KR20000069941A - 비트로넥틴 수용체 길항제 - Google Patents

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윌리암 에이치. 밀러
윌리암 이. 본디넬
토마스 웬 푸 쿠
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스튜어트 알. 수터, 스티븐 베네티아너, 피터 존 기딩스
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Abstract

본 발명은 인테그린 수용체 길항제인 특정 트리시클릭 화합물에 관한 것이다.

Description

비트로넥틴 수용체 길항제{Vitronectin Receptor Antagonists}
〈발명의 분야〉
본 발명은 비트로넥틴 수용체를 저해하고, 염증, 종양, 심장혈관 질병, 예를 들어, 동맥경화증과 재협착증, 및 골다공증과 같은 골 재흡수가 요인인 질병의 치료에 유용한 약제학적 활성 화합물에 관한 것이다.
〈발명의 배경〉
인테그린은 다양한 세포 상에서 발현하는 막투과 당단백질인 세포 부착 수용체의 수퍼패밀리이다. 이들 세포 표면 부착 수용체는 gpIIb/IIIa (피브리노겐 수용체) 및 αvβ3(비트로넥틴 수용체)를 포함한다. 피브리노겐 수용체 gpIIb/IIIa는 혈소판 표면 상에서 발현하고, 이는 혈소판 응집 및 출혈 상처 부위의 지혈 응혈의 형성을 매개한다(문헌 [Philips, et al., Blood., 1988, 71, 831] 참조). 비트로넥틴 수용체 αvβ3은 내피 세포, 평활근, 파골세포 및 종양 세포를 비롯한 다수의 세포 상에서 발현하고, 따라서 다양한 기능을 갖는다. 파골세포의 막상에서 발현된 αvβ3수용체는 골 기질에 파골세포의 부착을 매개하고, 이는 골 재흡수 과정에 있어서 중요한 단계이다(문헌 [Ross, et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703]). 과도한 골 재흡수를 특징으로 하는 병이 골다공증이다. 사람 대동맥 평활근 세포상에서 발현된 αvβ3수용체는 신내막으로 이들의 이동을 매개하고, 이 과정은 경피의 관상 혈관형성술 후 재협착증의 발생을 초래할 수 있다(문헌 [Brown, et al., Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815] 참조). 또한, 문헌 [Brooks, et al., Cell, 1994, 79, 1157]에는 αvβ3길항제가 혈관유래 혈관의 괴사를 야기함으로써 종양의 퇴행을 촉진시킬수 있음을 보여주고 있다. 따라서, 비트로넥틴 수용체를 차단하는 제제는 예를 들면 골다공증, 재협착증 및 종양과 같은 질병의 치료에 유용할 것이다.
현재, 비트로넥틴 수용체는 αvβ1, αvβ3및 αvβ5로 명명된 3 개의 상이한 인테그린으로 공지되어 있다(문헌[Horton, et al., Int. J. Exp. Pathol., 1990, 71, 741] 참조). αvβ1은 피브로넥틴 및 비트로넥틴을 결합한다. αvβ3은 피브린, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴, 본 윌브랜드(von Willebrand) 인자, 오스테오폰틴 및 골 시알로프로테인 I을 포함하여, 매우 다양한 리간드와 결합한다. 비트로넥틴 수용체 αvβ5는 미세혈관의 내피 세포를 포함하여 다양한 세포 타입의 세포 부착에 관련되어 있는 것으로 나타났고(문헌[Davis, et al., J. Cell. Biol., 1993, 51, 206]), 혈관형성에서의 그의 역할이 확인되었다(문헌[Brooks, et al., Science. 1994, 264, 569]). 이러한 인테그린은 정상 피부에서가 아니라 사람 상처의 육아 조직내 혈관에서 발현된다.
비트로넥틴 수용체는 트리-펩티드 Arg-Gly-Asp(또는 RGD) 모티프를 포함하는 골 기질 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 문헌[Horton, et al., Exp. Cell Res. 1991, 195, 368]에는 RGD-함유 펩티드 및 항-비트로넥틴 수용체 항체(23C6)이 덴틴(dentine) 재흡수 및 파골세포에 의한 세포 퍼짐을 억제한다고 기재되어 있다. 또한, 문헌[Sato, et al., J. Cell Biol, 1990, 111, 1713]에는 에키스타틴(eschistatin), RGD 서열을 함유하는 사독 펩티드가 조직 배양액내 골 재흡수의 강한 억제제이고, 뼈에 대한 파골세포의 부착을 억제한다고 기재되어 있다.
특정 화합물이 αvβ3및 αvβ5수용체의 강한 억제제임을 발견하였다. 특히, 그러한 화합물이 피브리노겐 수용체보다 비트로넥틴 수용체의 보다 유력한 억제제임을 알아내었다.
<발명의 요약>
이후에 서술된 바와 같이, 본 발명은 비트로넥틴 수용체의 억제를 위한 약물학적 활성을 갖고, 염증, 종양, 심장혈관 질병, 예를 들어, 동맥경화증과 재협착증, 및 골다공증과 같은 골 재흡수가 요인인 질병의 치료에 유용한 화합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 이후 서술된 바와 같은 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 비트로넥틴 수용체에 의해 매개되는 질병의 치료 방법이다. 특별한 측면에서, 본 발명의 화합물은 동맥경화증, 재협착증, 염증, 종양 및 골 재흡수가 요인인 질병, 예를 들어, 골다공증의 치료에 유용하다.
<상세한 설명>
본 발명은 피브리노겐 수용체보다 비트로넥틴 수용체의 보다 유력한 억제제인 신규 화합물을 포함한다. 신규 화합물은 질소-함유 치환체가 디벤조시클로헵텐의 방향족 6-원 고리들 중 하나 위에 존재하고, 산성 잔기를 함유하는 지방족 치환체가 디벤조시클로헵텐의 7-원 고리들 위에 존재하는 디벤조시클로헵텐 코어를 포함한다. 디벤조시클로헵텐 고리계는 6 및 7-원 고리상에 치환체 측쇄를 배향하여 이들이 비트로넥틴 수용체와 유리하게 상호작용할 수 있다고 믿어진다. 분자내 최단 경로를 통한 약 12 내지 14 개의 중재성 공유 결합이 디벤조시클로헵텐의 지방족 7원 고리의 치환체 위의 산성기 및 디벤조시클로헵텐의 방향족 6원 고리의 고리 중 하나 위의 질소 함유 치환체의 질소 사이에 존재할 것이다.
본 발명의 특정 화합물은 하기와 같다.
(±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-아미노-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산;
(±)-10,11-디히드로-3-[2-(6-(에틸아미노)-피리딜]-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산; 또는
(±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-메틸-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산; 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염.
본 발명의 화합물이 하나 이상의 키랄 중심을 가질 수 있는 경우에, 달리 명시되지 않는 한, 본 발명은 통상의 기술에 의해 합성 및 분할될 수 있는 각각의 독특한 비(non)-라세미 화합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물의 전구약물을 포함한다. 전구약물은 생체내에서 활성 모 약제물(본 발명의 화합물)를 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 말한다.
본 발명의 화합물은 비트로넥틴 및 기타 RGD-함유 펩티드의 비트로넥틴 수용체에의 결합을 억제한다. 파골세포 상의 비트로넥틴 수용체의 억제는 파골세포의 골 재흡수를 억제하고, 골 재흡수가 병인과 관련된 질병, 예를 들면, 골다공증 및 골관절염의 치료에 유용하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 오스테오칼신(osteocalcin) 방출을 증가시키는 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 골 형성의 촉진 방법이다. 요구되는 무기질화된 뼈의 질량, 또는 골절 치유 및 골절 보호와 같은 뼈의 리모델링이 부족한 질병 상태에서 증가된 골 생성은 명백한 유익이 된다. 뼈 구조의 손실을 초래하는 질병 및 대사상 장해 또한 이러한 치료가 유익할 것이다. 예를 들어, 상피소체기능항진증, 페제트(Peget)병, 악성 종양의 과칼슘혈증, 골 전이에 의해 생성된 골용해성 장해, 고정 또는 성 호르몬 부족에 의한 골 손실, 베흐셋(Behcet)병, 골연화증, 과골증 및 골화석증의 치료에도 본 발명의 화합물을 투여하는 것이 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 수많은 상이한 세포 유형에 대한 비트로넥틴 수용체를 억제하므로, 상기 화합물은 류마티스 관절염 및 건선과 같은 염증성 질병의 치료 및, 동맥경화 및 재협착증와 같은 심장혈관 질병의 치료에 유용할 것이다. 본 발명의 화합물은 이에 제한되는 것을 아니지만, 혈전색전증, 천식, 알레르기증, 성인 호흡기 장애 증상, 조직이식 대 숙주 질병, 기관 이식 거부증, 패혈성 쇼크, 습진, 접촉성 피부염, 염증성 장염 및 기타 자기면역 질병과 같은 기타 질병의 치료 또는 예방에 유용할 것이다. 또한, 본 발명의 화합물은 상처 치료에 유익할 수도 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 혈관유래 질병의 치료 및 예방에 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 혈관생성 질병이라는 용어는 비정상적인 신혈관생성과 관련된 질병을 포함한다. 신혈관의 성장이 질병과 관련된 병인이 되는 경우, 혈관생성의 억제가 질병의 해로운 효과를 감소시킬 것이다. 이러한 질병 표적의 예는 당뇨성성 망막증이다. 신혈관의 성장이 해로운 조직의 성장을 지지하는 경우, 혈관 생성을 억제함으로써, 조직에 혈액 공급을 감소시키고, 따라서 혈액 공급 요구량에 기초한 조직의 질량을 감소시킬 것이다. 예로서, 종양이 성장하여 성립된 고체상 종양이 생성하고 전이하기 위해서는, 종양의 성장을 포함하여 신혈관생성을 계속적으로 요구한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 종양 조직 혈관생성을 저해함으로써 종양의 전이 및 종양의 성장을 억제한다.
따라서, 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 화합물을 사용하여 혈관생성을 저해시키면 질병의 증상을 호전시킬 수 있고, 어떤 경우에는 질병을 치료할 수 있다.
본 발명의 화합물에 대한 또다른 치료학적 표적은 신혈관생성을 특징으로 하는 눈병이다. 이러한 눈병은 각막 신혈관 장해 예를 들어, 각막 이식병, 포집성 각막염, 매독성 각막염, 익상편, 및 콘택트 렌즈 착용과 관련된 신혈관 판누스를 포함한다. 또한, 부가적인 눈병은 노인성 퇴행 반점, 추정되는(presumed) 눈의 히스포플라스마증, 미성숙된 망막증 및 신혈관 녹내장을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 토포테칸 및 시스플라틴과 같은 항종양제를 단계적으로 또는 물리적 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 종양 성장의 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 II의 화합물을 환원시키는 것을 포함하는 화학식 I의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 화학식 III의 화합물을 고리화시키는 것을 포함하는 화학식 II의 화합물의 제조 방법이다.
<화학식 II>
추가로, 본 발명은 화학식 IV, V, VI 및 II의 신규 중간체를 제공한다.
<화학식 II>
본원에 사용된 바, C1-4알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실 및 그의 단순 지방족 이성질체를 포함한다.
본원에서 특정 시약들이 약자로 표시되어 있다. DCC는 디시클로헥실카르보디이미드를, DMAP는 디메틸아미노피리딘을, DIEA는 디이소프로필에틸 아민을, EDC는 N-에틸-N'(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 언급한다. HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸을, THF는 테트라히드로푸란을, DMF는 디메틸 포름아미드를, NBS는 N-브로모-숙신이미드를, Pd/C는 탄소상 팔라듐 촉매를, DPPA는 디페닐포스포릴 아지드를, BOP는 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트를, HF는 히드로플루오르산을, PPA는 폴리인산을, TEA는 트리에틸아민을, TFA는 트리플루오로아세트산을, PCC는 피리디늄 클로로크로메이트를 언급한다.
본 발명의 화합물은 본원에 참고문헌으로 인용하고 있는, 1997년 1월 16일에 발행된 본디넬(Bondinell) 등의 PCT 공보 제WO 97/01540(국제 출원 번호 PCT/US96/11108)에 기재된 방법에 의해서 제조된다.
또한, 본 발명의 화합물은 이후 상세한 반응식에 기재된 것과 유사한 방법에 의해서 제조된다.
<반응식 1>
2-벤질-4-메톡시페놀(문헌[J.Am. Chem. Soc. 1949, 71, 64])는 통상적으로 CH2CH2와 같은 불활성 용매 중에서 2,6-루티딘과 같은 적당한 염기의 존재하에 트리플루오로메탄술폰산 무수물(Tf2O)과 반응함으로써 상응하는 트리플루오로메탄 술포네이트 에스테르, 반응식 1-화합물 2(예를 들어, 1-2)로 전환된다. 틸리(Tilly)의 문헌[J. Org. Chem. 1990, 55, 906]에 기재된 방법에 의해, DMF와 같은 불활성 용매 중에서 LiCl 및 팔라듐 촉매, 예를 들어, 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드((Ph3P)2PdCl2)의 존재하에 1-2와 알릴트리부틸주석과의 반응으로 1-3을 얻는다. 카르복실산 1-4를 직접 얻기 위한 반응식 1-3의 올레핀의 산화적 분해는, 수성 아세톤 또는 수성 아세트산과 같은 적합한 수성 용매 중에서 적당한 산화제, 통상적으로 KMnO4와의 반응에 의해서 달성될 수 있다. 그러나, 바람직하게, 카르복실산 1-4를 직접 얻기 위해서 1-3에서 올레핀의 산화적 분해는, 샤플레스(Sharpless)(문헌[J. Org. Chem. 1981, 46, 3936; J. Org. Chem. 1985, 50, 1506, 주석 5]])의 일반적인 방법에 따라서 수행되며, RuO4는 CCl4, CH3CN 및 H2O의 용매 혼합물 중에서 RuCl3또는 RuO2와 NaIO4또는 H5IO6과의 반응에 의해서 동일반응계내에서 생성된다. 대안으로, 상기 산화는 2 개의 단계로 수행되는데, 제1 단계에서는 당업계에서 잘 공지된 방법일 수 있는, 올페핀을 상응하는 알데히드로 산화적 분해시키고, 그 후, 핀닉크(Pinnick)(문헌[Tetrahedron 1981, 37, 2091]) 또는 달카네일 및 몬타나리(Dalcanale and Montanari)(문헌[J. Org. Chem. 1986, 51, 567])에 의해서 서술된 바와 같이, 예를 들어, NaClO2를 사용하여 알데히드를 카르실산으로 산화시키는 단계를 포함한다. 1-4의 1-5로의 고리화는 포록토, 렌프류 및 사비지(Proctor, Renfrew and Savage) 등의 문헌[J. Chem. Soc.(C) 1969, 1000]에 기재된 방법에 따라서 폴리인산을 사용하여 달성할 수 있다. 대안으로, 1-4는 상응하는 1-4의 산 클로라이드를 통하여 1-5로 전환될 수 있고, 이는 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 불활성 용매, 예를 들어, CH2Cl2또는 CS2중에서 적합한 프리델-크래프트 촉매, 예를 들어, AlCl3또는 SnCl4로 이러한 산 클로라이드를 처리하면, 시클릭 케톤 1-5를 생성한다. 적합한 아미드 염기, 예를 들어, 리튬 디이소프로필아미드(LDA) 또는 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드(LiHMDS)에 노출상에서 에틸 아세테이트로부터 생성될 수 있는 에틸 아세테이트의 에놀레이트와, 알돌-타입 반응에서의 1-5와의 반응으로 1-6을 얻는다. 종종, THF는 알돌 반응을 위하여 선택되는 용매이지만, 이는 다양한 첨가제, 예를 들어, HMPA 또는 TMEDA의 존재하에서 자주 사용된다. 1-6을 환원시켜 1-7를 생성하는 반응은 HCl과 같은 무기산의 존재하에서 아세트산과 같은 적당한 용매 중에서 예를 들어, 활성 탄소(Pd/C)상 팔라듐 금속과 같은 적당한 촉매상의 수소분해에 의해서 달성될 수 있다. 대안으로, 이러한 환원은 오르파노포울로스 및 스모누(Orphanopoulos and Smonu)(문헌[Synth. Commun, 1988, 833])의 일반적인 방법에 의해서 붕소 트리플루오리드 에테레이트의 존재하에서 트리에틸실란으로 1-6을 처리함으로써 달성될 수 있다. 1-7의 메틸 에테르을 제거하여 1-8을 생성하는 반응은 불활성 용매, 예를 들어, CH2Cl2중에서 에탄티올 및 AlCl3과의 반응에 의해서, 불활성 용매, 예를 들어, CH2Cl2중에서 BBr3과 함께 달성될 수 있다. 메틸 에테르의 제거를 위한 다른 유용한 방법은 존 윌리 앤드 존슨에 의해서 발행된, 그린(Greene)의 문헌["Protective Groups in Organic Synthesis"]에 기재되어 있다. 1-1에서 1-2로의 전환에 대해 앞서 서술한 방법에 의해서 제조된, 1-9, 즉, 1-8의 트리플루오로메탄 술포네이트 에스테르는 칵키 및 루피(Cocchi and Lupi)(문헌[Tet, Lett, 1992, 33, 3939])의 일반적인 방법에 따라서 적합한 용매, 바람직하게는 DMSO 중에서 칼륨 아세트테이트, 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센(dppf) 및 팔라듐 촉매, 예를 들어, 팔라듐 아세테이트(Pd(OAc)2)의 존재하에서 일산화탄소와 반응시켜 1-10을 얻는다.
반응식 1는 에테르 결합을 생성하는데 사용될 수 있는 탄소-산소 결합 생성 커플링 방법을 예시하고 있다.
<반응식 2>
반응식 2의 화합물 1 (2-1)을 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]피리딘-N-옥시드와 미쯔노부(Mistunobu)-타입 커플링 반응(문헌[Organic Reactions, 1992, 42, 335-656; Synthesis 1981, 1-28])으로 반응시켜 2-2를 얻는다. 상기 반응은 디에틸 아조디카르복실레이트 및 트리페닐포스핀 사이에서 생성된 복합체에 의해서 매개되고, 비양성자성 용매, 예를 들어, THF, CH2Cl2또는 DMF중에서 수행된다. 2-2의 피리딘-N-옥시드 잔기는 불활성 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올 또는 2-프로판올 중에서 팔라듐 촉매, 바람직하게는 활성 탄소상의 팔라듐 금속을 사용하여 전이 수소화 조건 하에서 상응하는 피리딘 2-3으로 환원된다. 시클로헥센, 1,4-시클로헥사디엔, 포름산 및 포름산의 염, 예를 들어, 칼륨 포르메이트 또는 암모늄 포르메이트가 이러한 타입의 반응에서 수소 전이 시약으로서 통상 사용된다. 2-3의 에틸 에스테르는 반응식 1에 서술된 바와 같이 비누화되어 2-4를 생성한다.
본원에 기재된 특정 중간체 화합물을 제조하기 위한 또다른 방법은 반응식 3 및 4에서 나타낸 바와 같이 수행된다.
<반응식 3>
반응식 3은 반응식 1, 화학식 5(1-5) 화합물을 제조하기 위한 또다른 방법을 요약한다. 이 반응식 3-1(문헌[J. Med. Chem. 1981, 24, 998]])에 따라서, 3-1은 적합한 온도, 예를 들어, 25 ℃에서 빙초산과 같은 적합한 용매 중에서 50 psi와 같은 적합한 압력하의 수소 가스의 분위기 상에서 수소첨가하여 3-2를 생성한다. 3-2의 3-3으로의 고리화는 먼저, 예를 들어, 85 ℃의 적합한 온도에서 벤젠과 같은 적합한 용매 중에서 티오닐 클로라이드와 같은 적합한 염소화제의 존재하에 3-2를 상응하는 산 클로라이드로 전환시킴으로써 달성된다. 이러한 산 클로라이드를 적합한 프리델-크래프트 촉매, 예를 들어, AlCl3로 처리하여 6-3을 생성한다.
<반응식 4>
반응식 4는 반응식 1, 화학식 7(1-7)의 화합물을 제조하기 위한 대안의 방법을 요약한다. 이 반응식에 따르면(문헌[J. Med. Chem. 1981, 24, 998]]), 4-1을 적합한 온도, 예를 들어, -78 ℃에서 THF와 같은 적합한 용매 중에서 LiN(TMS)2와 같은 적합한 염기의 존재하에 에틸 브로모아세테이트와 반응시켜 4-2를 얻는다. 4-2는 적합한 온도, 예를 들어, 25 ℃에서 아세톤과 같은 적합한 용매 중에서 적합한 산화제의 혼합물, 예를 들어, OsO4/존스 시약의 존재하에 산화적으로 분해되어 4-3을 생성한다(문헌[J. Org. Chem. 1993, 58, 4745). 4-3은 적합한 온도, 예를 들어, 25 ℃에서 빙초산과 같은 적합한 용매 중에서 예를 들어, 10 % Pd/C의 팔라듐 촉매 존재하에 예를 들어, 50 psi와 같은 적합한 압력하의 수소 가스의 분위기 상에서 수소첨가되어 4-4를 얻는다. 4-4를 4-5로 고리화하는 것은, 먼저, 4-4를 25 ℃의 적합한 온도 및 CH2Cl2와 같은 적합한 용매 중에서 DMF와 같은 촉매량의 첨가제 존재하에 옥살릴 클로라이드와 같은 적합한 염소화제의 존재하에 상응하는 산 클로라이드로 전환시킴으로써 달성된다. 이러한 산 클로라이드를 25 ℃의 적합한 온도에서 CH2Cl2와 같은 적합한 용매 중에서 적합한 프리델-크래프트 촉매, 예를 들어, AlCl3로 처리하면 4-5를 생성한다. 4-5는 적합한 온도, 예를 들어, 25 ℃에서 빙초산과 같은 적합한 용매 중에서 예를 들어, 10 % Pd/C와 같은 팔라듐 촉매의 존재하 예를 들어, 50 psi와 같은 적합한 압력하의 수소 가스의 분위기 상에서 추가로 수소첨가되어 4-6을 생성한다.
상기 화합물의 산 부가 염은 모체 화합물, 및 염산, 브롬화수소산, 플루오로화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 숙신산 또는 메탄술폰산과 같은 과량의 산으로부터 적합한 용매 중에서 표준 방법으로 제조된다. 특정 화합물은 허용가능한 내부 염 또는 양성이온을 형성한다. 양이온성 염은 적당한 양이온을 함유하는 히드록시드, 카르보네이트 또는 알콕시드와 같은 과량의 알칼리 시약 또는 적합한 유기 아민으로 모체 화합물을 처리함으로써 제조된다. Li+, Na+, K+, Ca++, Mg++및 NH4 +와 같은 양이온은 약제학적으로 허용가능한 염에 존재하는 양이온의 특정 예이다.
또한, 본 발명은 본원에 기개된 바에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 의약 제조에 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 제조된 본 발명 화합물의 약제학적 조성물은 경구 투여용 용액제로서 또는 동결건조된 분말제로서 제제화될 수 있다. 분말제는 사용 전에 적합한 희석제 또는 기타 약제학적으로 허용가능한 담체를 가하여 재구성될 수 있다. 적합한 희석제의 예로는 통상적인 등장성 염수 용액, 물 또는 완충된 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액 중의 표준 5 % 덱스트로스가 있다. 상기 제제는 비경구 투여에 특히 적합하지만, 또한 경구 투여에 사용되거나 흡입용으로 흡입기 또는 분무기에 계량된 투여량으로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로오스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 염화 나트륨 또는 시트르산 나트륨과 같은 부형제를 가할 수 있다.
별법으로, 상기 화합물은 경구 투여를 위하여 캡슐화하거나, 타정하거나, 유제 또는 시럽제로 제조할 수 있다. 조성물을 증강시키거나 안정화시키기 위하여, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하기 위하여, 약제학적으로 허용가능한 고상 또는 액상 담체를 가할 수 있다. 고상 담체로는 전분, 락토스, 황산칼슘 이수화물, 백도토 (terra alba), 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산, 활석, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴이 있다. 액상 담체로는 시럽, 낙화생유, 올리브유, 염수 및 물이 있다. 또한, 담체는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 지연형 방출 물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 고상 담체의 양은 다양하지만, 바람직하게는 1 회 투여 단위 당 약 20 ㎎ 내지 약 1 g일 것이다. 필요시, 정제 형태를 위하여 제분, 혼합, 입제화 및 압착하고, 또는 경질의 젤라틴 캡슐 형태를 위하여 제분, 혼합 및 충진시키는 종래의 조제 기술에 따라 약제학적 제제를 제조한다. 액상 담체를 사용할 경우, 제제는 시럽, 엘릭서, 유제 또는 수성 또는 비수성 현탁제의 형태일 것이다. 상기 액상 제제는 직접적으로 경구 투여하거나 연질의 젤라틴 캡슐 안에 충전시킬 수 있다.
또한, 직장 투여를 위하여, 본 발명의 화합물을 코코아 버터, 글리세린, 젤라틴 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 부형제와 혼합하고, 좌약으로 성형할 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물은 비트로넥틴 수용체의 길항제이며, 잠재적인 병인이 비트로넥틴 수용체와 상호 작용하는 리간드 또는 세포에 기인하는 질병 치료에 유용하다. 예를 들면, 상기 화합물은 골 기질의 손실이 병을 초래하는 질병의 치료에 유용하다. 따라서, 상기 화합물은 골다공증, 상피소체기능항진증, 페제트병, 악성 종양의 과칼슘혈증, 골 전이에 의해 생성된 골용해성 장해, 고정 또는 성 호르몬 부족에 의한 골 손실의 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 화합물은 항암제, 항혈관생성제 및 항-전이제로서 유용하며, 동맥경화증 및 재협착증의 치료에 유용하다고 여겨진다.
상기 화합물은 약제의 농도가 골 재흡수 또는 기타의 이러한 징후를 억제하기에 충분하도록 환자에게 경구 또는 비경구 투여한다. 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 환자의 상태에 따라서 약 0.1 내지 약 50 ㎎/㎏의 경구 투여량으로 투여한다. 경구 투여량은 약 0.5 내지 약 20 ㎎/㎏이 바람직할 것이다. 급성 치료용으로는, 비경구 투여가 바람직하다. 근육내 환제 주사도 유용하지만, 물 또는 생리 식염수 중의 5 % 덱스트로스 중의 펩티드 또는 적합한 부형제를 갖는 유사 제제의 정맥내 주사가 가장 효과적이다. 전형적으로, 비경구 투여량은 약 0.01 내지 약 100 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/㎏일 것이다. 화합물은 1 일에 총 투여량이 약 0.4 내지 약 400 ㎎/㎏/1 일이 되도록 하루에 1 내지 4 회 투여한다. 당업자는 약제의 혈중 농도를 치료 효과를 갖는데 요구되는 농도와 비교하여, 화합물이 투여되는 정확한 농도 및 방법을 용이하게 측정한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 비스포스포네이트(즉, 알렌드로네이트), 호르몬 대체 요법, 항-에스트로겐 또는 칼시토닌과 같은 골 재흡수의 기타 억제제를 단계적으로 또는 물리적 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 다공증의 치료 방법 또는 골손실 억제 방법을 제공한다. 부가적으로, 본 발명은 골손실 억제 및(또는) 골 질량 증가시키는데 유용한, 본 발명의 화합물, 및 골 형태발생 단백질, 이프로플라본과 같은 동화제(anabolic agent)를 사용하는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 항종양제를 단계적으로 또는 물리적 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 종양 성장의 억제 방법을 제공한다. 토포테칸, 이리노테칸 및 9-아미노캄프토테신과 같은 캄프토테신 동족체계 화합물, 및 시스플라틴, 오르마플라틴 및 테트라플라틴과 같은 백금 배위 복합체는 항종양제로서 널리 공지된 군이다. 캄프토테신 동족계 화합물은 본원에 참고 문헌으로 인용하고 있는 미국 특허 제5,004,758호, 제4,604,463호, 제4,473,692호, 제4,473,692호, 제4,545,880호, 제4,342,776호, 제4,513,138호, 제4,399,276호, 유럽 특허 출원 공개 제0 418 099호 및 제0 088 642호, 와니(Wani) 등의 문헌[J. Med. Chem. 1986, 29, 2358]; 와니 등의 문헌[J. Med. Chem. 1980, 23, 554] ; 와니 등의 문헌[J. Med. Chem. 1987, 30, 1774] 및 닛타(Nitta) 등의 문헌[Proc. 14th International Congr. Chemotherapy., 1985, Anticancer Section 1, 28]에 기재되어 있다. 백금 배위 복합체, 즉 시스플라틴은 브리스톨-메이어-스퀴브 코포레이션으로부터 상품명 플라티놀(Platinol)(등록상표)로써 입수가능하다. 시스플라틴에 대한 유용한 제제는 본원에 참고 문헌으로 인용하고 있는 미국 특허 제5,562,925호 및 제4,310,515호에 기재되어 있다.
본 발명의 화합물 및 항종양제를 단계적으로 또는 물리적 조합하여 투여하는 것을 포함하는 종양 성장의 억제 방법에서, 시스플라틴과 같은 백금 배위 화합물은 느린 정맥 주입을 사용하여 투여할 수 있다. 바람직한 담체는 만니톨을 함유하는 덱스트로스/염수 용액이다. 백금 배위 화합물의 투여 스케줄은 치료 단계 마다 체표면적 평방미터 당 약 1 내지 약 500 mg(mg/m2)를 기본으로 할 수 있다. 백금 배위 화합물의 주입은 1 주마다 1 내지 2 회 수행할 수 있고, 주간격 치료가 여러번 반복할 수 있다. 비경구 투여에서 캄프토테신 동족계 화합물을 사용하면, 사용되는 치료 단계는 통상적으로 약 연속 5 일 동안 1 일 체표면적의 약 1.0 내지 약 2.0 mg/m2이다. 바람직하게는, 치료 단계는 약 7 일 내지 약 28 일 간격에 1 회 이상 반복된다.
약제학적 조성물은 동일한 용기내에 본 발명의 화합물 및 항종양제 모두를 포함하여 제제화할 수 있지만, 다른 용기내에 제제화하는 것이 바람직하다. 두 제제를 용액의 형태로 공급할 경우, 이들은 동시 투여를 위하여 주입/주사 시스템 내에 또는 텐덤(Tendem) 배열로 포함될 수 있다.
동시에 또는 상이한 시간에 본 발명의 화합물 및 항종양제의 간편한 투여를 위하여, 박스, 카톤 또는 다른 용기와 같은 단일 용기, 단독 바틀, 백, 바이알, 또는 상기 서술한 바와 같은 비경구 투여를 위한 본 발명의 화합물의 유효량 및 상기 서술한 바와 같은 비경구 투여를 위한 항종양제의 유효량을 포함하는 기타 용기들로 이루어지는 키트가 제조된다. 이러한 키트는 예들 들어, 임의로, 동결건조된 플러그(plug)로서 별도의 용기내 또는 동일한 용기내 약제학적 제제, 및 재구성을 위한 용액의 용기로 이루어질 수 있다. 이들의 변형은, 단독 용기의 2 개 챔버내에 동결건조된 플러그 및 재구성을 위한 용액을 포함한 것이고, 이는 사용 전에 혼합될 수 있다. 이러한 배열로, 항종양제 및 본 발명의 화합물은 두 개의 용기로서 별도로 포장되거나, 분말로서 함께 동결건조시켜 단일 용기내에 공급될 수 있다.
두 제제가 용액 형태로 제공되는 경우, 이들은 동시 투여를 위하여 주입/주사 시스템 내에 또는 텐덤 배열로 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 정맥 주사가능한 형태, 또는 튜빙을 통하여 제2 주입 백 중의 항종양제에 일련으로 연결된 주입 백에 넣을 수도 있다. 이러한 시스템을 사용하면, 환자는 본 발명의 화합물의 초기 환제 형태 주사 또는 주입, 그 후 항종양제가 주입될 수 있다.
상기 화합물은 필요한 약리 효과를 갖는데 요구되는 화합물의 농도를 결정하기 위하여 몇 가지 생물학적 분석법 중 하나로 테스트할 수 있다.
비트로넥틴 결합 억제
ανβ3에 결합하는 고체-상 [3H]-SK&F-107260 : 완충액 T (2 mM CaCl2및 1 % 옥틸글루코시드 함유) 내의 사람 태반 또는 사람 혈소판 ανβ3(0.1-0.3 ㎎/㎖)을 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2(완충액 A) 및 0.05 % NaN3를 함유하는 완충액 T로 희석시킨 다음, 바로 웰 당 0.1 ㎖로 96-웰 ELISA 플레이트 (Corning, New York, NY)에 가하였다. ανβ30.1-0.2 ㎍을 웰 마다 가하였다. 플레이트를 4℃ 에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 실험시에, 웰을 완충액 A로 1 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 상기 완충액 내 3.5 % 소혈청 알부민 0.1 ㎖와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에 웰을 완전히 흡인하고, 완충액 A 0.2 ㎖로 2 회 세척하였다.
화합물을 100 % DMSO에 용해시켜 2 mM 스톡 용액을 얻고, 이를 결합 완충액 (15 ㎖ 트리스-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2)로 희석시켜 100 μM 농도의 최종 화합물을 제조하였다. 상기 용액을 원하는 최종 화합물 농도로 희석시켰다. 다양한 농도의 표지되지 않은 길항제 (0.001-100 μM)을 3 개 조의 웰에 가하고, 이어서 [3H]-SK&F-107260 (65-86 Ci/mmol) 5.0 nM을 가하였다.
플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 웰을 완전히 흡인하고 웰-대-웰 방식으로 얼음 냉각된 완충액 A 0.2 ㎖로 1 회 세척하였다. 수용체를 1 % SDS 0.1 ㎖로 용해시키고, 베크만(Beckman) LS 액상 신틸레이션 계수기 (Beckman LS Liquid Scintillation Counter)에서 레디 세이프 (Ready Safe) 3 ㎖를 가하여 액상 신틸레이션 계수에 의해서 결합된 [3H]-SK&F-107260를 측정하였고, 효율은 40 %이었다. [3H]-SK&F-107260의 비특이적 결합을 SK&F-107260 2 μM의 존재 하에 측정하였고, 이는 일정하게, 총 방사성리간드 유입량의 1 % 미만이었다. IC50([3H]-SK&F-107260 결합을 50 % 억제하는 길항제 농도)는 비선형 최소 제곱 곡선-조정 절차(non-linear, least square curve-fitting routine)에 의해 측정하였고, LUNDON-2 프로그램으로 수정하였다. Ki (길항제의 해리 상수)는 등식 : Ki=IC50/(1+L/Kd)에 따라 계산하였고, 여기서 L 및 Kd는 각각 [3H]-SK&F-107260의 농도 및 해리 상수이었다.
또한, 본 발명의 화합물은 EP 528 587에 기재된 피트 형성 분석과 같은, 골 형성 억제를 평가하기 위한 당업계의 표준 분석법으로 생체외 및 생체내에서 골 재흡수 시험을 하며, 또한 상기 분석법은 래트 파골세포 대신에 사람 파골세포, 및 우론스키 (Wronski) 등의 문헌[Cells and Materials, 1991, Sup. 1, 69-74]에 서술된 난소외과절개된 래트 모델을 사용하여 수행될 수 있다.
혈관 평활근 세포 이동 분석
래트 또는 사람 대동맥 평활근 세포를 사용하였다. 세포 이동은 8 ㎛ 기공을 갖는 폴리카르보네이트 막(Costar)을 사용하여 트랜스 웰 (Transwell) 세포 배양 챔버 내에서 모니터하였다. 필터의 하부 표면을 비트로넥틴으로 피복하였다. 세포를 2.5-5.0×106세포/㎖의 농도로 0.2 % 소혈청 알부민을 보충한 DMEM 중에 현탁시키고, 20 ℃에서 20 분 동안 다양한 농도의 시험 화합물로 미리 처리하였다. 대조물로서 용매만을 사용하였다. 세포 현탁액 0.2 ㎖를 챔버의 상부 구획부에 놓았다. 하부 구획부는 0.2 % 소혈청 알부민을 보충한 DMEM 0.6 ㎖를 함유하였다. 95 % 공기/5 % CO2의 분위기에서 24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션을 수행하였다. 인큐베이션 후에, 필터의 상부 표면상의 비이동 세포를 약하게 스크래핑하여 제거하였다. 이어서, 필터를 메탄올 내에 고정시키고, 10 % 지엠사 (Giemsa) 염색제로써 염색시켰다. 이동율은 a) 필터의 하부 표면으로 이동된 세포수를 계수하거나, b) 10 % 아세트산으로 염색된 세포를 추출하고, 600 nM에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.
부갑상선외과절개 래트 모델
각각의 실험군은 5-6 마리의 성장한 수컷 스프라그-돌리 래트(250-400 g 체중)로 구성한다. 래트를 사용하기 7 일 전에 부갑상선외과절개한다 (Taconic Farms 제공). 모든 래트는 3 일 마다 대체 투여량의 티록신을 받는다. 래트에 공급할 때, 순환하는 이온화 칼슘 농도는 혈액이 헤파린화 튜브 내로 꼬리 정맥 천자에 의해 회수된 후 바로 전체 혈액에서 측정한다. 이온화 Ca 농도가 (시바-코닝 모델 634 칼슘 pH 분석기로 측정) < 1.2 mM/L 라면, 래트를 포함시킨다. 각 래트는 시험 물질의 전달 및 혈액 샘플링 각각을 위하여 내부의 정맥 및 동맥 카테터를 장착시킨다. 그 다음, 래트에게 칼슘이 없는 음식 및 탈이온수를 급식한다. 기준선 Ca 농도를 측정하고, 외부 시린지 펌프를 사용하여 정맥 카테터를 통하여 연속 정맥내 주입으로 부형제 대조물 또는 사람 파라티로이드 호르몬 1-34 펩티드 (hPTH1-34, 염수/0.1 % 소혈청 알부민 중 1.25 ug/㎏/h의 투여량, 바켐, Ca) 또는 PTH1-34 및 시험 물질의 혼합물을 각 래트에게 투여한다. 각 래트의 칼슘 반응은 6 내지 8 시간의 주입 시간 동안 2 시간 간격으로 측정한다.
사람 파골세포 재흡수 및 부착 분석법
파골세포종 조직으로부터 유래한 정상 사람 파골세포를 사용하여 피트(pit) 재흡수 및 부착 분석을 전개시키고, 표준화하였다. 분석 1은 레이저 동시촛점(confocal) 현미경에 의한 파골세포 피트 부피 측정을 위하여 수행하였다. 분석 2는 콜라겐 단편들(재흡수 동안 방출됨)이 경쟁 ELISA에 의해서 측정되는 보다 많은 처리량 스크린으로서 전개되었다.
분석 1(레이저 동시촛점 현미경 사용)
* 사람 파골세포종-추출 세포 현탁액의 분취량을 액상 질소 저장물로부터 이동시켜, 신속하게 37 ℃로 데우고 원심분리 (1000 rpm, 4 ℃에서 5 분)에 의해 RPMI-1640 배지에서 1 회 세척한다.
* 배지를 흡인하고 이를 쥐의 항-HLA-DR 항체로 대체하고, RPMI-1640 배지 내에서 1:3으로 희석한다. 상기 현탁액을 30 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하고, 종종 혼합한다.
* 세포를 원심분리 (1000 rpm, 4 ℃에서 5 분)에 의해 냉각 RPMI-1640으로 2 회 세척하고, 세포를 멸균된 15 ㎖ 원심분리 튜브에 옮긴다. 단핵 세포의 수를 개선된 뉴바우어 (Neubauer) 계수 챔버 내에서 계수한다.
* 염소 항-생쥐 IgG로 피복된 충분량의 마그네틱 비드 (5/단핵 세포)를 저장 병으로부터 이동시켜 새로운 배지 5 ㎖에 넣는다 (이것은 독성 아지드 보존제를 세척한다). 자석 상에 비드를 고정하여 배지를 제거하고 새로운 배지로 대체한다.
* 비드를 세포와 혼합하고, 현탁액을 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션시킨다. 현탁액을 종종 혼합한다.
* 비드-피복된 세포를 자석 상에 고정시키고, 잔류 세포 (파골세포가 풍부한 분획)를 멸균된 50 ㎖ 원심분리 튜브에 기울여 따른다.
* 새로운 배지를 비드-피복된 세포에 가하여 트래핑된 파골세포를 제거한다. 이 세척 공정을 10 회 반복한다. 비드-피복된 세포를 버린다.
* 표지성 플루오레세인 다아세테이트를 사용하여 계수 챔버 내에서 생세포를 계수한다. 큰 기공의 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버에 샘플을 가한다.
* 파골세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 파골세포의 밀도를 10 % 소 태아 혈청 및 1.7 g/ℓ의 중탄산나트륨을 보충한 EMEM 배지(파골세포수는 종양마다 다름) 내에서 적당한 수로 조정한다.
* (화합물의 매 처리마다) 세포 현탁액 3 ㎖ 분취량을 15 ㎖ 원심분리 튜브에 기울여 따른다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화한다.
* 각각의 튜브에 적당한 화합물 3 ㎖을 가한다 (EMEM 배지 중 50 uM로 희석됨). 또한, 적당한 부형제 대조물, 양성 대조물 (100 ㎍/㎖로 희석된 항-비트로넥틴 수용체 마우스 모노클론 항체[87 MEM1]) 및 유사형 대조물 (100 ㎍/㎖로 희석된 IgG2a)을 포함시킨다. 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션한다.
* 세포 0.5 ㎖ 분취량을 48-웰 플레이트내 멸균 덴틴 슬라이스 상에 시딩(seeding)하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 각각의 처리물을 5 회 스크리닝한다.
* 슬라이스를 따뜻한 PBS (6-웰 플레이트에서 10 ㎖/웰)를 6 회 교체하여 세척한 다음, 처리 화합물 또는 대조물 시료를 포함하는 신선한 배지내에 놓았다. 37 ℃에서 48 시간 동안 인큐베이션한다.
주석산염 내성 산 포스파타제 (TRAP) 절차 (파골세포 결합 세포에 대한 선택적 염색)
* 골 슬라이스를 인산염 완충 염수에서 세척하고 5 분 동안 (0.2 M 나트륨 카코딜레이트 중의) 2 % 글루테르알데히드 내에서 고정시킨다.
* 이를 물 중에서 세척하고 37 ℃에서 4 분 동안 10 mM 주석산 나트륨을 포함하는 TRAP 완충액 (N,N'-디메틸포름아미드 중에 용해된 나프톨 AB-SI 포스페이트 0.5 mg/ml을 0.25 M 시트레이트 완충액(pH 4.5)와 혼합함)중에서 인큐베이션시킨다.
* 슬라이스를 찬물 중에서 세척한 후에, 이를 심홍색 석류석 1 mg/ml을 함유하는 냉각 아세테이트 완충액(0.1 M pH 6.2)중에서 4 ℃에서 4 분 동안 인큐베이션 한다.
* 과량의 완충액을 흡인하고, 상기 슬라이스를 물 중에서 세척한 후에 공기 건조시킨다.
* TRAP 양성 파골세포를 브라이트-필드 현미경에 의해 계수한 후, 음파처리에 의해 덴틴 표면으로부터 제거한다.
* 피트 부피를 니콘/레이저테크 (Nikon/Lasertec) ILN21W 동시촛점 현미경을 사용하여 측정한다.
분석 2(ELISA 장치 사용)
* 사람 파골세포종-추출 세포 현탁액의 분취량을 액상 질소 저장물로부터 이동시켜, 신속하게 37 ℃로 데우고 원심분리 (1000 rpm, 4 ℃에서 5 분)에 의해 RPMI-1640 배지에서 1 회 세척한다.
* 배지를 흡인하고 이를 쥐의 항-HLA-DR 항체로 대체하고, RPMI-1640 배지 내에서 1:3으로 희석한다. 상기 현탁액을 30 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하고, 종종 혼합한다.
* 세포를 원심분리 (1000 rpm, 4 ℃에서 5 분)에 의해 냉각 RPMI-1640으로 2 회 세척하고, 세포를 멸균된 15 ㎖ 원심분리 튜브에 옮긴다. 단핵 세포의 수를 개선된 뉴바우어 (Neubauer) 계수 챔버 내에서 계수한다.
* 염소 항-생쥐 IgG로 피복된 충분량의 마그네틱 비드 (5/단핵 세포)를 저장 병으로부터 이동시켜 새로운 배지 5 ㎖에 넣는다 (이것은 독성 아지드 보존제를 세척한다). 자석 상에 비드를 고정하여 배지를 제거하고 새로운 배지로 대체한다.
* 비드를 세포와 혼합하고, 현탁액을 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션시킨다. 현탁액을 종종 혼합한다.
* 비드-피복된 세포를 자석 상에 고정시키고, 잔류 세포 (파골세포가 풍부한 분획)를 멸균된 50 ㎖ 원심분리 튜브에 기울여 따른다.
* 새로운 배지를 비드-피복된 세포에 가하여 트래핑된 파골세포를 제거한다. 이 세척 공정을 10 회 반복한다. 비드-피복된 세포를 버린다.
* 표지성 플루오레세인 다아세테이트를 사용하여 계수 챔버 내에서 생세포를 계수한다. 큰 기공의 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버에 샘플을 가한다.
* 파골세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 파골세포의 밀도를 10 % 소 태아 혈청 및 1.7 g/ℓ의 중탄산나트륨을 보충한 EMEM 배지(파골세포수는 종양마다 다름) 내에서 적당한 수로 조정한다.
분석 1에서 설명한 방법과는 반대로, 상기 화합물은 하기 제시한 대로 4 개 투여량으로 스크리닝하여 IC50을 얻었다.
* 파골세포 제조물을 시험 화합물(4 개 투여량) 또는 대조물과 함께 37 ℃에서 30 분간 미리 인큐베이션한다.
* 이들을 48-웰 조직 배양 플레이트의 웰 중 소의 피질성 골 슬라이스 상으로 시딩하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한다.
* 골 슬라이스를 따뜻한 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 6 회 교체하여 세척한 다음, 부착되지 않은 세포를 제거하고, 새로운 화합물 또는 대조물을 포함하는 48-웰 조직 플레이트의 웰로 복귀시킨다.
* 그 후, 조직 배양 플레이트를 37 ℃에서 48 시간 동안 인큐베이션한다.
* 각 웰로부터의 상등액을 각각의 튜브 중으로 흡인시키고, 재흡수 과정 동안 방출되는 타입 I 콜라겐의 c-텔로펩티드를 검출하는 경쟁적 ELISA에서 스크리닝하였다. 이는 타입 I 콜라겐의 a1-사슬의 카르복시-말단 텔로펩티드에 존재하는 8 개의 아미노산 서열(Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg)과 특이하게 반응하는 래빗 항체를 함유하는 시판용 ELISA(덴마크, 골측정기)이다. 부형제 대조물과 비교하여 재흡수 억제%로서 그 결과를 나타낸다.
사람 파골세포 재흡수 분석법
분석 1의 처음 9 단계에서 설명한 바와 같이 화합물 스크리닝을 위하여 사람 파골세포를 부화시켜 제조한다. 명확하게 하기 위해서, 이들 단계를 하기에 반복하였다.
* 사람 파골세포종-추출 세포 현탁액의 분취량을 액상 질소 저장물로부터 이동시켜, 신속하게 37 ℃로 데우고 원심분리 (1000 rpm, 4 ℃에서 5 분)에 의해 RPMI-1640 배지에서 1 회 세척한다.
* 배지를 흡인하고 이를 쥐의 항-HLA-DR 항체로 대체하고, RPMI-1640 배지 내에서 1:3으로 희석한다. 상기 현탁액을 30 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하고, 종종 혼합한다.
* 세포를 원심분리 (1000 rpm, 4 ℃에서 5 분)에 의해 냉각 RPMI-1640으로 2 회 세척하고, 세포를 멸균된 15 ㎖ 원심분리 튜브에 옮긴다. 단핵 세포의 수를 개선된 뉴바우어 (Neubauer) 계수 챔버 내에서 계수한다.
* 염소 항-생쥐 IgG로 피복된 충분량의 마그네틱 비드 (5/단핵 세포)를 저장 병으로부터 이동시켜 새로운 배지 5 ㎖에 넣는다 (이것은 독성 아지드 보존제를 세척한다). 자석 상에 비드를 고정하여 배지를 제거하고 새로운 배지로 대체한다.
* 비드를 세포와 혼합하고, 현탁액을 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션시킨다. 현탁액을 종종 혼합한다.
* 비드-피복된 세포를 자석 상에 고정시키고, 잔류 세포 (파골세포가 풍부한 분획)를 멸균된 50 ㎖ 원심분리 튜브에 기울여 따른다.
* 새로운 배지를 비드-피복된 세포에 가하여 트래핑된 파골세포를 제거한다. 이 세척 공정을 10 회 반복한다. 비드-피복된 세포를 버린다.
* 표지성 플루오레세인 다아세테이트를 사용하여 계수 챔버 내에서 생세포를 계수한다. 큰 기공의 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버에 샘플을 가한다.
* 파골세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 파골세포의 밀도를 10 % 소 태아 혈청 및 1.7 g/ℓ의 중탄산나트륨을 보충한 EMEM 배지(파골세포수는 종양마다 다름) 내에서 적당한 수로 조정한다.
* 파골세포종 유래 파골세포를 화합물(4 개 투여량) 또는 대조물과 함께 37 ℃에서 30 분간 미리 인큐베이션한다.
* 상기 세포를 오스테오폰틴(osteopontin)-피복된 슬라이드(사람 또는 쥐 오스테오폰틴 2.5 mg/ml) 상에 시딩하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한다.
* 슬라이드를 포스페이트 완충된 염수 중에서 격렬하게 세척함으로써 부착되지 않은 세포를 제거하고, 슬라이드 상에 남아있는 세포를 아세톤으로 고정시킨다.
* 파골세포를 주석산염-내성 산 포스파타제(TRAP), 이러한 표현형 세포에 대한 선택 표지(단계 15 내지 17 참고)에 대하여 염색하고, 광 현미경에 의해서 계수된다. 부형제 대조물과 비교하여 재흡수 억제%로서 그 결과를 나타낸다.
세포 부착 분석
세포 및 세포 배양액
사람 엠브리오 신장 세포(HEK293 세포)는 ATCC(Catalog NO. CRL 1573)으로부터 입수하였다. 세포를 이얼(Earl) 염, 10 % 소태아 혈청, 1 % 글루타민 및 1 % 페니실린 스트렙토마이신을 포함하는 이얼 최소 필수 배지(EMEM) 중에서 배양하였다.
작제물 및 형질감염
αν서브유닛의 3.2 kb EcoRI-KpnI 단편 및 β3서브유닛의 2.4 kb Xhol-Xhol 단편을 블런트 말단 결착에 의하여 CMV 프로모터 및 G418 선택성 표지를 포함하는 pCDN 벡터의 EcoRI-EcoRV 클로닝 부위(문헌[Aiyar et al., 1994]) 중으로 삽입하였다. 안정된 발현을 위해서, 80 x 106HEK 293 세포를 유전자 펄서(Gene Pulser)(1994, 헨슬레이(Hensley))를 사용하여 αν+β3작제물(각 서브유닛 당 20 μg DNA)로 전기 형질변형시키고, 100 mm 플레이트 중에 플레이팅하였다(5 x 105세포/플레이트). 48 시간 후, 성장 배지를 450 μg/ml 제네티신(Geneticin)(미국 매릴랜드 베데스다 소재 GIBCO-BRL사제, G418 술페이트)로 보충하였다. 콜로니가 분석하기에 충분할 정도로 클 때까지 상기 세포를 선택 배지내에서 유지하였다.
형질감염 세포의 면역세포화학적 분석
HEK293 형질감염체가 비트로넥틴 수용체를 발현하는지 결정하기 위해서, 상기 세포를 원심분리 후 유리 현미경 슬라이드 위에 고정시키고, 실온에서 2 분 동안 아세톤으로 고정시킨 후 공기 건조시켰다. 표준 간접 면역형광법을 사용하여 ανβ3복합체에 대하여 특이적인 모노클론 항체인 23C6과의 특이 반응성을 입증하였다.
세포부착 연구
코닝(Corning) 96-웰 ELISA 플레이트를 사람 비트로넥틴(RPMI 배지 중의 0.2 μg/ml) 0.1 ml로 4 ℃에서 밤새 미리 피복시켰다. 실험시, 플레이트를 RPMI 배지로 1 회 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 RPMI 배지 중의 3.5 % BSA로 차단하였다. 형질감염된 293 세포를 RPMI 배지 중에 재현탁시키고, 0.5 x 106세포/ml의 밀도에서 HEK 20 mM Hepes, pH 7.4 및 0.1 % BSA로 보충하였다. 세포 현탁액 0.1 ml을 각 웰에 가하고, 다양한 ανβ3길항제의 존재 또는 부재하에 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10 % 포름알데히드 용액 0.025 ml (pH 7.4)를 가하고, 상기 세포를 실온에서 10 분 동안 고정시켰다. 플레이트를 RPMI 배지 0.2 ml로 3 회 세척하고, 부착 세포를 실온에서 20 분 동안 0.5 % 톨루이딘 블루 0.1 ml로 염색하였다. 과량의 염색액을 탈이온수로 충분히 세척하였다. 세포 중에 삽입된 톨루이딘 블루는 50 mM HCl 함유 50 % 에탄올 0.1 ml을 가함으로써 용출시켰다. 마이크로티터 플레이트 리더(버지니아주 스터링 소재 Titertek Multiskan MC사제)상의 600 nm의 광학 밀도에서 세포 부착을 정량화하였다.
고체상 ανβ5결합 분석:
사람 태반으로부터 비트로넥틴 수용체 ανβ3를 정제하였다. 수용체 제제를 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2(완충액 A)로 희석하고, 곧 각 웰 당 0.1 ml을 96-웰 ELISA 플레이트에 가하였다. 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 실험시, 웰을 완충액 A로 1 회 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 동일한 완충액 중의 3.5 % 소혈청 알부민 0.1 ㎖와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 웰을 완전히 흡인하고 0.2 ㎖ 완충액 A로 2 회 세척하였다.
[3H]-SK&F-107260 경쟁 분석에서, 다양한 농도의 라벨되지 않은 길항제(0.001 내지 100 μM)를 웰에 가한 후, 5.0 nM [3H]-SK&F-107260을 가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 웰을 완전히 흡인하고 웰-대-웰 방식으로 얼음 냉각된 완충액 A 0.2 ㎖로 1 회 세척하였다. 수용체를 1 % SDS 0.1 ㎖로 용해시키고, 베크만 LS 액상 신틸레이션 계수기 (Beckman LS Liquid Scintillation Counter)에서 레디 세이프 (Ready Safe) 3 ㎖를 가하여 액상 신틸레이션 계수에 의해서 결합된 [3H]-SK&F-107260를 측정하였고, 효율은 40 %이었다. [3H]-SK&F-107260의 비특이적 결합을 SK&F-107260 2 μM의 존재 하에 측정하였고, 이는 총 방사성리간드 유입량의 1 % 미만을 유지하였다. IC50([3H]-SK&F-107260 결합을 50 % 억제하는 길항제 농도)는 비선형 최소 제곱 곡선-조정 절차에 의해 측정하였고, LUNDON-2 프로그램으로 수정하였다. Ki (길항제의 해리 상수)는 등식 : Ki=IC50/(1+L/Kd)에 따라 계산하였고, 여기서 L 및 Kd는 각각 [3H]-SK&F-107260의 농도 및 해리 상수이었다.
RGD-매개된 GPⅡb-Ⅲa 결합의 억제
GPⅡb-Ⅲa의 정제
10 유니트의 오래되고, 세척한 사람 혈소판 (적십자로부터 입수함)을 3 % 옥틸글루코시드, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2내에 4 ℃에서 2 시간 동안 약하게 교반하여 용해시켰다. 용해물을 100,000 g에서 1 시간 동안 원심분리시켰다. 얻어진 상등액을 20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2,1 % 옥틸글루코시드 (완충액 A)를 사용하여 미리 평형화시킨 5 ㎖ 렌즈콩 렉틴 세파로스 4B 컬럼 (E.Y. Labs)에 도포하였다. 2 시간 인큐베이션 후, 컬럼을 냉각 완충액 A 50 ㎖로 세척하였다. 렉틴-보유 GPⅡb-Ⅲa를 10 % 덱스트로스를 함유하는 완충액 A로 용출시켰다. 모든 절차를 4 ℃에서 수행하였다. 얻어진 GPⅡb-Ⅲa는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 입증된 바 95 % 초과로 순수하였다.
리포솜 내에 GPⅡb-Ⅲa의 삽입
포스파티딜세린 (70%) 및 포스파티딜콜린 (30%)의 혼합물 (아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids))을 질소 스트림 하에 유리관의 벽에 건조시켰다. 정제된 GPⅡb-Ⅲa를 최종 농도 0.5 ㎎/㎖로 희석하고, 단백질:인지질 비가 1:3 (w:w)으로 인지질과 혼합시켰다. 혼합물을 재현탁시키고, 욕조 음파장치에서 5 분 동안 음파 처리하였다. 계속해서, 혼합물을 1000 배 과량의 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2(2 회 교체)에 대하여 12,000-14,000 분자량 임계 투석관을 사용하여 밤새도록 투석시켰다. GPⅡb-Ⅲa-함유 리포솜을 12,000 g 에서 15 분 동안 원심분리시키고, 투석 완충액 중에서 약 1 ㎎/㎖의 최종 단백질 농도로 재현탁시켰다. 리포솜을 필요할 때까지 -70 ℃에서 저장하였다.
GPⅡb-Ⅲa에 대한 경쟁 결합
피브리노겐 수용체(GPⅡb-Ⅲa)에 대한 결합은 RGD-형 리간드로서 [3H]-SK&F-107260을 사용하여 간접 경쟁 결합법에 의해 분석하였다. 결합 분석은 96-웰 여과 플레이트 조립물 (매사추세츠주 베드포드 소재 밀리포어 코포레이션 제조) 내에서 0.22 ㎛ 친수성 듀라포어(durapore) 막을 사용하여 수행하였다. 웰을 10 ㎍/㎖ 폴리리신 (미주리주 세인트 루이스 소재 시그마 케미칼 코포레이션 제조) 0.2 ㎖를 사용하여 실온에서 1 시간 동안 예비도포시켜 비특이적 결합을 차단시켰다. 다양한 농도의 표지되지 않은 벤즈디아제핀을 5 개의 웰 내에 첨가하였다. [3H]-SK&F-107260을 4.5 nM의 최종 농도에서 각각의 웰에 도포하고, 정제 혈소판 GPⅡb-Ⅲa-함유 리포솜 1 ㎍을 가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. GPⅡb-Ⅲa-결합 [3H]-SK&F-107260을 밀리포어 여과 매니폴드를 사용하는 여과, 및 이어서 얼음-냉각 완충액을 사용한 세척 (2 회, 각각 0.2 ㎖)에 의해 결합되지 않은 물질로부터 분리시켰다. 필터상에 잔류하는 결합 방사능은 베크만 액상 신틸레이션 계수기 (모델 LS6800)에서 1.5 ㎖ 레디 솔브 (캘리포니아주 풀러톤 소재의 베크만 인스트루먼트 제조)내에서 계수하였고, 효율은 40 %이었다. 비특이적 결합은 비표지 SK&F-107260 2 μM의 존재하에 측정하였고, 샘플에 가해진 총 방사능은 0.14 % 미만으로 일정하였다. 모든 데이타 수치는 5 개 측정치의 평균이다.
경쟁 결합 데이타는 비선형 최소 제곱 곡선 적용 방법에 의해 분석하였다. 상기 방법은 길항제의 IC50(평형 상태에서 [3H]-SK&F-107260의 특이적 결합을 50 % 억제하는 길항제 농도)을 제공한다. IC50은 쳉 & 프루소프 (Chang & Prusoff) 식 : Ki=IC50/(1+L/Kd)에 근거한 길항제의 평형 해리 상수 (Ki)에 관한 것으로, 여기서 L은 경쟁 결합 분석에 사용된 [3H]-SK&F-107260의 농도(4.5 nM)이고, Kd는 스켓챠드 (Scatchard) 분석에 의해 측정된 바와 같이 4.5 nM인 [3H]-SK&F-107260의 해리 상수이다.
본 발명의 바람직한 화합물은 비트로넥틴 수용체에 대한 친화도가 피브리노겐 수용체에 대한 것보다 10:1보다 더 크다. 보다 바람직한 화합물은 100:1보다 큰 활성비를 갖는다.
몇몇 이식가능한 마우스 종양 모델을 사용하여 본 발명의 화합물 단독 또는 항종양제와의 조합물의 효능은 결정할 수 있다. 이들 모델의 세부적인 사항은 미국 특허 제5,004,758호 및 제5,633,016호를 참조한다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하려는 것은 아니고, 본 발명의 화합물의 제조 방법 및 사용 방법을 예시하고자 한다. 당업자는 많은 다른 실시태양을 용이하게 실시할 것이다.
<일반적인 방법>
브루커 (Bruker) AM 250 또는 브루커 AC 400 분광계를 각기 사용하여 250 또는 400 ㎒에서 핵 자기 공명 스펙트럼을 기록하였다. CDCl3은 중클로로포름이고, DMSO-d6은 육중디메틸술폭시드이며, CD3OD는 사중메탄올이다. 화학 전위는 내부 표준 테트라메틸실란으로부터 아래 영역인 ppm (δ)으로 기록한다. NMR 데이타에서의 약자는 다음과 같다: s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, m = 다중선, dd = 이중선의 이중선, dt = 삼중선의 이중선, app = 겉보기, br = 넓음. J는 ㎐ 단위로 측정한 NMR 커플링 상수를 나타낸다. 연속 파장 적외선 (IR) 스펙트럼은 퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer) 683 적외선 분광기 상에 기록하고, 니콜렛 인펙트 400 D 적외선 분광기 상에서 포리에 변형 적외선 스펙트럼을 기록하였다. IR 및 FTIR 스펙트럼을 투과 모드로 기록하였고, 밴드 위치는 파수의 역수 (㎝-1)로 기록한다. 질량 스펙트럼은 고속 원자 충격 (FAB) 또는 전자분사 (ES) 이온화 기술을 사용하여, VG 70 FE, PE Syx API Ⅲ 또는 VG ZAB HF 기기 상에서 조사하였다. 원소 분석은 퍼킨-엘머 240 C 원소 분석기를 사용하여 수행하였다. 용융점은 토마스-후버 (Thomas-Hoover) 용융점 장치 상에서 조사하였고 보정하지 않았다. 모든 온도는 섭씨로 기록하였다.
아날테크 실리카 겔 (Analtech Silica Gel) GF 및 이. 머크 실리카 겔(E. Merck Silica Gel) 60 F-254 박막 플레이트를 박막 크로마토그래피에 사용하였다. 플래쉬 및 중력 크로마토그래피 모두를 이 머크 키에젤겔 (E. Merck Kieselgel) 60 (230 내지 400 메쉬) 실리카겔 상에서 수행하였다. 분석 및 정량 HPLC는 레이닌 (Rainin) 또는 베크만 크로마토그래피 상에서 수행하였다. ODS는 옥타데실실릴 유도된 실리카 겔 크로마토그래피 지지체를 의미한다. 5μ 아펙스-ODS (Apex-ODS)는 5μ의 통상적인 입도를 갖는 옥타데실실릴 유도 실리카 겔 크로마토그래피 지지체 [콜로라도주 리틀톤 소재의 존스 크로마토그래피사 제조]를 의미한다. YMC ODS-AQ (등록 상표)는 ODS 크로마토그래피 지지체이며, 일본 교토 소재의 YMC Co. Ltd.의 등록 상표이다. PRP-1 (등록상표)은 중합체 (스티렌-디비닐벤젠) 크로마토그래피 지지체이고, 네바다주 르노 소재의 해밀톤사 (Hamilton Co.)의 등록 상표이다. 셀라이트 (Celite) (등록 상표)는 산 세척 규조토 실리카로 이루어진 필터 보조제이며, 콜로라도주 덴버 소재의 만빌사 (Manville Corp.)의 등록 상표이다.
제조예 1
에틸 (±)-10,11-디히드로-3-카르복시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트의 제조
a) 3-벤질-4-(트리플루오로메탄술포닐옥시)아니솔
트리플루오로메탄술폰산 무수물(10.0 ml, 60 밀리몰)을 아르곤 하의 -78 ℃에서 2-벤질-4-메톡시페놀(10.71 g, 50 밀리몰; 문헌[J. Am. Chem. Soc. 1949, 71, 64]에 따라서 제조됨) 및 무수 CH2Cl2(250 ml) 중의 무수 2,6-루티딘(12.0 mL, 100 밀리몰)의 용액에 3 분에 걸쳐서 가하였다. 반응물을 -78 ℃에서 0.5 시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온시켰다. 1 시간 후, 반응물을 헥산(250 ml)으로 희석시키고, 1.0 N HCl(2 x 100 ml), 1.0 N NaOH(2 x 50 ml), H2O(100 ml) 및 염수(50 ml)로 순차적으로 세척하였다. 건조(Na2SO4), 농축, 실리카겔 크로마토그래피하여 담황색 고체로서 표제 화합물(16.65 g, 96 %)을 얻었다. TLC Rf0.51 (10% EtOAc/헥산);1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7.10-7.40 (m, 6H), 6.77 (dd, J=9.0, 3.1 Hz, 1H), 6.66 (d, J=3.1 Hz, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.73 (s, 3H); FTIR (CCl4) 1492, 1423, 1405, 1249, 1216, 1161, 1144, 1039, 869 cm-1; MS (ES) m/e 369 (M+Na)+, 364.0 (M+NH4)+, 347.0 (M+H)+.
b) 4-알릴-3-벤질아니솔
둥근 플라스크내 LiCl(3.08 g, 72.8 밀리몰)을 높은 진공하에서 화염 건조하고, 상기 계를 질소하에서 실온으로 냉각시켰다. 3-벤질-4-(트리플루오로메탄술포닐옥시)아니솔(21.0 g, 60.0 밀리몰), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드(2.13 g, 3.0 밀리몰), 무수 DMF(150 ml) 및 알릴트리부틸주석(22.6 ml, 72.8 밀리몰)을 가하고, 상기 혼합물을 3 회의 배기/아르곤 플러쉬 사이클로 퍼징시켰다. 상기 혼합물을 95 ℃로 고정된 오일욕 중에서 가열시켜 황색의 균질한 용액을 얻었다. 1.5 시간 후, 어두운 색의 혼합물을 회전 증발기(높은 진공)상에서 농축시키고, 잔사를 크실렌으로부터 재농축시켰다. 생성하는 잔사를 Et2O(120 ml) 중에 용해시키고, 10 % KF(120 ml)를 가하여 0.5 시간 동안 활발하게 교반하였다. 층을 분리하고, 수층을 Et2O(2 x 120 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시키고, 불용성 고체를 제거하였으며, 여액을 H2O(60 ml) 및 염수(60 ml)로 순차적으로 세척하였다. 건조(MgSO4) 및 농축 후, 탁한 황색 오일이 남았다. 크로마토그래피(실리카겔, 5 % 에틸 아세테이트/헥산)하여 담황색 오일(14.21 g, 98 %)로서 표제 화합물을 얻었다. TLC Rf(10% EtOAc/헥산) 0.51;1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7.03-7.31 (m, 6H), 6.74 (dd, J=8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.66 (d, J=2.7 Hz, 1H), 5.79-5.98 (m, 1H), 4.89-5.07 (m, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.21-3.33 (m, 2H); FTIR (CCl4) 1610, 1496, 1256, 1046, 914 cm-1; MS (ES) m/e 239.2 (M+H)+.
c) 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산
물(56 ml)중의 H5IO6(23.83 g, 104.5 밀리몰)의 용액을 CCl4(28 ml) 및 CH3CN(28 ml) 중의 4-알릴-3-벤질아니솔(5.30 g, 22.24 밀리몰)의 용액에 가하고, 잘 교반된 혼합물을 0 ℃로 완전히 냉각시켰다. RuCl3(231 mg, 1.11 밀리몰)을 가하고, 반응물을 0 ℃에서 4 시간 동안 활발하게 교반한 후, 45 분 동안 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시키고, 필터 패드를 CH2Cl2(120 ml) 그 후, 물(120 ml)로 세척하였다. 층을 분리하고, 수층을 CH2Cl2(3 x 120 ml)로 추출하였다. 건조(Na2SO4) 및 농축 후, 갈색 오일이 남았다. 이를 Et2O(90 ml) 및 0.25 N NaOH(3 x 120 ml)사이에 분배시키고, 층을 분리하였다. Et2O 층을 0.25 N NaOH(90 ml)로 추출하고, 합한 수층을 농축 HCl을 가하여 산성화(pH 2)시켰다. CH2Cl2추출, 건조(Na2SO4) 및 농축하여 황색 오일로서 표제 화합물을 얻고, 이를 황색 고체(4.19 g, 74 %)로 고상화하였다.1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7.05-7.35 (m, 6H), 6.77 (dd, J=8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.71 (d, J=2.7 Hz, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.54 (s, 2H); FTIR (CCl4) 2300-3500(broad), 1710, 1611, 1502, 1496, 1285, 1257, 1045 cm-1; MS (ES) m/e 279.0 (M+Na)+, 274.0 (M+NH4)+, 257.0 (M+H)+.
d) 3-메톡시-5H-디벤조[a.d]시클로헵텐-10(11H)-온
미세하게 분말화된 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산(3.26 g, 12.72 밀리몰)을 100-110 ℃에서 잘 교반된 폴리인산(165 g)에 가하였다. 15 분 후, 반응물을 얼음(330 g)에 부었다. Et2O(330 ml)를 가하고, 상기 혼합물을 15 분 동안 잘 교반하였다. 층을 분리하고, 수층을 Et2O(330 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 5 % NaHCO3(2 x 80 mL) 그 후, 염수 (80 ml)로 세척하고, 건조(MgSO4) 및 농축시켰다. 잔사를 톨루엔으로부터 재농축한 후, 크로마토그래피(실리카겔, 20 % 에틸 아세테이트/헥산)하였다. 표제 화합물을 황색 오일(1.44 g, 48 %)로서 얻었다. TLC Rf(20% EtOAc/헥산);1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8.07-8.15 (m, 1H), 7.39-7.49 (m, 1H), 7.25-7.48 (m, 2H), 7.19 (d, J=8.3 Hz, 1H), 6.86 (d, J=2.6 Hz, 1H), 6.71 (dd, J=8.3, 2.6 Hz, 1H), 4.21 (s, 2H), 4.11 (s, 2H), 3.77 (s, 3H); FTIR (CCl4) 1680, 1501, 1282, 1270 cm-1; MS(ES) m/e 261 (M+Na)+, 256 (M+NH4)+, 239.0(M+H)+.
e) 에틸 (±)-10,11-디히드로-10-히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
에틸 아세테이트 무수물(0.58 ml, 6.6 밀리몰)을 아르곤하 -78 ℃에서 화염 건조시킨 플라스크내 무수 THF(24 mL) 중의 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드(THF 중의 1.0 M, 6 mL, 6 밀리몰)의 용액에 적가하였다. 황색 용액을 -78 ℃에서 0.5 시간 동안 교반한 후, 무수 THF(3 mL) 중의 3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10(11H)-온(715 mg, 3 밀리몰)의 용액을 3 분에 걸쳐 적가하였다. 이동시, 부가적인 무수 THF(0.4 mL)을 사용하였다. -78 ℃에서 0.5 시간 후, 반응물을 포화 NH4Cl(15 mL)로 켄칭시키고, 실온으로 가온하고, 에틸 아세테이트(2 X 3 mL)로 추출하였다. 건조(MgSO4) 및 농축 후, 크로마토그래피(실리카겔, 10 % 에틸 아세테이트/헥산(400 mL) 그 후, 20 % 에틸 아세테이트/헥산)하여 황색 고체로서 3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10(11H)-온(305.4 mg, 43 %)을 얻은 후, 담황색 오일로서 표제 화합물(531.9 mg, 54 %)을 얻었다. TLC Rf0.37 (20% EtOAc/헥산);1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7.63 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.00-7.30 (m, 4H), 6.80 (d, J=2.6 Hz, 1H), 6.69 (dd, J=8.2, 2.6 Hz, 1H), 3.95-4.35 (m, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.68 (s, 1H), 3.64 (d, J=14.2 Hz, 1H), 3.35 (d, J=14.2 Hz, 1H), 2.79 (d, J=16.0 Hz, 1H), 2.66 (d, J=16.0 Hz, 1H), 1.22 (t, J=7.2 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 3580 (sharp), 3509 (broad), 1735, 1715, 1503, 1261, 1198, 1156, 1044 cm-1; MS(ES) m/e 675.2 (2M+Na)+, 653.2 (2M+H)+.
f) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
10 % Pd/C(242 mg, 0.23 밀리몰)을 에틸 (±)-10,11-디히드로-10-히드록시-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트용액(741.1 mg, 2.27 밀리몰) 및 빙초산(23 ml)중의 농축 HCl(0.19 ml, 2.27 밀리몰)의 용액에 가하고, 상기 혼합물을 수소 가스하(50 psi) 실온에서 파르(Parr) 장치상에서 진동시켰다. 6 시간 후, 반응물을 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시키고, 필터 패드를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여액을 농축시키고, 잔사를 톨루엔으로부터 재농축시켰다. 생성되는 옅은 황색 오일 잔사를 크로마토그래피(실리카겔, 20 % 에틸 아세테이트/헥산)하여 무색 오일(643.6 mg, 91 %)로서 표제 화합물을 얻었다. TLC Rf0.57 (20% EtOAc/헥산);1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7.05-7.22 (m, 4H), 7.01 (d, J=8.2 Hz, 1H), 6.76 (d, J=2.7 Hz, 1H), 6.67 (dd, J=8.2, 2.7 Hz, 1H), 4.30 (d, J=15.0 Hz, 1H), 4.11-4.25 (m, 2H), 3.85 (d, J=15.0 Hz, 1H), 3.70-3.90 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.31 (dd, J=15.0, 4.1 Hz, 1H), 2.93 (dd, J=15.0, 9.2 Hz, 1H), 2.64 (dd, J=15.6, 5.0 Hz, 1H), 2.52 (dd, J=15.6, 9.3 Hz, 1H), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 1734, 1611, 1504, 1285, 1263, 1155, 1044, cm-1; MS(ES) m/e 333.0 (M+Na)+, 328.0 (M+NH4)+, 311.0 (M+H)+, 265.0 (M+H-EtOH)+.
g) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
무수 AlCl3(1.38 g, 10.35 밀리몰)을 아르곤하에 0 ℃에서 무수 CH2Cl2(21 ml) 중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 용액(643.6 mg, 2.07 밀리몰)에 가하였다. 황색 용액을 실온으로 가온시키고, 3 시간 동안 교반한 후, 0 ℃로 냉각시키고, 냉각 3 N HCl(10 ml)로 켄칭시켰다. 층을 분리하고, 수층을 CH2Cl2로 추출하였다. 합한 유기층을 건조(MgSO4) 및 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(25 % 에틸 아세테이트/헥산)하여 거의 무색 오일(611.7 mg, 100 %)로서 표제 화합물을 얻었다. TLCf0.26 (20% EtOAc/헥산);1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.03-7.22 (m, 4H), 6.93 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.69 (d, J=2.6Hz, 1H), 6.58 (dd, J=8.1, 2.6 Hz, 1H), 5.00 (s, 1H), 4.25 (d, J=14.9 Hz, 1H), 4.11-4.25 (m, 2H), 3.73-3.88 (m, 1H), 3.79 (d, J=14.9 Hz, 1H), 3.28 (dd, J=15.6, 9.5 Hz, 1H), 2.91 (dd, J=15.0, 9.3 Hz, 1H), 2.65(dd, J=15.6, 4.9 Hz, 1H), 2.53(dd, J=15.6, 9.5 Hz, 1H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 3611 (sharp), 3447 (broad), 1734, 1504, 1291, 1272, 1176, 1152 cm-1; MS(ES) m/e 314.2(M+NH4)+, 297.2(M+H)+.
h) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-(트리플루오로메탄술포닐옥시)-5H-디벤조 [a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
트리플루오로메탄술폰산 무수물(0.45 ml, 2.68 밀리몰)을 아르곤하에 -78 ℃에서 무수 CH2Cl2(10.3 ml) 중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(611.7 ml, 2.06 밀리몰) 및 2,6-루티딘(0.48 ml, 4.12 밀리몰)의 용액에 적가하였다. 0.5 시간 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 시간 동안 교반하였다. 황색 용액을 Et2O(50 ml)로 희석하고, 0.1 N HCl(5 ml), 5 % NaHCO3(5 ml) 및 염수(5 ml)로 순차적으로 세척하였다. 건조(MgSO4) 및 농축 후, 크로마토그래피(실리카겔, 20 % 에틸 아세테이트/헥산)하여 무색 오일(808.9 g, 92 %)로서 표제 화합물을 얻었다.
TLC Rf(20% EtOAc/헥산) 0.58;1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 6.98-7.30(m, 7H), 4.35 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.19(q, J=7.1 Hz, 2H), 3.91(d, J=15.2 Hz, 1H), 3.78-3.95 (m,1H), 3.37(dd, J=15.2 4.1 Hz, 1H), 3.02 (dd, J=15.2, 9.6 Hz, 1H), 2.70(dd, J=15.8, 4.8 Hz, 1H), 2.53 (dd, J=15.8, 9.6 Hz, 1h), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 1735, 1493, 1427, 1250, 1215, 1144, 961, 856 cm-1; MS (ES) m/e 451.1 (M+Na)+, 446.2 (M+Na)+, 429.2 (M+H)+.
i) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-카르복시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
에틸 (±)-10,11-디히드로-3-(트리플루오로메탄술포닐옥시)-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(808.9 mg, 1.89 밀리몰), KOAc(742 mg, 7.56 밀리몰), Pd(OAc)2(21.2 mg, 0.095 밀리몰), 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센(210 mg, 0.38 밀리몰) 및 무수 DMSO(11 ml)을 일산화탄소(3 회의 배기/CO 플러쉬 사이클 후, 4 분 동안 혼합물을 CO로 버블링시킴)로 퍼징시킨 후, 70 ℃로 고정된 오일욕에서 CO 발룬(baloon)하에서 교반하였다. 3.5 시간 후, 반응물을 물(11 ml)로 희석하고, 0 ℃로 냉각시키고, 1.0 N 농축 HCl(약 8 ml)을 가하여 산성화시켰다. CH2Cl2(3 x 30 ml)추출, 건조(Na2SO4) 및 농축하고, 톨루엔으로부터 재농축하여 붉은 오렌지색 액체(2-3 ml)을 얻었다. 이를 크로마토그래피(실리카겔, 3:2:0.1 에틸 아세테이트/톨루엔/AcOH; 1:1:0.1 에틸 아세테이트/톨루엔/AcOH으로 다시 혼합된 분획들)하여 점성의 황색 오일(581.9 g, 95 %)로서 표제 화합물을 얻었고, 이를 40 ℃의 높은 진공하에서 부분적으로 결정화하였다. TLC Rf(3:2:0.1 EtOAc/톨루엔/AcOH) 0.60;1H NMR (250 MHz, CDCl3)δ7.95 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.87 (dd, J=7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.00-7.35 (m, 5H), 4.40 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.19 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.97 (d, J=15.2Hz, 1H), 3.82-4.00 (m, 1H), 3.43 (dd, J=15.3, 4.0 Hz, 1H), 3.07 (dd, J=15.3, 9.5Hz, 1H), 2.69(dd, J=15.8, 4.8 Hz, 1H), 2.53 (dd, J=15.8, 9.5 Hz, 1h), 1.28 (t, J=7.1 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 2357-3378 (broad), 1735, 1692, 1280 cm-1; MS (ES) m/e 342.2 (M+NH4)+, 325.2 (M+H)+, 307.2 (M+H-H2O)+.
제조예 2
에틸 2-카르복시-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d]시클로헵테닐-10-아세테이트의 제조
a) 메틸 2-벤조일-5-메톡시페닐아세테이트
문헌[J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1991, 171]에 따라서 메틸 3-메톡시-페닐아세테이트를 벤조일 클로라이드 및 알루미늄 클로라이드로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
b) 메틸 2-벤조일-5-메톡시페닐아세테이트
문헌[Synthesis. 1978. 763]의 일반적인 방법에 따라서, 제조예 2 (a)의 화합물을 디클로로메탄 중의 나트륨 보로히드리드 및 트리플루오로아세트산으로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
c) 2-벤질-5-메톡시페닐아세트산
제조예 2 (b)의 화합물을 수성 수산화나트륨 및 메탄올로 처리하고 교반하였다. 상기 혼합물을 농축하고 희석 염산으로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
d) 5,11-디히드로-2-메톡시-10H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온
미국 특허 제3,567,730호의 일반적인 방법에 따라서 제조예 2(c)의 화합물을 교반된 인산 및 인 펜톡시드의 혼합물에 가하고 80℃로 가열하여 표제 화합물을 얻었다.
e) 5,11-디히드로-2-히드록시-10H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온
문헌[Tetrahedron, Letters 1978, 5211]의 일반적인 방법에 따라서, 제조예 2 (d)의 화합물을 에탄티올 및 알루미늄 클로라이드로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
f) 5,11-디히드로-2-(트리플루오로에탄술포닐)옥시-10H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온
문헌[J.Chem.Soc., Chem, Commun, 1987, 904]의 일반적인 방법에 따라서, 제조예 2 (e)의 화합물을 트리플릭 무수물로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
g) 5,11-디히드로-2-메톡시카르보닐-10H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온
문헌[J.Chem.Soc., Chem, Commun, 1987, 904]의 일반적인 방법에 따라서, 제조예 2 (f)의 화합물을 디메틸 술폭시드 중의 일산화탄소, 메탄올, 팔라듐 아세테이트 및 1,3-비스(디페닐포스피노)프로페어로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
h) 5,11-디히드로-2-카르복시-10H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온
제조예 2 (g)의 화합물을 희석된 수성 수산화나트륨을 가하여 교반하였다. 혼합물을 희석 염산으로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
i) 5,11-디히드로-2-tert-부톡시카르보닐-10H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온
문헌[Synthesis. 1983, 2, 135]의 일반적인 방법에 따라서, 제조예 2 (h)의 화합물을 N,N'-디메틸포름아미드 디-tert-부틸 아세탈로 처리하여 표제 화합물을 얻었다.
j) 에틸 2-tert-부톡시카르보닐-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
문헌[Org. Reactions, 1947, I] 및 문헌[J. Am. Chem. Soc.,1938, 60, 2947]의 일반적인 방법에 따라서, 제조예 2 (i)의 화합물을 아연 분말 및 에틸 브로모아세테이트로 처리하였다.
k) 에틸 2-카르복시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
제조예 2 (j)의 화합물을 디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산으로 처리하고 교반하였다. 혼합물을 농축하여 표제 화합물을 얻었다.
제조예 3
2-[(2-아미노에틸)아미노]피리딘 이수화물의 제조
a) 모노-Boc-1,2-에틸렌디아민
CH2Cl2(50 ml) 중의 디-tert-부틸 디카르보네이트(10.91 g, 50 밀리몰)의 용액을 30 분에 걸쳐 잘 교반된 CH2Cl2(250 ml) 중의 1,2-에틸렌디아민(33 mL, 500 밀리몰)의 용액에 적가하였다. 부가하는 동안 침전물을 분리하였다. 다 부가한 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 시간 동안 교반하고, 회전 증발기 상에서 농축하였다. 잔사를 물(100 ml)중에 용해시키고, 여과하여 소량의 불용성 물질을 여과하였다. 여액을 CH2Cl2(3 x 100 ml)로 추출하고, 합한 유기 물질로 건조(MgSO4) 및 농축시켜 탁한 액체로서 표제 화합물(6.00 g, 75 %)을 얻었다.1H NMR (250, CDCl3) δ 4.75-5.00 (m, 1H), 3.05-3.25 (m, 2H), 2.65-2.85 (m, 2H), 1.46(s, 9H), 1.12(br s, 2H).
b) 2-[[2-(Boc-아미노)에틸]아미노]피리딘-N-옥시드
모노-Boc-1,2-에틸렌아민(5.83 g, 36.39 밀리몰), 2-클로로피리딘-N-옥시드 히드로클로라이드(7.25 g, 43.67 밀리몰), NaHCO3(15.29 g, 182 밀리몰) 및 tert-아밀 알코올(36 ml)의 혼합물을 가열 환류시켰다. 47 시간 후, 어두운 갈색의 혼합물을 냉각시키고, CH2Cl2(100 ml)로 희석하고, 흡입 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여액을 농축하고 톨루엔으로 재농축하였다. 크로마토그래피(실리카겔, 10 % 메탄올/CHCl3)하여 황색 고체로서 순수하지 않은 표제 화합물(8.23 g, 89 %)을 얻었고, 이를 추가 정제없이 사용하였다. TLC (10% MeOH/CHCl3)Rf0.42;1H NMR (250, CDCl3) δ 8.16 (dd, J=6.5, 1.3 Hz, 1H), 7.05-7.30 (m, 2H), 6.68 (br d, J=8.6Hz, 1h), 6.50-6.65 (m, 1H), 5.70-5.95 (m, 1H), 3.25-3.60 (m, 4H), 1.44 (s, 9H); MS (ES) m/e 254 (m+H)+.
c) 2-[[2-(Boc-아미노)에틸]아미노]피리딘
10 % Pd/C(106.4 mg, 0.10 밀리몰)을 2-[[2-(Boc-아미노)에틸]아미노]피리딘-N-옥시드(126.7 mg, 0.5 밀리몰) 및 무수 에탄올(5 ml)중의 시클로헥센(0.25 ml, 0.25 밀리몰)의 용액에 가하고, 상기 혼합물을 가열 환류시켰다. 16 시간 후, 반응물을 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시키고, 여액을 농축시켰다. 상기 잔사를 별도의 제조로부터 얻어진 잔사(0.5 밀리몰 스케일)와 합하고, 합한 물질을 크로마토그래피(실리카겔, 5 % 메탄올/CHCl3)하였다. 황색 오일로서 표제 화합물(2-[[2-(Boc-아미노)에틸]아미노]피리딘-N-옥시드 1 밀리몰을 기준으로 148.4 g, 63 %)을 얻었다. TLC (5% MeOH/CHCl3)Rf0.43;1H NMR (400, CDCl3)δ8.05-8.12 (m, 1H), 7.37-7.46 (m, 1H), 6.53-6.61 (m, 1H), 6.41 (d, J=8.3 Hz, 1H), 5.12 (br s, 1H), 4.86 (br s, 1H), 3.26-3.51 (m, 4H), 1.44 (s, 9H); MS (ES) m/e 238 (M+H)+.
d) 2-[(2-아미노에틸)아미노]피리딘 디히드로클로라이드
디옥산(3.2 ml) 중의 4 N HCl를 0 ℃에서 무수 CH2Cl2(3.2 ml) 중의 2-[[2-(Boc-아미노)에틸]아미노]피리딘의 용액(148.4 mg, 0.63 밀리몰)에 스트림으로 가하였다. 2 시간 후, 혼합물을 흡입 여과하여 고상 침전물을 수집하고, 무수 Et2O로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물(132.8 mg, 대량)을 황색 고체로서 얻었다.1H NHR (400, CD3OD)δ7.99-8.07 (m, 1H), 7.92-7.98 (m, 1H), 7.19 (d, J=9.1 Hz, 1H), 6.98 - 7.04 (m, 1H), 3.76 (t, J=6.2 Hz, 2h), 3.27 (t, J=6.2Hz, 2H, 잔류 용매 신호에 의해 부분적으로 모호함; MS (ES) m/e 138 (M+H)+.
제조예 4
2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]피리딘-N-옥시드의 제조
a) 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]피리딘-N-옥시드
2-클로로피리딘-N-옥시드(16.6 g, 0.1 밀리몰), 3-아미노-1-프로판올(15.3 mg, 0.2 밀리몰), NaHCO3(42 g, 0.5 밀리몰) 및 tert-아밀 알코올(100 ml)의 혼합물을 가열 환류시켰다. 21 시간 후, 반응물을 냉각시키고, CH2Cl2(300 ml)로 희석하고, 흡입 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여액을 농축하고 톨루엔으로 재농축하여 황색 오일을 얻었다. 크로마토그래피(실리카겔, 20 % 메탄올/CHCl3)하여 황색 고체로서 표제 화합물(15.62 g, 93 %)을 얻었다. TLC (20% MeOH/CHCl3) Rf0.48;1H NMR (250 CDCl3)δ8.07 (dd, J=6.6, 1.2 Hz, 1H), 7.34 (br t, 1H), 7.10-7.30 (m, 1h), 6.64 (dd, J=8.5, 1.4 Hz, 1H), 6.40-6.60 (m, 1H), 4.49 (br s, 1H), 3.65-3.90 (m, 2H), 3.35-3.60 (m, 2H), 1.75-2.00 (m, 2H); MS (ES) m/e 169 (M+H)+.
제조예 5
2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-니트로피리딘-N-옥시드의 제조
a) 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-니트로피리딘-N-옥시드
2-클로로피리딘-N-옥시드 히드로클로라이드 대신에 2-클로로-4-니트로피리딘-N-옥시드로 치환하는 것을 제외하고(문헌[Jain, P.C.; Chatterjee, S.K.; Anand, N. Indian Journal of CHemistry 1966, 403]참고), 제조 방법 12에 따라서, 오렌지색 고체로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 214.2(M+H)+
제조예 6
2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드의 제조
a) 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드
2-클로로피리딘-N-옥시드 히드로클로라이드 대신에 2-클로로-4-메틸피리딘-N-옥시드로 치환하는 것을 제외하고(문헌[Brawnm E.V. J. Amer. Chem. Soc. 57, 79, 3565]참고) 제조 방법 12에 따라서, 회백색 고체로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 183(M+H)+
제조예 7
2-(에틸아미노)-6-피리딜에탄올의 제조
a) 2-(N-Boc-아미노)-6-피콜린
0 ℃에서 2-아미노-6-피콜린(4.33 g, 40 밀리몰), Et3N(6.2 mL, 40 밀리몰) 및 CH2Cl2(50 ml)의 교반된 용액에 디-tert-부틸 디카르보네이트(9.6 g, 44 밀리몰)을 가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 물로 희석하고, CH2Cl2(2 X 50 ml)로 희석하였다. 건조(MgSO4) 및 농축 후, 무색 오일로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 209(M+H)+
b) 2-(N-Boc-N-에틸아미노)-6-피콜린
0 ℃에서 DMF(50 ml) 중의 NaH(무기 오일 중 60 % 분산액, 1.15 g, 29.5 밀리몰)의 현탁액에 DMF(30 ml) 중의 2-(N-Boc-아미노)-6-피콜린의 용액을 가하였다. 반응물을 0 ℃에서 15 분 동안 교반한 후, 에틸 요오디드(4.6 g, 30 밀리몰)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 진공에서 농축하였다. 상기 잔사를 물로 희석하고, CH2Cl2(3 X 50 ml)로 추출하였다. 건조(MgSO4) 및 농축 후, 크로마토그래피(실리카겔, 20 % 에틸 아세테이트/헥산)하여 무색 오일로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 237(M+H)+
c) 에틸 2-(N-Boc-N-에틸아미노)-6-피리딜아세테이트
LDA(0.018 몰)을 THF(30 ml) 중에서 제조하고, - 78 ℃로 냉각시키고, 2-(N-Boc-N-에틸아미노)-6-피콜린(3.5 g, 15 밀리몰)을 가하고, 짙은 적색 용액을 생성하였다. 15 분 후, 디에틸 카르보네이트(2.2 mL, 17.9 밀리몰)을 가하고, 상기 짙은 홍색 용액을 -78 ℃에서 부가적인 15 분 동안 교반한 후, 반응물을 포화 NH4Cl로 켄칭하였다. 상기 혼합물을 실온으로 가온시키고, 에틸 아세테이트(3 X 30 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 건조(MgSO4) 및 농축하였다. 크로마토그래피(실리카겔, 10 % 에틸 아세테이트/헥산)하여 무색 오일로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 309(M+H)+
d) 에틸 2-(에틸아미노)-6-피리딜아세테이트
에틸 2-(N-Boc-N-에틸아미노)-6-피리딜아세테이트(1.5 g, 4.87 밀리몰) 및 4 M HCl/디옥산(5 ml, 20 몰)의 용액을 실온에서 밤새 교반한 후, 농축하였다. 톨루엔으로부터 재농축하여 백색 고체로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 209(M+H)+
e) 2-(에틸아미노)-6-피리딜에탄올
기계적으로 교반된, THF(1.0 M, 20 ml, 20.3 밀리몰) 중의 LiAlH4용액에 THF(30 ml)중의 에틸 2-(에틸아미노)-6-피리딜아세테이트(1 g, 4.1 밀리몰)의 용액을 적가하였다. 부가 종결 후, 반응 혼합물을 가열 환류시켰다. 5 시간 후, 반응물을 0 ℃로 냉각시키고, 10 % NaOH 용액으로 켄칭시켰다. 여과에 의해서 고체를 제거하고 여액을 진공에서 농축하였다. 상기 잔사를 CH2Cl2중에 용해시키고, 상기 용액을 건조(MgSO4) 및 농축하였다. 톨루엔으로부터 재농축(x3)하여 무색 오일로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 167(M+H)+
제조예 8
10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로텐-10-온의 제조
a) 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산
빙초산(600 ml)중의, 문헌[J.Med. Chem. 1981, 24, 998]의 방법에 의해서 제조된 2-벤조일-4-메톡시페닐아세트산(13.0 g, 0.048 몰) 용액을 아르곤하에 10 % Pd/C 4.3 g로 처리하고, 17 시간 동안 50 psi에서 수소첨가하였다. 혼합물을 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시키고, 여액을 농축하고, 톨루엔 및 염화메틸렌으로부터 재농축하여 표제 화합물 14.2 g을 얻었다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.52 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 4.0 (s, 3H), 6.7 (m, 2H), 7.15 (m, 6H).
b) 10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온
벤젠(120 ml) 및 티오닐 클로라이드(28 ml) 중의 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산(14.2 g, 0.055 밀리몰) 용액을 1 시간 동안 환류시키고 농축하였다. 산 클로라이드를 무수 염화메틸렌(40 ml) 중에 용해시키고, 용액을 아르곤하에 염화메틸렌(600 ml)중의 AlCl3(14.7 g, 0.11 밀리몰)용액에 적가하였다. 반응물을 실온에서 2.5 시간 동안 아르콘 대기하에서 교반한 후, 빙수(200 ml)로 켄칭하였다. 층을 분리하고, 유기상을 10 % NaOH 용액, 물 및 희석 HCl로 순차적으로 세척하였다. 생성되는 용액을 에테르(200 ml)로 희석하고, 건조(MgSO4)시키고, 농축시켰다. 고체 잔사를 에테르/헥산(1:1)로 연마하고, 여과를 통하여 표제 화합물 9.35 g을 얻었다. Mp 105-106℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.72 (s, 3H), 4.1 (s, 2H), 4.2 (s, 2H), 6.7 (d, 1H), 6.82 (s, 1H), 7.30 (m, 4H), 8.1 (d, 1H).
제조예 9
에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로텐-10-아세테이트의 제조
a) 에틸(±) 3-(3-메톡시페닐)인덴아세테이트
0 ℃에서 THF(50 ml) 중의 문헌[J.Med. Chem. 1981, 24, 998]의 방법에 의해서 제조된 3-(3-메톡시페닐)인덴(4 g, 18 밀리몰)의 냉각된 용액에 5 분에 걸쳐서 LiN(TMS)2(20 ml, THF 중의 1M) 용액을 적가하였다. 생성되는 용액을 -78 ℃에서 THF(15 ml) 중의 에틸 브로모아세테이트(3.34 g, 20 밀리몰)의 용액에 30 분에 걸쳐서 적가하였다. 2.5 시간 후, 혼합물을 포화 염화암모모늄 용액으로 켄칭시키고, 층을 분리하였다. 유기층을 건조(MgSO4)시키고, 농축시켜 조생성물을 얻고, 칼럼 크로마토그래피(SiO2/2-4 % 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 표제 화합물(1.1 g)을 얻었다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.30 (t, 3H), 2.50 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 4.0 (m, 1H), 4.20 (q, 2H), 6.6 (s, 1H), 6.9 (m, 1H), 7.2 (s, 1H), 7.35 (m, 6H).
b) 에틸(±) 3-[(3-메톡시벤조일)]페닐숙시네이트
아세톤(30 ml) 중의 에틸(±) 3-(3-메톡시페닐)인덴아세테이트(1.1 g, 3.6 밀리몰) 용액을 오스뮴 테트록시드(0.5 ml)의 4 % 수용액으로 처리하고, 문헌[J. Org. Chem. 1993, 58, 4745]의 방법에 따라서, 1.2 M 존스 시약(5 ml, 6 밀리몰)을 적가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 어두운 색의 반응 혼합물을 이소프로판올(2.5 ml)로, 그 후 나트륨 비술파이트(0,9 g) 및 물(30 ml)로 켄칭시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수로 세척하고, 건조(MgSO4)시키고, 농축시켜 고체 잔사를 얻었다. 이를 1:1 에테르/헥산으로 연마시켜 표제 화합물(0.76 g)을 얻었다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.18 (t, 3H), 2.90 (m, 1H), 3.3 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 4.1 (q, 2H), 4.4 (m, 1H), 4.4 (d, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.5 (m, 6H).
c) 에틸(±) 3-[(3-메톡시벤질)]페닐숙시네이트
빙초산(35 ml) 중의 에틸(±) 3-[(3-메톡시벤조일)]페닐숙시네이트(0.76 g, 2.1 밀리몰) 및 10 % Pd/C(0.6 g)의 혼합물을 17 시간 동안 50 psi에서 수소첨가하였다. 상기 혼합물을 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시키고, 필터 패드를 아세트산으로 세척하였다. 여액을 농축시키고, 톨루엔 및 염화메틸렌으로부터 재농축하여 표제 화합물 0.65 g을 얻었다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.20 (t, 3H), 2.20 (m, 1H), 3.0 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 4.1 (q, 2H), 4.18 (q, 2H), 4.4 (d, 1H), 6.2 (m, 2H), 7.22 (m, 6H).
d) (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-11-옥소-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
기계적으로 교반된, 무수 염화메틸렌(10 ml) 중의 에틸(±) 3-[(3-메톡시벤질)]페닐숙시네이트(0.65 g, 1.9 밀리몰) 용액에 DMF(0.2 ml) 및 옥살릴 클로라이드(0.2 ml, 2.28 밀리몰)를 가하였다. 1.5 시간 후, 상기 용액을 무수 염화메틸렌(15 ml) 중의 알류미늄 클로라이드(0.6 g, 4.5 밀리몰)의 현탁액에 적가하였다. 2 시간 후 상기 혼합물을 빙수로 켄칭시키고, 층을 분리하고, 수층을 염화메틸렌으로 추출하였다. 합한 유기층을 건조(MgSO4)시키고, 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피(SiO2/2-4 % 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 표제 화합물(0.3 g)을 얻었다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.28 (t, 3H), 2.88 (m, 1H), 3.55 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.88 (d, 1H), 4.18 (q, 2H), 4.85 (d, 1H), 4.95 (m, 1H), 5.8 (m, 2H), 7.22 (m, 4H), 8.1 (s, 1H).
e) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
빙초산(25 ml) 중의 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-11-옥소-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(0.3 g, 0.93 밀리몰) 및 10 % Pd/C(0.3 g)의 혼합물을 18 시간 동안 50 psi에서 수소첨가하였다. 상기 혼합물을 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시키고, 아세트산으로 세척하였다. 여액을 농축시키고, 톨루엔 및 염화메틸렌으로부터 재농축하여 표제 화합물 0.25 g을 얻었다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.28 (t, 3H), 2.60 (m, 2H), 2.90 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.85 (d, 1H), 4.18 (q, 2H), 4.30 (d, 1H), 6.70 (m, 2H), 7.0 (d, 1H), 7.22 (m, 4H).
하기 화합물은 상기의 제조법에서 서술된 바와 같은 중간체 화합물로부터 본 발명의 생물학적 활성 화합물의 제조 방법을 예시한다.
실시예 1
(±)-10,11-디히드로-3-[(2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산의 제조
a) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시] -5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
무수 DMF(58 ml)중의 2-[3-히드록시-1-프로필)아미노]파라딘-N-옥시드(1.94 g, 11.55 밀리몰) 및 디에틸 아조디카르복실레이트(1.8 ml, 11.55 밀리몰)의 용액을 아르곤하에 실온에서 무수 DMF(23 ml)중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(1.37 g, 4.62 밀리몰) 및 트리페닐포스핀(3.27 g, 12.47 밀리몰)에 10 분에 걸쳐서 적가하였다. 23.5 시간 후, 반응물을 회전 증발기상에서 농축하고, 잔사를 크실렌으로부터 재농축하고, 남은 DMF를 제거하였다. 실리카겔 크로마토프래피(30 % 에틸 아세테이트/헥산(0.5 L), 그 후, 에틸 아세테이트(1 L) 그 후, 5 % 메탄올/CHCl3)하여 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(298.1 mg, 22 %)를 회수하고, 황색 오일로서 표제 화합물(1.54 g, 75 %)을 얻었다.1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8.10 (dd, J=6.6, 1.3 Hz, 1H), 6.85-7.30 (m, 7H), 6.78 (d, J=2.6 Hz, 1H), 6.68 (dd, J=8.2, 2.6 Hz, 1H), 6.61 (dd, J=8.5, 1.6 Hz, 1H), 6.45-6.57 (m, 1H), 4.29 (d, J=15.1 Hz, 1H), 4.10-4.25 (m, 2H), 4.06 (t, J=5.7 Hz, 2H), 3.84 (d, J=15.1 Hz, 1H), 3.70-3.92 (m, 1H), 3.49 (q, J=6.5 Hz, 2H), 3.30 (dd, J=15.0, 4.2 Hz, 1H), 2.93 (dd, J=15.0, 9.3 Hz, 1H), 2.65 (dd, J=15.6, 5.0 Hz, 1H), 2.51 (dd, J=15.6, 9.4 Hz, 1H), 2.05-2.25 (m, 2H), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 447 (M+H)+.
b) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-(2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(1.54 g, 3.45 밀리몰), 10 % Pd/C(0.73 g, 0.69 밀리몰), 시클로헥센(7 ml, 6.9 밀리몰) 및 이소프로판올(35 mL)의 혼합물을 2 시간 동안 가열 환류시키고, 셀라이트(등록상표)를 통하여 여과시켜 촉매를 제거하였다. 농축하여 황색 오일을 얻고, 이를 다시 반응 조건에 적용시켰다. 17 시간 후, 반응물을 상기와 같이 워킹 업하고, 용매로서 이소프로판올 대신에 1:1 에틸 아세테이트/이소프로판올(35 ml)을 사용하여 다시 반응 조건에 적용시켰다. 혼합물을 5 시간 동안 가열 환류하고, Pd 블랙(73 mg, 0.69 밀리몰)을 가하고, 또다른 18.5 시간 동안 계속 환류시켰다. 상기와 같이 워킹 업하고, 실리카겔 크로마토프래피(1:1 에틸 아세테이트/헥산), 담황색 오일로서 표제 화합물(0.94 g, 63 %)을 얻었다. TLC Rf(1:1 EtOAc/헥산) 0.38;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.02-8.11 (m, 1H), 7.33-7.42 (m, 1H), 7.02-7.20 (m, 4H), 7.00 (d, J=8.2 Hz, 1H), 6.77 (d, J=2.6 Hz, 1H), 6.67 (dd, J=8.2, 2.6 Hz, 1H), 6.50-6.60 (m, 1H), 6.39 (d, J=8.5 Hz, 1H), 4.69 (br t, 1H), 4.29 (d, J=15.0 Hz, 1H), 4.11-4.25 (m, 2H), 4.05 (t, J=5.8 Hz, 2H), 3.84 (d, J=15.0 Hz, 1H), 3.75-3.90 (m, 1H), 3.48 (app.q, 2H), 3.30 (dd, J=15.0, 4.1 Hz, 1H), 2.93 (dd, J=15.0, 9.2 Hz, 1H), 2.64 (dd, J=15.6, 4.8 Hz, 1H), 2.52 (dd, J=15.6, 9.5 Hz, 1H), 2.02-2.15 (m, 2H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3H); MS (ES) m/e 431 (M+H)+.
c) (±)-10,11-디히드로-3-[3-(2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조 [a,d]시클로헵텐-10-아세트산
무수 에탄올 (19.2 ml) 중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(피리딜아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(0.94 g, 2.18 밀리몰) 및 1.0 N NaOH(2.6 mL, 2.62 밀리몰)의 혼합물을 50 ℃로 고정된 오일욕 중에서 가온시켰다. 28.5 시간 후, 반응물을 회전 증발기상에서 농축하고, 잔사를 ODS 크로마토프래피(1:1 메탄올/물)로 정제하였다. 농축하여 탁한 수용액을 얻고, 이에 소량의 1.0 N NaOH를 첨가하여 균질하게 만들었다. pH는 1.0 N HCl를 가하여 7로 조정하고, 고상 침전물을 수집하고 물로 세척하였다. 모 액체를 농축하고, 잔사를 유사하게 처리하여 소량의 제2 생성물을 얻었다. 합한 물질을 40 ℃의 높은 진공하에서 건조시키고, 거의 무색 고체로서 표제 화합물(0.70 g, 79 %)을 얻었다. HPLC(해밀톤 PRP-1(등록상표), 0.1 % TFA 함유 40 % CH3CN/H2O)k'=1.2;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ7.94(d, J=4.4Hz, 1H), 7.32-7.41(m, 1H), 7.03-7.22(m, 4H), 6.97(d, J=8.4Hz, 1H), 6.83(d, J=2.4Hz, 1H), 6.60-6.74(m, 2H), 6.41-6.50(m, 2H), 4.20(d, J=14.7Hz, 1H), 4.00(t, J=6.2Hz, 2H), 3.88(d, J=14.7Hz, 1H), 3.60-3.70(m, 1H), 3.26-3.40(m, 2H, 잔류 용매 신호에 의해 부분적으로 모호함), 3.20(dd, J=15.1, 4.3Hz, 1H), 2.83(dd, J=15.1, 10.3Hz, 1H), 2.60(dd, J=15.9, 5.3Hz, 1H), 2.50(dd, 1H, 잔류 용매 신호에 의해 부분적으로 모호함), 1.88-2.00(m, 2H); MS(ES) me 403(M+H)+. 분석 계산치 C25H26N2O3·0.25H2O: C, 73.78; H, 6.56; N, 6.88. 실측치: C, 73.85; H, 6.47; N, 6.75.
실시예 2
(±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-아미노-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산의 제조
a) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(4-니트로-N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]피리딘-N-옥시드 대신에 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-니트로피리딘-N-옥시드로 치환하는 것을 제외하고는, 실시예 1(a)의 방법을 따라서, 실리카겔 크로마토프래피(2:1의 에틸 아세테이트/헥산, 그 후, 에틸 아세테이트 그 후, 에틸 아세테이트/CHCl3중의 5 % 메탄올의 농도 구배)를 수행하여 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 492(M+H)+
b) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-아미노-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 대신에 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(4-니트로-N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트로 치환하는 것을 제외하고는, 실시예 1(b)의 방법을 따라서, 실리카겔 크로마토프래피(20 % 메탄올/CHCl3)를 수행하여 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 446(M+H)+
c) (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-아미노-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산
실온에서 THF(2.5 ml)중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-아미노-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(216.3 mg, 0.49 밀리몰) 및 물(1.8 ml) 용액에 1.0 N LiOH(0.74 ml, 0.74 밀리몰)을 한꺼번에 가하였다. 두 개 상의 혼합물을 40 ℃로 마춘 오일욕 중에서 1 시간 동안 가온시키고, 무수 에탄올(약 1 ml)을 가하여 상들을 혼합하였다. 반응물을 19.5 시간 동안 40 ℃에서 유지한 후, 농축시키고 잔사를 1:1 CH3CN/물(5 ml) 중에 용해시켰다. 용액을 TFA(0.11 mL, 1.47 밀리몰)로 산성화시키고, 농축시켰다. ODS 크로마토프래피(0.1 % TFA를 함유하는 40 % CH3CN/물)하고 농축하여 CH3CN를 제거한 후, 오일성 수용액을 얻었고, 이에 소량의 CH3CN를 가하여 균질하게 만들었다. 1.0 N NaOH를 가하여 pH를 7로 조정하고, 오일성 반고체를 침전시켰다. 상기 혼합물을 농축시켜 CH3CN를 제거한 후, 생성되는 고체를 수집하였다. 이는 수성 NaOH 중에 용해시키고, pH를 7로 조정하였다. 고체를 수집하고, 많은 양의 물로 세척하고, 45 ℃의 진공에서 건조시켜 회백색 고체로서 표제 화합물(133.3 mg, 61 %)을 얻었다. HPLC(해밀톤 PRP-1(등록상표), 0.1 % TFA 함유 35 % CH3CN/H2O)k'=3.0;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ7.48(d, J=6.3Hz, 1H), 7.04-7.22(m, 4H), 6.95(D, J=8.2Hz, 1H), 6.88-7.02(m, 1H), 6.82(D, J=2.4Hz, 1H), 6.67(dd, J=8.2, 2.4Hz, 1H), 6.27(br s, 2H), 5.95(dd, 1H), 5.65(narrow d, 1H), 4.18(d, J=14.7Hz, 1H), 4.00(t, J=6.1Hz, 2H), 3.88(d, J=14.7Hz, 1H), 3.59-3.70(m, 1H), 3.13-3.30(m, 3H), 2.82(dd, J=15.2, 10.0Hz, 1H), 2.46(dd, J=15.8, 8.8Hz, 1H, 잔류 용매 신호에 의해 부분적으로 모호함), 2.58(dd, J=15.8, 5.2Hz, 1H), 1.86-2.01(m, 2H); MS(ES)m/e 418(M+H)+. 분석 계산치 C25H27N3O3·1.67H2O: C, 67.09; H, 6.83; N, 9.39. 실측치: C, 66.99; H, 6.59; N, 9.34.
실시예 3
(±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-메틸-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산의 제조
a) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(4-메틸-N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]피리딘-N-옥시드 대신에 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드로 치환하는 것을 제외하고는, 실시예 1(a)의 방법을 따라서, 실리카겔 크로마토프래피(구배; 30, 50, 100 % 헥산 중의 에틸 아세테이트, 그 후, CHCl3중의 1-5 % 메탄올)를 수행하여 담황색 오일로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 461.3(M+H)+
b) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-메틸-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 대신에 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-[2-(4-메틸-N-옥소피리딜)아미노]-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트로 치환하는 것을 제외하고는, 실시예 1(b)의 방법을 따라서, 실리카겔 크로마토프래피(구배; 30-50 % 헥산 중의 에틸 아세테이트)를 수행하여 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 445.3(M+H)+
c) (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-메틸-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산
실온에서 에탄올(5 ml)중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-메틸-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트(35 mg, 0.08 밀리몰) 용액에 1.0 N NaOH(0.144 ml, 0.144 밀리몰)을 가하였다. 혼합물을 32 ℃로 마춘 오일욕 중에서 밤새 가온시키고, 농축시켰다. 잔사를 물(3 ml) 중에 용해시키고, 용액을 20 % TFA로 산성화시켰다. ODS 크로마토프래피(0.1 % TFA를 함유하는 5-10 % CH3CN/물)하고 농축한 후, 동결 건조시켜 백색 분말로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 417.3(M+H)+분석 계산치 C26H28N2O3·2.0 TFA·1.0H2O: C, 54.38; H, 4.87; N, 4.23. 실측치: C, 54.66; H, 6.4.53; N, 4.32.
실시예 4
(±)-10,11-디히드로-3-[2-(6-(에틸아미노)-2-피리딜]-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산의 제조
a) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[2-[6-(에틸아미노)-2-피리딜]-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]피리딘-N-옥시드 대신에 2-(에틸아미노)-6-피리딜에탄올로 치환하는 것을 제외하고는 실시예 1(a)의 방법을 따라서, 실리카겔 크로마토프래피(5 % 메탄올/CH2Cl2)를 수행하여 무색 오일로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) m/e 445(M+H)+
b) (±)-10,11-디히드로-3-[2-[6-(에틸아미노)-2-피리딜]-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트
에틸 (±)-10,11-디히드로-3-[2-(6-(에틸아미노)-2-피리딜]-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산(80 mg, 0.18 밀리몰)을 메탄올(3 ml) 중에 용해시키고, 1.0 NaOH(0.22 ml, 0.22 밀리몰)을 가하였다. 상기 용액을 실온에서 밤새 교반하고, 진공에서 농축하였다. 상기 잔사를 물(3 ml)중에 용해시키고, 용액을 20 % TFA로 산성화시켰다. C-18 본드 엘루트(Bond Elute)상의 크로마토프래피(0.1 % TFA를 함유하는 30 % CH3CN/물)하여 백색 고체로서 표제 화합물을 얻었다. MS(ES) 417(M+H)+분석 계산치 C26H28N2O3·1.3CF3CO2H: C, 60.83; H, 5.23; N, 4.96. 실측치: C, 60.64; H, 5.26; N, 4.26.
상기 설명은 본 발명의 제조 및 사용 방법을 충분히 기재하고 있다. 그러나, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시태양에 제한되지 않으며, 하기 청구 범위내 그의 모든 변형을 포함한다. 본원에서 인용하고 있는 저널지, 특허 및 다른 발행물에 대한 여러 참고 문헌은 기술의 상태를 포함하고, 앞서 제시한 바와 같이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용하고 있다.

Claims (21)

  1. (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-아미노-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산;
    (±)-10,11-디히드로-3-[2-(6-(에틸아미노)-피리딜]-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산;
    (±)-10,11-디히드로-3-[3-(4-메틸-2-피리딜아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산; 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물.
  2. 제1항에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 따른 화합물, 항종양제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 항종양제가 토포테칸(topotecan)인 약제학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴(cisplatin)인 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 따른 화합물을 αvβ3수용체의 길항작용을 나타내는 질병의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 상기 질병의 치료 방법.
  7. 제1항에 따른 화합물을 αvβ5수용체의 길항작용을 나타내는 질병의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 상기 질병의 치료 방법.
  8. 제1항에 따른 화합물을 골다공증의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 상기 질병의 치료 방법.
  9. 제1항에 따른 화합물을 혈관형성의 억제를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 혈관형성 억제 방법.
  10. 제1항에 따른 화합물을 종양성장 또는 종양 전이의 억제를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 종양성장 또는 종양 전이의 억제 방법.
  11. 제1항에 따른 화합물을 동맥경화증 또는 재협착증의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 상기 질병의 치료 방법.
  12. 제1항에 따른 화합물을 염증 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 염증의 치료 방법.
  13. 제1항에 따른 화합물 및 항종양제를 단계적으로 또는 물리적으로 조합하여 투여하는 것을 포함하는 종양 성장의 억제 방법.
  14. 제13항에 있어서, 항종양제가 토포테칸인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴인 방법.
  16. 화학식 II의 화합물을 환원시키는 것을 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조 방법.
    <화학식 I>
    <화학식 II>
  17. 화학식 III의 화합물을 고리화시키는 것을 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법.
    <화학식 II>
    <화학식 III>
  18. 하기 화학식의 화합물.
  19. 하기 화학식의 화합물.
  20. 하기 화학식의 화합물.
  21. 하기 화학식의 화합물.
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