CZ241599A3 - Antagonista vitronektinového receptorů - Google Patents

Abstract

Řešení popisuje určité tricyklické sloučeniny, kteréjsou antagonisty integrinového receptorů

Description

Antagonista vitronektinového receptorů

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceuticky účinných sloučenin, které inhibují vitronektinový receptor a jsou použitelné pro léčbu zánětu, nádorového bujení a kardiovaskulárních chorob, jako například atherosklerozy a restenózy, a onemocnění, u kterých dochází k resorpci kosti, jako například u osteoporózy.

Dosavadní stav techniky

Integriny patří do nadskupiny buněčných adhezních receptorů, což jsou transmembránové glykoproteiny exprimované na různých buňkách. Mezi tyto povrchové adhezní receptory patří gpIIb/IIIa (receptor pro fibrinogen) a α_νβ3 (vitronektinový receptor). Receptor pro fibrinogen gpIIb/IIIa je exprimován na povrchu krevních destiček a zprostředkovává agregaci destiček a tvorbu hemostatického krevního koagula v místě krvácejícího poranění (Philips a kol., Blood, 71, 831 (1988)). Vitronektinový receptor 0í_vp3 je exprimován na četných buňkách, včetně buněk endotheliálních, hladkých svalových buněk, osteoklastů a nádorových buněk, a proto má různé funkce. Receptor α_νβ3 exprimovaný na membráně osteoklastových buněk zprostředkovává adhezi osteoklastů ke kostní základní hmotě, což je klíčový krok v procesu kostní resorpce (Ross a kol., J. Biol. Chem., 262, 7703 (1987)). Onemocnění charakterizované nadměrnou kostní resorpci je osteoporóza. Receptor α_νβ3 exprimovaný na lidských hladkých svalových buňkách aorty zprostředkovává jejich migraci do neointimy a tento proces může vést k restenoze po perkutánní koronární angioplastice (Brown a kol., Cardiovascular Res., 28, 1815 (1994)). Brooks a kol.,

Cell, 7 9, 1157 (1994) navíc prokázal, že α_νβ3 antagonista může navodit regresi nádoru prostřednictvím indukce apoptózy angiogenních krevních cév. Prostředky, které blokují vitronektinový receptor, by proto mohly být účinné v léčbě onemocnění jako osteoporózy, restenozy a zhoubných nádorů.

Nyní je známo, že vitronektinový receptor se týká třech různých integrinů, označovaných jako α_νβι, Οίνβ3 a α_νβ5 (Horton a kol., Int. J. Exp. Pathol., 71, 741 (1990)). «νβχ váže fibronektin a vitronektin. α_νβ3 váže velký počet ligandů zahrnující fibrin, fibrinogen, laminin, thrombospondin, vitronektin, von Willebrandův faktor, osteopontin a kostní sialoprotein I. α_νβ5 váže vitronektin. Ukázalo se, že se vitronektinový receptor oívPs účastní buněčné adheze různých buněčných typů, včetně mikrovaskulárních endotheliálních buněk (Davis a kol., J. Cell. Biol., 51, 206 (1993)), a potvrdila se jeho role v angiogenezi (Brooks a kol., Science, 264, 569 (1994)). Tento integrin je exprimován v krevních cévách poraněné lidské granulační tkáně, ale ne v normální kůži.

Je známo, že se vitronektinový receptor váže na proteiny kostní základní hmoty, které obsahují tripeptidový vzorec Arg-Gly-Asp (nebo RGD). Publikace Horton a kol., Exp. Cell Res., 195, 368 (1991) popisuje, že peptidy obsahující RGD a protilátka proti vitronektinovému receptorů (23C6) inhibují resorpci dentinu a rozdělování buněk osteoklasty. Navíc publikace Sáto a kol., J. Cell Biol., 111, 1713 (1990) popisuje, že echistatin, peptid obsažený v hadím jedu, který obsahuje RGD sekvenci, je účinný inhibitor kostní resorpce v tkáňové kultuře a inhibuje přichycení osteoklastů ke kosti.

Nyní bylo nalezeno, že určité sloučeniny jsou účinné inhibitory α_νβ3 a α_νβ5 receptorů. Obzvláště se zjistilo, že tyto sloučeniny jsou účinnější inhibitory vitronektinového receptoru než receptoru pro fibrinogen.

Podstata vynálezu

Tento vynález zahrnuje sloučeniny, jaké jsou popsány dále, které jsou farmakologicky účinné v inhibici vitronektinového receptoru a jsou vhodné pro léčbu zánětu, zhoubného bujení a kardiovaskulárních onemocnění, jako atherosklerozy a restenozy, a chorob, u kterých se uplatňuje kostní resorpce, jako je osteoporóza.

Tento vynález se také týká farmaceutického prostředku, který obsahuje sloučeniny popsané dále a farmaceutický nosič.

Tento vynález dále popisuje způsob léčby chorob, které jsou zprostředkovány vitronektinovým receptorem. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou obzvláště vhodné pro léčbu atherosklerozy, restenozy, zánětu, zhoubného bujení a chorob, u kterých se uplatňuje kostní resorpce jako osteoporózy.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález zahrnuje nové sloučeniny, které jsou účinnějšími inhibitory vitronektinového receptoru než inhibitory receptoru pro fibrinogen. Nové sloučeniny mají dibenzocykloheptenové jádro, ve kterém je na jednom z aromatických šestičlenných kruhů dibenzocykloheptenu přítomen substituent obsahující atom dusíku, a na sedmičlenném kruhu dibenzocykloheptenu je alifatický • · ····· · ··· * ··· ··· ·«···· ·· substituent obsahující kyselou část. Věří se, že dibenzocykloheptenová kruhová soustava orientuje substituentové boční řetězce na šesti- a sedmičlennému kruhu tak, že mohou příznivě interagovat s vitronektinovým receptorem. Je výhodné, že v průběhu nej kratší intramolekulární cesty bude přítomno přibližně 12 až 14 intervenujících kovalentních vazeb mezi kyselou skupinou na alifatickém substituentu sedmičlenného kruhu dibenzocykloheptenu a atomem dusíku dusík-obsahujícího substituentu na aromatickém šestičlenném kruhu dibenzocykloheptenu.

Specifické sloučeniny podle vynálezu jsou:

kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová;

kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová; a kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1 propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová;

nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

V případech, kdy sloučeniny podle vynálezu mohou mít jedno nebo více chirálních center, pokud není upřesněno jinak, zahrnuje tento vynález každou jednotlivou neracemickou sloučeninu, kterou lze připravit a štěpit běžnými postupy.

Tento vynález také zahrnuje prekurzor léčiva sloučenin podle tohoto vynálezu. Prekurzory léčiva jsou jakékoliv kovalentně vázané nosiče, které uvolňují aktivní • · · • · ·

výchozí léčivo (sloučeniny podle přítomného vynálezu) in v i vo.

Sloučeniny podle vynálezu inhibují vazbu vitronektinu a jiných RGD-obsahujících peptidů na vitronektinový receptor. Inhibice vitronektinového receptorů na osteoklastěch inhibuje kostní resorpci zprostředkovanou osteoklasty, a je vhodná pro léčbu chorob, kde je kostní resorpce patologická, jako u osteoporózy a osteoartritidy.

Z dalšího aspektu je tímto vynálezem způsob stimulace novotvorby kosti, který zahrnuje podání sloučeniny působící zvýšení uvolňování kalcitoninu. Zvýšení tvorby kosti přináší jasný užitek u těch stavů, u kterých je nedostatek mineralizované kostní hmoty, nebo tam, kde je žádoucí remodelace kosti, jako u hojení a prevence kostních zlomenin. V případě onemocnění a metabolických poruch, které vedou ke ztrátě kostní struktury, by také tato léčba byla užitečná.

Například hyperparathyreoza, Pagetova nemoc, hyperkalcemie u maligního onemocnění, osteolytická ložiska kostních metastáz, ztráta kosti v důsledku imobilizace nebo deficitu pohlavních hormonů, Behgetova choroba, osteomalácie, hyperostóza a osteopetróza jsou stavy, u kterých by podání sloučeniny podle vynálezu mohlo být užitečné.

Protože sloučeniny podle přítomného vynálezu inhibují vitronektinové receptory na množství různých typů buněk, byly by navíc uvedené sloučeniny vhodné pro léčbu zánětlivých onemocnění jako revmatoidní artritidy a psoriázy, a kardiovaskulárních chorob jako atherosklerozy a restenozy. Sloučeniny podle vynálezu mohou být vhodné pro léčení a prevenci jiných chorob včetně, ale ne pouze, tromboembolických poruch, astmatu, alergií, ARDS (adult respirátory distress syndrom), reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host disease), rejekce orgánového transplantátu, septického šoku, ekzému, kontaktní dermatitidy, zánětlivých střevních onemocnění a jiných autoimunních chorob.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu mohou být také vhodné pro zlepšení hojení ran.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou také užitečné pro léčbu a prevenci angiogenních poruch. Název angiogenní poruchy, jak je zde používán, zahrnuje stavy vyznačující se abnormální neovaskularizací. V případech, kdy růst nových cév zapříčiňuje nebo přispívá k patologii spojené s onemocněním, bude inhibice angiogeneze snižovat zhoubné účinky onemocnění. Příkladem takového onemocnění je diabetická retinopatie. Tam, kde je růst nových krevních cév vyžadován pro udržení růstu zhoubné tkáně, bude inhibice angiogeneze snižovat dodávku krve do této tkáně, a tím přispěje k redukci tkáňové hmoty, která je na dodávce krve závislá. Příklady zahrnují růst nádorů tam, kdy je neovaskularizace kontinuálním požadavkem pro růst nádoru a pro vznik solidních nádorových metastáz. Proto sloučeniny podle přítomného vynálezu inhibují angiogenezi v nádorové tkáni a tím zabraňují nádorovému metastazování a růstu nádoru.

Proto podle způsobů podle přítomného vynálezu může inhibice angiogeneze použitím sloučenin podle přítomného vynálezu ovlivnit symptomy onemocnění, a v některých případech může onemocnění vyléčit.

Další terapeutický cíl sloučenin podle přítomného vynálezu jsou oční choroby charakterizované neovaskularizací. Mezi tyto oční choroby patří rohovkové neovaskularizační procesy, například při transplantaci rohovky, dále herpetická keratitis, luetická keratitis, pterygium a nevaskulární pannus spojený s používáním kontaktních čoček.

Další oční choroby také zahrnují makulární degeneraci spojenou s věkem, předpokládanou oční histoplazmozu, retinopatii z nezralosti a neovaskulární glaukom.

Tento vynález dále poskytuje způsob inhibice nádorového růstu, který zahrnuje podání postupně nebo ve fyzikální kombinaci sloučeniny podle přítomného vynálezu a protinádorového léčiva jako topotecanu a cisplatiny.

Tento vynález také poskytuje způsob přípravy slouče niny obecného vzorce (I)

(I) který zahrnuje redukci sloučeniny obecného vzorce (II)

Tento vynález se, z dalšího aspektu, týká způsobu přípravy sloučeniny obecného vzorce (II)

který zahrnuje cyklizací sloučeniny obecného vzorce

III

(III).

Dále tento vynález popisuje nové meziprodukty obecných vzorců (IV), (V), (VI) a (II)

(IV) ;

(V) ;

• · · · · • · · · • · · • · ·

Jak je v tomto spisu používáno, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku zahrnuje methylovou skupinu, ethylovou skupinu , n-propylovou skupinu, izopropylovou skupinu, nbutylovou skupinu, izobutylovou skupinu, terč.-butylovou skupinu, pentylovou skupinu, n-pentylovou skupinu, izopentylovou skupinu, neopentylovou skupinu a hexylovou skupinu, a jejich jednoduché alifatické izomery.

Místo názvů určitých činidel jsou v tomto spisu používány zkratky. DCC znamená dicyklohexylkarbodiimid, DMAP znamená dimethylaminopyridin, DIEA znamená diizopropylethylamin, EDC znamená N-ethyl-N(dimethylaminopropyl)karbodiimid. HOBt znamená 1-hydroxybenzotriazol, THF znamená tetrahydrofuran, DMF znamená dimethylformamid, NBS znamená N-bromsukcimid, Pd/C znamená palladium na uhlí jako • · · · ·· · · · · · ·· · · ·· · · ·· · • ····· · · · · · ··· ··· katalyzátoru, DPPA znamená difenylfosforylazid, BOP znamená benzotriazol-l-yloxy-tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfat, HF znamená kyselinu fluorovodíkovou. PPA znamená kyselinu polyfosforečnou, TEA znamená triethylamin, TFA znamená kyselinu trifluoroctovou, PCC znamená pyridiniumchlorchromat.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu se připraví způsoby popsanými v publikaci Bondinell a kol., PCT publikace č. WO 97/01540 (Mezinárodní přihláška č. PCT/US96/11108), publikovaná 16. ledna 1997, jejíž kompletní popis je v tomto spise zahrnut do odkazu.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu se dále připraví způsoby analogickými těm, které jsou popsány ve schématech, která jsou podrobně v tomto spise uvedena dále.

Schéma 1 h₃co

• ·· · · ·· · · ·· · • ·· · · ·· · · ·· · • · ····· · ··· · ··· · · · i i 111 i 1 · ιι ·· ·· ·· ·· · · ··

a) Tf₂O, 2,6-lutidin, CH₂C1₂;

b) allyltributylcín, LÍCI, (Ph₃P) ₂PdCl₂, DMF;

c) RuC1₃, H₅IO₆, CC1₄, CH₃CN, H₂0;

d) PPA;

e) EtOAc/LiHMDS, THF;

f) H₂, 10% Pd/C, konc. HCI, AcOH;

g) EtSH, AICI3, CH₂C1₂;

h) Tf₂O, 2,6-lutidin, CH₂C1₂;

i) CO, Pd(OAc)₂, KOAc, dppf, DMSO.

2-Benzyl-4-methoxyfenol (J. Am. Chem. Soc., 71, 64 (1949)) se konvertuje na příslušný ester kyseliny trifluormethansulfonové, tj. sloučeninu 2 ze schématu 1 (tzn. 1-2) reakcí s anhydridem kyseliny trifluormethansulfonové (Tf₂O) , za přítomnosti vhodné báze například 2,6-lutidinu, v inertním rozpouštědle, obecně CH₂C1₂. Reakce sloučeniny 1-2 s allyltributylcínem za přítomnosti LiCl a palladiového katalyzátoru, například bis (trifenylfosfin)palladium-(II) chloridu ( (Ph₃P) ₂PdCl₂) v inertním rozpouštědle jako DMF, způsobem popsaným v publikaci Tilley, J. Org. Chem., 55, 906 (1990), poskytne sloučeninu 1-3. Oxidativni štěpení olefinu 3 ze schématu 1, za účelem přímého zisku karboxylové kyseliny 1-4 může být dosaženo reakcí s příslušným oxidačním činidlem, většinou KMnOo ve vhodném vodném rozpouštědle, • · • ·

například vodném acetonu nebo vodné kyselině octové.

S výhodou je ale oxidativní štěpení olefinu 1-3 za účelem přímého zisku karboxylové kyseliny 1-4 prováděno podle obecného postupu uvedeného v publikaci Sharpless, J. Org. Chem., 4 6, 3936 (1981) a J. Org. Chem., 50, 1560 pozn. 4 (1985), při kterém vzniká RuO₄ in šitu, reakcí RuCl₃ nebo RuO₂ s NaIO₄ nebo H₅IO₆ ve směsi rozpouštědel CC1₄, CH₃CN a H₂O. Alternativně může být oxidace provedena dvěma postupy, které zahrnují v prvním stupni oxidativní štěpení olefinu na odpovídající aldehyd, které může být provedeno způsoby odborníkovi v oboru dobře známými, což je následováno oxidací aldehydu na karboxylovou kyselinu použitím, například, NaC10₂, jak je popsáno v publikaci Pinnick, Tetrahedron, 37, 2091 (1981), nebo v publikaci Dalcanale a Montanari, J. Org. Chem., 51, 567 (1986). Cyklizace sloučeniny 1-4 na sloučeninu 1-5 může být provedena použitím kyseliny polyfosforečné, podle postupu popsaného v Proctor, Renfrew a Savage J. Chem Soc. (C) , 1000 (1969). Alternativně je možné konvertovat sloučeninu 1-4 na sloučeninu 1-5 skrze odpovídající chlorid kyseliny 1-4, který může být připraven způsoby odborníkovi v oboru dobře známými. Zpracování tohoto chloridu kyseliny příslušným Friedel-Craftsovým katalyzátorem, jako A1C1₃ nebo SnCl₄, v inertním rozpouštědle, jako v CH₂C1₂ nebo CS₂, poskytne cyklický keton 1-5. Reakcí aldolového typu sloučeniny 1-5 s enolátem ethylacetátu, který může být získán z ethylacetatu jeho vystavením příslušné amidové bázi, například lithium-diizopropylamidu .(LDA) nebo lithium-bis(trimethylsilyl)amidu (LiHMDS), se získá sloučenina 1-6. THF je často rozpouštědlem voleným pro aldolovou reakci, i když často se používá THF za přítomnosti různých přídatných látek, například HMPA nebo TMEDA. Redukce sloučeniny 1-6 na sloučeninu 1-7 může být provedena hydrogenolýzou s příslušným katalyzátorem, například kovovým palladiem • · · · · · • · · · · • · · · · • · ··· « · · ··· ft ··· ··· ι->·« · · · · · · i J · · ·· ·· ·· ·· ·· na aktivním uhlí (Pd/C), v příslušném rozpouštědle, například kyselině octové, za přítomnosti minerální kyseliny, jako HCI. Alternativně může být tato redukce provedena zpracováním sloučeniny 1-6 s triethylsilanem, za přítomnosti bor-trifluoridetheratu, obecným způsobem podle Orphanopoulos a Smonu (Synth. Commun., 833 (1988)). Odstranění methyletheru ze sloučeniny 1-7, aby vznikla sloučenina 1-8, může být provedeno reakcí BBr3 v inertním rozpouštědle, například CH2CI2, s ethanethiolem a A1C13 v inertním rozpouštědle, s výhodou CH2C12. Jiné vhodné způsoby odstraňování methyletheru jsou popsány v Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis, vyd. John Wiley and Sons. Sloučenina 1-9, neboli ester kyseliny trifluormethansulfonové sloučeniny 1-8, připravená způsobem popsaným dříve pro konverzi sloučeniny 1-1 na sloučeninu 1-2, reaguje s oxidem uhelnatým za přítomnosti octanu draselného, 1,1'bis(difenylfosfino)ferrocenu (dppf), a palladového katalyzátoru, například octanu palladnatého (Pd(0Ac)2)< ve vhodném rozpouštědle, s výhodou DMSO, podle obecného způsobu popsaného Cacchi a Lupi (Tet. Lett., 33, 3939 (1992)), aby vznikla sloučenina 1-10.

Schéma 2 ilustruje způsob kondenzace, při které vzniká vazba mezi atomem uhlíku a atomem kyslíku, a která může být použita pro vytvoření etherové vazby.

Schéma 2

COjEt • · · · 4 • 44 • 44

a) 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]pyridin-N-oxid, DEAD, (Ph)₃P, DMF;

b) cyklohexen, 10% Pd/C, 2-propanol;

c) l,0N NaOH, EtOH, poté acidifikace.

Sloučenina 1 ze schématu 2 (2-1) se nechá reagovat s 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]pyridin-N-oxidem, kondenzační reakcí Mitsunobuova typu (Organic Reactions, 42, 335 až 656 (1992); Synthesis, 1 až 28 (1981)), aby vznikla sloučenina 2-2. Reakce je zprostředkována komplexem, který vzniká mezi diethylazodikarboxylatem a trifenylfosfinem, a provádí se v aprotickém rozpouštědle, například v THF, CH2CI2 nebo DMF. Pyridin-N-oxidová část sloučeniny 2-2 je redukována na příslušný pyridin 2-3, za podmínek hydrogenace přenosem, použitím palladiového katalyzátoru, s výhodou kovového palladia na aktivním uhlí, v inertním rozpouštědle, například methanolu, ethanolu nebo 2-propanolu. Jako činidlo přenášející atom vodíku v tomto typu reakce se běžně používají cyklohexen, 1-4-cyklohexadien, kyselina mravenčí a soli kyseliny mravenčí, jako mravenčan draselný a mravenčan • · · amonný. Ethylester sloučeniny 2-3 se zmýdelní tak, jak je popsáno ve schématu 1, aby vznikla sloučenina 2-4.

Alternativní způsoby přípravy určitých meziproduktů zde dříve popsaných byly provedeny tak, jak dále znázorňují schémata 3 a 4.

Schéma 3

a) 10% Pd/C, HOAc;

b) SOC1₂, toluen;

c) A1C1₃, CH₂C1₂.

Schéma 3 shrnuje alternativní způsob přípravy sloučenin 5 ze schématu 1 (1-5). Podle tohoto schématu se sloučenina 3-1 (J. Med. Chem., 24, 998 (1981)) hydrogenuje v atmosféře plynného vodíku při vhodném tlaku, například 343,5 kPa, za přítomnosti palladiového katalyzátoru, například 10% Pd/C, ve vhodném rozpouštědle, například ledové kyselině octové, za vhodné teploty, například 25 °C, aby vznikla sloučenina 3-2. Cyklizace sloučeniny 3-2 na sloučeninu 3-3 se provede nejprve konvertováním sloučeniny

3-2 na odpovídající chlorid kyseliny za přítomnosti vhodného chloračního činidla, například thionylchloridu, ve vhodném rozpouštědle, například v benzenu, za vhodné teploty, například 85 °C. Zpracování tohoto chloridu kyseliny vhodným Friedel-Craftsovým katalyzátorem, například A1C1₃, ve vhodném rozpouštědle, například CH₂C1₂, za vhodné teploty, například 25 °C, poskytne sloučeninu 6-3.

• ···«· · ··· • · · · · • * ·· ·· · ’

Schéma 4

a) LiN(TMS)2, ethylbromacetat;

b) Jonesovo činidlo, 0s0₄;

c) H₂, 10% Pd/C, HOAc;

d) C₂O₂C1₂, DMF;

e) AICI3, CH2CI2, teplota místnosti;

f) H₂, 10% Pd/C, HOAc.

Schéma 4 shrnuje alternativní způsob přípravy sloučenin vzorce 7 ze schématu 1 (1-7). Podle tohoto schématu reaguje sloučenina 4-1 (J. Med. Chem., 24, 998 (1981)) s ethylbromacetatem, za přítomnosti vhodné báze, například LiN(TMS)₂, ve vhodném rozpouštědle, například THF, « · • · r · • · za vhodné teploty, například -78 °C, aby vznikla sloučenina

4-2. Sloučenina 4-2 se oxidativně štěpí za přítomnosti vhodné směsi oxidantů, například OsCh/Jonesovo činidlo, ve vhodném rozpouštědle, například v acetonu, za vhodné teploty, například 25 °C, aby vznikla sloučenina 4-3 (J.

Org. Chem., 58, 4745 (1993)). Sloučenina 4-3 je dále hydrogenována v atmosféře plynného vodíku za vhodného tlaku, například 343,5 kPa, za přítomnosti palladiového katalyzátoru, například 10% Pd/C, ve vhodném rozpouštědle, například ledové kyselině octové, za vhodné teploty, například 25 °C, aby vznikla sloučenina 4-4. Cyklizace sloučeniny 4-4 na sloučeninu 4-5 se provede nejprve konverzí sloučeniny 4-4 na odpovídající chlorid kyseliny za přítomnosti vhodného chloračního činidla, například oxalylchloridu, za přítomnosti katalytického množství přídatné látky, například DMF, ve vhodném rozpouštědle, například CH2CI2, za vhodné teploty, například 25 °C. Zpracování tohoto chloridu kyseliny s vhodným FriedelCraftsovým katalyzátorem, například AICI3, ve vhodném rozpouštědle, například CH2CI2, za vhodné teploty, například 25 °C, poskytne sloučeninu 4-5. Sloučenina 4-5 se dále hydrogenuje v atmosféře plynného vodíku za vhodného tlaku, například 343,5 kPa, za přítomnosti palladiového katalyzátoru, například 10% Pd/C, ve vhodném rozpouštědle, například ledové kyselině octové, za vhodné teploty, například 25 °C, aby vznikla sloučenina 4-6.

Adiční soli sloučenin s kyselinou se připraví standardním způsobem ve vhodném rozpouštědle, z výchozí sloučeniny a přebytku kyseliny, například kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, fluorovodíkové, sírové, fosforečné, octové, trifluoroctové, maleinové, jantarové nebo methansulfonové. Určité ze sloučenin tvoří vnitřní soli neboli obojetné ionty, které mohou být přijatelné.

• · · * · • · · · • · ·

Kationtové soli se připraví zpracováním výchozí sloučeniny s přebytkem alkalického činidla, jako například hydroxidu, uhličitanu nebo alkoxidu, které obsahuje příslušný kationt; nebo s příslušným organickým aminem. Kationty jako Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ a NH₄ ⁺ jsou konkrétní příklady kationtů přítomných ve farmaceuticky přijatelných solích.

Tento vynález také poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje sloučeninu podle zde uvedeného popisu a farmaceuticky přijatelný nosič. Podle toho mohou být sloučeniny podle tohoto vynálezu použity pro výrobu léčiva. Farmaceutické prostředky sloučenin podle tohoto vynálezu, připravené jak zde bylo dříve popsáno, mohou být formulovány jako roztoky nebo lyofilizované prášky pro parenterální podání. Prášky mohou být před použitím rekonstituovány přidáním vhodného ředidla nebo jiného farmaceuticky přijatelného nosiče. Kapalný prostředek může být pufrovaný izotonický vodný roztok. Mezi příklady vhodných ředidel patří běžný izotonický fyziologický roztok, standardní 5% glukóza ve vodě nebo pufrovaný roztok octanu sodného nebo amonného. Takové prostředky jsou obzvláště vhodné pro parenterální podání, ale lze je také použít pro perorální podání, nebo mohou být obsaženy v inhalátorech s odměřením dávky nebo nebulizátorech pro insuflaci. Může být žádoucí přidat excipienty jako polyvinylpyrrolidon, želatinu, hydroxycelulózu, arabskou gumu, polyethylenglykol, mannitol, chlorid sodný nebo citrát sodný.

Alternativně mohou být tyto sloučeniny enkapsulovány, tabletovány nebo připraveny jako emulze nebo sirup pro perorální podání. Mohou být přidány farmaceuticky přijatelné pevné nebo kapalné nosiče, za účelem posílení nebo stabilizace prostředku, nebo pro usnadnění přípravy prostředku. Pevné nosiče zahrnují škrob, laktózu, dihydrát síranu • · π · · ··· * · · ··· · ··· ·»· ly ..·.·· ·· vápenatého, bílou hlinku, stearat hořečnatý nebo kyselinu stearovou, mastek, pektin, arabskou gumu, agar nebo želatinu. Kapalné nosiče zahrnují sirup, arašídový olej, olivový olej, fyziologický roztok nebo vodu. Nosič může také zahrnovat látku pro trvalé uvolňování, jako je glycerylmonostearat nebo glyceryl-distearat, samotný nebo s voskem. Množství pevného nosiče může být různé, ale s výhodou bude od zhruba 20 mg do asi 1 g na dávkovou jednotku. Farmaceutické prostředky se připravují běžnými farmaceutickými postupy, které zahrnují, pro tabletové formy, drcení, míšení, granulování a stlačování, pokud je nezbytné; nebo drcení, míchání a plnění do tvrdých želatinových kapslí. Pokud se používá kapalný nosič, prostředek bude ve formě ve formě sirupu, elixíru, emulze nebo vodné nebo nevodné suspenze. Takový kapalný prostředek může být přímo podán perorálně nebo naplněn do měkké želatinové kapsle.

Pro rektální podání mohou být také sloučeniny podle tohoto vynálezu kombinovány s excipienty, jako s kakaovým máslem, glycerinem, želatinou nebo polyethylenglykoly, a nality do čípku.

Sloučeniny zde popsané jsou antagonisté vitronektinového receptoru, a jsou vhodné pro léčení onemocnění, u kterých je základní patologie připisována ligandu nebo buňce, které interaguj! s vitronektinovým receptorem. Tyto sloučeniny jsou například vhodné pro léčbu chorob, jejichž patologie je způsobena úbytkem kostní základní hmoty. Proto jsou přítomné sloučeniny užitečné pro léčbu osteoporózy, hyperparathyreózy, Pagetovy nemoci, hyperkalcemie u maligních onemocnění, osteolytických ložisek způsobených kostními metastázami, kostního úbytku v důsledku imobilizace nebo deficitu pohlavních hormonů. Věří se také, že • · • · • · · sloučeniny podle tohoto vynálezu naleznou využití jako protinádorové, antiangiogenní, protizánětlivé a protimetastatické přípravky, a budou využity se pro léčbu atherosklerozy a restenozy.

Sloučenina se pacientovi podá perorálně nebo parenterálně, takovým způsobem, aby byla koncentrace léčiva dostatečná k inhibici kostní resorpce nebo jinou podobnou indikaci. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu se podává v perorální dávce asi 0,1 až zhruba 50 mg/kg, takovým způsobem, který je adekvátní stavu pacienta. S výhodou bude perorální dávka přibližně 0,5 až asi 20 mg/kg. Pro léčbu akutních stavů se dává přednost léčbě parenterální. Nejúčinnější je intravenózní infuze peptidu v 5% glukóze ve vodě nebo v normálním fyziologickém roztoku, nebo podobný prostředek obsahující vhodné excipienty, ačkoliv injekce intramuskulárního bolusu je také účinná. Parenterální dávka je obvykle asi 0,01 až asi 100 mg/kg; s výhodou 0,1 až 20 mg/kg. Sloučeniny se podávají jednou až čtyřikrát za den v takovém množství, aby se dosáhlo celkové denní dávky asi 0,4 až asi 400 mg/kg za den. Přesná hladina a způsob, kterým jsou sloučeniny podány, budou snadno stanoveny odborníkem v oboru, a to porovnáním hladiny látky v krvi a koncentrace požadované pro léčebný účinek.

Tento vynález dále popisuje způsob léčby osteoporózy nebo inhibice kostní ztráty, který zahrnuje podání postupně nebo ve fyzikální kombinaci, sloučeniny podle tohoto vynálezu a jiných inhibitorů kostní resorpce, například bifosfonatů (např. allendronatu), hormonální substituční léčby, antiestrogenů nebo kalcitoninu. Navíc popisuje tento vynález způsob léčby použitím sloučeniny podle tohoto vynálezu a anabolického přípravku, například kostního • · • · • · • ·· · · ·· · · · * · ·«·· · · · · ···· a i · · · · · · · · ···· ··· ··· ·· ··· · · · ·· · « ·· ·» ·· * * morfogenního proteinu, iproflavonu, účinného pro prevenci kostní ztráty a/nebo zvýšení kostní hmoty.

Tento vynález navíc popisuje způsob inhibice růstu nádoru, který zahrnuje podání postupně nebo ve fyzikální kombinaci sloučeniny podle tohoto vynálezu a protinádorového léčiva. Sloučeniny patřící do třídy analog kamptothecinu, jako topotekan, irinotekan a 9-aminokamptothecin, a koordinačních komplexů platiny, jako je cisplatina, ormaplatina a tetraplatina, jsou dobře známé skupiny protinádorových léčiv. Sloučeniny třídy analog kamptothecinu jsou popsány v US patentech č. 5 004 758, 4 604 463, 4 473 692,

545 880, 4 342 776, 4 513 138, 4 399 276, EP patentových přihláškách č. 0 418 099 a 0 088 642, Wani a kol., J. Med. Chem., 2 9, 2358 (1986), Wani a kol., J. Med. Chem., 23, 554 (1980), Wani a kol., J. Med. Chem., 30, 1774 (1987) a Nitta a kol., Proč. 14^th International Congr. Chemotherapy, Anticancer Section 1, 28 (1985), jejichž kompletní popis je v tomto spisu zahrnut odkazem. Platinový koordinační komplex, cisplatina, je dostupný pod názvem Platinol® od společnosti Bristol Myers-Squibb Corporation. Vhodné prostředky cisplatiny jsou popsány v U.S. patentech č. 5 562 925 a 4 310 515, jejichž popis je v tomto spisu zahrnut odkazem.

Ve způsobu inhibice růstu nádoru, který zahrnuje podání postupně nebo ve fyzikální kombinaci sloučeniny podle tohoto vynálezu a protinádorového léčiva, může být koordinační sloučenina platiny, například cisplatina, podána v pomalé intravenózní infuzi. Výhodný nosič je roztok dextrózy ve fyziologickém roztoku obsahující mannitol.

Rozvrh dávkování platinové koordinační sloučeniny může být na základě asi 1 až asi 500 mg na 1 m² (mg/m²) tělesného povrchu na jeden cyklus léčby. Infuze platinové koordinační

22' :

• · • · · · · • « · • · sloučeniny může být podána jednou až dvakrát za týden, a týdenní léčebné cykly mohou být několikrát zopakovány. Při použití sloučeniny třídy analog kamptothecinu pro parenterální podání, se běžně používá léčebný režim od asi 0,1 do asi 300,0 mg/m² tělesného povrchu za den v průběhu pěti po sobě jdoucích dnů. Nejvýhodněji je režim léčby používaný pro topotecan od asi 1,0 do asi 2,0 mg/m² tělesného povrchu za den v průběhu pěti po sobě jdoucích dnů. Cyklus léčby se s výhodou zopakuje nejméně jednou se sedmidenní až jednadvacetidenní přestávkou.

Farmaceutický prostředek může být formulován s oběma látkami, tedy sloučeninou podle vynálezu a protinádorovým léčivem, ve stejném zásobníku, ale přednost se dává prostředkům, kde jsou tyto látky obsaženy v oddělených zásobnících. V případě, že jsou obě látky ve formě roztoků, mohou být obsaženy systému infuze/injekce pro simultánní podávání nebo v tandemovém uspořádání.

Pro pohodlné podání sloučeniny podle vynálezu a protinádorového léčiva současně nebo zvlášť je připraven kit, který obsahuje v jednom zásobníku (kontejneru), například v krabičce, kartónu nebo jiném zásobníku, jednotlivé láhve, pytle, lékovky nebo jiné zásobníky, z nichž každý obsahuje účinné množství sloučeniny podle vynálezu pro parenterální podání jak je popsáno výše, a účinné množství protinádorového léčiva pro parenterální podání, jak je popsáno výše. Tento kit může například obsahovat oba farmaceutické přípravky v oddělených nebo v jediném zásobníku, popřípadě jako lyofilizované zátky, a zásobníky roztoků pro rekonstituci. Variantou předchozího může být uskladnění roztoku pro rekonstituci a lyofilizované zátky do dvou oddílů jediného zásobníku, které se před použitím nechá smísit. U tohoto uspořádání může být • · • ·

protinádorové léčivo a sloučenina podle vynálezu baleny zvlášť, ve dvou zásobni-cích, nebo lyofilizovány společně jako prášek a předloženy jako zásobník jediný.

Pokud jsou obě látky předloženy ve formě roztoku, mohou být obsaženy v systému pro infuzi/injekci pro simultánní podávání, nebo v tandemovém uspořádání.

Sloučenina podle vynálezu může například být obsažena ve formě pro intravenózní injekci nebo v infuzním pytli, které jsou prostřednictvím kanyly spojeny v sérii s druhým pytlem obsahujícím protinádorové léčivo. Při použití takového systému může pacient dostat počáteční injekci jako bolus nebo infuzi sloučeniny podle vynálezu, což je následováno infuzí protinádorového léčiva.

Pro určení takové koncentrace sloučeniny, která je nutná pro dosažení určitého farmakologického účinku mohou být sloučeniny testovány několika biologickými stanoveními.

Inhibice vazby vitronektinu

Pevná fáze [³H] -SK&F-107260 vázající se na α_νβ₃: Lidský α_νβ3 (0,1 až 0,3 mg/ml) z placenty nebo krevních destiček v pufru T (obsahuje 2 mM CaCÍ2 a 1 % oktylglukosidu) se naředí pufrem T obsahujícím 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (pufr A) a 0,05 % NaN3, a pak se ihned přidá do ELISA ploten o 96 jamkách (Corning, New York, N.Y.) v množství 0,1 ml na jamku. Přidá se 0,1 až 0,2 gg α_νβ3 na jamku. Plotny se inkubují přes noc při teplotě 4 °C. V průběhu experimentu se jamky jednou promyjí pufrem A, a inkubují s 0,1 ml 3,5% bovinního sérového albuminu ve stejném pufru, po dobu 1 hodiny, při teplotě místnosti. Po inkubaci se jamky úplně odsají a dvakrát se promyjí 0,2 ml pufru A.

• · • ·

Sloučeniny se rozpustí ve 100% DMSO tak, aby vzniklo 2 mM zásobního roztoku, který se ředí vazebným pufrem (15 mM Tris-HCl s pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂) na konečnou koncentraci sloučeniny 100 μΜ. Tento roztok se pak ředí na požadovanou konečnou koncentraci sloučeniny. Do jamek se ve třech provedeních přidají různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 až 100 μΜ), a to je následováno přidáním 5,0 mM [³H]-SK&F-107260 (aktivita 240-10⁶ až 318-10'⁶ s^_1/mmol) .

Plotny se inkubují po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po inkubaci se jamky úplně odsají a jednou jamka po jamce promyjí 0,2 ml ledového pufru A. Receptory se solubilizují s 0,1 ml 1% SDS a stanoví se vazba [³H] -SK&F107260 kapalinovým scintilačním čítáním po přidání 3 ml prostředku Ready Safe do Beckmanova LS čítače scintilace kapaliny (Beckman LS Liquid Scintillation Counter), se 40% účinností. Nespecifická vazba [³H]-SK&F-107260 se stanoví za přítomnosti 2 μΜ SK&F-107260, a je opakovaně méně než 1 % celkového množství původního radioaktivně značeného ligandu. IC₅₀ (koncentrace antagonisty potřebná pro inhibici 50 % vazeb [³H]-SK&F-107260) se určí běžným nelinárním vynesením křivky metodou nejmenších čtverců, která je modifikací LUNDON-2 programu. Ki (disociační konstanta antagonisty) se vypočítá podle rovnice:

Ki = IC_5O/(1 + L/K_d) kde

L a je koncentrace a K_d je disociační konstanta [³H] — SK&F-107260 .

Sloučeniny podle vynálezu se také testují na kostní resorpci in vitro a in vivo, a to ve stanoveních, která jsou v oboru běžná pro určování inhibice novotvorby kosti, jako je stanovení tvorby důlků, které je popsané v EP 528 587, a • · · • · · které může také být provedeno za použití lidských osteoklastů namísto krysích osteoklastů, a model ovarektomizované krysy, který je popsán v publikaci Wronski a kol., Cells and Materials., Sup. 1, 69 až 74 (1991).

Stanoveni migrace buňky hladké svaloviny cévy

Použijí se krysí nebo lidské aortální hladké svalové buňky. Migrace buněk se monitoruje v Transwellově komoře pro buněčné kultury, za použití polykarbonatové membrány s póry o velikosti 8 pm (Costar). Nižší plocha filtru se povleče vitronektinem. Buňky se suspendují v DMEM obohaceném 0,2% bovinním sérovým albuminem v koncentraci 2,5 až 5,0 χ 10⁶ jamek/ml, a jsou předem zpracovány s testovanou sloučeninou v různých koncentracích po dobu 20 min při teplotě 20 °C. Rozpouštědlo jako takové se použije jako kontrola. 0,2 ml buněčné suspenze se umístí do horního oddílu komory. Nižší oddíl obsahuje 0,6 ml DMEM obohaceného 0,2% bovinním sérovým albuminem. Inkubace probíhá při teplotě 37 °C, v atmosféře 95 % vzduchu/5 % CO₂ po dobu 24 hodin. Po inkubaci se buňky na horním povrchu filtru, které nemigrovaly, odstraní jemným seškrábnutím. Filtr se pak fixuje methanolem a obarví 10% Giemsou. Migrace se měří buď

a) počítáním počtu buněk, keré migrovaly na nižší povrch filtru, nebo

b) extrakcí obarvených buněk 10% kyselinou octovou a následným určením absorbance při 600 nM.

Model thyroparaidektomizované krysy

Každá experimentální skupina sestává z 5 až 6 krys kmene Sprague-Dawley (tělesná hmotnost 250 až 400 g). Krysy jsou thyroparaidektomizovány (od prodejce, Taconic Farms) 7 dní před použitím. Všechny krysy dostávají substituční dávku

thyroxinu každé 3 dny. Při příjmu krys ze změří hladiny cirkulujícího ionizovaného vápníku v plné krvi, ihned poté, co byla odebrána venepunkcí z ocasu do heparinizovaných zkumavek. Krysy jsou použity pokud je hladina ionizovaného vápníku menší než 1,2 mM/litr (měřeno na Ciba-Corningově modelu 634 pH analyzátoru vápníku). Každá krysa je vybavena permanentním venózním a arteriálním katetrem pro dodávání zkoumané látky a pro odebírání vzorků krve. Krysy jsou pak udržovány na dietě, kdy dostávají krmivo bez vápníku a deionizovanou vodu. Měří se základní hladiny vápníku a každá krysa dostává buď kontrolní vehikulum, lidský parathyreoidní hormon 1-34 peptid (hPTHl-34, dávka 1,25 pg/kg/h ve fyziologickém roztoku/0,1% bovinním sérovém albuminu,

Bachem, Ca) nebo směs hPTHl-34 a testované látky, kontinuální intravenózní infuzí do venózního katetru použitím zevní infuzní pumpy. Odpověď kalcémie každé krysy se měří ve dvouhodinových intervalech v průběhu infuzního období trvajícího 6 až 8 hodin.

Stanovení resorpce a adheze lidských osteoklastů

Stanovení důlkové resorpce a adheze byla vyvinuta a standardizována za použití normálních lidských osteoklastů odvozených od tkáně osteoklastomu. Stanovení 1 bylo vyvinuto pro měření dálkových objemů osteoklastů laserovou konfokální mikroskopií. Stanovení 2 bylo vyvinuto jako třídění s vyšším obratem, kde se měří fragmenty kolagenu (uvolněné během resorpce) kompetitivní ELISA metodou.

Stanovení 1 (použití laserové konfokální mikroskopie) • Ze zásoby skladované v tekutém dusíku se odeberou alikvoty suspenzí buněk odvozených od lidského osteoklastomu, rychle se ohřejí na 37 °C a jednou se promyjí centrifugaci RPMI27

1640 médiem (frekvence otáček 1000 za min, 5 min při teplotě 4 °C) .

• Médium se odsaje a nahradí myší anti-HLA-DR protilátkou, pak se v poměru 1:3 naředí RPMI-1640 médiem. Suspenze se inkubuje po dobu 30 min na ledu, za častého míchání.

• Buňky se dvakrát promyjí studeným RPMI-1640 médiem, následuje centrifugace (frekvence otáček 1000 za min, 5 min při teplotě 4 °C), a pak se buňky přenesou do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 15 ml. Mononukleární buňky se spočítají ve zdokonalené Neubauerově počítací komoře.

• Dostatečný počet magnetických kuliček (5/mononukleární buňku) povlečených husím anti-myším IgG (Dynal, Great Neck,

N.Y.) se odebere z jejich zásobní nádoby a umístí do 5 ml čerstvého média (tím se odplaví toxická azidová konzervační látka) . Médium se pak odstraní imobilizací kuliček magnetem a nahradí se čerstvým médiem.

• Kuličky se smísí s buňkami a suspenze se inkubuje na ledu po dobu 30 min. Suspenze se často promíchává.

• Buňky obalené kuličkami se imobilizují magnetem a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se dekantují do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml.

• K buňkám obaleným kuličkami se přidá čerstvé médium, aby se uvolnily jakékoliv zachycené osteoklasty. Tento promývací postup se zopakuje lOx. Buňky obalené kuličkami se odstraní.

• Životaschopné osteoklasty se spočítají v citaci komoře za použití fluorescein-diacetatu pro označení živých buněk. Pro • · • ·

zavedení vzorku do komory se použije umělohmotná pasteurova pipeta se širokým kalibrem pro jedno použití.

• Osteoklasty se peletují centrifugací a jejich hustota se přizpůsobí příslušnému počtu do EMEM média (počet osteoklastů se nádor od nádoru liší) obohaceného 10% fetálním telecím sérem a 1,7 g/litr hydrogenuhličitanem sodným.

• Alikvoty buněčné suspenze o objemu 3 ml (na zpracovanou sloučeninu) se dekantují do centrifugačních zkumavek o objemu 15 ml. Buňky se peletují centrifugací.

• Do každé zkumavky se přidá 3 ml příslušného vzorku zpracované sloučeniny (ředěné do 50 μΜ EMEM médiem). Jsou zahrnuty také příslušné kontroly vehikulem, pozitivní kontrola (myší monoklonální protilátka proti vitronektinovému receptorů [87MEM1] ředěná na 100 pg/ml) a kontrola izotypem (IgG2a ředěná na 100 pg/ml). Vzorky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 30 min.

• Díly buněk o objemu 0,5 ml se naočkují na sterilní plátky dentinu na plotnu o 48 jamkách se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 2 h. Každé zpracování se sleduje ve čtyřech vyhotoveních.

• Plátky se promyjí šestkrát vyměněným teplým PBS (10 ml/jamka na plotně o 6 jamkách), a pak se umístí do čerstvého média, které obsahuje vzorek zpracovávané sloučeniny nebo kontrolní vzorky. Vzorky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin.

Postup s kyselou fosfatázou rezistentní na vinan (TRAP) (selektivní barvení buněk osteoklastické linie) • Plátky kosti obsahující přichycené osteoklasty se promyji fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a fixují 2% glutaraldehydem (v 0,2M kakodylatu sodném) po dobu 5 min.

• Poté se promyji vodou a inkubují po dobu 4 min v TRAP pufru při teplotě 37 °C (0,5 mg/ml naftol-AS-BI-fosfátu rozpuštěného v N, N-dimethylformamidu a smíchaného s 0,25 M citrátového pufru o pH 4,5, obsahující 10 mM vinanu sodného).

• Po promytí ledovou vodou se plátky ponoří do chladného acetatového pufru (0,1 M, pH 6,2), který obsahuje 1 mg/ml látky fast red garnet, a inkubují při teplotě 4 °C po dobu 4 minut.

• Přebytečný pufr se odsaje a plátky se po promytí vodou vysuší na vzduchu.

• TRAP pozitivní osteoklasty (cihlově červená/fialová sraženina) se spočítají mikroskopií v jasném poli a poté se odstraní z povrchu dentinu sonikaci.

• Objemy důlků se urči Nikon/Lasertec ILM21W konfokálním mikroskopem.

Stanovení 2 (použití odečtení prostřednictvím ELISA)

Lidské osteoklasty se obohatí a připraví pro sledování sloučeniny tak, jak je popsáno v počátečních 9 krocích ve stanovení 1. Pro názornost jsou tyto kroky zopakovány níže.

• · • · • ·

• Ze zásoby skladované v tekutém dusíku se odeberou alikvoty suspenzí buněk odvozených od lidského osteoklastomu, rychle se ohřejí na 37 °C a jednou se promyjí centrifugací RPMI1640 médiem (frekvence otáček 1000 za min, 5 min při teplotě 4 °C) .

• Médium se odsaje a nahradí myší anti-HLA-DR protilátkou, pak se v poměru 1:3 naředí RPMI-1640 médiem. Suspenze se inkubuje po dobu 30 min na ledu, za častého míchání.

• Buňky se dvakrát promyjí studeným RPMI-1640 médiem, následuje centrifugace (frekvence otáček 1000 za min, 5 min při teplotě 4 °C), a pak se buňky přenesou do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 15 ml. Mononukleární buňky se spočítají ve zdokonalené Neubauerově počítací komoře.

• Dostatečný počet magnetických kuliček (5/mononukleární buňku) povlečených husím anti-myším IgG (Dynal, Great Neck, N.Y.) se odebere z jejich zásobní nádoby a umístí do 5 ml čerstvého média (tím se odplaví toxická azidová konzervační látka). Médium se pak odstraní imobilizací kuliček magnetem a nahradí se čerstvým médiem.

• Kuličky se smísí s buňkami a suspenze se inkubuje na ledu po dobu 30 min. Suspenze se často promíchává.

• Buňky obalené kuličkami se imobilizují magnetem a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se dekantují do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml.

• K buňkám obaleným kuličkami se přidá čerstvé médium, aby se uvolnily jakékoliv zachycené osteoklasty. Tento promývací postup se zopakuje lOx. Buňky obalené kuličkami se odstraní.

• ftft · • ftft «

• · • Životaschopné osteoklasty se spočítají v čítači komoře za použití fluorescein-diacetatu pro označení živých buněk. Pro zavedení vzorku do komory se použije umělohmotná pasteurova pipeta se širokým kalibrem pro jedno použití.

• Osteoklasty se peletují centrifugaci a jejich hustota se přizpůsobí příslušnému počtu do EMEM média (počet osteoklastů se nádor od nádoru liší) obohaceného 10% fetálním telecím sérem a 1,7 g/litr hydrogenuhličitanem sodným.

Naproti způsobu ze stanovení 1 popsaném výše, se sloučeniny sledují ve 4 dávkách proto, aby se získala IC₅₀, jak je upřesněno níže.

• Přípravky osteoklastů se předem inkubují po dobu 30 min při teplotě 37 °C s testovanou sloučeninou (4 dávky) nebo s kontrolami.

• Potom se naočkují na plátky bovinní kortikální kosti do jamek na plotně pro tkáňové kultury o 4 8' jamkách, a inkubují se po dobu dalších 2 hodin při teplotě 37 °C.

• Plátky kosti se promyjí šestkrát vyměněným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), aby se odstranily neadherující buňky, poté se vrátí do jamek plotny se 48 jamkami, které obsahují čerstvou sloučeninu nebo kontroly.

• Plotna s tkáňovou kulturou se poté inkubuje po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C.

• Supernatanty z každé jamky se odsají do jednotlivých zkumavek a testují se kompetitivní ELISA metodou, která • · * · · · « · · ··· .....

• ·· · ···· ·.·· • « ····< · · ·« · «·· ·· · ······ ·· detekuje c-telopeptid kolagenu typu I, který se v průběhu procesu resorpce uvolňuje. Použije se komerčně dostupná ELISA (Osteometer, Denmark), která obsahuje králičí protilátku specificky reagující se sekvencí 8 aminokyselin (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg), která je přítomna v karboxy-terminálním telopeptidu al-řetězce kolagenu typu I. Výsledky se vyjádří jako % inhibice resorpce při porovnání s kontrolním vehikulem.

Stanovení adheze lidských osteoklastů

Lidské osteoklasty jsou obohaceny a připraveny pro sledování sloučeniny podle výše uvedeného popisu počátečních 9 kroků stanovení 1. Pro názornost jsou dále tyto kroky zopakovány.

• Ze zásoby skladované v tekutém dusíku se odeberou alikvoty suspenzí buněk odvozených od lidského osteoklastomu, rychle se ohřejí na 37 °C a jednou se promyjí centrifugací RPMI1640 médiem (frekvence otáček 1000 za min, 5 min při teplotě 4 °C) .

• Médium se odsaje a nahradí myší anti-HLA-DR protilátkou, pak se v poměru 1:3 naředí RPMI-1640 médiem. Suspenze se inkubuje po dobu 30 min na ledu, za častého míchání.

• Buňky se dvakrát promyjí studeným RPMI-1640 médiem, následuje centrifugace (frekvence otáček 1000 za min, 5 min při teplotě 4 °C), a pak se buňky přenesou do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 15 ml. Mononukleární buňky se spočítají ve zdokonalené Neubauerově počítací komoře.

• Dostatečný počet magnetických kuliček (5/mononukleární buňku) povlečených husím anti-myším IgG (Dynal, Great Neck, * * μ ·· · < ·· e · • ·· · · · · · · · » · _ _ · · · · · · « · · * · · · · r·· « · ř ftftft ♦ ··* ·*♦

-¹-> ft····· ·· • ft ftft ·· ·· ·· K

N.Y.) se odebere z jejich zásobní nádoby a umístí do 5 ml čerstvého média (tím se odplaví toxická azidová konzervační látka) . Médium se pak odstraní imobilizaci kuliček magnetem a nahradí se čerstvým médiem.

• Kuličky se smísí s buňkami a suspenze se inkubuje na ledu po dobu 30 min. Suspenze se často promíchává.

• Buňky obalené kuličkami se imobilizují magnetem a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se dekantují do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml.

• K buňkám obaleným kuličkami se přidá čerstvé médium, aby se uvolnily jakékoliv zachycené osteoklasty. Tento promývací postup se zopakuje lOx. Buňky obalené kuličkami se odstraní.

• Životaschopné osteoklasty se spočítají v čítači komoře za použití fluorescein-diacetatu pro označení živých buněk. Pro zavedení vzorku do komory se použije umělohmotná pasteurova pipeta se širokým kalibrem pro jedno použití.

• Osteoklasty se peletují centrifugací a jejich hustota se přizpůsobí příslušnému počtu do EMEMmédia (počet osteoklastů se nádor od nádoru liší) obohaceného 10% fetálnim telecím sérem a 1,7 g/litr hydrogenuhličitanem sodným.

• Osteoklasty odvozené od osteoklastomu se předem inkubují se sloučeninou (4 dávky) nebo s kontrolami, při teplotě 37 °C po dobu 30 min.

• Buňky se poté naočkují na podložní sklíčka povlečená osteopontinem (lidský nebo krysí osteopontin, 2,5 pg/ml) a inkubují se po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C.

• · • ·

34í • · · · · · · * · ♦ ·· ft··· ···· ····· · ···· ··· ··· • · · · · · ·· »· ·· · · · · • Neadherující buňky se odstraní důkladným promýváním sklíček fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a buňky, které zůstanou na sklíčku, se fixují acetonem.

• Osteoklasty se barví na kyselou fosfatázu rezistentní na vinan (TRAP), selektivní markér buněk s tímto fenotypem (viz kroky 15 až 17), a spočítají se mikroskopií v jasném poli. Výsledky se vyjádří jako % inhibice adheze při porovnání s kontrolou vehikulem.

Stanovení adheze buněk

Buňky a buněčná kultura

Lidské embryonální buňky ledviny (HEK293 buňky) se získají od ATCC (katalogové číslo CRL 1573). Buňky se pěstují v Earlově minimálním esenciálním médiu (EMEM), které obsahuje Earlovy soli, 10 % fetálního bovinního séra, 1 % glutaminu a 1 % penicilinu/streptomycinu.

Konstrukty a transfekce

3,2 kb EcoRI-KpnI fragment podjednotky oí_v a 2,4 kb Xbal-Xhol fragment podjednotky β3 se vloží do míst pCDN vektoru klonujících EcoRI-EcoRV (Aiyar a kol., 1994), který obsahuje CMV promotor a G418 selektabilní markér prostřednictvím ligace tupého konce. Pro stabilní expresi se 80 x 10⁶ HEK 293 buněk elektrotransformuje a_v a £3 konstrukty (20 pg DNA každé podjednotky), použitím Gene Pulseru (Hensley a kol., 1994), a naočkuje se do 100 mm ploten (5 x 10⁵ buněk/plotnu). Po 48 hodinách se růstové médium obohatí 450 pg/ml Geneticinu (G418 sulfát, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Buňky se udržují ve selekčním médiu, až jsou jejich kolonie dostatečně velké, aby mohly být použity pro stanovení.

35:

haunocytochemická analýza, tranfekovaných buněk

Pro určení, zdali exprimovaly HEK 293 transfektanty vitronektinový receptor, se buňky na skleněných mikroskopických podložních sklíčkách imobilizují centrifugací, fixují acetonem po dobu 2 min při teplotě místnosti, a vysuší. Specifická reaktivita s 23C6 se demonstruje použitím monoklonální protilátky specifické pro komplex α_νβ3, použitím standardní metody nepřímé imunofluorescence.

Studie buněčné adheze

Corningovy ELISA plotny o 96 jamkách se přes noc při teplotě 4 ° předem povlékají 0,1 ml lidského vitronektinu (0,2 pg/ml v RPMI médiu). V průběhu experimentu se plotny jednou promyjí RPMI médiem a blokují 3,5% BSA v RPMI médiu po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Transfekované buňky 293 se resuspendují v RPMI médiu, obohaceném 20 mM Hepes o pH 7,4, a 0,1% BSA v hustotě 0,5 χ 10⁶ buněk/ml. Do každé jamky se přidá 0,1 ml buněčné suspenze a inkubuje po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C, za přítomnosti nebo nepřítomnosti různých antagonistů a„p3. Po inkubaci se přidá 0,025 ml 10% roztoku formaldehydu o pH 7,4, a buňky se fixují při teplotě místnosti po dobu 10 min. Plotny se třikrát promyjí 0,2 ml RPMI média a adherující buňky se barví 0,1 ml 0,5% toluidinové modři, po dobu 20 min při teplotě místnosti. Nadbytečné barvivo se odstraní důkladným promýváním deionizovanou vodou. Toluidinová modř inkorporovaná do buněk se eluuje přidáním 0,1 ml 50% ethanolu, který obsahuje 50 mM HCI. Adheze buněk se kvantifikuje na čítači mikrotitrační plotny při optické hustotě 600 nm (Titertek Multiscan MC, Sterling, VA).

Stanovení pevné fáze vazby α_νβ₅

Vitronektinový receptor α_νβ5 se čistí z lidské placenty. Přípravek receptoru se naředí 50 mM Tris-HCl o pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (pufr A), a ihned se přidá do ELISA ploten o 96 jamkách, v množství 0,1 ml na jamku. Do každé jamky se přidá 0,1 až 0,2 pg α_νβ3. Plotny se inkubují přes noc při teplotě 4 °C. V průběhu experimentu se jamky jednou promyjí pufrem A, a inkubují se s 0,1 ml 3,5% bovinního sérového albuminu ve stejném pufru, po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po inkubaci se jamky kompletně odsají a dvakrát promyjí 0,2 ml pufru A.

Během stanovení kompetice [³H]-SK&F-107260 se přidávají do jamek různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 až 100 pM), a to je následováno přidáním 5,0 nM [³H] — SK&F-107260. Plotny se inkubují po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po inkubaci se jamky kompletně odsají a jednou se jamka po jamce promyjí 0,2 ml ledově chladného pufru A. Receptory se solubilizují s 0,1 ml 1% SDS a vazba [³H]-SK&F107260 se stanoví kapalinovým scintilačním čítáním po přidání 3 ml prostředku Ready Safe do Beckman LS 6800 čítače kapalinové scintilace, s účinností 40 %. Nespecifická vazba [³H]-SK&F-107260 se stanoví za přítomnosti 2 pM [³H]-SK&F107260 a je konzistentně méně než 1 % celkového původního množství radioaktivně značeného ligandu. IC50 (koncentrace antagonisty potřebná pro inhibici 50 % vazeb [³H]-SK&F107260) se stanoví běžným nelineárním vynesením křivky metodou nejmenších čtverců, která je modifikací LUNDON-2 programu. Kí (disociační konstanta antagonisty) se vypočítá z Cheng a Prusoffovy rovnice:

Ki - IC50/ (1 + L/K_d) kde

37:

• · · · · • ·

L je koncentrace a K_d je disociační konstanta pro [³H]-SK&F107260.

Inhibice vazby GPIIb-IIIa zprostředkované RGD

Čištění GPIIb-IIIa jednotek prošlých promytých lidských krevních destiček (získaných od Červeného kříže) se lyžuje opatrným mícháním v 3% oktylglukosidu, 20 mM Tris-HCl o pH 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, při teplotě 4 °C po dobu 2 hodin. Lyzát se centrifuguje při 100 000 g po dobu 1 hodiny. Získaný supernatant se aplikuje na 5 ml čoček ve sloupci s lektin sefarozou 4B (Ε. Y. Labs), který se předem ekvilibruje 20 mM Tris-HCl o pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 a 1% oktylglukosidu (pufr A). Po inkubaci trvající 2 hodiny se sloupec promyje 50 ml studeného pufru A. Lektinem zadržený GPIIbIIIa se eluuje pufrem A, který obsahuje 10 % dextrózu. Všechny postupy se provádí při teplotě 4 °C. Získaný GPIIbIIIa má čistotu více než 95%, jak se ukáže při elektroforéze v SDS polyakrylamidovém gelu.

Inkorporace GPIIb-IIIa do lipozomů

Směs sestávající ze 70 % fosfatidylserinu a 30 % fosfatidylcholinu (Avanti Polar Lipids) se suší na stěnách skleněné zkumavky pod proudem dusíku. Čištěný GPIIb-IIIa se naředí na konečnou koncentraci 0,5 mg/ml a smísí s fosfolipidy v poměru protein:fosfolipid = 1:3 (hmotnostně). Směs se resuspenduje a sonikuje v sonikátorové v lázni po dobu 5 min. Poté se směs přes noc dialyzuje za použití systému trubic k dialyzačnímu řezu o molekulové hmotnosti 12 000 až 14 000, proti 1000-násobnému nadbytku 50 mM Tris-HCl o pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (se 2 výměnami). Lipozomy • ·

38:

• · · · • · · ) · · · • · * · · · obsahující GPIIb-IIIa se centrifugují při 12 000 g po dobu 15 min, a resuspendují v dialyzačnim pufru na konečnou koncentraci proteinu přibližně 1 mg/ml. Lipozomy se skladují při teplotě -70 °C až do chvíle, kdy jsou použity.

Kompetitivní vazba na GPIIb-IIIa

Vazba na fibrinogenový receptor (GPIIb-IIIa) se stanoví metodou nepřímé kompetitivní vazby, která používá [³H]-SK&F-107260 jako ligand typu RGD. Stanovení vazby se provede na souboru filtrační plotny o 96 jamkách (Millipore Corporation, Bedford, MA), za použití hydrofilních duraporových membrán s průměrem pórů 0,22 pm. Jamky se předem povlečou 0,2 ml polylyzinu v koncentraci 10 pg/ml (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) , při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, aby se blokovaly nespecifické vazby. Do jamek se přidají různé koncentrace neznačených benzazepinů ve čtyřech provedeních. Do každé jamky se přidá [³H]-SK&F107260 v konečné koncentraci 4,5 nM, a následuje přidání 1 pg čištěných destičkových lipozomů obsahujících GPIIb-IIIa. Směsi se inkubují po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. GPIIb-IIIa navázaný na [³H]-SK&F-107260 se oddělí od nenavázaného filtrací za použití filtrační soustavy Millipore, což je následováno promytím ledovým pufrem (dvakrát, pokaždé 0,2 ml). Vázaná radioaktivita, která zůstává na filtrech, se čítá v 1,5 ml prostředku Ready to Solve (Beckmann Instruments, Fullerton, CA) v Beckmann čítači kapalinové scintilace (Model LS6800), s účinností 40 %. Nespecifická vazba se stanoví v přítom-nosti 2 pM neznačeného SK&F-107260 a je konzistentně méně než 0,14 % celkové radioaktivity dodané do vzorků. Všechny údaje jsou průměrem výsledků stanovení ze čtyřech provedeních.

• · ····· · • · · · ·

Údaje kompetitivní vazby se analyzují vynesením nelineární křivky metodou nejmenších čtverců. Tento způsob poskytne IC₅₀ antagonisty (koncentrace antagonisty, která inhibuje specifickou vazbu [³H] -SK&F-107260 při 50% rovnováze) . IC50 souvisí s rovnovážnou disociační konstantou (Ki) antagonisty získané výpočtem podle Cheng a Prusoffovy rovnice:

Ki = IC₅₀/ (1 + L/Kd) kde

L je koncentrace [³H]-SK&F-107260 použitá ke stanovení kompetitivní vazby (4,5 nM) a K_d je disociační konstanta [³H]-SK&F-107260, což je 4,5 nM, jak se určí Scatchardovou analýzou.

Výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu mají afinitu k vitronektinovému receptorů v porovnání s afinitou k receptorů pro fibrinogen vyšší než 10:1. Nejvýhodnější sloučeniny mají poměr aktivity vyšší než 100:1.

Účinnost sloučenin podle tohoto vynálezu samotných nebo v kombinaci s protinádorovým léčivem může být určena použitím několika modelů myšího transplantabilního nádoru. Pro detaily těchto modelů se odkazuje na US patenty č. 5 004 758 a 5 633 016.

Následující příklady nemají v žádném případě omezovat rámec tohoto vynálezu, ale jsou uvedeny proto, aby ilustrovaly přípravu a použití sloučenin podle tohoto vynálezu. Odborníkovi v oboru bude ihned zřejmé i mnoho jiných provedení.

Příklady provedení vynálezu • ·

Obecné údaje

Spektra nukleární magnetické rezonance se zaznamenávají při 250 nebo 400 MHz, používá se spektrometr Bruker AM 250 nebo Bruker AC 400. CDCI3 znamená deuteriochloroform, DMSO-d6 znamená hexadeuteriodimethylsulfoxid a CD3OD znamená tetradeuteriomethanol. Chemické posuny jsou udávány v částech na milion (δ) směrem dolů od vnitřního standardu tetramethylsilanu. Zkratky pro hodnoty NMR jsou následující s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet, dd = dvojitý dublet, dt = dvojitý triplet, app = zřejmý, br - široký. J znamená NMR kuplovací konstantu měřenou v Hertzech. Infračervená (IR)spektra s kontinuální vlnou se zaznamenávají na infračerveném spektrometru PerkinElmer 683, Fourierova transformovaná infračervená spektra (FTIR) se zaznamenávají na infračerveném spektrometru Nicolet Impact 400 D. IR a FTIR spektra se zaznamenávají způsobem transmise, a polohy pásů jsou udávány v obrácených vlnových číslech (cm^-1). Hmotnostní spektra se zaznamenávají na jakémkoliv z přístrojů VG 70 FE, PE Syx API III nebo VG ZAB HF, použitím metod bombardování rychlými atomy (FAB) nebo ionizace elektrosprchou (ES = electrospray).

Elementární anaylýzy se získají použitím elementárního analyzátoru Perkin-Elmer 240C. Teploty tání se získají na Thomas-Hoover přístroji pro měření teplot tání, a jsou nekorigované. Všechny teploty jsou uvedeny ve stupních celsia.

Pro chromatografií na tenké vrstvě se použijí plotny s tenkou vrstvou Analtech Silica Gel GF a E. Merck Silica Gel 60 F-254. Jak mžiková chromatografie, tak gravitační chromatografie se provedou v silikagelu E. Merck Kieselgel 60 (rozměr částice 0,038 až 0,0688 mm). Analytická a preparativní HPLC se provedou na Rainin nebo Beckmann chromatografech. ODS znamená chromatografický nosič z oktadecylsilyl derivatizovaného silikagelu. 5 μ Apex-ODS znamená chromatografický nosič ve formě oktadecylsilylem derivatizovaného silikagelu s nominální velikostí částice 5 pm, vyrobeno Jones Chromatography, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ® je ODS chromatografický nosič, a je to registrovaná ochranná známka společnosti YMC Co. Ltd.,

Kyoto, Japan. PRP-1® je polymerní (styren-divinylbenzenový) chromatografický nosič, a je to registrovaná ochranná známka společnosti Hamilton Co., Reno, Nevada. Celíte® je filtrační pomůcka, která je složena z oxidu křemičitého na bázi rozsivkové zeminy promytého kyselinou, a je to je to registrovaná ochranná známka společnosti Manville Corp., Denver, Colorado.

Příprava 1

Příprava ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-karboxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-acetatu

a) 3-Benzyl-4-(trifluormethansulfonyloxy)anizol

10,0 ml (60 mmol) anhydridu kyseliny trifluormethansulfonové se v průběhu 3 minut přidává do roztoku 10,71 g (50 mmol) 2-benzyl-4-methoxyfenolu (připraven podle J. Am. Chem. Soc., 71, 64 (1949)) a 12,0 ml (100 mmol) bezvodého 2,6-lutidinu v 250 ml bezvodého CH2CI2, při teplotě -78 °C pod argonem. Reakční směs se míchá při teplotě -78 °C po dobu 0,5 hodiny, poté se ohřeje na teplotu místnosti. Po 1 hodině se reakční směs naředí 250 ml hexanů, a promyje se postupně l,0N HCI (2 x 100 ml), 1,0 N NaOH (2 x 50 ml), H₂O (100 ml) a roztokem hydroxidu sodného (50 ml). Vysoušení Na2SO₄, odpaření a chromatografie na silikagelu (10% EtOAc/hexany) poskytne 16,65 g (96%) sloučeniny pojmenované • · • · · v nadpisu, jako pevné látky světle žluté barvy: TLC R_f 0,51 (10% EtOAc/hexany); ¹H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 7,10 až 7,40 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 9,0, 3,1 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 4,03 (s, 2H), 3,73 (s, 3H); FTIR (CC14) 1492, 1423, 1405, 1249, 1216, 1161, 1144, 1039, 869 cm'¹; MS (ES) m/e 369 (M+Na)⁺, 364,0 (M + NH4)⁺, 347,0 (M + H)⁺.

b) 4-Allyl-3-benzylanizol

3,08 g (72,8 mmol) LiCl v baňce s kulatým dnem se vysuší nad plamenem ve vysokém vakuu, a soustava se nechá pod argonem ochladit na teplotu místnosti. Přidá se 21,0 g (60,6 mmol) 3-benzyl-4-(trifluormethansulfonyloxy)anizolu, 2,13 g (3,0 mmol) bis(trifenylfosfin)palladium(II) chloridu, 150 ml bezvodého DMF a 22,6 ml (72,8 mmol) allyltributylcínu, a směs se propláchne argonem v průběhu tří cyklů odstranění a rychlého zavedení argonu. Směs se zahřeje na teplotu olejové lázně předem nastavenou na 95 °C, čímž vznikne žlutý homogenní roztok. Po 1,5 h se směs odpaří na rotační odparce ve vysokém vakuu, a odparek se opět odpaří, aby se oddělily xyleny. Výsledný odparek se vyjme do 120 ml Et₂O a rychle se míchá s 120 ml 10% KF, po dobu 0,5 hodiny. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 2 x 120 ml Et₂O. Kombinované organické extrakty se přefiltrují skrze Celíte®, aby se odstranily nerozpustné pevné látky, a filtrát se postupně promyje 60 ml H₂O a 60 ml roztoku hydroxidu sodného. Vysušení MgSO₄ a odpaření zanechá zakalený olej žluté barvy. Chromatografie (silikagel, 5% EtOAc/hexany) poskytne 14,21 g (98%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako olej světle žluté barvy: TLC Rf (5%

EtOAc/hexany)	0,51; XH NMR (250 MHz, CDC13)	δ 7,03 až 7,31
(m,	6H) ,	6,74	(dd, J -	8,3, 2,7 Hz,	1H), 6,	66 (d, J = 2,7
Hz,	1H) ,	5,79	až 5,98	(m, 1H) , 4,89	až 5,07	(m, 2H), 3,97
(s,	2H) ,	3,75	(s, 3H),	3,21 až 3,33	(m, 2H)	; FTIR (CC14)

• · · · · · • · l> · · · · • · o · · · · • · ··«·« · · · « « · · · · ·

1610, 1496, 1256, 1046, H)⁺.

914 cm¹; MS (ES) m/e 239,2 (M

c) Kyselina 2-benzyl-4-methoxyfenyloctová

Roztok 23,83 g (104,5 mmol) H5IO6 v 56 ml vody se přidá k roztoku 5,30 g (22,24 mmol) 4-allyl-3-benzylanizolu v 28 ml CC1₄ a 28 ml CH₃CN, a dobře promíchaná směs se důkladně ochladí na teplotu 0 °C. Přidá se 231 mg (1,11 mmol) RuC1₃ a reakční směs se rychle míchá při teplotě 0 °C po dobu 4 hodin, pak při teplotě místnosti po dobu 45 min. Směs se přefiltruje přes Celite® a filtrační vrstva se promyje 120 ml CH2CI2 a pak 120 ml vody. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 3 x 120 ml CH₂C1₂. Vysušením Na₂SO₄ a odpařením vznikne olej hnědé barvy. Ten se rozdělí mezi 90 ml Et₂O a 90 ml 0,25N NaOH, a vrstvy se oddělí. Vrstva s Et₂O se extrahuje 2 x 10 ml 0,25 N NaOH, a kombinované vodné vrstvy se okyselí koncentrovanou HCI na pH 2. Extrakce CH₂C1₂, vysušení Na₂SO₄ a odpaření poskytnou sloučeninu pojmenovanou v nadpisu, jako olej žluté barvy, který tuhne na pevnou látku žluté barvy v množství 4,19 g (74%): ¹H NMR (250 MHz, CDC13) 5 7,05 až 7,35 (m, 6H) , 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (s, 2H); FTIR (CC14) 2300 až 3500 (široký)), 1710, 1611, 1502, 1496, 1285, 1257, 1045 cm'¹; MS (ES) m/e 279,0 (M + Na)⁺, 274,0 (M + NH4)⁺, 257,0 (M + H) ⁺ .

d) 3-Methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10(11H)-on

3,26 g (12,72 mmol) jemného prášku kyseliny 2-benzyl4-methoxyfenyloctové se přidá do dobře promíchané kyseliny polyfosforečné v množství 165 g při teplotě 100 až 110 °C.

Po 15 min se reakční směs naleje na 330 g ledu. Přidá se 33C ml Et₂O a reakční směs se rychle míchá po dobu 15 min.

* ·

• · · · • « · · · · • · • Φ φφ

Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 330 ml Et₂O. Kombinované organické vrstvy se promyjí 2 x 80 ml 5% NaHCO3, pak 80 ml solanky, vysuší MgSO₄ a odpaří. Odparek se znovu odpaří z toluenu, poté je podroben chromatografií (silikagel, 20% EtOAc/hexany). Sloučenina pojmenovaná v nadpise se získá jako pevná látka žluté barvy v množství

1,44	g (48%) :	TLC	Rf (	20% EtOAc/hexany) 0,46; XH NMR (250
MHz,	CDC13) δ	8,07	až	8,15	(m, 1H), 7,39 až 7,49 (m, 1H),
7,25	až 7,48	(m, 2	Η) ,	7,19	(dd, J = 8,3, 1H), 6,86 (d, J =
2,6 :	Hz, 1H),	6,71	(dd,	. J =	8,3, 2,6 Hz, 1H) , 4,21 (s, 2H) ,
4,11	(s,2H),	3,77	(s,	3H) ;	FTIR (CC14) 1680, 1501, 1282,
1270	cm-1; MS	(ES)	m/e	261	(M + Na)+, 256, 0 (M + NH4)+, 239,0
(M +	H)+.

e) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy-5Hdibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

0,58 ml (6,6 mmol) bezvodého EtOAc se po kapkách přidává k 6 ml (l,0M v THF, 6 mmol) roztoku lithiumbis(trimethylsilyl)amidu v 24 ml suchého THF v baňce vysušené plamenem, při teplotě -78 °C pod argonem. Roztok žluté barvy se promíchává při teplotě -78 °C po dobu 0,5 hodiny, potom se po kapkách během 3 minut přidá roztok 715 mg (3 mmol) 3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10(11H)-onu ve 3 ml suchého THF. Při přenosu se použije dalších 0,4 ml suchého THF. Po 0,5 hodině se při teplotě -78 °C reakce přeruší přidáním 15 ml nasyceného NH₄C1 zahřátého na teplotu místnosti, a extrahuje 2 x 30 ml EtOAc. Vysušení MgSO₄, odpaření a chromatografie (silikagel, 10% EtOAc/hexany (400 ml), pak 20% EtOAc/hexany) poskytne 305,4 mg (43%) opět získaného 3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10(11H)-onu jako pevnou látku žluté barvy, následovaného 531,9 mg (54%) sloučeniny pojmenované v nadpisu jako oleje světle žluté barvy: TLC R_f 0,37 (20% EtOAc/hexany); LH NMR (250 MHz, • · · * • · · · • · · *·.

CDC1₃) δ 7,63 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,00 až 7,30 (m, 4H),

6, 80	(d,	J = 2, 6 Hz, 1H) ,	6,69 (dd, J	= 3,2,	2,6 Hz,	1H)	r
3,95	až 4	,35 (m, 2H), 4,07	(s, 2H), 3,	76 (s,3H), 3,68	(s	r
1H) ,	3, 64	(d, J = 14,2 Hz,	1H), 3,35 (	d, J =	14,2 Hz,	1H	),
2,79	(d,	J = 16,0 Hz, 1H),	2,66 (d, J	= 16,0	Hz, 1H),	1,	22
(t,	J = 7	,2 Hz, 3H); FTIR	(CC14) 3580	(ostrý)	, 3509
(široký) ,	1735, 1715, 1503	, 1261, 1198	, 1156,	1044 cm	-1. /	MS
(ES)	m/e	675,2 (2M + Na)+,	653,2 (2M +	H)+.

f) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

242 mg (0,23 mmol) 10% Pd/C se přidá do roztoku 741,1 mg (2,27 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu a 0,19 ml (2,27 mmol) koncentrované HCI ve 23 ml ledové AcOH, a směs se protřepává na Parrově přístroji při teplotě místnosti pod vodíkem, za tlaku 343,5 kPa. Po 6 hodinách se reakční směs přefiltruje skrze Celíte® a filtrační vrstva se promyje EtOAc. Filtrát se odpaří a odparek se znovu odpaří z toluenu. Výsledný olej ovitý odparek matně žluté barvy je podroben chromatografii (silikagel, 20% EtOAc/hexany), aby se získalo 643,6 mg (91%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako bezbarvého oleje: TLC R_f 0,57 (20% EtOAc/hexany); ^XH NMR (250 MHz,

CDC1₃) δ 7,05 až 7,22 (m, 4H), 7,01 (d, J = 8,2 Hz, 1H),

6,76 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,7 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,11 až 4,25 (m, 2H), 3,85 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,70 až 3,90 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,31 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2 Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 5,0 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,3 Hz, 1H) , 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CC1₄) 1734, 1611, 1504, 1285, 1263, 1155, 1044 cm'¹; MS (ES) m/e 333,0 (M + Na)⁺, 328,0 (M + NH₄)⁺, 311,0 (M + H)⁺, 265,0 (M + H-EtOH)⁺.

• · ····· · ···« ··· ··· ·«···· ··

g) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

1,38 g (10,35 mmol) bezvodého AICI3 se najednou přidá k roztoku 643, 6 mg (2,07 mmol) ethyl- ( + )-10,ll-dihydro-3methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu v 21 ml bezvodého CH2CI2, při teplotě 0 °C pod argonem. Roztok žluté barvy se zahřeje na teplotu místnosti a míchá se po dobu 3 hodin, poté se ochladí na teplotu 0 °C a reakce se přeruší 10 ml 3N HCI. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje CH₂C1₂. Kombinované organické vrstvy se vysuší MgSO₄ a odpaří. Chromatografie v silikagelu (25% EtOAc/hexany) poskytne 611,7 mg (100%) sloučeniny pojmenované v nadpisu jako téměř bezbarvý olej: TLC Rf 0,26 (20% EtOAc/hexany); ¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 7,03 až 7,22 (m, 4H) , 6,93 (d, J = 8,1 Hz, IH), 6,69 (d, J = 2,6 Hz, IH), 6,58 (dd, J = 8,1, 2,6 Hz, IH), 5,00 (s, IH), 4,25 (d, J = 14,9 Hz, IH), 4,11 až 4,25 (m, 2H), 3,73 až 3,88 (m, IH), 3,79 (d, J = 14,9 Hz IH), 3,28 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, IH), 2,91 (dd, J = 15,0,

9,3 Hz, IH),	2,65	(dd, J = 15,6, 4, 9 Hz, IH) ,	2,53	(dd, J
15,6, 9,5 Hz,	IH) ,	1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ;	FTIR	(CC14)
3611 (ostrý),	3447	(široký), 1734, 1504, 1291	, 1272, 1176,
1152 cm1; MS	(ES)	m/e 314,2 (M + NH4)+, 297,2	(M +	H)+.

h) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-(trifluormethansulfonyloxy)-5H dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

0,45 ml (2,68 mmol) anhydridu kyseliny trifluormethansulfonové se po kapkách přidává do roztoku 611,7 mg (2,06 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu a 0,48 ml (4,12 mmol) 2,6lutidinu v 10,3 ml bezvodého CH2CI2, při teplotě -78 °C pod argonem. Po 0,5 hodině se reakční směs zahřeje na teplotu místnosti a míchá po dobu 1 hodiny. Roztok žluté barvy se • «· · · 6· · · ·· « ·«·· · · · · ·♦·· • « ···«· « ···« ··· ··· ·«···· · · naředí 50 ml Et₂O a postupně promyje 5 ml l,0N HCI, 5 ml 5% NaHCO₃ a 5 ml roztoku hydroxidu sodného. Vysušení MgSO₄, odpaření a chromatografie v silikagelu (20% EtOAc/hexany) poskytne 808,9 mg (92%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako bezbarvý olej: TLC R_f (20% EtOAc/hexany) 0,58; ¹H NMR (250 MHz, CDC1₃) δ 6,98 až 7,30 (m, 7H), 4,35 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,91 (d, J = 15,2 Hz,

1H) , 3,78 až 3,95 (m, 1H), 3,37 (dd, J = 15,2, 4,1 Hz, 1H), 3,02 (dd, J = 15,2, 9,6 Hz, 1H), 2,70 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,6 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CC1₄) 1735, 1493, 1427, 1250, 1215, 1144, 961,

856 cm'¹; MS (ES) m/e 451,1 (M + Na)⁺, 446,2 (M + NH₄)⁺,

429,2 (M + H)⁺.

i) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-karboxy-5H-dibenzo[a, d] cyklohepten-10-acetat

Směs 808,9 mg (1,89 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3(trifluormethansulfonyloxy)-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10acetatu, 742 mg (7,56 mmol) KOAc, 21,2 mg (0,095 mmol) Pd(OAc)₂, 210 mg (0,38 mmol) 1,1'-bis(difenylfosfino)ferrocenu a 11 ml bezvodého DMSO se propláchne oxidem uhelnatým (tři proplachovací cykly odstranění a rychlé zavedení CO následované probubláváním CO směsí po dobu 5 minut), pak se míchá pod bublinou CO v olejové lázni s teplotou nastavenou na 70 °C. Po 3,5 hodinách se reakční směs naředí 11 ml vody, ochladí na teplotu 0 °C, a okyselí asi 8 ml l,0N HCI. Extrakce 3 x 30 ml CH₂C1₂, vysušením Na₂SO₄, odpaření a opětovném odpaření z toluenu zanechá 2 až 3 ml kapaliny oranžové barvy s odstínem do červena. Chromatografie (silikagel, EtOAc/toluen/AcOH v poměru 3:2:0,l; smísené frakce opět s EtOAc/tlouen/AcOH v poměru 1:1:0,1) poskytne 581,9 mg (95%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako viskózního oleje žluté barvy, který ve « 1>· · » · · « · »· · • 4> ····· · ···· ··· ··· ·(·«·· ·· vysokém vakuu částečně krystalizuje při teplotě 40 °C: TLC Rf (EtOAc/toluen/AcOH v poměru 3:2:0,1) 0,60; ¹H NMR (250 MHz, CDC1₃) δ 7,95 (d, J = 1,5 Hz, 1H) , 7,87 (dd, J = 7,8,

1,5 Hz, 1H), 7,00 až 7,35 (m, 5H), 4,40 (d, J = 15,2 Hz,

1H) , 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,97 (d, J = 15,2 Hz, 1H) , 3,82 až 4,00 (m, 1H), 3,43 (dd, J = 15,3, 4,0 Hz, 1H) , 3,07 (dd, J = 15,3, 9,5 Hz, 1H), 2,69 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,5 Hz, 1H), 1,28 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CC1₄) 2357 až 3378 (široký), 1735, 1692, 1280 cm¹; MS (ES) m/e 342,2 (M + NH4)⁺, 325,2 (M + H)⁺, 307,2 (Μ + HH2O)⁺.

Příprava 2

Příprava ethyl-2-karboxy-10,ll-dihydro-5H-dibenzo[a,d] cyklohepteny1-10-acetátu

a) Methyl-2-benzoyl-5-methoxyfenylacetat

Methyl-3-methoxyfenylacetat se zpracuje s bezoylchloridem a chloridem hlinitým podle popisu z J. Chem. Soc., Perkín Trans I, 171 (1991), aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

b) Methyl-2-benzyl-5-methoxyfenylacetat

Sloučenina uvedená v bodu (a) přípravy 2, se zpracuje s tetrahydroboritanem sodným a kyselinou trifluoroctovou v dichlormethanu podle obecného ,postupu uvedeného v Synthesis, 763 (1978), aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

c) Kyselina 2-benzyl-5-methoxyfenyloctová :

Sloučenina uvedená v bodu (b) přípravy 2, se zpracuje s vodným hydroxidem sodným a methanolem, a promíchá. Směs se odpaří a zpracuje se ředěnou kyselinou chlorovodíkovou, aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

d) 5,ll-Dihydro-2-methoxy-10H-dibenzo[a, d] cyklohepten-10-on

Sloučenina uvedená v bodu (c) přípravy 2 se přidá do směsi kyseliny fosforečné a oxidu fosforečného, a zahřeje se na teplotu 80 °C podle obecného způsobu popsaného v US patentu č. 3 567 730, aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

e) 5, ll-Dihydro-2-hydroxy-10H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Sloučenina uvedená v bodu (d) přípravy 2 se zpracuje s ethanethiolem a chloridem hlinitým, podle obecného postupu popsaného v Tetrahedron. Letters, 5211 (1978), aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

f) 5,ll-Dihydro-2-(trifluormethansulfonyl)oxy-lOHdibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Sloučenina uvedená v bodu (e) přípravy 2 se zpracuje s anhydridem kyseliny trifluormethansulfonové podle obecného postupu popsaného v J. Chem. Soc., Chem. Commun., 904 (1987), aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

g) 5,ll-Dihydro-2-methoxykarbonyl-10H-dibenzo[a, d] cyklohepten-10-on

Sloučenina uvedená v bodu (f) přípravy 2 se zpracuje s oxidem uhelnatým, methanolem, octanem palladnatým a 1,3bis(difenylfosfino)propanem v dimethylsulfoxidu podle • 4 * · · ·· · · · · · • 4' · · · · · · ···* · · ♦ · · · ·«'«··* ·« obecného postupu popsaného v J. Chem. Soc., Chem. Commun., 904 (1987), aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

h) 5, ll-Dihydro-2-karboxy-10H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Sloučenina uvedená v bodu (g) přípravy 2 se míchá se ředěným vodným hydroxidem sodným. Směs se zpracuje se ředěnou kyselinou chlorovodíkovou, aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

i) 5,11-Dihydro-2-terč.-butoxykarbonyl-lOH-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Sloučenina uvedená v bodu (h) přípravy 2 se zpracuje s N,N-dimethylformamid-di-terc.-butylacetatem podle obecného postupu popsaného v Synthesis, 2, 135 (1983), aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

j ) Ethyl-2-terč.-butoxykarbonyl-5H-dibenzo[a,d]-cyklohepten10-acetat

Sloučenina uvedená v bodu (i) přípravy 2 se zpracuje se zinkovým práškem a ethylbromacetatem podle obecného postupu popsaného v Org. Reactions, 1^ 1 (1947), a J. Am. Chem. Soc., 60, 2947 (1938), aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

k) Ethyl-2-karboxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Sloučenina uvedená v bodu (j) přípravy 2 se zpracuje s kyselinou trifluoroctovou v dichlormethanu a promíchá. Směs se odpaří, aby vznikla sloučenina pojmenovaná v nadpisu.

· · · · · · · · · · • <1 ····· · ···· ··· ··· ·!>···« · ·

Příprava 3

Příprava dihydrochloridu 2-[(2-aminoethyl)amino]pyridinu

a) Mono-BOC-1,2-ethylendiamin

Roztok 10,91 g (50 mmol) di-terc.-butyldikarbonatu v 50 ml CH₂C1₂ se v průběhu 30 min po kapkách přidává do rychle promíchávaného roztoku 33 ml (500 mmol) 1,2ethylendiaminu v 250 ml CH₂C1₂, při teplotě 0 °C po argonem.

V průběhu přidávání se odděluje sraženina. Poté, co je přidávání ukončeno, se reakční směs zahřeje na teplotu místnosti, míchá se po dobu 1 hodiny a odpaří na rotační odparce. Odparek se vyjme do 100 ml vody a přefiltruje, aby se odstranilo malé množství nerozpustné látky. Filtrát se extrahuje 3 x 100 ml CH₂C1₂, a kombinované organické extrakty se vysuší MgSO4 a koncentrují, aby se získalo 6,00 g (75%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, v podobě kalné kapaliny: ^ΧΗ NMR (250, CDCI3) δ 4,75 až 5,00 (m, IH), 3,05 až 3,25 (m, 2H), 2,65 až 2,85 (m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,12 (br s, 2H) .

b) 2-[[2-(BOC-amino)ethyl]amino]pyridin-N-oxid

Směs 5,83 g (36,39 mmol) mono-BOC-1,2-ethylendiaminu, 7,25 g (43, 67 mmol) hydrochloridu 2--chlorpyridin-N-oxidu, 15,29 g (182 mmol) NaHCCj a 36 ml terč.-amylalkoholu se zahřívá při zpětném toku. Po uplynutí 47 hodin se směs tmavě hnědé barvy ochladí, naředí 100 ml CH₂C1_2/ a přefiltruje podtlakovým filtrem, aby se odstranily nerozpustné látky. Filtrát se odpaří a znovu odpaří z toluenu. Chromatografie v silikagelu (10% MeOH/CHCl₃) poskytne 8,23 g (89%) nevyčištěné sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako pevné látky žluté barvy, která se použije bez dalšího čištěni: TL·

*..· (10% MeOH/CHCl₃) Rf 0,42; NMR (250 MHz, CDC1₃) δ 8,16 (dd,

J = 6,5,	1,3 Hz, 1H), 7,05 až 7,30	(m, 2H),	6,68	(br d, J
8,6 Hz,	1H) ,	6,50 až 6,65	(m, 1H) ,	5,70 až	5,95	(m, 1H),
3,25 až	3,60	(m, 4H), 1,44	(s, 9H);	MS (ES)	m/e	254 (M +

H)\

c) 2-[[2-(BOC-amino)ethyl]amino]pyridin

106,4 mg (0,10 mmol) 10% Pd/C se přidá do roztoku 126,7 mg (0,5 mmol) 2-[[2-(BOC-amino)ethyl]amino]pyridin-Noxidu a 0,25 ml (0,25 mmol) cyklohexenu v 5 ml absolutního EtOH, a směs se zahřívá při zpětném toku. Po 16 hodinách se reakční směs přefiltruje skrze Celíte® a filtrát se odpaří. Odparek se zkombinuje se zbytkem získaným ze samostatně připraveného preparátu v rozsahu 0,5 mmol, a kombinované látky se čistí chromatografií na sloupci silikagělu (5% MeOH/CHCl₃). Získá se 148,4 mg (63% vztaženo na 1 mmol 2[[2-(BOC-amino)ethyl]amino]pyridin-N-oxidu) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako oleje žluté barvy: TLC (5% MeOH/CHCl₃) R_f 0,43; ^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,05 až 8,12 (m, 1H), 7,37 až 7,46 (m, 1H), 6,53 až 6,61 (m, 1H), 6,41 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,12 (br s, 1H), 4,86 (br s, 1H), 3,26 až 3,51 (s, 4H), 1,44 (s, 9H); MS (ES) m/e 238 (M + H)⁺.

d) Dihydrochlorid 2-[(2-aminoethyl)amino]pyridinu

4N HCI v 3,2 ml dioxanu se přidá do proudu roztoku 148,4 mg (0,63 mmol) 2-[[2-(BOC-amino)ethyl]amino]pyridinu ve 3,2 ml bezvodého CH2CI2 při teplotě 0 °C, a poté se reakční směs zahřeje na teplotu místnosti. Po uplynutí 2 hodin se směs přefiltruje podtlakovým filtrem, aby se zachytila sražená pevná látka, která se promyje bezvodým Et2O a vysuší, aby se získalo 132,8 mg (kvantitativní množství) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako pevné látk • · · • I» · • · žluté barvy: ^XH NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,99 až 8,07 (m, IH), 7,92 až 7,98 (m, IH), 7,19 (d, J = 9,1 Hz, IH), 6,98 až 7,04 (m, IH), 3,76 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,27 (t, J = 6,2 Hz, 2H, částečně nečitelné pro signál zbývajícího rozpouštědla); MS (ES) m/e 138 (M + H)\

Příprava 4

Příprava 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]pyridin-N-oxidu

a) 2-[(3-Hydroxy-l-propyl)amino]pyridin-N-oxid

Směs 16,6 g (0,1 mol) 2-chlorpyridin-N-oxidu, 15,3 ml (0,2 mol) 3-amino-l-propanolu, 42 g (0,5 mol) NaHCO₃ a 100 ml terč.-amylalkoholu se zahřívá na teplotu zpětného toku.

Po 21 hodině se reakční směs ochladí, naředí 300 ml CH2CI2 a přefiltruje podtlakovým filtrem, aby se odstranily nerozpustné látky. Filtrát se odpaří a znovu odpaří z toluenu, aby zbyl olej žluté barvy. Chromatografie na silikagelu (20% MeOH/CHCl₃) poskytne 15,62 g (93%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako pevnou látku žluté barvy: TLC (20% MeOH/CHCl₃) R_f 0,48; ^XH NMR (250 MHz, CDC1₃)

δ 8,07	(dd,	J	= 6,6, 1,2 Hz, IH),	7,34	(br t,	IH) ,	7,10	až
7,30 (	m, IH	) ,	6,64 (dd, J	= 8,5, 1	, 4 Hz	, IH) ,	6, 40	až 6,	60
(m, IH) , 4,	49	(br s, IH),	3,65 až	3,90	(m, 2H)	, 3,	35 až	3,60
(m, 2H), 1,	75	až 2,00 (m,	2H); MS	(ES)	m/e 169	(M	+ H) + .

Příprava 5

Příprava 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]-4-nitropyridin-Noxidu

a) 2-[(3-Hydroxy-l-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid • ····· · · · · · ··· ··· *0···· ··

Podle postupu z přípravy 12, kromě toho, že se použije 2-chlor-4-nitropyridin-N-oxid (viz P. C. Jain, S. K. Chatterjee, N. Anand, Indián Journal of Chemistry, 403 (1996)) místo hydrochloridu 2-chlorpyridin-N-oxidu, se připraví sloučenina pojmenovaná v nadpisu jako pevná látka oranžové látky: MS (ES) m/e 214,2 (M + H)⁺.

Příprava 6

Příprava 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]-4-methylpyridin-Noxidu

a) 2-[(3-Hydroxy-l-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid

Příprava se provede podle postupu z přípravy 12, kromě toho, že se použije 2-chlor-4-methylpyridin-N-oxid (viz E.V. Brown, J. Amer. Chem. Soc., 7 9, 3565 (1957)) namísto hydrochloridu 2-chlorpyridin-N-oxidu, a sloučenina pojmenovaná v nadpisu se připraví jako pevná látka bělavé barvy: MS (ES) m/e 183 (M + H)⁺.

Příprava 7

Příprava 2-(ethylamino)-6-pyridylethanolu

a) 2-(N-BOC-amino)-6-pikolin

K roztoku 4,33 g (40 mmol) 2-amino-6-pikolinu, 6,2 ml (40 mmol) Et₃N a 50 ml CH2CI2 se při teplotě 0 °C za stálého míchání přidá 9,6 g (44 mmol) di-terc.-butyldikarbonatu. Poté, co reakční se směs míchá při teplotě místnosti přes noc, se odpaří ve vakuu, naředí vodou a extrahuje 2 x 50 ml CH₂C1₂. Vysušení MgSO₄ a odpaření poskytne sloučeninu • <»« · · · · · » · · · • ····· · ···· ··· ··· • « · · · · ·· pojmenovanou v nadpisu, jako bezbarvý olej: MS (ES) m/e 209 (Μ + H) ⁺.

b) 2-(N-BOC-N-ethylamino)-6-pikolin

K suspenzi 1,15 g (29,5 mmol) NaH (60% disperze v minerálním oleji) v 50 ml DHF, se při teplotě 0 °C přidá roztok 2-(N-BOC-amino)-β-pikolinu v 30 ml DMF. Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu 15 minut; poté se přidá

4,6 g (30 mmol) ethyljodidu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc; pak se odpaří ve vakuu. Odparek se naředí vodou a extrahuje 3 x 50 ml CH2CI2. Vysušení MgSO₄, odpaření a chromatografíe v silikagelu (20% EtOAc/hexan) poskytne sloučeninu pojmenovanou v nadpisu, jako bezbarvý olej: MS (ES) m/e 237 (M + H)⁺.

c) Ethyl-2-(N-BOC-N-ethylamino)-6-pyridylacetat

0,018 mol LDA se připraví v 30 ml THF, ochladí na teplotu -78 °C a přidá se 3,5 g (15 mmol) 2-(N-BOC-Nethylamino) -6-pikolinu, čímž vznikne roztok tmavě červené barvy. Po 15 minutách se přidá 2,2 ml (17,9 mmol) diethylkarbonatu, a roztok zabarvený do barvy burgundské červeně se míchá při teplotě -78 °C po dobu dalších 15 minut, reakce se poté přeruší nasyceným NH₄C1. Směs se zahřeje na teplotu místnosti a extrahuje 3 x 30 ml EtOAc. Kombinované organické vrstvy se promyjí roztokem hydroxidu sodného, vysuší MgSO₄ a odpaří. Chromatografíe v silikagelu (10% EtOAc/hexan) poskytne sloučeninu pojmenovanou v nadpisu, jako bezbarvý olej: MS (ES) m/e 309 (M + H)⁺.

d) Ethyl-2-(ethylamino)-6-pyridylacetat • 4» ····· · ···· ··· ··· ·<»···· ··

Roztok 1,5 g (4,87 mmol) ethyl-2-(N-BOC-N-ethyiamino) -6-pyridylacetatu a 5 ml (20 mol) 4M HCI/ dioxanu, se při teplotě místnosti míchá přes noc, a poté se odpaří. Opětovným odpařením z toluenu se dostane sloučenina pojmenovaná v nadpisu, jako pevná látka bílé barvy: MS (ES) m/e 209 (M + H) ⁺ .

e) 2-(Ethylamino)-6-pyridylethanol

K mechanicky míchanému roztoku LiAlH₄ v THF (l,0M, 20 ml, 20,4 mmol) se po kapkách přidává roztok 1 g (4,1 mmol) ethyl-2-(ethylamino)-6-pyridylacetatu ve 30 ml THF. Poté, co je přidávání ukončeno, se reakční směs zahřívá na teplotu zpětného toku. Po 5 hodinách se reakční směs ochladí na 0 °C a reakce se přeruší 10% roztokem NaOH. Pevné látky se oddělí filtrací a filtrát se odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí v CH2CI2, roztok se vysuší MgSO₄ a odpaří. Třikrát provedeným opakovaným odpařením z toluenu, se získá sloučenina pojmenovaná v nadpisu, jako bezbarvý olej: MS (ES) 167 (M + H)⁺.

Příprava 8

Příprava 10,ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-onu

a) Kyselina 2-benzyl-4-methoxyfenyloctová

Roztok 13,0 g (0,048 mmol) kyseliny 2-benzoyl-4methoxyfenyloctové, připravené podle postupu z J. Med.

Chem., 24, 998 (1981), v 600 ml ledové kyseliny octové, se zpracuje pod argonem se 4,3 g 10% Pd/C, a hydrogenuje se při tlaku 343,5 kPa po dobu 17 hodin. Směs se přefiltruje použitím Celite® a filtrát se odpaří a znovu odpaří • · ····· · ···· ··· ··· ······ ·· z toluenu a methylenchloridu, aby vzniklo 14,2 g sloučeniny pojmenované v nadpisu: ¹H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 3,52 (s,

2H) , 3,75 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 6,7 (m, 2H), 7,15 (m, 6H) .

b) 10,ll-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-on

Roztok 14,2 g (0,055 mmol) kyseliny 2-benzyl-4-methoxyfenyloctové ve 120 ml benzenu a 28 ml thionylchloridu, se vaří pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny a odpaří. Chlorid kyseliny se rozpustí ve 40 ml suchého methylenchloridu a roztok se pod argonem po kapkách přidává k roztoku 14,7 g (0,11 mol) AICI3 v 600 ml methylenchloridu. Reakční směs se míchá pod argonovou atmosférou po dobu 2,5 hodin, při teplotě místnosti, pak se reakce přeruší 200 ml ledové vody. Vrstvy se oddělí a organická fáze se postupně promyje 10% roztokem NaOH, vodou a zředěnou HCI. Výsledný roztok se naředí 200 ml etheru, vysuší MgSO₄ a odpaří. Odparek se rozetře se směsí ether/hexan v poměru 1:1, a filtrací se získá 9,35 g sloučeniny pojmenované v nadpisu: Teplota tání 105 až 106 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 3,72 (s, 3H) 4,1 (s, 2H), 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, IH), 6,82 (s, IH) 7,30 (m, 4H), 8,1 (d, IH).

Příprava 9

Příprava ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]— cyklohepten-10-acetátu

a) Ethyl-(±)-3-(3-methoxyfenyl)indenacetat

Ke studenému roztoku 4 g (18 mmol) 3-(3-methoxyfenyl ) indenu, který se připraví podle postupu z J. Med. Chem., 24, 998 (1981), v 15 ml THF, se při teplotě 0°C po kapkách přidává 20 ml (IM v THF) roztoku LiN(TMS)2r ·

• · · · ·· · · ·· · • ····· · ···· ··· ··· • · · · · · · v průběhu 5 minut. Výsledný roztok se při teplotě -78 °C v průběhu 30 minut po kapkách přidává k roztoku 3,34 g (20 mmol) ethylbromacetátu v 15 ml THF. Po 2,5 hodinách se reakce přeruší nasyceným roztokem chloridu amonného a vrstvy se oddělí. Organická vrstva se vysuší MgSO₄ a odpaří, aby vznikl surový produkt, který se čistí sloupcovou chromatografií (SiO₂/2 až 4% směs EtOAc/hexan), aby se dostalo 1,1 g sloučeniny pojmenované v nadpisu: ¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,30 (t, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 6,6 (s, 1H), 6,9 (m,

1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 6H).

b) Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzoyl)]fenylsukcinát

Roztok 1,1 g (3,6 mmol) ethyl-(±)-3-(3-methoxyfenyl)indenacetatu v 30 ml acetonu se zpracuje s 0,5 ml 4% vodného roztoku oxidu osmičelého, a následuje přidání 5 ml 1,2 M (6 mmol) Jonesova činidla po kapkách, podle postupu uvedeného v literatuře v J. Org. Chem., 58, 4745 (1993). Po míchání přes noc při teplotě v místnosti se tmavá reakční směs rychle ochladí 2,5 ml izopropanolu, poté 0,9 g hydrogensiřičitanu sodného a 30 ml vody. Produkt se extrahuje ethylacetátem, promyje roztokem hydroxidu sodného, vysuší MgSC>4 a odpaří, aby se dostal pevný odparek. Rozetřením se směsí etheru/hexanu v poměru 1:1 se získá 0,76 g sloučeniny pojmenované v nadpisu: NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,18 (t, 3H), 2,90 (m, 1H), 3,3 (m, 1H) , 3,92 (s, 3H) , 4,1 (q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m,

6H) .

c) Ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzyl) ]fenylsukcinát

Směs 0,76 g (2,1 mmol) ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzoyl )]fenylsukcinátu a 0,6 g 10% Pd/C ve 35 ml ledové • ·· · · · · · · ·· · • · ····· · ···· ··· ··· ······ · · kyseliny octové, se při tlaku 343,5 kPa hydrogenuje po dobu 17 hodin. Směs se přefiltruje přes Celíte® a filtrační vrstva se promyje kyselinou octovou. Filtrát se odpaří a znovu odpaří z toluenu a methylenchloridu, aby se dostalo 0,65 g sloučeniny pojmenované v nadpisu: ¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,20 (t, 3H), 2,20 (m, 1H), 3,0 (m, 1H), 3,74 (s,

3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H), 6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).

d) Ethyl- (±)-10,ll-dihydro-3-methoxy-ll-oxo-5H-dibenzo[a, d] cyklohepten-10-acetat

K magneticky míchanému roztoku 0,65 g (1,9 mmol) ethyl-(±)-3-[(3-methoxybenzyl)]fenylsukcinátu v 10 ml suchého methylenchloridu se přidá 0,2 ml DMF a 0,2 ml (2,28 mmol) oxalylchloridu. Po 1,5 hodině se roztok po kapkách přidá k suspenzi 0,6 g (4,5 mmol) chloridu hlinitého v 15 ml suchého methylenchloridu. Po 2 hodinách se směs prudce ochladí ledovou vodou, vrstvy se oddělí, a vodná vrstva se extrahuje methylenchloridem. Kombinované organické vrstvy se vysuší MgSO₄ a odpaří. Odparek se čistí sloupcovou chromatografií (SÍO2/2 až 4% EtOAc/hexan) , aby se dostalo 0,3 g sloučeniny pojmenované v nadpisu: ¹H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,28 (t, 3H), 2,88 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H) , 3,88 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,85 (d, 1H) , 4,95 (m, 1H), 5,8 (m, 2H), 7,22 (m, 4H), 8,1 (s, 1H) .

e) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a, d] cyklohepten-10-acetat

Směs 0,3 g (0,93 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3methoxy-ll-oxo-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu a 0,3 q 10% Pd/C v 25 ml ledové kyseliny octové se hydrogenuje při tlaku 343,5 kPa po dobu 18 hodin. Směs se přefiltruje přes '» · ····· · ···· ··· · · · '»· · · · · · ·

Celíte® a promyje se kyselinou octovou. Filtrát se odpaří a znovu odpaří z toluenu a methylenchloridu, aby se dostalo 0,25 g sloučeniny pojmenované v nadpisu: ¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,28 (t, 3H) , 2,60 (m, 2H) , 2,90 (m, ÍH) , 3,30 (m, ÍH), 3,80 (s, 3H), 3,85 (d, ÍH), 4,18 (q, 2H), 4,30 (d, 1H) , 6,70 (m, 2H), 7,0 (d, ÍH), 7,22 (m, 4H).

Následující sloučeniny ilustrují způsoby přípravy biologicky aktivních sloučenin podle tohoto vynálezu z intermediárních sloučenin, které jsou popsány v předchozích přípravách.

Příklad 1

Příprava kyseliny (+)-10,ll-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octové

a) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Roztok 1,94 g (11,55 mmol) 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]pyridin-N-oxidu a 1,8 ml (11,55 mmol) diethylazodikarboxylatu v 58 ml bezvodého DMF, se v průběhu 10 min po kapkách přidává k roztoku 1,37 g (4,62 mmol) ethyl-(±)10,ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10acetatu a 3,27 g (12,47 mmol) trifenylfosfinu ve 23 ml bezvodého DMF, při teplotě místnosti pod argonem. Po 23,5 hodinách se reakční směs odpaří na rotační odparce a odparek se znovu odpaří z xylenů, aby se odstranil nadbytečný DMF. Chromatografie na silikagelu (30% EtOAc/0,5 L hexany, potom 1 L EtOAc, potom 5% MeOH/CHCla) poskytne 298,1 mg (22%) znovu získaného ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-hydroxy-5Hdibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu, a potom 1,54 g (75%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako oleje žluté barvy: ¹H • · · φ φ * φ φ

NMR	(250 MHz	, cdci3;	ι δ	8,10	(d<	d, J = 6,6, 1,3 Hz, 1H	), 6,85
až 7,	.30 (m,	7H), 6,	73	(d, J	=	2,6 Hz, 1H), 6,68 (dd,	J =
8,2,	2,6 Hz,	1H) , 6	, 61	(dd,	J	= 8,5, 1,6 Hz, 1H), 6,	45 až
6,57	(m, 1H)	, 4,29	(d,	J =	15,	1 Hz, 1H), 4,10 až 4,2	5 (m,
2H) ,	4,06 (t	, J = 5	,7	Hz, 2	Η) ,	3,84 (d, J = 15,1 Hz,	1H) ,
3,70	až 3,92	(m, 1H	) ,	3,49	(Q/	J = 6,5 Hz, 2H), 3,30	(dd, J
= 15,	0, 4,2	Hz, 1H)	, 2	/93 (	dd,	J = 15,0, 9,3 Hz, 1H)	/ 2,65
(dd,	J = 15,	6, 5,0	Hz,	1H) ,	2,	51 (dd, J = 15,6, 9,4	Hz, 1H)
2,05	až 2,25	(m, 2H	) ,	1,27	(t,	J = 7,1 Hz, 3H); MS (	ES) m/e

447 (Μ + Η)⁺.

b) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propoxy]5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Směs 1,54 g (3,45 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu, 0,73 g (0,69 mmol) 10% Pd/C, 7 ml (6,9 mmol) cyklohexenu a 35 ml izopropanolu se zahřívá na teplotu zpětného toku po dobu 2 hodin, pak se katalyzátor odstraní filtrací přes Celíte®. Odpaření vede ke vzniku oleje žluté barvy, který se opět vystaví podmínkám reakce. Po 17 hodinách se reakční směs zpracuje stejně, jak je uvedeno výše, a odparek žluté barvy se opět vystaví podmínkám reakce, s tím, že se místo izopropanolu jako rozpouštědla použije 35 ml směsi EtOAc/izopropanol v poměru 1:1. Směs se zahřívá na teplotu zpětného toku po dobu 5 hodin, pak se přidá 73 mg (0,69 mmol) palladiové černi, a vše se zahřívá na teplotu zpětného toku po dobu dalších 18,5 hodin. Postup popsaný výše následovaný chromatografií na sloupci silikagelu (směs EtOAc/hexany v poměru 1:1) poskytne 0,94 g (63%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako olej světle žluté barvy: TLC R_f (směs EtOAc/hexany v poměru 1:1) 0,38;

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 8,02 až 8,11 (m, 1H), 7,33 až 7,42 (m, 1H) , 7,02 až 7,20 (m, 4H), 7,00 (d, J = 8,2 Hz, 1H), · · ·♦ ·4 ·· *· ···* « « · 4 4 4·4· 4 · 4 4 4 4 4 44444 4 ·4· 4

444444 44

6,77 (d, J = 2,6 Hz, 1Η), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,6 Hz, 1H) , 6,50 až 6,60 (m, 1H), 6,39 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,69 (br t, 1H) , 4,29 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,11 až 4,25 (m, 2H) , 4,05 (t, J = 5,8 Hz, 2H) , 3,84 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,75 až 3,90 (m, 1H), 3,48 (zřejmý q, 2H), 3,30 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz,

1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2 Hz, 1H) , 2,64 (dd, J = 15,6,

4,8 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,5 Hz, 1H), 2,02 až 2,15 (m, 2H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H); MS (ES) m/e 431 (M + H)⁺.

c) Kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová

Směs 0,94 g (2,18 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3(2-pyridylamino)-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10acetatu a 2,6 ml (2,62 mmol) l,0N NaOH v 19,2 ml absolutního EtOH, se zahřívá v olejové lázni nastavené na teplotu 50 °C. Po 28,5 hodinách se reakční směs odpař! na rotační odparce a odparek se čistí ODS chromatografií (MeOH/H₂O v poměru 1:1). Po odpaření zbyde zakalený vodný roztok, který se stane homogenní po přidání malého množství l,0N NaOH. pH se upraví na 7 přidáním 1,0 N HCI, a pevná sraženina se odebere a promyje vodou. Matečné louhy se odpaří a odparek se zpracuje obdobným způsobem, aby vzniklo malé množství druhé várky. Zkombinované látky se vysuší ve vysokém vakuu při teplotě 40 °C, aby se dostalo 0,70 g (79%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako pevné téměř bezbarvé látky: HPLC (Hamilton PRP-1®, 40% CH₃CN/H₂O obsahující 0,1 % TFA) k'= 1,2,; X NMR

(400	MHz,	DMSO-d6) δ 7,94	(d, J = 4,4 Hz,	1H), 7,32 až 7,41
(m,	1H) ,	7,03 až 7,22 (m,	4H), 6,97 (d, J	= 8,4 Hz, 1H),
6, 83	(d,	J = 2,4 Hz, 1H),	6,60 až 6,74 (m,	2H), 6,41 až 6,50
(m,	2H) ,	4,20 (d, J = 14,7	Hz, 1H), 4,00 (	;t, J = 6,2 Hz,
2H) ,	3,88	(d, J = 14,7 Hz,	1H), 3,60 až 3,	70 (m, 1H), 3,26

až 3,40 (m, 2H, částečně nečitelné pro signál zbývajícího rozpouštědla), 3,20 (dd, J = 15,1, 4,3 Hz, 1H) , 2,83 (dd, J • 99 = 15,1, 10,3 Hz, ΙΗ), 2,60 (dd, J = 15,9, 5,3 Hz, 1H), 2,50 (dd, 1H, částečně znečitelněno signálem zbývajícího rozpouštědla), 1,88 až 2,00 (m, 2H); MS (ES) m/e 403 (M + H)\

Analýza (%) pro C25H_2SN2O3 · 0,25 H₂0:

vypočteno: C, 73,78; H, 6,56; N, 6,88, nalezeno: C, 73,85; H, 6,47; N, 6,75.

Příklad 2

Příprava kyseliny (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-amino-2pyridylamino)-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10octové

a) Ethyl-(±) -10,ll-dihydro-3-[3-[2-(4-nitro-N-oxopyridyl)amino]-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Podle postupu z příkladu 1(a), kromě toho, že se použije 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridin-N-oxid namísto 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]-pyridin-N-oxidu, a sloučenina pojmenovaná v nadpisu se získá chromatografií na sloupci silikagelu (gradient: EtOAc/hexany v poměru 2:1, potom EtOAc, potom 5% MeOH ve směsi EtOAc/CHCl₃ v poměru 1:1): MS (ES) m/e 492 (M + H)⁺.

b) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino) -1propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Podle postupu z příkladu 1(b), kromě toho, že se použije ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-[2-(4-nitro-N-oxopyridyl ) amino]-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat místo ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino] 1-propoxy]-5H-dibenzo [a,d]cyklohepten-10-acetatu, a sloučenina pojmenovaná v nadpisu se získá chromatografií na

64............

sloupci silikagelu (20% MeOH/ CHCI3) : MS (ES) m/e 446 (M + H)⁺.

c) Kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino) · 1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová

0,74 ml (0,74 mmol) l,0N NaOH se najednou přidá k roztoku 216,3 mg (0,49 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[ 3· (4-amino-2-pyridylamino)-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu v 2,5 ml THF a 1,8 ml vody, při teplotě místnosti. Dvoufázová směs se zahřívá po dobu 1 hodiny v olejové lázni nastavené na teplotu 40 °C, poté se přidá asi 1 ml absolutního EtOH, aby se obě fáze spojily. Reakční směs se udržuje při teplotě 40 °C po dobu 19,5 hodin, potom se odpaří a odparek se rozpustí v 5 ml směsi CH3CN/H2O v poměru 1:1. Roztok se okyselí 0,11 ml (1,47 mmol) TFA a odpaří. ODS chromatografie(40% CH3CN/H2O obsahující 0,1 % TFA) je následována odpařením, aby se odstranil zbývající CH3CN, a získal se olejovitý vodný roztok, který se přidáním malého množství CH₃CN stane homogenní. pH se upraví na 7 přidáním l,0N NaOH, a vysráží se olej ovitá polotuhá látka. Směs se odpaří, aby se odstranil CH₃CN, a výsledná pevná látka se zachytí. Ta se rozpustí ve vodném NaOH a pH se upraví na 7. Pevná látka se odebere, promyje dostatečným množstvím vody a vysuší ve vysokém vakuu, při teplotě 45 °C, aby se získalo 133,3 mg (61%) sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako pevné bělavé látky: HPLC (Hamilton PRP-1®, 35% CH₃CN/H₂O obsahující 0,1 % TFA) k' = 3,0; ^XH NMR (400 MHz, DMSO-dg) δ 7,48 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,04 až 7,22 (m, 4H), 6,95 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,88 až 7,02 (m, 1H), 6,82 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 6,67 (dd, J = 8,2, 2,4 Hz, 1H), 6,27 (br s, 2H), 5,95 (dd, 1H) , 5,65 (úzký d, 1H), 4,18 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,88 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 3,59 až 3,70 (m, 1H), • · · · · · • · • · · ·

3,13 až 3,30 (m, 3H), 2,82 (dd, J = 15,2, 10,0 Hz, 1H), 2,46 (dd, J = 15,8, 8,8 Hz, 1H, částečně nečitelné pro signál zbývajícího rozpouštědla), 2,58 (dd, J = 15,8, 5,2 Hz, 1H), 1,86 až 2,01 (m, 2H); MS (ES) m/e 418 (M + H)⁺.

Analýza (%) pro C25H27N3O3 · 1,67 H2O:

vypočteno: C, 67,09; H, 6,83; N, 9,39, nalezeno: C, 66,99; H, 6,59; N, 9,34.

Příklad 3

Příprava kyseliny (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-methyl-2pyridylamino)-1-propoxy]-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10octové

a) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-[2-(4-methyl-N-oxopyridyl)amino]-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Podle postupu z příkladu l(a), kromě toho, že se použij e 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid místo 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]pyridin-N-oxidu, se připraví sloučenina pojmenovaná v nadpisu jako olej světle žluté barvy chromatografií na sloupci silikagelu (gradient: 30, 50, 100% EtOAc v hexanu, potom 1 až 5% MeOH v CHC1₃) : MS (ES) m/e 461,3 (M + H)⁺.

b) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Podle postupu z příkladu l(b), kromě toho, že se použij e ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-[2-(4-methyl-N-oxopyridyl) amino]-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat místo ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]1-propoxy]-5H-díbenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu, se připraví sloučenina pojmenovaná v nadpisu následující chromatografií na sloupci silikagelu (gradient: 30 až 50% EtOAc v hexanu): MS (ES) m/e 445,3 (M + H) ⁺ .

c) Kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová

0,144 ml (0,144 mmol) l,0N NaOH se přidá k roztoku 35 mg (0,08 mmol) ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-methyl-2pyridylamino)-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10acetatu v 5 ml EtOH, při teplotě místnosti. Směs se zahřívá přes noc v olejové lázni nastavenou na teplotu 32 °C, a pak se odpaří. Odparek se rozpustí ve 3 ml vody a roztok se okyselí 20% TFA. ODS chromatografie(5 až 10% CH3CN/H2O obsahující 0,1 % TFA) následovaná odpařením a lyofilizací, poskytne sloučeninu pojmenovanou v nadpisu, jako prášek bílé barvy: MS (ES) m/e 417,3 (M + H)⁺.

Analýza (%) pro C26H28N2O3 · 2,0 TFA · 1,0 H₂O:

vypočteno: C, 54,38; H, 4,87; N, 4,23, nalezeno: C, 54,66; H, 4,53; N, 4,32.

Příklad 4

Příprava kyseliny (±)-10,ll-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octové

a) Ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2-pyridyl]1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Podle postupu z příkladu l(a), kromě toho, že se použije 2-(ethylamino)-6-pyridylethanol místo 2-[(3-hydroxy 1-propyl)amino]pyridin-N-oxidu, se získá sloučenina pojmenovaná v nadpisu se získá jako bezbarvý olej • · ····· · · ·· · ··· ··· · · · · · · · následující chromatografií na sloupci silikagelu (5%

MeOH/CH₂Cl₂) : MS (ES) m/e 445 (M + H) ⁺ .

b) Kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2py ridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová mg (0,18 mmol) kyseliny ethyl-(±)-10,ll-dihydro-3[2-[6-(ethylamíno)-2-pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octové se rozpustí ve 3 ml MeOH a přidá se 0,22 ml (0,22 mmol) 1,0 N NaOH. Roztok se při teplotě místnosti míchá přes noc a pak se odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí ve 3 ml vody a roztok se okyselí 20% TFA. Chromatografie na sloupci C-18 Bond Elute (30% CH₃CN/H₂O obsahující 0,1 % TFA) poskytne sloučeninu pojmenovanou v nadpisu, jako pevnou látku bílé barvy: MS (ES) m/e 417 (M + H) ⁺ .

Analýza (%) pro Ο₂₆Η28Ν₂Ο₃ · 1,3 CF₃CO₂H:

vypočteno: C, 60,83; H, 5,23; N, 4,96, nalezeno: C, 60,64; H, 5,26; N, 4,26.

Výše uvedený popis úplně popisuje, jak připravit a využít přítomný vynález. Přítomný vynález avšak není omezen na příslušná výše popsaná provedení, ale zahrnuje všechny jejich modifikace, které jsou v rámci následujících patentových nároků. Různé odkazy na časopisy, patenty a jiné publikace, které jsou v tomto spisu citovány, vyjadřují stav oboru, a jsou zde zahrnuty odkazem ve svém celku.

Claims (21)

PATENTOVÉ NÁROKY

1.

1. Sloučenina, kterou je:

kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridy1amino)-1-propoxy)-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová;

kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[2-[6-(ethylamino)-2pyridyl]-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová; nebo kyselina (±)-10,ll-dihydro-3-[3-(4-methyl-2-pyridylamino)-1-propoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octová;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

2. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

3. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1, protinádorové léčivo a farmaceuticky přijatelný nosič.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že protinádorové léčivo je topotekan.

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že protinádorové léčivo je cisplatina.

• · · ·

β.

Způsob léčby chorobného stavu, u kterého je naznačen antagonismus receptorů α_νβ3, vyznačuj ící se t 1 m, že zahrnuje podání subjektu, který to potřebuje, sloučeniny podle nároku 1.

7. Způsob léčby chorobného stavu, u kterého je naznačen antagonismus receptorů α_νβ₅, vyznačuj ící se t 1 m, že zahrnuje podání subjektu, který to potřebuje, sloučeniny podle nároku 1.

_ř

8. Způsob léčby osteoporózy, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje podání subjektu, který to potřebuje, sloučeniny podle nároku 1.

9. Způsob inhibice angiogeneze, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje podání subjektu, který to potřebuje, sloučeniny podle nároku 1.

10. Způsob inhibice růstu nádoru nebo nádorových metastáz, vyznačující se tím, že zahrnuje podání subjektu, který to potřebuje, sloučeniny podle nároku

11. Způsob léčení atherosklerozy nebo restenozy, v yznačující se tím, že zahrnuje podání subjektu, který to potřebuje, sloučeniny podle nároku 1.

j

12. Způsob léčení zánětu, vyznačující se tím, že zahrnuje podání subjektu, který to potřebuje, sloučeniny podle nároku 1.

13. Způsob inhibice růstu nádoru, vyznačuj Ιοί se t í m, že zahrnuje podání postupně nebo ve fyzikální kombinaci, sloučeniny podle nároku 1 a protinádorového léčiva.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že protinádorové léčivo je topocekan.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že protinádorové léčivo je cisplatina.

16. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (I) (I) vyznačující se tím, že zahrnuje redukci sloučeniny obecného vzorce (II)

17. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (II) (II) 71 • · ····· · ···· ··· ··· ······ ·· vyznačující se sloučeniny obecného vzorce tím, že zahrnuje cyklizací (III)

C^alkyl-O (III) .

18. Sloučenina, kterou je

19. Sloučenina, kterou je

20. Sloučenina, kterou je • · · · ·· · · ·· · ·

72:

• · ····· · ···· ··· ··· ······ ··

21. Sloučenina, kterou je