kochsalzlösung (80 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und auf konzentriert. Der Rückstand wurde aus Toluol erneut aufkonzentriert und dann chromatographiert (Kieselgel, 20% EtOAc/Hexan). Die Titelverbindung wurde als gelber Feststoff erhalten (1,44 g, 48%):
DC R_f (20% EtOAc/Hexan) 0,46; ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 8,07–8,15 (m, 1H), 7,39–7,49 (m, 1H), 7,25–7,48 (m, 2H), 7,19 (d, J = 8,3Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,71 (dd, J = 8,3, 2,6Hz, 1H), 4,21 (s, 2H), 4,11 (s, 2H), 3,77 (s, 3H);
FTIR (CCl₄) 1680, 1501, 1282, 1270 cm^-1;
MS (ES) m/e 261 (M + Na)⁺, 256,0 (M + NH₄)⁺, 239,0 (M + H)⁺.
e) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-l0-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cycloheptten-10-acetat
Wasserfreies EtOAc (0,58 ml, 6,6 mmol) wurde zu einer Lösung aus Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (1,0 M in THF, 6 ml, 6 mmol) in trockenem THF (24 ml) in einem feuergetrocknetem Kolben bei –78°C unter Argon ge- tropft. Die gelbe Lösung wurde bei –78°C für 0,5 h gerührt, dann wurde eine Lösung aus 3-Methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10(11H)-on (715 mg, 3 mmol) in trockenem THF (3 ml) während 3 min hinzugetropft. Zusätzliches trockenes THF (0,4 ml) wurde bei der Übertragung verwendet. Nach 0,5 h bei –78°C wurde die Reaktion mit gesättigtem NH₄Cl (15 ml)-gelöscht, auf RT erwärmt und mit EtOAc extrahiert (2 × 30 ml). Trocknen (MgSO₄), Aufkonzentrieren und Chromatographie (Kieselgel, 10% EtOAc/Hexan (400 ml), dann 20% EtOAc/Hexan)-ergab gewonnenes 3-Methoxy-6H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10(11H)on (305,4 mg, 43 %) als gelben Feststoff, gefolgt von der Titelverbindungals hellgelbes Öl (531,9 mg, 54%):
DC R_f 0,37 (20% EtOAc/Hexan);
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7,63 (d, J = 7,7Hz, 1H), 7,00–7,30 (m, 4H), 6,80 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,69 (dd, J = 8,2, 2,6Hz, 1H), 3,95–4,35 (m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 1H), 3,64 (d, J = 14,2Hz, 1H), 3,35 (d, J = 14,2Hz, 1H), 2,79 (d, J = 16,0Hz, 1H), 2,66 (d, J = 16,0Hz, 1H), 1,22 (t, J = 7,2Hz, 3H);
FTIR (CCl₄) 3580 (scharf), 3509 (breit), 1735, 1715, 1503, 1261, 1198, 1156, 1044 cm^-1;
MS (ES)m/e 675,2 (2M + Na)⁺, 653,2 (2M + H)⁺.
f) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat.
10% Pd/C (242 mg, 0,23 mmol) wurde zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (741,1 mg, 2,27 mmol) und konz. HCl (0,19 ml, 2,27 mmol) in Eisessig (23 ml) gegeben, und die Mischung wurde auf einer Parr-Vorrichtung bei RT unter H₂ (50 psi) geschüttelt. Nach 6 h wurde die Reaktion durch Celite^® filtriert, und das Filterkissen wurde mit EtOAc gewaschen. Das Filtrat wurde auf konzentriert, und der Rückstand wurde aus Toluol erneut auf konzentriert. Der resultierende schwachgelbe ölige Rückstand wurde chromatographiert (Kieselgel, 20% EtOAc/Hexan), um die Titelverbindung als farbloses Öl zu ergeben (643,6 mg, 91%):
DC R_f 0,57 (20% EtOAc/Hexan);
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7,05–7,22 (m, 4H), 7,01 (d, 1 = 8,2Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,7Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,7Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,0Hz, 1H), 4,11–4,25 (m, 2H), 3,85 (d; J = 15,0Hz, 1H), 3,70–3,90 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,31 (dd, J = 15,0, 4,1Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 5,0Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,3Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1Hz, 3H);
FTIR (CCl₄) 1734, 1611, 1504, 1285, 1263, 1155, 1044 cm ^-1;
MS (ES)m/e 333,0 (M + Na)⁺, 328,0 (M + NH₄)⁺, 311,0 (M + H)⁺, 265,0 (M + H - EtOH)⁺.
g) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Wasserfreies AlCl₃ (1,38 g, 10,35 mmol) wurde auf einmal zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (643,6 mg, 2,07 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (21 ml) bei 0°C unter Argon gegeben. Die gelbe Lösung wurde auf RT erwärmt und für 3 h gerührt, dann auf 0°C abgekühlt und mit kaltem 3 N HCl (10 ml) gelöscht. Die Schichten wurden getrennt; und die wäßrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄) und aufkonzentriert: Kieselgel-Chromatographie (25% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als fast farbloses Öl (611,7 mg, 100%):
DC R_f 0,26 (20% EtOAc/Hexan);
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7,03–7,22 (m, 4H), 6,93 (d, J = 8,1Hz, 1H), 6,69 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 8,1, 2,6Hz, 1H), 5,00 (s, 1H), 4,25 (d; J = 14,9Hz, 1H), 4,11–4,25 (m, 2H), 3,73–3,88 (m, 1H), 3,79 (d, J = 14,9Hz, 1H), 3,28 (dd, J = 15,0, 4,1Hz, 1H), 2,91 (dd, J = 15,0, 9,3Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,6, 4,9Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,6, 9,5Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H);
FTIR (CCl₄) 3611 (scharf), 3447 (breit), 1734, 1504, 1291, 1272, 1176, 1152 cm^-1;
MS (ES) m/e 314,2 (M + NH₄)⁺, 297,2 (M + H)⁺.
h) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-(trifluormethansulfonyloxy)-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat
Trifluormethansulfonsäureanhydrid (0,45 ml, 2,68 mmol) wurde zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat (611,7 mg, 2,06 mmol) und 2,6-Lutidin (0,48 ml, 4,12 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (10,3 ml) bei –78°C unter Argon getropft. Nach 0,5 h wurde die Reaktion auf RT erwärmt und für 1 h gerührt. Die gelbe Lösung wurde mit Et₂O (50 ml) verdünnt und nacheinander mit 1,0 N HCl (5 ml), 5%igem NaHCO₃ (5 ml) und Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen. Trocknen (MgSO₄), Aufkonzentrieren und Kieselgel-Chromatographie (20% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als farbloses Öl (808,9 mg, 92%}.
DC R_f(20% EtOAc/Hexan) 0,58;
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 6,98–7,30 (m, 7H), 4,35 (d, J = 15,2Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1Hz, 2H), 3,91 (d, J = 15,2Hz, 1H), 3,78–3,95 (m, 1H), 3,37 (dd, J = 15,2, 4,1Hz, (H), 3,02 (dd, J = 15,2, 9,6Hz, 1H), 2,70 (dd, J = 15,8, 4,8Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,6Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1Hz, 3H);
FTIR (CCl₄) 1735, 1493; 1427, 1250, 1215, 1144, 961, 856 cm^-1;
MS (ES) m/e 451,1 (M + Na)⁺, 446,2 (M + NH₄)⁺, 429,2 (M + H)⁺.
i) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-carboxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-(trifluormethansulfonyloxy)-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-l0-acetat (808,9 mg, 1,89 mmol), KOAc (742 mg, 7,56 mmol), Pd(OAc)₂ (21,2 mg, 0,095 mmol), 1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocen (210 mg, 0,38 mmol) und wasserfreiem DMSO (11 ml) wurde mit Kohlenmonoxid gespült (drei Zyklen von Evakuierung/CO-Spülung, gefolgt von Durchblasen von CO durch die Mischung für 5 min), dann wurde unter einem CO-Ballon in einem auf 70°C eingestellten Ölbad gerührt. Nach 3,5 h wurde die Reaktion mit H₂O (11 ml) verdünnt, auf 0°C abgekühlt und mit 1,0 N HCl (ca. 8 ml) angesäuert. CH₂Cl₂-Extraktion (3 × 30 ml), Trocknen (Na₂SO₄), Aufkonzentrieren und erneutes Aufkonzentrieren aus Toluol ließ eine rötlich orangefarbene Flüssigkeit zurück (2–3 ml). Chromatographie (Kieselgel, 3 : 2 : 0,1, EtOAc/Toluol/AcOH; gemischte Fraktionen erneut mit 1 : 1 : 0,1 EtOAc/Toluol/AcOH) ergab die Tite1verbindung (581,9 mg, 95%) als viskoses gelbes Öl, das im Hochvakuum bei 40°C teilweise kristallisierte:
DC Rf (3 : 2 : 0,1 EtOAc/Toluol/AcOH) 0,60;
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7,95 (d; J = 1,5Hz, 1H), 7,87 (dd, J = 7,8, 1,5Hz, 1H), 7,00–7,35 (m, 5H), 4,40 (d, J = 15, 2Hz, 1h), 4,19 (q, J = 7,1Hz, 2H), 3,97 (d, J = 15,2Hz, 1H), 3,82–4,00 (m, 1H), 3,43 (dd, J = 15,3, 4,0Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 15,3, 9,5Hz, 1H), 2,69 (dd, J = 15,8, 4,8Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,5Hz, 1H), 1,28 (t, J = 7,1Hz, 3H);
FTIR (CCl₄) 2357–3378 (breit), 1735, 1692, 1280 cm^-1;
MS (ES) m/e 342,2 (M + NH₄)⁺, 325,2 (M + H)⁺, 307,2 (M + H-H₂O)⁺.
Herstellung 2
Herstellung von Ethyl-2-carboxy-10,11-dihydro-5H=dibenzo[a,d]cycloheptenyl-10-acetat
a) Methyl-2-benzoyl-5-methoxyphenylacetat
Methyl-3-methoxy-phenylacetat wurde mit Benzoylchlorid und Aluminiumchlorid wie in J. Chem. Soc., Perkin Trans I, 1991, 171 beschrieben behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
b) Methyl-2-benzyl-5-methoxyphenylacetat
Die Verbindung der Herstellung 2(a) wird mit Natriumborhydrid und Trifluoressigsäure in Dichlormethan gemäß dem allgemeinen Verfahren von Synthesis 1978, 763 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
c) 2-Benzyl-5-methoxyphenylessigsäure
Die Verbindung der Herstellung 2(b) wird mit wäßrigem Natriumhydroxid und Methanol behandelt und gerührt. Die Mischung wird auf konzentriert und mit verdünnter Salzsäure behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
d) 5,11-Dihydro-2-methoxy-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
Die Verbindung aus Herstellung 2(c) wird zu einer Mischung aus Phosphorsäure und Phosphorpentoxid gegeben, gerührt und auf 80°C erwärmt gemäß dem allgemeinen Verfahren von US-PS 3 567 730 , um die Titelverbindung zu ergeben.
e) 5,11-Dihydro-2-hydroxy-l0H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
Die Verbindung aus Herstellung 2(d) wird mit Ethanthiol und Aluminiumchlorid gemäß dem allgemeinen Verfahren von Tetrahedron Letters 1978, 5211 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
f) 5,11-Dihydro-2-(trifluormethansulfonyl)oxy-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
Die Verbindung aus Herstellung 2(e) wird mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid gemäß dem allgemeinen Verfahren von J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 904 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben:
g) 5,11-Dihydro-2-methoxycarbonyl-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
Die Verbindung aus Herstellung 2(f) wird mit Kohlenmonoxid, Methanol, Palladiumacetat und 1,3-Bis(diphenylphosphino)propan in Dimethylsulfoxid gemäß dem allgemeinen Verfahren von J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 904 behandelt, um die Titelverbindung au ergeben.
h) 5,11-Dihydro-2-carboxy-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
Die Verbindung aus Herstellung 2(g) wird mit verdünntem wäßrigem Natriumhydroxid behandelt. Die Mischung wird mit verdünnter Salzsäure behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
i) 5,11-Dihydro-2-tert-butoxycarbonyl-10H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
Die Verbindung aus Herstellung 2(h) wird mit N,N-Dimethylformam d-ditert-butylacetal gemäß dem allgemeinen Verfahren von Synthesis 1983, 2, 135 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
j) Ethyl-2-tert-butoxycarbonyl-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Die Verbindung aus Herstellung 2(i) wird mit Zinkpulver und Ethylbromacetat gemäß dem allgemeinen Verfahren von Org. Reactions 1947, 1, 1 und J. Am. Chem. Soc., 1938, 60, 2947 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
k) Ethyl-2-carboxy-5H-dibenzo[a,d]cyalohepten-10-acetat
Die Verbindüng aus Herstellung 2(j) wurde mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan behandelt und gerührt. Die Mischung wird auf konzentriert, um die Titelverbindüng zu ergeben.
Herstellung 3
Herstellung von 2-[(2-Aminoethyl)aminoppyridindihydrochlorid
a) Mono-Boc-1,2-ethylendiamin
Eine Lösung aus Di-tert-butyldicarbonat (10,91 g, 50 mmol) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde während 30 min zu einer kräftig gerührten Lösung aus 1,2-Ethylendiamin (33 ml, 500 mmol) in CH₂Cl₂ (250 ml) bei 0°C unter Argon getropft. Während der Zugabe trennte sich eine Ausfällung ab. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktion auf RT erwärmt, für 1 h gerührt und am Rotationsverdampfer auf konzentriert. Der Rückstand wurde in H₂O (100 ml) aufgenommen und filtriert, um eine kleine Menge von unlöslichem Material zu entfernen. Das Filtrat wurde mit CH₂Cl₂ gewaschen (3 × 100 ml), und die vereinigten organischen Anteile wurden getrocknet (MgSO₄) und auf konzentriert, um die Titelverbindung (6,00 g, 75%) als trübe Flüssigkeit zu ergeben:
¹H-NMR (250,CDCl₃) δ 4,75–5,00 (m, 1h}, 3,05–3,25 (m, 2H), 2,65 – 2,85 (m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,12 (br s, 2H),
b) 2-[[2-(Boc-amino)ethyl]amino]pyridin-N-oxid
Eine Mischung aus Mono-Boc-1,2-Ethylendiamin (5,83 g, 36,39 mmol), 2-Chlorpyridin-N-oxidhydrochlorid (7,25 g, 43,67 mmol), NaHCO₃ (15,29 g, 182 mmol) und tert-Amylalkohol (36 ml) wurde zum Rückfluß erwärmt. Nach 47 h wurde die dunkelbraune Mischung abgekühlt, mit CH₂Cl₂ (100 ml) verdünnt und abgenutscht, um unlösliche Stoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde auf konzentriert und aus Toluol erneut aufkonzentriert. Kieselgel-Chromatographie (10% MeOH/CHCl₃) ergab unreine Titelverbindung (8,23 g, 89%) als gelben Feststoff, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde:
DC (10% MeOH/CHCl₃) R_f 0,42;
¹H-NMR (250, CDCl₃) δ 8,16 (dd, J = 6,5, 1,3Hz, 1H), 7,05–7,30 (m, 2H), 6,68 (br d, J = 8,6Hz, 1H), 6,50–6,65 (m, 1H), 5,70–5,95 (m, 1H), 3,25–3,60 (m, 4H), 1,44 (s, 9H);
MS (ES) m/e 254 (M + H)⁺.
c) 2-[[2-(Boc-amino)ethyl]amino]pyridin
10% Pd/C (106,4 mg, 0,10 mmol) wurde zu einer Lösung aus 2-[[2-(Bocamino)ethyl]amino]pyridin-N-oxid (126,7 mg, 0,5 mmol) und Cyclohexen 0,25 ml, 0,25 mmol) in absolutem Ethanol (5 ml ) gegeben, und die Mischung. wurde zum Rückfluß erwärmt. Nach 16 h wurde die Reaktion durch Celite^® filtriert, und das Filtrat wurde aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit dem aus einer separaten Herstellung (Maßstab 0,5 mmol) erhaltenen Rückstand vereinigt, und die vereinigten Stoffe wurden durch Kieselgel-Chromatographie (5% MeOH/CHCl₃) gereinigt. Die Titelverbindung (148,4 mg; 63% auf Basis von 1 mmol 2-[[2-(Boc-aminö)ethyl]amino]pyridin-N-oxid) wurde als gelbes Öl erhalten:
DC (5% MeOH/CHCl₃) R_f 0,43;
¹H-NMR (400, CDCl₃) δ 8,05–8,12 (m, 1H), 7,37–7,46 (m, 1H), 6,53–6,61 (m, 1H), 6,41 (d, J = 8,3Hz; 1H), 5,12 (br s, 1H), 4,86 (br s, 1h), 3,26 = 3,51 (m, 4H), 1,44 (s, 9H);
MS (ES) m/e 238 (M + H)⁺.
d) 2-[(2-Aminoethyl)amino]pyridindihydrochlorid
4N HCl in Dioxan (3,2 ml) wurde in einem Strom zu einer Lösung aus 2-[[2-(Boc-amino)ethyl]amino]pyridin (148,4 mg, 0,63 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (3,2 ml) bei 0°C gegeben, dann wurde die Reaktion auf RT erwärmt. Nach 2 h wurde die Mischung abgenutscht, um den ausgefällten Feststoff aufzusammeln, der mit wasserfreiem Et₂O gewaschen und getrocknet wurde, um die Titelverbindung (132,8 mg, quantitativ) als gelben Feststoff zu, ergeben:
¹H-NMR (400, CD₃OD) δ 7,99–8,07 (m, 1H), 7,92–7,98 (m, 1H), 7,19 (d, J = 9,1Hz, 1H), 6,98–7,04 (m, 1H), 3,76 (t, J = 6,2Hz, 2H), 3,27 (t, J = 6,2Hz, 2H, teilweise verdeckt durch Restlösungsmittel-Signal);
MS (ES) m/e 138 (M + H)⁺.
Herstellung 4
Herstellung von 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid
Eine Mischung aus 2-Chlorpyridin-N-oxid (16,6 g, 0,1 mol), 3-Amino-1-propanol (15,3 ml, 0,2 mol), NaHCO₃ (42 g, 0,5 mol) und tert-Amylalkohol (100 ml) wurde zum Rückfluß erwärmt. Nach 21 h wurde die Reaktion abge kühlt, mit CH₂Cl₂ (300 ml) verdünnt und abgenutscht, um unlösliche Stoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde auf konzentriert und erneut aus Toluol aufkonzentriert, wobei ein gelbes Öl zurückblieb. Kieselgel-Chromatographie (20% MeOH/CHCl₃) ergab die Titelverbindung (15,62 g, 93%) als gelben Feststoff:
DC (20% MeOH/CHCl₃) R_f 0,48;
¹H-NMR (250, CDCl₃) δ 8,07 (dd, J = 6,6, 1,2Hz, 1H), 7,34 (br t, 1H), 7,10–7,30 (m, 1H), 6,64 (dd, J = 8,5, 1,4Hz, 1H), 6,40–6,60 (m, 1H), 4,49 (br s, 1H), 3,65–3,90 (m, 2H), 3,35–3,60 (m, 2H), 1,75–2,00,(m, 2H);
MS (ES) m/e 169 (M + H)⁺.
Herstellung 5
Herstellung von 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid
a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid
Gemäß dem Verfahren von Herstellung 12, außer daß 2-Chlorpyridin-Noxidhydrochlorid gegen 2-Chlor-4-nitropyridin-N-oxid ausgetauscht wurde (siehe Ja n, P.C.; Catterjee, S.K.; Anand, N., Indian Journal of Chemistry 1966, 403), wurde die Titelverbindung als orangefarbener Feststoff hergestellt:
MS (ES) m/e 214,2 (M + H)⁺.
Herstellung 6
Herstellung von 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid
a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid
Gemäß dem Verfahren von Herstellung 12, außer daß 2-Chlorpyridin-Noxidhydrochlorid gegen 2-Chlor-4-methylpyridin-N-oxid ausgetauscht wurde (siehe Brown, E.V., J. Amer. Chem. Soc. 1957, 79, 3565), wurde die Titelverbindung als cremefarbener Feststoff hergestellt:
MS (ES) m/e 183 (M + H)⁺.
Herstellung 7
Herstellung von 2-(Ethylamino)-6-pyridylethanol
a) 2-(N-Boc-amino)-6-picolin
Zu einer gerührten Lösung aus 2-Amino-6-picolin (4,33 g, 40 mmol), Et₃N (6,2 ml, 40 mmol) und CH₂Cl₂ (50 ml) bei 0°C wurde Di-tert-butyldicarbonat (9,6 g, 44 mmol) gegeben. Nach Rühren über RT über Nacht wurde die Reaktionsmischung im Vakuum auf konzentriert, mit H₂O verdünnt und mit CH2C12 (2 × 50 ml) extrahiert. Trocknen (MgSO₄) und Aufkonzentrieren ergab die Titelverbindung als farbloses Öl: MS (ES) m/e 209 (M + H)⁺.
b) 2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-picolin
Zu einer Suspension aus NaH (60%ige Dispersion in Mineralöl, 1,15 g, 29,5 mmol) in DMF (50 ml) bei 0°C wurde eine Lösung aus 2-(N-Boc-amino)-6-picolin in DMF (30 ml) gegeben. Die Reaktion wurde bei 0°C für 15 min gerührt; dann wurde Ethyliodid (4,6 g, 30 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt; dann wurde sie im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit H₂O verdünnt und mit CH₂Cl₂ (3 × 50 ml) extrahiert. Trockenen (MgSO₄), Aufkonzentrieren und Kieselgel-Chromatographie (20% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als farbloses Öl:
MS (ES) m/e 237 (M + H)⁺.
c) Ethyl-2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-pyridylacetat
LDA (0,018 mol) wurde in THF (30 ml) hergestellt, auf –78°C gekühlt und mit 2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-picolin (3,5 g, 15 mmol) versetzt, wodurch eine tiefrote Lösung gebildet wurde. Nach 15 min wurde Diethylcarbonat (2,2 ml, 17,9 mmol) hinzugegeben, die burgunderfarbene Lösung wurde bei –78°C für weitere 15 min gerührt, dann wurde die Reaktion mit gesättigtem NH₄Cl gelöscht. Die Mischung wurde, auf RT erwärmt und mit EtOAc extrahiert (3 × 30 ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und aufkonzentriert. Kieselgel-Chromatographie (10% EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung als farbloses Öl:
MS (ES) m/e 309 (M + H}⁺.
d) Ethyl-2-(ethylamino)-6-pyridylacetat
Eine Lösung aus Ethyl-2-(N-Boc-N-ethylamino)-6-pyridylacetat (1,5 g, 4,87 mmol) und 4 M HCl/Dioxan (5 ml, 20 mol) wurde bei RT über Nacht gerührt und dann aufkonzentriert. Erneutes Aufkonzentrieren aus Toluol ergab die Titelverbindung als weißen Feststöff:
MS (ES) m/e 209 (M + H)⁺.
e) 2-(Ethylamino)-6-pyridylethanol
Zu einer mechanisch gerührten Lösung aus LiAlH₄ in THF (1,0 M, 20 ml, 20,4 mmol) wurde eine Lösung aus Ethyl-2-(ethylamino)-6-pyridylacetat (1 g, 4,1 mmol) in THF (30 ml) getropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung zum Rückfluß erwärmt. Nach 5 h wurde die Reaktion auf 0°C abgekühlt und mit 10%iger NaOH-Lösung gelöscht. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ gelöst, und die Lösung wurde getrocknet (MgSO₄) und aufkonzentriert. Erneutes Aufkonzentrieren aus Toluol (3x) ergab die Titelverbindung als farbloses Öl:
MS (ES) 167 (M + H)⁺.
Herstellung 8
Herstellung von 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
a) 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure
Eine Lösung aus 2-Benzoyl-4-methoxyphenylessigsäure (13,0 g, 0,048 mol), hergestellt durch das Verfahren von J. Med. Chem. 1981, 24, 998, in Eisessig (600 ml) wurde unter Argon mit 4,3 g 10% Pd/C behandelt und bei 50 psi für 17 Stunden hydriert. Die Mischung wurde unter Verwendung von Celite^® filtriert, und das Filtrat wurde auf konzentriert und erneut aus Toluol und Methylenchlorid auf konzentriert, um 14,2 g der Titelverbindung zu ergeben:
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3,52 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,0 (s, 3H.), 6,7 (m, 2A), 7,15 (m, 6H).
b) 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
Eine Lösung aus 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure (14,2 g, 0,055 mol) in Benzol (120 ml) und Thionylchlorid (28 ml) wurde für 1 Stunde zum Rückfloß erwärmt und auf konzentriert. Das Säurechlorid wurde in trockenem Methylenchlor d (40 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter Argon zu einer Lösung aus AlCl₃(14,7 g, 0,11 mol) in Methylenchlorid (600 ml) getropft. Die Reaktion wurde unter einer Argonatmosphäre für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit Eiswasser (200 ml) gelöscht. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Phase wurde nacheinander mit 10%iger NaOH-Lösung, Wasser und verdünntem HCl gewaschen. Die resultierende Lösung wurde mit Ether (200 ml) verdünnt, über MgSO₄ getrocknet und auf konzentriert. Der feste Rückstand wurde mit Ether/Hexan (1 : 1) verrieben, und 9,35 g der Titelverbindung wurden durch Filtration aufgefängen: Smp. 105-106°Cp
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3,72 (s, 3H), 4,1 (s, 2H); 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, 1H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (m, 4H), 8,1 (d, 1H).
Herstellung 9
Herstellung von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
a) Ethyl-(±)-3-(3-methoxyphenyl)indenacetat
Zu einer kalten Lösung aus 3-(3-Methoxyphenyl)inden (4 g, 18 mmol), hergestellt durch das Verfahren von J. Med. Chem. 1981, 24, 998, in THF (15 ml) bei 0°C wurde eine Lösung aus LiN(TMS)₂ (20 ml, 1 M in THF) während 5 min getropft. Die resultierende Lösung wurde zu einer Lösung aus Ethylbromacetat (3,34 g, 20 mmol) in THF (15 ml) bei –78°C während 30 min getropft. Nach 2,5 h wurde die Mischung mit gesättigter Ammoniumchlorid- Lösung gelöscht, und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über MgSO₄, getrocknet und aufkonzentriert, um das Rohprodukt zu ergeben, das durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (Sio2/2–4% EtOAc/Hexan), um die Titelverbindung (1,1 g) zu ergeben:
1H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,30 (t, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 6,6 (s, 1H), 6,9 (m, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 6H).
b) Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzoyl)]phenylsuccinat
Eine Lösung aus Ethyl-(±)-3-(3-methoxyphenyl)indenacetat (1,1 g, 3,6 mmol) in Aceton (30,ml) wurde mit 4%iger wäßriger Osmiumtetroxid-Lösung (0,5 ml) behandelt, gefolgt von tropfenweiser Zugabe von 1,2 M Jones-Reagens (5 ml, 6 mmol) gemäß dem Literaturverfahren (J. Org. Chem. 1993, 58, 4745}. Nach Rühren Über Nacht bei Raumtemperatur wurde die dunkle Reaktionsmischung mit Isopropanol (2,5 ml) gelöscht, gefolgt von Natriumbisulfit (0,9 g) und Wasser (30 ml). Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und auf konzentriert, um einen festen Rückstand zu ergeben. Verreiben mit 1 : 1 Ether/Hexan ergab 0,76 g der Titelverbindung:
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,18 (t, 3H), 2,90 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m, 6H).
c) Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzyl)]phenylsuccinat
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzoyl)]phenylsuccinat (0,76 g, 2,1 mmol) und 10% Pd/C (0,6 g) in Eisessig (35 ml) wurde bei 50 psi für 17 Stunden hydriert: Die Mischung wurde unter Verwendung von Celite^® filtriert, und das Filterkissen wurde mit Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde aufkonzentriert und erneut aus Toluol und Methylenchlorid aufkonzentriert, um 0,65 g der Titelverbindung zu ergeben:
1H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,20 (t, 3H), 2,20 (m, 1H), 3,0 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H), 6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).
d) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-11-oxo-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Zu einer magnetisch gerührten Lösung aus Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzyl)]phenylsuccinat (0,65 g, 1,9 mmol) in trockenem Methylenchlorid (10 ml) wurden DMF (0,2 ml) und Oxalylchlorid (0,2 ml, 2,28 mmol) gegeben. Nach 1,5 h. wurde die Lösung zu einer Suspension aus Aluminiumchlorid (0,6 g, 4,5 mmol) in trockenem Methylenchlorid (15 ml) getropft. Die Mischung wurde nach 2 h mit Eiswasser gelöscht, die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über MgSO₄ getrocknet und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt (SiO₂/2–4% EtOAc/Hexan), um die Titelverbindung (0,3 g) zu ergeben:
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,28 (t, 3H), 2,88 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,88 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,85, (d, 1H), 4,95 (m, 1H), 5,8, (m, 2H), 7,22 (m, 4H), 8,1 (s, 1H).
e) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-3H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-11-oxo-5Hd benzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (0,3 g, 0,93 mmol) und 10% Pd/C (0,3 g) in Eisessig (25 ml) wurde bei 50 psi für 18 Stunden hydriert. Die Mischung wurde unter Verwendung von Celite^® filtriert und mit Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde aufkonzentriert und erneut aus Toluol und Methylenchlorid aufkonzentriert, um 0,25 g der Titelverbindung zu ergeben:
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,28 (t, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,85 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,30 (d, 1H), 6,70 (m, 2H), 7,0 (d, 1H), 7,22 (m, 4H).
Die folgenden Verbindungen erläutern Verfahren zur Herstellung der biologisch aktiven Verbindungen dieser Erfindung aus Zwischenverbindungen, wie sie in den vorhergehenden Herstellungen beschrieben wurden.
Referenzbeispiel 1
Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Eine Lösung aus 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid (1,94 g, 11,55 mmol) und D ethylazodicarobxylat (1,8 ml, 11,55 mmol) in wasserfreiem DMF (58 ml) wurde während 10 min zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (1,37 g, 4,62 mmol) und Triphenylphosphin (3,27 g, 12,47 mmol} in wasserfreiem DMF (23 ml) bei RT unter Argon getropft. Nach 23,5 h wurde die Reaktion am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, und der Rückstand würde aus Xylolen zur Entfernung von verbleibendem DMF aufkonzentriert. Kieselgel-Chromatographie (30% EtOAc/Hexan (0,5 l), dann EtOAc (1 l); dann 5% MeOH/CHCl₃) ergab wiedergewonnenes Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (298,1 mg, 22%), dann die Titelverbindung (1,54 g, 75%) als gelbes Öl:
¹H-NMR (250 MHz; CDCl₃) δ 8,10 (dd, J = 6,6, 1,3Hz, 1H), 6,85–7,30 (m; 7H)_; 6,78 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,68 (dd, J = 8,2, 2,6Hz, 1H), 6,61 (dd, J = 8,5, 1,6Hz, 1H), 6,456,57 (m, 1h), 4,29 (d, J = 15,1Hz, 1H); 4,10–4,25 (m, 2H), 4,06 (t, J = 5,7Hz, 2H), 3,84 (d, J = 15,1Hz, 1H), 3,70–3,92 (m, 1H), 3,49 (q; J = 6,5Hz, 2H), 3,30 (dd, J = 15,0, 4,2Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,3Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,6, 5,0Hz, 1H), 2,51 (dd, J = 15,6, 9,4Hz, 1H), 2,05–2,25 (m, 2H); 1,27 (t, J = 7,1Hz, 3H);
MS (ES) m/e 447 (M + H)⁺.
b) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(.2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-100,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,b]cyclohepten-10-acetat (1,54 g, 3,45 mmol), 10% Pd/C (0,73 g, 0,69 mmol); Cyclohexen (7 ml, 6,9 mmol) und Isopropanol(35 ml) wurde im Rückfluß für 2 h erwärmt, dann wurde der Katalysator durch Filtration durch Celite^® entfernt. Auf konzentrieren ließ ein gelbes Öl zurück, das erneut den Reaktionsbedingungen unterworfen wurde. Nach 17 h wurde die Reaktion wie zuvor aufgearbeitet, und der gelbe Rückstand wurde erneut den Reaktionsbedingungen unterworfen, wobei 1 : 1 EtOAc/Isopropanol (35 ml) anstelle von Isopropanol als Lösungsmittel verwendet wurde. Die Mischung wurde für 5 h zum Rückfluß erwärmt, Pd-Schwarz (73 mg, 0,69 mmol) wurde hinzugegeben, und der Rückfluß wurde für weitere 18,5 h fortgesetzt. Aufarbeitung wie zuvor, gefolgt von Kieselgel-Chromatographie (1 : 1 EtOAc/Hexan) ergab die Titelverbindung (0,94 g, 63%) als hellgelbes Öl:
DC Rf (1 : 1 EtOAc/Hexan) 0,38;
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8,02–8,11 (m, 1H), 7,33–7,42 (m, 1H), 7,02–7,20 (m, 4H), 7,00 (d, J = 8,2Hz, 1H), 6,77 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,6Hz, 1H), 6,50 – 6,60 (m, 1H), 6,39 (d, J = 8,5Hz, 1H), 4,69 (br t, 1H), 4,29 (d, J = 15,0Hz, 1H), 4,11 – 4,25 (m; 2H), 4,05 (t, J = 5,8Hz, 2H), 3,84 (d, J = 15,0Hz, 1H), 3,75–3,90 (m, 1H), 3,48 (app. q, 2H), 3,30 (dd, J = 15,0, 4,1Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 4,8Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,5Hz, 1H), 2,02–2,15 (m, 2H), 1,27 (t, J = 7,2Hz, 3H);
MS (ES) m/e 431 (M + H)⁺.
c) (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
Eine Mischung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (0,94, g, 2,18 mmol) und 1,0 N NaOH (2,6 ml, 2,62 mmol) in absolutem EtOH (19,2 ml) wird in einem auf 50°C eingestellten Ölbad erwärmt. Nach 28,5 h wurde die Reaktion am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, und der Rückstand wurde durch ODS-Chromatographie (1:1 MeOH/H₂O) gereinigt. Auf konzentrieren hinterließ eine trübe wäßrige Lösung, die durch Zugabe von etwas 1,0 N NaOH homogen gemacht wurde. Der pH wurde auf 7 mit 1,0 N HCl eingestellt, und der feste Niederschlag wurde aufgefangen und mit H₂O gewaschen. Die Mutterlaugen wurden auf konzentriert und der Rückstand in ähnlicher Weise behandelt, um eine kleine zweite Ausbeute zu liefern. Die vereinigten Materialien wurden im Hochvakuum bei 40°C getrocknet, um die Titelverbindung (0,70 g, 79%) als beinahe farblosen Feststoff zu liefern: HPLC (Hamilton PRP-1^®, 40% CH₃CN/H₂O enthaltend 0,1% TFA) k' = 1,2;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7,94 (d, J = 4,4Hz, 1H); 7,32–7,41 (m, 1H), 7,03–7,22 (m, 4H), 6,97 (d, J = 8,4Hz, 1H), 6,83 (d; J = 2,4Hz, 1H), 6,60–6,74 (m, 2H), 6,41–6,50 (m, 2H), 4,20 (d, J = 14,7Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,2Hz, 2H), 3,88 (d, J = 14,7Hz, 1H), 3,60–3,70 (m, 1H), 3,26–3,40 (m, 2H, teilweise durch Restlösungsmittel-Signal verdeckt), 3,20 (dd, J = 15,1, 4,3Hz, 1H), 2,83 (dd J = 15,1, 10,3Hz, 1H), 2,60 (dd, J = 15,9, 5,3Hz, 1H), 2,50 (dd, 1H, teilweise durch Restlösungsmittel-Signal verdeckt), 1,88 – 2,00 (m, 2H);
MS (ES) m/e 403 (M + H)⁺.
Analyse: berechnet für C₂₅H₂₆N₂O₃·0,25 H₂O: C, 73,78; H, 6,56; N, 6,88
gefunden: C, 73,85; H, 6,47; N, 6,75.
Beispiel 2
Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4-nitro-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclöhepten-10-acetat
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 1(a), außer daß 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid gegen 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid ausgetauscht wurde, wurde die Titelverbindung im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie (Gradient: 2:1 EtOAc/Hexan, dann EtOAc, dann 5% MeOH in 1 : 1 EtOAc/CHCl₃) erhalten:
MS (ES) m/e 492 (M + H)⁺.
b) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 1(b), außer daß Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat gegen Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4- nitro-N-oxopyr dyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat ausgetauscht wurde, wurde die Titelverbindüng im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie (20% MeOH/CHCl₃) erhalten:
(ES) m/e 446 (M + H)⁺.
c) (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-Essigsäure
1,0 N LiOH (0,74 ml, 0,74 mmol) würde auf einmal zu einer Lösung aus Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (216,3 mg, 0,49 mmol) in THF (2,5ml) und H₂O (1,8 ml) bei RT gegeben. Die zweiphasige Mischung wurde für 1 h in einem auf 40°C eingestellten Ölbad erwärmt, dann wurde absolutes EtOH (ca. 1 ml) zur Vereinigung der Phasen hinzugegeben. Die Reaktion wurde für 19,5 h auf 40°C gehalten und dann aufkonzentriert, und der Rückstand wurde in 1 : 1 CH₃CN/H₂O (5 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit TFA (0,11 ml, 1,47 mmol) angesäuert und aufkonzentriert. ODS-Chromatographie (40% CH₃CN/H₂O, enthaltend 0,1% TFA), gefolgt von Aufkonzentrieren zur Entfernung von CH₃CN hinterließ eine ölige wäßrige Lösung, die durch Zugabe von etwas CH₃CN homogen gemacht wurde. Der pH wurde mit 1,0 NaOH auf 7 eingestellt, und ein öliger halbfester Stoff fiel aus. Die Mischung wurde zur Entfernung des CH₃CN aufkonzentriert, und der resultierende Feststoff. wurde aufgefangen. Dieser wurde in wäßrigem NaOH gelöst, und der pH wurde auf 7 eingestellt. Der Feststoff wurde aufgefangen, mit viel H₂O gewaschen und im Hochvakuum bei 45°C getrocknet, um die Titelverbindung (133,3 mg, 61%) als cremefarbenen Feststoff zu liefern. HPLC (Hammilton PRP-1^®, 35% CH₃CN/H₂O enthaltend 0,1% TFA) k' = 3,0;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7,48 (d, J = 6,3Hz, 1H), 7,04–7,22 (m, 4H), 6,95 (d, J = 8,2Hz, 1H), 6,88–7,02 (m, 1H), 6,82 (d, J = 2,4Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,4Hz, 1H), 6,27 (br s, 2H), 5,95 (dd, 1H), 5,65 (schmal d, 1H), 4,18 (d, J = 14,7Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,1Hz, 2H); 3,88 (d, J = 14,7Hz, 1H), 3,59–3,10 (m, 1H), 3,13–3,30 (m, 3H}, 2,82 (dd, J = 15,2, 10,0Hz, 1H), 2,46 (dd, J = 15,8, 8,8Hz, 1H, teilweise durch Restlösungsmittel-Signal verdeckt), 2,58 (dd, J = 15,8, 5,2Hz, 1H), 1,86–2,01 (m, 2H);
MS (ES) m/e 418 (M + H)⁺.
Analyse:
berechnet für C₂₅H₂₇N₃O₃·1,67 H₂O: C, 67,09; H, 6,83; N, 9,39
gefunden: C, 66,99; H, 6,59; N, 9,34.
Beispiel 3
Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-(3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäüre
a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4-methyl-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 1(a), außer daß das 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid gegen 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid ausgetauscht wurde, wurde die Titelverbindung als blaßgelbes Öl im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie (Gradient: 30, 50, 100% EtOAc in Hexan, dann 1–5% MeOH in CHCl₃) erhalten
MS (ES) m/e 461,3 (M + H)⁺.
b) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 1(b), außer daß Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat gegen Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4-methyl-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat ausgetauscht wurde, wurde die Titelverbindung im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie (Gradient: 30–50% EtOAc in Hexan) erhalten:
MS (ES) m/e 445,3 (M + H)⁺.
c) (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
1,0 N NaOH (0,144 ml, 0,144 mmol) wurde zu einer Lösung aus Ethyl(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (35 mg, 0,08 mmol) in EtOH (5 ml) bei RT gegeben. Die Mischung wurde über Nacht in einem auf 32°C eingestellten Ölbad erwärmt und dann auf konzentriert. Der Rückstand wurde in H₂O (3 ml) gelöst, und die Lösung wurde mit 20%igem TFA angesäuert. ODS-Chromatographie (5–10% CH₂CN/H₂O, enthaltend 0,1% TFA), gefolgt von Aufkonzentrieren und Gefriertrocknung ergab die Titelverbindung als weißes Pulver:
MS (ES) m/e 417,3 (M + H)⁺.
Analyse:
berechnet für C₂₆H₂₈N₂O₃·2,0 TFA·1,0 H₂O: C, 54,38; H, 4,87; N, 4,23
gefunden: C, 54,66; H, 4,53; N, 4,32.
Beispiel 4
Herstellung von (±)-10,11-Dihydro-3-[2-(6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
a) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]eyclohepten-10-acetat
Gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 1(a), außer daß das 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]pyridin-N-oxid gegen 2-(Ethylamino)-6-pyridylethanol ersetzt wurde, wurde die Titelverbindung als farbloses Öl im Anschluß an Kieselgel-Chromatographie (5% MeOH/CH₂Cl₂) erhalten:
MS (ES) 445 (M + H)⁺.
b) (±)-10,11-Dihydro-3-(2-(6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5Hdibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure (80 mg, 0,18 mmol) wurde in MeOH (3 ml) gelöst, und 1,0 N NaOH (0,22 ml, 0,22 mmol) wurde hinzugegeben. Die Lösung wurde bei RT über Nacht gerührt und dann im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in H₂O (3 ml) gelöst, und die Lösung wurde mit 20%igem TFA angesäuert. Chromatographie an C-18 Bond Elute (30% CH₃CN/H₂O, enthaltend 0,1% TFA) ergab die Titelverbindung als weißen Feststoff:
MS (ES) 417 (M + H)⁺.
Analyse:
berechnet für C₂₆H₂₈N₂O₃·1,3 CF₃CO₂H: C, 60,83; H, 5,23; N, 4,96
gefunden: C, 60,64; H, 5,26; N, 4,26.
Die obige Beschreibung offenbart vollständig, wie die vorliegende Frfindung gemacht und verwendet wird. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die hier oben beschriebenen, besonderen Ausführungsformen beschränkt, sondern schließt alle Modifikationen davon im Umfang der folgendert Patentansprüche ein. Die verschiedenen Verweise auf Journale, Patente und andere Veröffentlichungen, die hier zitiert werden, umfassen den Stand der Technik und werden hier durch Verweis eingeführt, als ob sie vollständig aufgeführt werden.

Claims

Verbindung, die: (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure; (±)-10,11-Dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäüre; oder (±)-10,11-Dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäss Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäss Anspruch 1, ein antineoplastisches Mittel und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 3, worin das antineoplastische Mittel Topotecan oder Cisplatin ist.
Verbindung gemäss Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung eines Krankheitszustands, in dem ein Antagonismus des α_vβ₃-Rezeptors indiziert ist.
Verbindung gemäss Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung eines Krankheitszustands, in dem ein Antagonismus des α_vβ₅-Rezeptors indiziert ist.
Verbindung gemäss Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung von Osteoporose oder Entzündung.
Verbindung gemäss Anspruch l zur Verwendung in der Hemmung von Angiogenese, Tumorwachstum oder Tumormetastase.
Verbindung gemäss Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung von Atherosklerose oder Restenose.
Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krankheitszustands, in dem ein Antagonismus des α_vβ₃-Rezeptors indiziert ist.
Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krankheitszustands, in dem ein Antagonismus des α_vβ₅-Rezeptors indiziert ist.
Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Osteoporose oder Entzündung.
Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Angiogenese, Tumorwachstum oder Tumormetastase.
Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Atherosklerose oder Restenose.