DE69920518T2 - Vitronectin-rezeptor-antagonist - Google Patents

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, die den Vitronectin-Rezeptor hemmt und zur Behandlung von Entzündung, Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen, wie Atherosklerose und Restenose, und Krankheiten, bei denen Knochenresorption einen Faktor darstellt, wie Osteoporose, verwendbar ist.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Integrine sind eine Superfamilie von Zell-Adhäsionsrezeptoren, die transmembranöse Glycoproteine, exprimiert auf einer Vielfalt von Zellen, sind. Diese Zelloberflächen-Adhäsions-Rezeptoren schließen gpIIb/IIIa (den Fibrinogenrezeptor) und αvβ3 (den Vitronectin-Rezeptor) ein. Der Fibrinogenrezeptor gpIIb/IIIa wird auf der Blutplättchen-Oberfläche exprimiert und vermittelt Plättchenaggregation und die Bildung eines blutungsstillenden Gerinnsels an der Stelle einer blutenden Wunde. Philips et al., Blood., 1988, 71, 831. Der Vitronectin-Rezeptor αvβ3 wird auf mehreren Zellen, einschließlich Endothel-, glatten Muskel-, Osteoklasten- und Tumorzellen, exprimiert und hat folglich eine Vielfalt von Funktionen. Der auf der Membran der Osteoklasten exprimierte αvβ3-Rezeptor vermittelt die Osteoklastenadhäsion an die Knochenmatrix, ein Schlüsselschritt im Knochenresorptionsprozess. Ross et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703. Eine durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnete Krankheit ist Osteoporose. Der auf humanen, glatten Muskelzellen der Aorta exprimierte αvβ3-Rezeptor vermittelt deren Migration in die Neointima, ein Prozess, der zu Restenose nach perkutaner Koronarangioplastik führen kann. Brown et al., Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815. Zusätzlich hat Brooks et al., Cell, 1994, 79, 1157 gezeigt, dass ein αvβ3-Antagonist durch Induzieren der Apoptose angiogener Blutgefäße Tumorregression fördern kann. Folglich wären Mittel, die den Vitronectin-Rezeptor blockieren, zur Behandlung von Krankheiten wie Osteoporose, Restenose und Krebs verwendbar.
  • Von dem Vitronectin-Rezeptor ist nun bekannt, dass er sich auf drei unterschiedliche Integrine bezieht, bezeichnet als αvβ1, αvβ3 und αvβ5. Horton et al., Int. J. Exp. Pathol., 1990, 71, 741. αvβ1 bindet Fibronectin und Vitronectin. αvβ3 bindet ein breites Spektrum von Liganden, einschließlich Fibrin, Fibrinogen, Laminin, Thrombospondin, Vitronectin, von-Willebrand-Faktor, Osteopontin und Knochen-Sialoprotein I. αvβ5 bindet Vitronectin. Von dem Vitronectin-Rezeptor αvβ5 ist gezeigt worden, dass er an der Zelladhäsion einer Vielfalt von Zelltypen, einschließlich mikrovaskulärer Endothelzellen, beteiligt ist (Davis et al., J. Cell. Biol., 1993, 51, 206) und seine Rolle in der Angiogenese ist bestätigt worden. Brooks et al., Science, 1994, 264, 569. Dieses Integrin wird auf Blutgefäßen in humanem Wundgranulationsgewebe exprimiert, aber nicht in normaler Haut.
  • Von dem Vitronectin-Rezeptor ist bekannt, dass er an Knochenmatrix-Proteine bindet, die das Tri-Peptid-Motiv Arg-Gly-Asp (oder RGD) enthalten. Folglich offenbaren Horton et al., Exp. Cell Res. 1991, 195, 368, dass RGD-enthaltende Peptide und ein anti-Vitronectin-Rezeptor-Antikörper (23C6) die Dentinresorption und Zellausbreitung von Osteoklasten hemmen. Außerdem offenbart Sato et al., J. Cell Biol. 1990,111, 1713, dass Echistatin, ein Schlangengift-Peptid, das die RGD-Sequenz enthält, ein potenter Inhibitor der Knochenresorption in Gewebekultur ist und Anlagerung von Osteoklasten an Knochen hemmt.
  • WO 98/15278 (SmithKline Beecham Corporation) beschreibt eine Reihe bicyclischer Verbindungen, von denen beansprucht wird, dass sie Freisetzung von Osteocalcin aus Osteoblasten bewirken, um Knochenbildung zu stimulieren.
  • Es ist nun entdeckt worden, dass eine bestimmte Verbindung ein potenter Inhibitor der αvβ3- und αvβ5-Rezeptoren ist. Insbesondere ist entdeckt worden, dass eine solche Verbindung ein potenterer Inhibitor des Vitronectin-Rezeptors als des Fibrinogenrezeptors ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung umfasst eine Verbindung der Formel (I), wie nachstehend beschrieben, die pharmakologische Aktivität zur Hemmung des Vitronectin-Rezeptors aufweist und bei der Behandlung von Entzündung, Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen, wie Atherosklerose und Restenose, und Krankheiten, bei denen Knochenresorption einen Faktor darstellt, wie Osteoporose, verwendbar ist.
  • Diese Erfindung ist auch ein Arzneimittel, umfassend eine Verbindung gemäß Formel (I) und einen pharmazeutischen Träger.
  • Diese Erfindung ist auch eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die durch den Vitronectin-Rezeptor vermittelt werden. In einer speziellen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Verbindung verwendbar zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Atherosklerose, Restenose, Entzündung, Krebs und Krankheiten, bei denen Knochenresorption einen Faktor darstellt, wie Osteoporose.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Diese Erfindung umfasst eine neue Verbindung, die ein potenterer Inhibitor des Vitronectin-Rezeptors als des Fibrinogenrezeptors ist. Die neue Verbindung umfasst einen Dibenzocycloheptenkern, in dem ein Stickstoff-enthaltender Substituent an einem der aromatischen sechsgliedrigen Ringe des Dibenzocycloheptens vorhanden ist und ein, eine saure Einheit enthaltender, aliphatischer Substituent an dem siebengliedrigen Ring des Dibenzocycloheptens vorhanden ist. Man glaubt, dass das Dibenzocyclohepten-Ringsystem die Substituenten-Seitenketten an den sechs- und siebengliedrigen Ringen so ausrichtet, dass sie günstig mit dem Vitronectin-Rezeptor interagieren können. Es wird bevorzugt, dass etwa zwölf bis vierzehn dazwischenliegende kovalente Bindungen über den kürzesten intramolekularen Weg zwischen dem sauren Rest an dem aliphatischen Substituenten des siebengliedrigen Rings des Dibenzocycloheptens und dem Stickstoff des Stickstoff-enthaltenden Substituenten an einem der aromatischen sechsgliedrigen Ringe des Dibenzocycloheptens vorkommen.
  • Diese Erfindung umfasst eine Verbindung der Formel (I):
    Figure 00030001
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  • Die Verbindung der Formel (I) hemmt die Bindung von Vitronectin und anderen RGD-enthaltenden Peptiden an den Vitronectin-Rezeptor. Hemmung des Vitronectin-Rezeptors auf Osteoklasten hemmt osteoklastische Knochenresorption und ist bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen Knochenresorption mit einem pathologischen Befund, wie Osteoporose und Osteoarthritis, verbunden ist, verwendbar.
  • In einer anderen Ausführungsform ist diese Erfindung eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I), die einen Anstieg der Osteocalcin-Freisetzung bewirkt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Knochenbildung. Gesteigerte Knochenbildung ist ein deutlicher Vorteil bei Erkrankungszuständen, bei denen ein Mangel an mineralisierter Knochenmasse vorliegt oder Knochenumbildung erwünscht ist, wie der Heilung von Knochenbrüchen und Vorbeugung von Knochenbrüchen. Krankheiten und Stoffwechselstörungen, die zu Verlust von Knochenstruktur führen, würden auch von einer solchen Behandlung profitieren. Zum Beispiel könnten Nebenschilddrüsenüberfunktion, Paget-Krankheit, Hyperkalzämie durch Malignität, von Knochenmetastasen hervorgerufene osteolytische Läsionen, durch Immobilisierung oder Geschlechtshormon-Mangel bedingter Knochenverlust, Behçet-Krankheit, Knochenerweichung, Knochenhypertrophie und Marmorknochenkrankheit, vom Verabreichen einer erfindungsgemäßen Verbindung profitieren.
  • Zusätzlich wäre, da die erfindungsgemäße Verbindung Vitronectin-Rezeptoren auf mehreren unterschiedlichen Zelltypen hemmt, die Verbindung bei der Behandlung von entzündlichen Störungen, wie rheumatoider Arthritis und Psoriasis, und kardiovaskulären Krankheiten, wie Atherosklerose und Restenose, verwendbar. Die erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I) kann zur Behandlung oder Vorbeugung von anderen Krankheiten verwendbar sein, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, thromboembolischer Störungen, Asthma, Allergien, Schocklunge, Transplantat-Wirt-Erkrankung, Organtransplantatabstoßung, septischem Schock, Ekzem, Kontaktdermatitis, entzündlicher Darmerkrankung und anderer Autoimmunerkrankungen. Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch zur Wundheilung verwendbar sein.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung ist auch zur Behandlung, einschließlich Vorbeugung, von angiogenen Störungen verwendbar. Der Ausdruck angiogene Störungen, wie hier verwendet, beinhaltet Zustände, die mit anormaler Gefäßneubildung verbunden sind. Wo das Wachstum von neuen Blutgefäßen die Ursache für den pathologischen Befund im Zusammenhang mit einer Krankheit ist, oder dazu beiträgt, wird die Angiogenese-Hemmung die schädlichen Auswirkungen der Krankheit vermindern. Ein Beispiel für eine solche ins Auge gefasste Erkrankung ist diabetische Retinopathie. Wo das Wachstum von neuen Blutgefäßen erforderlich ist, um das Wachstum eines schädlichen Gewebes zu unterstützen, wird Angiogenese-Hemmung die Blutzufuhr zu dem Gewebe vermindern und dadurch zur Verminderung der Gewebemasse, basierend auf Erfordernissen der Blutzufuhr, beitragen. Beispiele beinhalten Wachstum von Tumoren, bei denen Gefäßneubildung ein ständiges Erfordernis ist, damit der Tumor wächst und für die Ansiedlung solider Tumormetastasen. Folglich hemmt die erfindungsgemäße Verbindung Angiogenese im Tumorgewebe, wodurch sie Tumormetastase und Tumorwachstum verhindert.
  • Folglich kann, gemäß der Verwendungen der vorliegenden Erfindung, die Angiogenese-Hemmung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung die Symptome der Krankheit bessern und kann, in manchen Fällen, die Krankheit heilen.
  • Ein anderes therapeutisches Ziel für die erfindungsgemäße Verbindung sind durch Gefäßneubildung gekennzeichnete Augenerkrankungen. Solche Augenerkrankungen beinhalten Gefäßneubildungs-Störungen der Hornhaut, wie Hornhauttransplantation, Herpes-Keratitis, Syphilis-Keratitis, Pterygium- und Pannusbildung bei Kontaktlinsenträgern. Zusätzliche Augenerkrankungen beinhalten auch altersbedingte Makuladegeneration, Verdacht auf okuläre Histoplasmose, Frühgeborenenretinopathie und neurovaskuläres Glaukom.
  • Diese Erfindung stellt ferner eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I) in stufenweiser Verabreichung oder physikalischer Kombination mit einem Antineoplastikum, wie Topotecan und Cisplatin, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Tumorwachstum bereit.
  • Die neue erfindungsgemäße Verbindung ist (S)-10,11-Dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die (S)-Konfiguration der Formel (I)-Verbindung bevorzugt.
  • Auch eingeschlossen in diese Erfindung sind Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindung. Als Prodrugs werden alle kovalent gebundenen Träger betrachtet, die den aktiven Stamm-Arzneistoff gemäß Formel (I) in vivo freisetzen. Folglich sind in einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung neue Prodrugs, die auch Zwischenstufen bei der Synthese der Formel (I)-Verbindung sind, der Formel (II):
    Figure 00060001
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  • Bei Peptiden und in der Chemie gebräuchliche Abkürzungen und Symbole werden hier verwendet, um die erfindungsgemäße Verbindung zu beschreiben. Im Allgemeinen folgen die Aminosäure-Abkürzungen der „IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature", wie in Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984) beschrieben.
  • C1-6-Alkylrest, wie hier angewendet, bedeutet einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und beinhaltet eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, t-Butyl-, Pentyl-, n-Pentyl, Isopentyl-, Neopentyl- und Hexylgruppe und die einfachen aliphatischen Isomere davon.
  • Jeder C1-6-Alkylrest kann gegebenenfalls mit dem Rest RX substituiert sein, der an jedem Kohlenstoffatom sein kann, das zu einer stabilen Struktur führt und mit herkömmlichen Syntheseverfahren erhältlich ist. Geeignete Reste für RX sind die Reste C1-4-Alkyl-, OR'', SR'', C1-4-Alkylsulfonyl-, C1-4-Alkylsulfoxyl-, -CN, -N(R'')2, -CH2N(R'')2, -NO2, -CF3, -CO2R'', -CON(R'')2, -COR'', -NR''C(O)R'', F, Cl, Br, I oder der Rest CF3S(O)r-, wobei r 0,1 oder 2 ist und R'' H oder einen C1 6-Alkylrest bedeutet.
  • Bestimmte Reste werden hier abgekürzt. t-Bu bezeichnet den tertiären Butyl-Rest, Boc bezeichnet den t-Butyloxycarbonyl-Rest, Fmoc bezeichnet den Fluorenylmethoxycarbonyl-Rest, Ph bezeichnet den Phenyl-Rest, Cbz bezeichnet den Benzyloxycarbonyl-Rest, Bn bezeichnet den Benzyl-Rest, Me bezeichnet eine Methylgruppe, Et bezeichnet eine Ethylgruppe, Ac bezeichnet eine Acetylgruppe, Alk bezeichnet einen C1-4-Alkylrest, Nph bezeichnet einen 1- oder 2-Naphthylrest und cHex bezeichnet einen Cyclohexylrest. Tet bezeichnet einen 5-Tetrazolylrest.
  • Bestimmte Reagenzien werden hier abgekürzt. DCC bezeichnet Dicyclohexylcarbodiimid, DMAP bezeichnet Dimethylaminopyridin, DIEA bezeichnet Diisopropylethylamin, EDC bezeichnet 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid. HOBt bezeichnet 1-Hydroxybenzotriazol, THF bezeichnet Tetrahydrofuran, DEAD bezeichnet Diethylazodicarboxylat, PPh3 bezeichnet Triphenylphosphin, DIAD bezeichnet Diisopropylazodicarboxylat, DME bezeichnet Dimethoxyethan, DMF bezeichnet Dimethylformamid, NBS bezeichnet N-Bromsuccinimid, Pd/C bezeichnet einen Palladium-auf-Kohle-Katalysator, PPA bezeichnet Polyphosphorsäure, DPPA bezeichnet Diphenylphosphorylazid, BOP bezeichnet Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat, HF bezeichnet Flusssäure, TEA bezeichnet Triethylamin, TFA bezeichnet Trifluoressigsäure, PCC bezeichnet Pyridiniumchlorchromat.
  • Die Verbindung der Formel (I) kann nach den in Bondinell et al., PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 97/01540 (Internationale Anmeldenummer PCT/L1S96/11108), veröffentlicht am 16. Januar 1997, beschriebenen Verfahren synthetisiert werden.
  • Folglich ist eine andere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I), wobei das Verfahren Umsetzen einer Verbindung der Formel (III):
    Figure 00070001
    mit 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethanol in einer Reaktion, die durch den zwischen Diisopropylazodicarboxylat und Triphenylphosphin gebildeten Komplex vermittelt wird, gefolgt von Esterhydrolyse unter Verwendung einer wässrigen Base, umfasst.
  • Zusätzlich wird die Verbindung der Formel (I) mit Verfahren synthetisiert, analog zu denjenigen in den nachstehend ausführlich beschriebenen Schemata. Schema I
    Figure 00080001
    a) 10% Pd/C, HOAc; b) SOCl2, Toluol; c) AlCl3, CH2Cl2
  • Schema I beschreibt ausführlich die Herstellung einer bei der Herstellung einer Verbindung mit Formel (I) verwendbaren Zwischenstufe. Schema II
    Figure 00080002
    a) LiN(TMS)2, Ethylbromacetat; b) Jones-Reagenz, OsO4; c) H2, 10% Pd/C, HOAC; d) C2O2Cl2, DMF; e) AlCl3, CH2Cl2, RT; f) H2, 10% Pd/C, HOAC
  • Auch Schema II beschreibt ausführlich die Herstellung einer bei der Herstellung einer Verbindung mit der Formel (I) verwendbaren Zwischenstufe Schema III
    Figure 00090001
    (a) EtOAc/LiHMDS, THF; (b) H2, 10% Pd/C, konz. HCl, AcOH; (c) EtSH, AlCl3, CH2Cl2; (d) 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethanol, Diisopropylazodicarboxylat, (Ph)3P; (e) 1,0 N LiOH, EtOH; HCl.
  • Schema III beschreibt ausführlich die Synthese einer Verbindung der Formel (I). Umsetzung von III-1 (das eine Schema I-3-Verbindung ist) in einer Aldol-artigen Reaktion mit dem Enolat von Ethylacetat, das aus Ethylacetat durch Einwirkenlassen einer passenden Amid-Base, zum Beispiel Lithiumdiisopropylamid (LDA) oder Lithium-bis(trimethylsilyl)amid (LiHMDS), erzeugt werden kann, ergibt III-2. Häufig ist THF das Lösungsmittel der Wahl für eine Aldol-Reaktion, obwohl THF oft in Gegenwart verschiedener Zusätze, zum Beispiel HMPA oder TMEDA, verwendet wird. Reduktion von III-2, um III-3 (das eine Schema II-6-Verbindung ist) zu ergeben, kann durch Hydrogenolyse über einem passenden Katalysator, beispielsweise metallisches Palladium auf aktivierter Kohle (Pd/C), in einem passenden Lösungsmittel, wie Essigsäure, in Gegenwart einer Mineralsäure wie HCl erreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann diese Reduktion durch Behandlung von III-2 mit Triethylsilan in Gegenwart von Bortrifluorid-Etherat nach dem allgemeinen Verfahren von Orfanopoulos und Smonou (Synth. Commun. 1988, 833) erreicht werden. Entfernung des Methylethers von III-3, um III-4 zu ergeben, kann mit BBr3 in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise CH2Cl2, erreicht werden oder durch Umsetzung mit Thioethanol und AlCl3 in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise CH2Cl2. Andere verwendbare Verfahren zur Entfernung eines Methylethers werden in Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis" (veröffentlicht von John Wiley and Sons) beschrieben. Verbindung 4 von Schema 3 (III-4) wird mit 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethanol umgesetzt, was III-5 gibt. Die Umsetzung wird durch den zwischen Diisopropylazodicarboxylat und Triphenylphosphin gebildeten Komplex vermittelt und wird in einem aprotischen Lösungsmittel, zum Beispiel THF, CH2Cl2 oder DMF, durchgeführt. Der Ethylester von III-5 wird unter Verwendung einer wässrigen Base, beispielsweise LiOH in wässrigem THF oder NaOH in wässrigem Methanol oder Ethanol, hydrolisiert und das intermediäre Carboxylat-Salz wird mit einer geeigneten Säure, zum Beispiel TFA oder HCl, angesäuert, was die Carbonsäure III-6 gibt. Alternativ kann das intermediäre Carboxylat-Salz isoliert werden, falls gewünscht, oder ein Carboxylat-Salz der freien Carbonsäure kann mit Fachleuten bekannten Verfahren hergestellt werden. Schema IV
    Figure 00110001
    (a) PhOH, Cu, K2CO3; (b) Schwefel, Morpholin; (c) KOH, H2O, i-PrOH; (d) SOCl2, Benzol; (e) AlCl3, CH2Cl2; (f) EtOAc, LiN(TMS)2, TMEDA, THF; (g) Et3SiH, BF3·OEt2, CH2Cl2; (h) H2, Pd/C, EtOH; (i) BBr3, CH2Cl2.
  • Im Handel erhältliches 2-Fluor-4-methoxyacetophenon (IV-1) reagiert mit einem Alkohol, beispielsweise Phenol, in Gegenwart von metallischem Kupfer und einer geeigneten Base, zum Beispiel K2CO3, was den Diarylether IV-2 gibt. Auf Behandlung mit Schwefel und einem passenden primären oder sekundären Amin, vorzugsweise Morpholin, gemäß dem allgemeinen Verfahren von Harris (J. Med. Chem. 1982, 25, 855) hin, wird IV-2 in einer klassischen Willgerodt-Kindler-Reaktion in IV-3 umgewandelt. Das so erhaltene Thioamid wird durch Umsetzung mit einem Alkalimetallhydroxid, geeigneterweise KOH, in einem wässrigalkoholischen Lösungsmittel, wie wässrigem McOH, EtOH oder i-PrOH, zu der entsprechenden Carbonsäure IV-4 hydrolisiert. Carbonsäure IV-4 wird durch Umsetzung mit entweder SOCl2 oder Oxalylchlorid gemäß Fachleuten bekannten Bedingungen in das entsprechende Säurechlorid umgewandelt. Behandlung dieses Säurechlorids mit einem passenden Friedel-Crafts-Katalysator, wie AlCl3 oder SnCl4, in einem inerten Lösungsmittel, wie CH2Cl2 oder CS2, liefert das cyclische Keton IV-5. In einer anderen Ausführungsform kann die Säure IV-4 unter sauren Bedingungen direkt in das Keton IV-5 umgewandelt werden, beispielsweise mit Polyphosphorsäure. Umsetzung von IV-5 in einer Aldol-artigen Reaktion mit dem Enolat von Ethylacetat, das aus Ethylacetat durch Einwirkenlassen einer passenden Amid-Base, zum Beispiel Lithiumdiisopropylamid (LDA) oder Lithium-bis(trimethylsilyl)amid (LiHMDS), erzeugt werden kann, ergibt IV-6. Häufig ist THF das Lösungsmittel der Wahl für eine Aldol-Reaktion, obwohl THF oft in Gegenwart verschiedener Zusätze, zum Beispiel HMPA oder TMEDA, verwendet wird. Reduktion von IV-6, um IV-7 zu ergeben, kann durch Behandlung von IV-6 mit Triethylsilan in Gegenwart von Bortrifluorid-Etherat nach dem allgemeinen Verfahren von Orphanopoulos und Smonu (Synth. Commun. 1988, 833) erreicht werden. Jedwede olefinischen Nebenprodukte, die sich aus der Eliminierung des Alkohols ergeben, werden durch Hydrierung über einem passenden Katalysator, beispielsweise metallischem Palladium auf aktivierter Kohle (Pd/C), in einem passenden Lösungsmittel, wie McOH oder EtOH, reduziert. In einer anderen Ausführungsform kann die Reduktion von IV-6, um IV-7 zu ergeben, durch Hydrogenolyse in Gegenwart einer Mineralsäure wie HCl erreicht werden. Typischerweise wird diese Umsetzung durch Pd/C katalysiert und wird optimalerweise in Essigsäure durchgeführt. Entfernung des Methylethers von IV-7, um IV-8 zu ergeben, kann mit BBr3 in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise CH2Cl2, erreicht werden oder durch Umsetzung mit Thioethanol und AlCl3 in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise CH2Cl2. Andere verwendbare Verfahren zur Entfernung eines Methylethers werden in Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis" (veröffentlicht von John Wiley and Sons) beschrieben. IV-8 wird anschließend, dem in Schema III umrissenen Verfahren folgend, in eine Verbindung der Formel (I) umgewandelt.
  • Säureadditionssalze der Verbindung werden auf übliche Weise in einem geeigneten Lösungsmittel aus der Stamm-Verbindung und einem Überschuss einer Säure, wie Salz-, Bromwasserstoff-, Fluss-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Trifluoressig-, Malein-, Bernstein- oder Methansulfonsäure, hergestellt. Bestimmte Verbindungen bilden innere Salze oder Zwitterionen, die verträglich sein können. Kationensalze werden durch Behandeln der Stamm-Verbindung mit einem Überschuss eines alkalischen Reagenz, wie einem Hydroxid, Carbonat oder Alkoxid, das das passende Kation enthält, hergestellt oder mit einem passenden organischen Amin. Kationen wie Li+, Na+, K+, Ca++, Mg++ und NH4 + sind spezifische Beispiele für in pharmazeutisch verträglichen Salzen vorhandene Kationen.
  • Diese Erfindung stellt auch ein Arzneimittel bereit, das eine Verbindung gemäß Formel (I) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Demgemäß kann die Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments verwendet werden. Arzneimittel aus der Verbindung der Formel (I), hergestellt wie hier vorstehend beschrieben, können als Lösungen oder lyophilisierte Pulver zur parenteralen Verabreichung formuliert werden. Pulver können durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder anderen pharmazeutisch verträglichen Trägers vor Gebrauch rekonstituiert werden. Die flüssige Formulierung kann eine gepufferte, isotonische, wässrige Lösung sein. Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel sind normale isotonische Kochsalzlösung, normale 5%ige Glucoselösung in Wasser oder gepufferte Natrium- oder Ammoniumacetat-Lösung. Eine solche Formulierung ist besonders zur parenteralen Verabreichung geeignet, kann aber auch zur oralen Anwendung oder, enthalten in einem Dosieraerosol oder Vernebler, zur Insufflation verwendet werden. Es kann wünschenswert sein, Exzipienten wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose, Gummi arabicum, Polyethylenglykol, Mannit, Natriumchlorid oder Natriumcitrat zuzugeben.
  • In einer anderen Ausführungsform können diese Verbindungen verkapselt, tablettiert oder in einer Emulsion oder einem Sirup zur oralen Anwendung zubereitet werden. Pharmazeutisch verträgliche feste oder flüssige Träger können zugegeben werden, um die Zusammensetzung zu verbessern oder zu stabilisieren, oder um die Herstellung der Zusammensetzung zu erleichtern. Feste Träger beinhalten Stärke, Lactose, Calciumsulfat-Dihydrat, Terra alba, Magnesiumstearat oder Stearinsäure, Talkum, Pektin, Gummi arabicum, Agar oder Gelatine. Flüssige Träger beinhalten Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Kochsalzlösung und Wasser. Der Träger kann auch eine Substanz zur verlängerten Freisetzung beinhalten, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, alleine oder mit einem Wachs. Die Menge des festen Trägers variiert, wird aber vorzugsweise zwischen etwa 20 mg bis etwa 1 g je Dosiereinheit betragen. Die pharmazeutischen Präparate werden, den herkömmlichen Verfahren der Pharmazie folgend, hergestellt, wobei für Tabletten, sofern notwendig, Mahlen, Mischen, Granulieren und Tablettieren einbezogen werden oder Mahlen, Mischen und Befüllen für Hartgelatinekapseln. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird das Präparat als Sirup, Elixier, Emulsion oder einer wässrigen oder nicht-wässrigen Suspension vorliegen. Eine solche flüssige Formulierung kann direkt p.o. verabreicht oder in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden.
  • Für die rektale Anwendung kann die erfindungsgemäße Verbindung auch mit Exzipienten wie Kakaobutter, Glycerin, Gelatine oder Polyethylenglykolen kombiniert und als Zäpfchen gegossen werden.
  • Die hier beschriebenen Verbindungen sind Antagonisten des Vitronectin-Rezeptors und sind zur Behandlung von Krankheiten verwendbar, bei denen das zugrunde liegende Krankheitsgeschehen einem Liganden oder einer Zelle zugeschrieben werden kann, der/die mit dem Vitronectin-Rezeptor interagiert. Zum Beispiel sind diese Verbindungen zur Behandlung von Krankheiten verwendbar, bei denen Verlust der Knochenmatrix einen pathologischen Befund schafft. Folglich sind die gegenwärtigen Verbindungen zur Behandlung von Osteoporose, Nebenschilddrüsenüberfunktion, Paget-Krankheit, Hyperkalzämie durch Malignität, von Knochenmetastasen hervorgerufenen osteolytischen Läsionen, durch Immobilisierung oder Geschlechtshormon-Mangel bedingtem Knochenverlust verwendbar. Man glaubt auch, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen einen Nutzen als Antitumor-, Anti-Angiogenese-, antientzündliche und Anti-Metastasen-Mittel aufweisen und bei der Behandlung von Atherosklerose und Restenose verwendbar sind.
  • Die Verbindung wird dem Patienten entweder peroral oder parenteral derart verabreicht, dass die Arzneistoffkonzentration ausreicht, Knochenresorption, oder eine andere solche Indikation, zu hemmen. Das die Verbindung enthaltende Arzneimittel wird mit einer oralen Dosis von zwischen etwa 0,1 bis etwa 50 mg/kg im Einklang mit dem Zustand des Patienten verabreicht. Vorzugsweise betrüge die orale Dosis etwa 0,5 bis etwa 20 mg/kg. Für die Akuttherapie wird parenterale Verabreichung bevorzugt. Eine intravenöse Infusion des Peptids in 5%iger Glucoselösung in Wasser oder normaler Kochsalzlösung oder einer ähnlichen Formulierung mit geeigneten Exzipienten ist am wirksamsten, obwohl eine intramuskuläre Bolusinjektion auch verwendbar ist. Typischerweise wird die parenterale Dosis etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg betragen, vorzugsweise zwischen 0,1 und 20 mg/kg. Die Verbindungen werden ein bis vier Mal täglich in einer Höhe verabreicht, die eine Gesamttagesdosis von etwa 0,4 bis etwa 400 mg/kg/Tag ergibt. Die genaue Höhe und das Verfahren mit der die Verbindungen verabreicht werden, wird ohne weiteres von jemand in dem Fachgebiet routinemäßig Ausgebildeten durch Vergleichen des Blutspiegels des Mittels mit der für eine therapeutische Wirkung erforderlichen Konzentration bestimmt.
  • Diese Erfindung stellt ferner eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I) in stufenweiser Verabreichung oder physikalischer Kombination mit anderen Knochenresorptionshemmern, wie Bisphosphonaten (d.h. Alendronat), Hormonersatztherapie, Anti-Östrogenen oder Calcitonin, zur Herstellung eines Medikaments, zur Behandlung von Osteoporose, bereit. Außerdem stellt diese Erfindung eine Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung und eines Anabolikums, wie dem knochenbildenden Protein (bone morphogenic protein) Iproflavon, zur Herstellung eines Medikaments, verwendbar zur Vorbeugung von Knochenverlust und/oder um die Knochenmasse zu erhöhen, bereit.
  • Zusätzlich stellt diese Erfindung eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I) in stufenweiser Verabreichung oder physikalischer Kombination mit einem Antineoplastikum zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Tumorwachstum bereit. Verbindungen der Camptothecin-Analoga-Klasse, wie Topotecan, Irinotecan und 9-Aminocamptothecin und der koordinativen Platinkomplexe, wie Cisplatin, Ormaplatin und Tetraplatin, sind bekannte Gruppen von Antineoplastika. Verbindungen der Camptothecin-Analoga-Klasse sind in den U.S.-Patenten Nr. 5,004,758, 4,604,463, 4,473,692, 4,545,880, 4,342,776, 4,513,138, 4,399,276, den EP-Patentanmeldungen, Veröffentlichungs-Nrn. 0 418 099 und 0 088 642, in Wani et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 2358, Wani et al., J. Med. Chem., 1980, 23, 554, Wani et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1774 und Nitta et al., Proc. 14th International Congr. Chemotherapy., 1985, Anticancer Section 1, 28 beschrieben. Der Platin-Koordinationskomplex Cisplatin ist unter dem Namen Platinol® von der Bristol Myers-Squibb Aktiengesellschaft erhältlich. Verwendbare Formulierungen für Cisplatin sind in den U.S.-Patenten Nr. 5,562,925 und 4,310,515 beschrieben.
  • Bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Tumorwachstum, welches stufenweises Verabreichen, oder die physikalische Kombination, einer Verbindung der Formel (I) und eines Antineoplastikums umfasst, kann die koordinative Platin-Verbindung, beispielsweise Cisplatin, unter Verwendung langsamer, intravenöser Infusion verabreicht werden. Der bevorzugte Träger ist eine Glucose/Kochsalz-Lösung, die Mannit enthält. Das Dosierungsschema der Platin-Koordinationskomplex-Verbindung kann auf von etwa 1 bis etwa 500 mg je Quadratmeter (mg/m2) Körperoberfläche je Behandlungsverlauf basieren. Infusionen der Platin-Koordinationskomplex-Verbindung können ein- bis zweimal wöchentlich gegeben werden und die wöchentlichen Behandlungen können mehrmals wiederholt werden. Wenn eine Verbindung der Camptothecin-Analoga-Klasse bei einer parenteralen Verabreichung verwendet wird, umfasst der generell eingesetzte Therapiezyklus von etwa 0,1 bis etwa 300,0 mg/m2 Körperoberfläche je Tag für etwa fünf aufeinander folgende Tage. Am meisten bevorzugt umfasst der für Topotecan eingesetzte Therapieverlauf von etwa 1,0 bis etwa 2,0 mg/m2 Körperoberfläche je Tag für etwa fünf aufeinander folgende Tage. Vorzugsweise wird der Therapieverlauf mindestens einmal in einem etwa sieben- bis etwa achtundzwanzigtägigen Intervall wiederholt.
  • Das Arzneimittel kann mit sowohl der Verbindung der Formel (I) als auch dem Antineoplastikum im gleichen Behälter formuliert werden, aber Formulierung in unterschiedlichen Behältern wird bevorzugt. Wenn beide Mittel als Lösung bereitgestellt werden, können sie in einem Infusions-/Injektionssystem zur gleichzeitigen Verabreichung enthalten sein oder in einer „Tandem-Anordnung".
  • Zur bequemen Verabreichung der Verbindung der Formel (I) und des Antineoplastikums zur gleichen oder zu unterschiedlichen Zeiten, wird ein Kit hergestellt, umfassend in einem Einzelbehälter, wie einer Kiste, Karton oder anderen Behälter, einzelne Flaschen, Beutel, Fläschchen oder andere Behälter, die jeweils eine wirksame Menge der Verbindung der Formel (I) zur parenteralen Verabreichung, wie vorstehend beschrieben, und eine wirksame Menge des Antineoplastikums zur parenteralen Verabreichung, wie vorstehend beschrieben, enthalten. Ein solches Kit kann beispielsweise beide Pharmazeutika in getrennten Behältern oder dem gleichen Behälter, gegebenenfalls als gefriergetrocknete Pfropfen, und Behälter mit Lösungen zur Rekonstitution umfassen. Eine Abwandlung davon ist, die Lösung zur Rekonstitution und den gefriergetrockneten Pfropfen in zwei Kammern eines Einzelbehälters einzuschließen, deren Mischung vor Gebrauch bewirkt werden kann. Bei einer solchen Anordnung können das Antineoplastikum und die erfindungsgemäße Verbindung getrennt verpackt, wie in zwei Behältern, oder zusammen als ein Pulver gefriergetrocknet und in einem Einzelbehälter bereitgestellt werden.
  • Wenn beide Mittel als Lösung bereitgestellt werden, können sie in einem Infusions-/Injektionssystem zur gleichzeitigen Verabreichung enthalten sein oder in einer „Tandem-Anordnung". Beispielsweise kann die Verbindung der Formel (I) in einer i.v.-injizierbaren Form vorliegen oder in einem Infusionsbeutel, über Schlauchleitung der Reihe nach mit dem Antineoplastikum in einem zweiten Infusionsbeutel verbunden. Wenn ein solches System verwendet wird, kann ein Patient eine initiale bolus-artige Injektion oder Infusion der Verbindung der Formel (I) erhalten, gefolgt von einer Infusion des Antineoplastikums.
  • Die Verbindung kann in einem von mehreren biologischen Tests getestet werden, um die Konzentration der Verbindung zu bestimmen, die für eine bestimmte pharmakologische Wirkung erforderlich ist.
  • Hemmung der Vitronectin-Bindung
  • Bindung von [3H]-SK&F-107260 an αvβ3 in der festen Phase: αvβ3 aus humaner Plazenta oder humanen Blutplättchen (0,1-0,3 mg/ml) in Puffer T (enthaltend 2 mM CaCl2 und 1% Octylglucosid) wurde mit Puffer T, enthaltend 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (Puffer A) und 0,05% NaN3, verdünnt und dann sofort in ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning, New York, NY) mit 0,1 ml je Vertiefung gegeben. 0,1-0,2 μg αvβ3 wurden je Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Vertiefungen einmal mit Puffer A gewaschen und wurden mit 0,1 ml 3,5% Rinderserumalbumin in dem gleichen Puffer für 1 Std bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und zweimal mit 0,2 ml Puffer A gewaschen.
  • Verbindungen wurden in 100%igem DMSO zu einer 2 mM Vorratslösung gelöst, die mit Bindungs-Puffer (15 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2) auf eine Endkonzentration der Verbindung von 100 μM verdünnt wurde. Diese Lösung wird dann auf die erforderliche Endkonzentration der Verbindung verdünnt. Verschiedene Konzentrationen unmarkierter Antagonisten (0,001 – 100 μM) wurden in dreifacher Ausfertigung zu den Vertiefungen zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5,0 nM [3H]-SK&F-107260 (65 – 86 Ci/mMol).
  • Die Platten wurden für 1 Std bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und einmal mit 0,2 ml eiskaltem Puffer A Vertiefung für Vertiefung gewaschen. Die Rezeptoren wurden mit 0,1 ml 1% SDS solubilisiert und das gebundene [3H]-SK&F-107260 wurde durch Flüssigkeits-Szintillationszählung mit der Zugabe von 3 ml „Ready Safe" in einem Beckmann LS Flüssigkeits-Szintillationszähler mit 40%iger Zählausbeute bestimmt. Unspezifische [3H]-SK&F-107260-Bindung wurde in Gegenwart von 2 μM SK&F-107260 bestimmt und betrug beständig weniger als 1 % des Gesamt-Radioliganden-Einsatzes. Die IC50 (Konzentration des Antagonisten, die 50% der Bindung von [3H]-SK&F-107260 hemmt) wurde mit einer nichtlinearen Kurvenanpassungs-Routine, die von dem LUNDON-2-Programm abgewandelt wurde, nach der Kleinste-Quadrate-Methode bestimmt. Die Ki (Dissoziationskonstante des Antagonisten) wurde gemäß der Gleichung: Ki = IC50/(1 + L/Kd) berechnet, wobei L und Kd die Konzentration beziehungsweise die Dissoziationskonstante von [3H]-SK&F-107260 waren.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung hemmt Vitronectin-Bindung an [3H]-SK&F-107260 bei einer Ki von etwa 1,7 nanomolar.
  • Erfindungsgemäße Verbindungen werden auch auf in-vitro- und in-vivo-Knochenresorption getestet, in Tests, die auf dem Gebiet der Evaluation der Hemmung der Knochenbildung Standard sind, wie dem in EP 528 587 offenbarten Grubenbildungs(pit-formation)-Test, der auch unter Verwendung von humanen Osteoklasten anstelle von Ratten-Osteoklasten ausgeführt werden kann, und dem Modell mit Ratten nach Ovarektomie, beschrieben von Wronski et al., Cells and Materials 1991, Erg. 1, 69-74.
  • Migrations-Test glatter Gefäßmuskelzellen
  • Ratten- oder humane glatte Muskelzellen der Aorta wurden verwendet. Die Zellmigration wurde in einer Transwell Zellkulturkammer unter Verwendung einer Polycarbonat-Membran mit 8 μm-Poren (Costar) überwacht. Die untere Oberfläche des Filters wurde mit Vitronectin beschichtet. Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 0,2% Rinderserumalbumin, mit einer Konzentration von 2,5-5,0 × 106 Zellen/ml suspendiert und wurden mit Testverbindung bei verschiedenen Konzentrationen für 20 Min. bei 20°C vorbehandelt. Das Lösungsmittel alleine wurde als Kontrolle verwendet. 0,2 ml der Zellsuspension werden in das obere Kompartiment der Kammer gefüllt. Das untere Kompartiment enthielt 0,6 ml DMEM, ergänzt mit 0,2% Rinderserumalbumin. Inkubation wurde bei 37°C in einer 95% Luft/5% CO2-Atmosphäre für 24 Std durchgeführt. Nach Inkubation wurden die nicht gewanderten Zellen auf der oberen Oberfläche des Filters durch vorsichtiges Abschaben entfernt. Der Filter wurde dann in Methanol fixiert und mit 10% Giemsa-Färbung gefärbt. Migration wurde entweder durch a) Zählen der Anzahl der Zellen, die an die untere Oberfläche des Filters gewandert waren, gemessen oder durch b) Extrahieren der gefärbten Zellen mit 10%iger Essigsäure, gefolgt von Bestimmen der Extinktion bei 600 nm.
  • Modell mit Ratten nach Thyroparathyroidektomie
  • Jede experimentelle Gruppe besteht aus 5-6 erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley-Ratten (250-400g Körpergewicht). Die Ratten werden 7 Tage vor Verwendung thyroparathyroidektomiert (vom Verkäufer, Taconic Farms). Alle Ratten erhalten alle 3 Tage eine Ersatzdosis Thyroxin. Nach Erhalt der Ratten werden, unmittelbar nach Entnahme durch Schwanzvenenpunktion in heparinisierte Röhrchen, zirkulierende Calciumionenspiegel im Vollblut gemessen. Ratten werden eingeschlossen, falls der Ca-Ionenspiegel < 1,2 mM/l beträgt (gemessen mit einem Ciba-Corning Calcium-pH-Wert-Analysengerät, Modell 634). Bei jeder Ratte wird ein venöser und arterieller Verweilkatheter zur Verabreichung der Testsubstanz beziehungsweise zur Blutprobenentnahme gelegt. Die Ratten werden dann auf eine Ernährung mit calciumfreiem Fressen und deionisiertem Wasser gesetzt. Ausgangs-Ca-Spiegel werden gemessen und jeder Ratte wird entweder Kontroll-Vehikel oder humanes Parathormon-1-34-Peptid (hPTH1-34, Dosis 1,25 μg/kg/Std in Kochsalzlösung/0,1% Rinderserumalbumin, Bachem, Ca) oder ein Gemisch aus hPTH1-34 und Testsubstanz durch kontinuierliche intravenöse Infusion über den Venenkatheter unter Verwendung einer externen Spritzenpumpe verabreicht. Die calcämische Reaktion jeder Ratte wird während des Infusionszeitraums von 6-8 Stunden in zweistündigen Intervallen gemessen.
  • Resorptions- und Adhäsions-Tests mit humanen Osteoklasten
  • Tests zur grubenbildenden Resorption und zur Adhäsion sind unter Verwendung normaler, humaner, aus Osteoklastom-Gewebe stammenden Osteoklasten entwickelt und standardisiert worden. Test 1 wurde zur Messung der Volumina der von Osteoklasten gebildeten Gruben durch konfokale Laserscanningmikroskopie entwickelt. Test 2 wurde als ein Screeningverfahren mit höherem Durchsatz entwickelt, in dem Kollagenbruchstücke (freigesetzt während der Resorption) durch kompetitven ELISA gemessen werden.
  • Test 1 (unter Verwendung konfokaler Laserscanningmikroskopie)
    • • Aliquote von aus einem humanen Osteoklastom gewonnenen Zellsuspensionen werden aus flüssigem Stickstoff geholt, in dem sie aufbewahrt worden waren, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640 Medium durch Zentrifugation (1000 U/Min, 5 Min. bei 4°C) gewaschen.
    • • Das Medium wird abgesaugt und durch murine anti-HLA-DR-Antikörper ersetzt, dann mit RPMI-1640 Medium 1:3 verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert und häufig gemischt.
    • • Die Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, gefolgt von Zentrifugation (1000 U/Min, 5 Min. bei 4°C) und die Zellen werden dann in ein steriles 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl der mononukleären Zellen wird in einer verbesserten Neubauer Zählkammer genau gezählt.
    • • Ausreichend magnetische Kügelchen (5/mononukleärer Zelle), überzogen mit Ziegen-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck, NY), werden aus der Vorratsflasche geholt und in 5 ml frisches Medium gegeben (dies wäscht das toxische Azid-Konservierungsmittel heraus). Das Medium wird durch Immobilisieren der Kügelchen an einem Magneten entfernt und durch frisches Medium ersetzt.
    • • Die Kügelchen werden mit den Zellen gemischt und die Suspension für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig gemischt.
    • • Die mit Kügelchen überzogenen Zellen werden an einem Magneten immobilisiert und die verbleibenden Zellen (osteoklastenreiche Fraktion) werden in ein steriles 50ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
    • • Frisches Medium wird zu den mit Kügelchen überzogenen Zellen gegeben, um jegliche zurückgehaltenen Osteoklasten zu verdrängen. Dieser Waschvorgang wird 10mal wiederholt. Die kügelchen-überzogenen Zellen werden verworfen.
    • • Die lebensfähigen Osteoklasten werden in einer Zählkammer ausgezählt, unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat, um lebende Zellen zu markieren. Eine großkalibrige Einmal-Plastikpasteurpipette wird verwendet, um die Probe in die Kammer zu geben.
    • • Die Osteoklasten werden durch Zentrifugation pelletiert und die Dichte auf die passende Anzahl in EMEM-Medium (die Osteoklastenanzahl variiert von Tumor zu Tumor), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 1,7g/l Natriumbicarbonat, eingestellt.
    • • 3 ml-Aliquote der Zellsuspension (je Verbindungs-Behandlung) werden in 15ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert.
    • • Zu jedem Röhrchen werden 3 ml der passenden Verbindungs-Behandlung gegeben (verdünnt auf 50μM in dem EMEM-Medium). Ebenso eingeschlossen werden passende Vehikelkontrollen, eine Positivkontrolle (mariner, monoklonaler anti-Vitronectinrezeptor-Antikörper [87MEM1], verdünnt auf 100μg/ml) und eine Isotypenkontrolle (IgG2a, verdünnt auf 100μg/ml). Die Proben werden bei 37°C für 30 Min. inkubiert.
    • • 0,5 ml-Aliquote der Zellen werden auf sterile Zahnbeinscheiben in einer Platte mit 48 Vertiefungen aufgebracht und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Jede Behandlung wird jeweils vierfach getestet.
    • • Die Scheiben werden sechsmal mit frischem warmem PBS (10 ml/Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen) gewaschen und dann in frisches Medium, das die Verbindungs-Behandlungs- oder Kontrollproben enthält, eingebracht. Die Proben werden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert.
  • Verfahren mit tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP) (selektive Färbung für Zellen mit Osteoklasten-Abstammung)
    • • Die Knochenscheiben, die die anhaftenden Osteoklasten enthalten, werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 2%igem Glutaraldehyd (in 0,2M Natriumcacodylat) für 5 Min fixiert.
    • • Sie werden dann in Wasser gewaschen und für 4 Minuten in TRAP-Puffer bei 37°C inkubiert (0,5 mg/ml Naphthol-AS-BI-Phosphat, gelöst in N,N-Dimethylformamid und gemischt mit 0,25 M Citratpuffer (pH-Wert 4,5), enthaltend 10 mM Natriumtartrat).
    • • Nach Waschen in kaltem Wasser werden die Scheiben in kalten Acetatpuffer (0,1 M, pH-Wert 6,2), der 1 mg/ml Fast-Red-Garnet enthält, eingetaucht und bei 4°C für 4 Minuten inkubiert.
    • • Der überschüssige Puffer wird abgesaugt und die Scheiben nach Waschen in Wasser luftgetrocknet.
    • • Die TRAP-positiven Osteoklasten (ziegelroter/purpurfarbener Niederschlag) werden mit Hellfeld-Mikroskopie ausgezählt und werden dann mit Ultraschall von der Oberfläche des Zahnbeins entfernt.
    • • Die Volumina der Gruben werden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop der Marke Nikon/Lasertec ILM21 W bestimmt.
  • Test 2 (unter Verwendung einer ELISA-Ablesung)
  • Die humanen Osteoklasten werden für das Screening der Verbindungen angereichert und vorbereitet, wie in den ersten 9 Schritten von Test 1 beschrieben. Der Klarheit wegen werden diese Schritte hier nachstehend wiederholt.
    • • Aliquote von aus einem Osteoklastom gewonnenen Zellsuspensionen werden aus flüssigem Stickstoff geholt, in dem sie aufbewahrt worden waren, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640 Medium durch Zentrifugation (1000 U/Min, 5 Min. bei 4°C) gewaschen.
    • • Das Medium wird abgesaugt und durch murine anti-HLA-DR-Antikörper ersetzt, dann mit RPMI-1640 Medium 1:3 verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert und häufig gemischt.
    • • Die Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, gefolgt von Zentrifugation (1000 U/Min, 5 Min. bei 4°C) und die Zellen werden dann in ein steriles 15 ml- Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl der mononukleären Zellen wird in einer verbesserten Neubauer Zählkammer ausgezählt.
    • • Ausreichend magnetische Kügelchen (5/mononukleärer Zelle), überzogen mit Ziegen-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck, NY), werden aus der Vorratsflasche geholt und in 5 ml frisches Medium gegeben (dies wäscht das toxische Azid-Konservierungsmittel heraus). Das Medium wird durch Immobilisieren der Kügelchen an einem Magneten entfernt und durch frisches Medium ersetzt.
    • • Die Kügelchen werden mit den Zellen gemischt und die Suspension für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig gemischt.
    • • Die mit Kügelchen überzogenen Zellen werden an einem Magneten immobilisiert und die verbleibenden Zellen (osteoklastenreiche Fraktion) werden in ein steriles 50ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
    • • Frisches Medium wird zu den mit Kügelchen überzogenen Zellen gegeben, um jegliche zurückgehaltenen Osteoklasten zu verdrängen. Dieser Waschvorgang wird 10mal wiederholt. Die kügelchen-überzogenen Zellen werden verworfen.
    • • Die lebensfähigen Osteoklasten werden in einer Zählkammer ausgezählt, unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat, um lebende Zellen zu markieren. Eine großkalibrige Einmal-Plastikpasteurpipette wird verwendet, um die Probe in die Kammer zu geben.
    • • Die Osteoklasten werden durch Zentrifugation pelletiert und die Dichte auf die passende Anzahl in EMEM-Medium (die Osteoklastenanzahl variiert von Tumor zu Tumor), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 1,7g/l Natriumbicarbonat, eingestellt.
  • Im Gegensatz zu dem vorstehend in Test 1 beschriebenen Verfahren werden die Verbindung mit 4 Dosen getestet, um IC50-Werte zu erhalten, wie nachstehend in Umrissen dargelegt:
    • • Die Osteoklasten-Präparate werden für 30 Minuten bei 37°C mit Testverbindung (4 Dosen) oder Kontrollen vorinkubiert.
    • • Sie werden dann auf Rinder-Kortikalis-Scheiben in Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 48 Vertiefungen aufgebracht und werden für weitere 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
    • • Die Knochenscheiben werden sechsmal mit frischer, warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um nicht-haftende Zellen zu entfernen, und werden dann in Vertiefungen einer Platte mit 48 Vertiefungen, die frische Verbindung oder Kontrollen enthält, zurückgebracht.
    • • Die Gewebekulturplatte wird dann für 48 Stunden bei 37°C inkubiert.
    • • Die Überstände aus jeder Vertiefung werden in einzelne Röhrchen abgesaugt und werden in einem kompetitiven ELISA getestet, der das c-Telopeptid des Typ I-Kollagens, das während des Resorptionsprozesses freigesetzt wird, nachweist. Dies ist ein im Handel erhältlicher ELISA (Osteometer, Dänemark), der einen Kaninchen-Antikörper enthält, der spezifisch mit einer 8-Aminosäuren-Sequenz (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) reagiert, die in dem C-terminalen Telopeptid der al-Kette des Typ I-Kollagens vorhanden ist. Die Ergebnisse werden als %-Hemmung der Resorption, verglichen mit einer Vehikelkontrolle, ausgedrückt.
  • Adhäsions-Test mit humanen Osteoklasten
  • Die humanen Osteoklasten werden für das Screening der Verbindungen angereichert und vorbereitet, wie in den ersten 9 Schritten von Test 1 beschrieben. Der Klarheit wegen werden diese Schritte hier nachstehend wiederholt.
    • • Aliquote von aus einem Osteoklastom gewonnenen Zellsuspensionen werden aus flüssigem Stickstoff geholt, in dem sie aufbewahrt worden waren, schnell auf 37°C erwärmt und einmal in RPMI-1640 Medium durch Zentrifugation (1000 U/Min, 5 Min. bei 4°C) gewaschen.
    • • Das Medium wird abgesaugt und durch murine anti-HLA-DR-Antikörper ersetzt, dann mit RPMI-1640 Medium 1:3 verdünnt. Die Suspension wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert und häufig gemischt.
    • • Die Zellen werden zweimal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, gefolgt von Zentrifugation (1000 U/Min, 5 Min. bei 4°C) und die Zellen werden dann in ein steriles 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Anzahl der mononukleären Zellen wird in einer verbesserten Neubauer Zählkammer ausgezählt.
    • • Ausreichend magnetische Kügelchen (5/mononukleärer Zelle), überzogen mit Ziegen-anti-Maus-IgG (Dynal, Great Neck, NY), werden aus der Vorratsflasche geholt und in 5 ml frisches Medium gegeben (dies wäscht das toxische Azid-Konservierungsmittel heraus). Das Medium wird durch Immobilisieren der Kügelchen an einem Magneten entfernt und durch frisches Medium ersetzt.
    • • Die Kügelchen werden mit den Zellen gemischt und die Suspension für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wird häufig gemischt.
    • • Die mit Kügelchen überzogenen Zellen werden an einem Magneten immobilisiert und die verbleibenden Zellen (osteoklastenreiche Fraktion) werden in ein steriles 50ml-Zentrifugenröhrchen abdekantiert.
    • • Frisches Medium wird zu den mit Kügelchen überzogenen Zellen gegeben, um jegliche zurückgehaltenen Osteoklasten zu verdrängen. Dieser Waschvorgang wird 10-mal wiederholt. Die kügelchen-überzogenen Zellen werden verworfen.
    • • Die lebensfähigen Osteoklasten werden unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat, um lebende Zellen zu markieren, in einer Zählkammer ausgezählt. Eine großkalibrige Einmal-Plastikpasteurpipette wird verwendet, um die Probe in die Kammer zu geben.
    • • Die Osteoklasten werden durch Zentrifugation pelletiert und die Dichte auf die passende Anzahl in EMEM-Medium (die Osteoklastenanzahl variiert von Tumor zu Tumor), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 1,7g/l Natriumbicarbonat, eingestellt.
    • • Aus einem Osteoklastom gewonnene Osteoklasten werden mit Verbindung (4 Dosen) oder Kontrollen bei 37°C für 30 Minuten vorinkubiert.
    • • Die Zellen werden dann auf Osteopontin-beschichtete Objektträger (humanes oder Ratten-Osteopontin, 2,5μg/ml) aufgebracht und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
    • • Nicht-haftende Zellen werden durch kräftiges Waschen der Objektträger in phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt und die auf dem Objektträger verbleibenden Zellen werden in Aceton fixiert.
    • • Die Osteoklasten werden auf tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP), einen selektiven Marker für Zellen dieses Phänotyps (siehe Schritte 15-17), hin gefärbt und werden im Lichtmikroskop ausgezählt. Die Ergebnisse werden als %-Hemmung der Adhäsion, verglichen mit einer Vehikelkontrolle, ausgedrückt.
  • Zelladhäsions-Test Zellen und Zellkultur
  • Humane Embryo-Nierenzellen (HEK293-Zellen) wurden von ATCC (Katalog-Nr. CRL 1573) erhalten. Zellen wurden in „Earl's minimal essential medium" (EMEM)-Medium, das Earl-Salze, 10% fötales Rinderserum, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Steptomycin enthielt, gezüchtet.
  • Konstrukte und Transfektionen
  • Ein 3,2 kb EcoRI-KpnI-Fragment der αv-Untereinheit und ein 2,4 kb XbaI-XhoI-Fragment der β3-Untereinheit wurden durch stumpfendige Ligation in die EcoRI-EcoRV-Klonierungsstellen des pCDN-Vektors (Aiyar et al., 1994), der einen CMV-Promotor und einen durch G418 selektierbaren Marker enthält, inseriert. Für stabile Expression wurden 80 × 106 HEK 293-Zellen unter Verwendung eines „Gene-Pulser" elektrotransformiert mit αv+β3-Konstrukten (20 μg DNA jeder Untereinheit) (Hensley et al., 1994) und auf 100 mm-Platten (5 × 105 Zellen/Platte) ausplattiert. Nach 48 Std wurde das Wachstumsmedium mit 450 μg/ml Geneticin (G418-Sulfat, GIBCO-BRL, Bethesda, MD) ergänzt. Die Zellen wurden in Selektionsmedium gehalten, bis die Kolonien groß genug waren, um getestet zu werden.
  • Immunocytochemische Analyse transfizierter Zellen
  • Um zu bestimmen, ob die HEK 293-Transfektanten den Vitronectin-Rezeptor exprimierten, wurden die Zellen durch Zentrifugation auf Mikroskop-Glasobjektträgern immobilisiert, für 2 Min bei Raumtemperatur in Aceton fixiert und luftgetrocknet. Spezifische Reaktivität mit 23C6, einem für den αvβ3-Komplex spezifischen monoklonalen Antikörper, wurde unter Verwendung eines indirekten Standard-Immunofluoreszenz-Verfahrens gezeigt.
  • Zelladhäsions-Untersuchungen
  • Corning ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 0,1 ml humanem Vitronectin (0,2 μg/ml in RPMI-Medium) vorbeschichtet. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Platten einmal mit RPMI-Medium gewaschen und mit 3,5% BSA in RPMI-Medium für 1 Std bei Raumtemperatur blockiert. Transfizierte HEK 293-Zellen wurden in RPMI-Medium, ergänzt mit 20 mM Hepes, pH-Wert 7,4 und 0,1% BSA, mit einer Dichte von 0,5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. 0,1 ml Zellsuspension wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und für 1 Std bei 37°C in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener αvβ3-Antagonisten inkubiert. Nach Inkubation wurden 0,025 ml einer 10%igen Formaldehyd-Lösung, pH-Wert 7,4, zugegeben und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 10 Min fixiert. Die Platten wurden 3-mal mit 0,2 ml RPMI-Medium gewaschen und die anhaftenden Zellen wurden mit 0,1 ml einer 0,5%igen Toluidinblau-Lösung für 20 Min bei Raumtemperatur gefärbt. Überschüssige Farbe wurde durch ausgiebiges Waschen mit deionisiertem. Wasser entfernt. Das in die Zellen aufgenommene Toluidinblau wurde durch die Zugabe von 0,1 ml 50%igem Ethanol, der 50 mM HCl enthielt, eiuiert. Zelladhäsion wurde bei einer Extinktion von 600 nm mit einem Mikrotiterplattenleser (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA) quantitativ bestimmt:
  • Festphasen-αvβ5-Bindungs-Test:
  • Der αvβ5-Vitronectin-Rezeptor wurde aus humaner Plazenta gereinigt. Das Rezeptorpräparat wurde mit 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (Puffer A) verdünnt und wurde sofort zu ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen mit 0,1 ml je Vertiefung zugegeben. 0,1-0,2 μg αvβ3 wurden je Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Vertiefungen einmal mit Puffer A gewaschen und wurden mit 0,1 ml 3,5% Rinderserumalbumin in dem gleichen Puffer für 1 Std bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und zweimal mit 0,2 ml Puffer A gewaschen.
  • In einem kompetitiven [3H]-SK&F-107260-Test wurden verschiedene Konzentrationen unmarkierter Antagonisten (0,001-100 μM) zu den Vertiefungen zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5,0 nM [3H]-SK&F-107260. Die Platten wurden für 1 Std bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und einmal mit 0,2 ml eiskaltem Puffer A Vertiefung für Vertiefung gewaschen. Die Rezeptoren wurden mit 0,1 ml 1% SDS solubilisiert und das gebundene [3H]-SK&F-107260 wurde durch Flüssigkeits-Szintillationszählung mit der Zugabe von 3 ml „Ready Safe" in einem Beckmann LS 6800 Flüssigkeits-Szintillationszähler mit 40%iger Zählausbeute bestimmt. Unspezifische [3H]-SK&F-107260-Bindung wurde in Gegenwart von 2 μM SK&F-107260 bestimmt und betrug beständig weniger als 1 % des Gesamt-Radioliganden-Einsatzes. Die IC50 (Konzentration des Antagonisten, die 50% der Bindung von [3H]-SK&F-107260 hemmt) wurde mit einer nichtlinearen Kurvenanpassungs-Routine, die von dem LUNDON-2-Programm abgewandelt wurde, nach der Kleinste-Quadrate-Methode bestimmt. Die Ki (Dissoziationskonstante des Antagonisten) wurde gemäß der Cheng-und-Prusoff-Gleichung: Ki = IC50/(1 + L/Kd) berechnet, wobei L und Kd die Konzentration beziehungsweise die Dissoziationskonstante von [3H]-SK&F-107260 waren.
  • Hemmung RGD-vermittelter GPIIb-IIIa-Bindung
  • Reinigung von GPIIb-IIIa
  • Zehn Einheiten überalteter, gewaschener humaner Blutplättchen (erhalten vom Roten Kreuz) wurden durch sanftes Rühren in 3% Octylglucosid, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2 bei 4°C für 2 Std lysiert. Das Lysat wurde bei 100.000g für 1 Std zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde auf eine 5 ml-Linsenlektin-Sepharose-4B-Säule (E. Y. Labs), voräquilibriert mit 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1% Octylglucosid (Puffer A), aufgebracht. Nach 2 Std Inkubation wurde die Säule mit 50 ml kaltem Puffer A gewaschen. Das vom Lektin zurückgehaltene GPIIb-IIIa wurde mit Puffer A, der 10% Glucose enthielt, eluiert. Alle Verfahren wurden bei 4°C ausgeführt. Das erhaltene GPIIb-IIIa war > 95% rein, wie mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gezeigt.
  • Einbau von GPIIb-IIIa in Liposome.
  • Ein Gemisch aus Phosphatidylserin (70%) und Phosphatidylcholin (30%) (Avanti Polar Lipids) wurde an den Wänden eines Glaskolbens unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Gereinigtes GPIIb-IIIa wurde auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt und mit den Phospholipiden in einem Protein:Phospholipid-Verhältnis von 1:3 (G:G) gemischt. Das Gemisch wurde resuspendiert und in einem Ultraschallbad für 5 Min behandelt. Das Gemisch wurde dann über Nacht unter Verwendung eines Dialyseschlauchs, mit einem Cut-off von 12,000-14,000 MW, gegen einen 1000-fachen Überschuss von 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (mit 2 Auswechslungen) dialysiert. Die GPIIb-IIIa-enthaltenden Liposomen wurden bei 12.000g für 15 Min zentrifugiert und in dem Dialyse-Puffer mit einer Protein-Endkonzentration von annähernd 1 mg/ml resuspendiert. Die Liposome wurden bei –70°C bis zum Gebrauch gelagert.
  • Kompetitive Bindung an GPIIb-IIIa
  • Die Bindung an den Fibrinogenrezeptor (GPIIb-IIIa) wurde mit einem indirekten, kompetitiven Bindungs-Verfahren unter Verwendung von [3H]-SK&F-107260 als RGD-artigen Liganden getestet. Der Bindungs-Test wurde in einem Filtrationsplatten-System mit 96 Vertiefungen (Millipore Corporation, Bedford, MA) unter Verwendung von hydrophilen 0,22 μm-Durapore-Membranen ausgeführt. Die Vertiefungen wurden mit 0,2 ml von 10 μg/ml Polylysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) bei Raumtemperatur für 1 Std vorbeschichtet, um unspezifische Bindung zu blockieren. Verschiedene Konzentrationen unmarkierter Benzazepine wurden in vierfacher Ausfertigung zu den Vertiefungen zugegeben. [3H]-SK&F-107260 wurde jeder Vertiefung mit einer Endkonzentration von 4,5 nM zugefügt, gefolgt von der Zugabe von 1 μg der gereinigten, Blutplättchen-GPIIb-IIIa-enthaltenden Liposomen. Die Gemische wurden für 1 Std bei Raumtemperatur inkubiert. Das GPIIb-IIIa-gebundene [3H]-SK&F-107260 wurde von dem ungebundenen durch Filtration unter Verwendung eines Millipore Filtrations-Manifolds abgetrennt, gefolgt von Waschen mit eiskaltem Puffer (2-mal, jeweils 0,2 ml). Auf den Filtern verbleibende, gebundene Radioaktivität wurde in 1,5 ml „Ready Solve" (Beckman Instruments, Fullerton, CA) in einem Beckman Flüssigkeits-Szintillationszähler (Modell LS6800), mit 40%iger Zählausbeute, gezählt. Unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 2 μM unmarkiertem SK&F-107260 bestimmt und betrug beständig weniger als 0,14% der zu den Proben zugegebenen Gesamt-Radioaktivität. Alle Datenpunkte sind der Mittelwert aus je vier Bestimmungen.
  • Daten der kompetitiven. Bindung wurden mit einem nichtlinearen Kurvenanpassungs-Verfahren nach der Kleinste-Quadrate-Methode analysiert. Dieses Verfahren liefert die IC50-Werte der Antagonisten (Konzentration des Antagonisten, die im Gleichgewicht die spezifische Bindung von [3H]-SK&F-107260 zu 50% hemmt).
  • Die IC50 hängt mit der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante (Ki) des Antagonisten zusammen, basierend auf der Cheng-und-Prusoff-Gleichung: Ki = IC50/(1+L/Kd), wobei L die in dem Assay zur kompetitiven Bindung verwendete Konzentration von [3H]-SK&F-107260 (4,5 nM) ist und Kd die Dissoziationskonstante von [3H]-SK&F-107260, die 4,5 nM beträgt, wie mit Scatchard-Analyse bestimmt.
  • Die Wirksamkeit der Verbindung der Formel (I) allein oder in Kombination mit einem Antineoplastikum kann unter Verwendung mehrerer Modelle mit transplantierbaren Tumoren der Maus bestimmt werden. Für Einzelheiten dieser Modelle, siehe U.S.-Patente Nr. 5,004,758 und 5,633,016.
  • Die folgenden Beispiele sollen in keiner Weise den Umfang dieser Erfindung begrenzen, sondern werden bereitgestellt, um die Synthese und Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zu veranschaulichen. Viele andere Ausführungsformen sind für Fachleute ohne weiteres offensichtlich.
  • BEISPIELE Allgemeines
  • Magnetische Protonen-Kernresonanz (1H-NMR)-Spektren wurden bei 300 MHz aufgenommen und chemische Verschiebungen sind in parts per million (δ) Tieffeld vom internen Standard Tetramethylsilan (TMS) angegeben. Abkürzungen für NMR-Daten sind wie folgt: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletts, dt = Dublett von Tripletts, app = apparent, br = breit. J zeigt die NMR-Kopplungskonstante, gemessen in Hertz, an. CDCl3 ist Deuteriochloroform, DMSO-d6 ist Hexadeuteriodimethylsulfoxid und CD3OD ist Tetradeuteriomethanol. Massenspektren wurden unter Verwendung von Elektrospray(ES)-Ionisationsverfahren erhalten. Elementaranalysen wurden von Quantitative Technologies Inc., Whitehouse, NJ ausgeführt. Schmelzpunkte wurden mit einem Thomas-Hoover Schmelzpunktapparat erhalten und sind unkorrigiert angegeben. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Analtech Silica Gel GF und E. Merck Kieselgel 60 F-254 Dünnschichtplatten wurden zur Dünnschichtchromatographie verwendet. Flashchromatographie wurde mit E. Merck Kieselgel 60 (230-400 mesh) Kieselgel durchgeführt. Analytische und präparative HPLC wurden mit Beckman Chromatographen durchgeführt. ODS bezeichnet ein Octadecylsilyl-derivatisiertes Kieselgel-Trägermaterial für die Chromatographie. YMC ODS-AQ® ist ein ODS-Trägermaterial für die Chromatographie und ist ein eingetragenes Warenzeichen von YMC Co. Ltd., Kyoto, Japan. PRP-1® ist ein Polymer (Styrol-Divinylbenzol)-Trägermaterial für die Chromatographie und ist ein eingetragenes Warenzeichen von Hamilton Co., Reno, Nevada. Celite® ist eine Filtrierhilfe, bestehend aus säuregewaschenem Diatomeenerde-Siliciumdioxid, und ist ein eingetragenes Warenzeichen von Manville Corp., Denver, Colorado.
  • Präparat 1
  • Herstellung von 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethanol
  • a) 2-Methyl-8-(tert-butoxycarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin
  • Einem Gemisch aus 2-Methyl-1,8-naphthyridin (J. Chem. Soc. (C) 1966, 315; 5,13 g, 35,58 mMol), 10% Pd/C (1,14 g, 1,07 mMol) und absolutem EtOH (70 ml) wurde durch drei Vakuum/H2-Spüldurchgänge der Sauerstoff entzogen, dann wurde unter einem Ballon mit H2 heftig gerührt. Nach 18,5 Std wurde das Gemisch durch Celite® filtriert und das Filterkissen wurde nacheinander mit absolutem EtOH und EtOAc gewaschen. Das Filtrat wurde bis zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde noch einmal aus EtOAc konzentriert, was einen cremefarben Feststoff (5,25 g) zurückließ.
  • Eine Lösung aus der obigen Substanz (5,25 g), Di-tert-butyldicarbonat (15,53 g, 71,16 mMol), und CH2Cl2 (10 ml) wurde am Rotavapor konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen, und der ölige Rückstand wurde unter N2 in einem auf 55 – 60 °C eingestellten Ölbad erhitzt. Nach 45
  • Std wurde der Reaktionsansatz auf RT abgekühlt und der Rückstand wurde über Kieselgel flashchromatographiert (40% EtOAc/n-Hexan). Die Titelverbindung (4,90 g, 55%) wurde als ein hellgelber Feststoff erhalten: 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,27 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,81 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 3,69-3,79 (m, 2 H), 2,65-2,75 (m, 2 H), 2,48 (s, 3 H), 1,83-1,98 (m, 2 H), 1,52 (s, 9 H); MS (ES) m/e 249 (M + H)+.
  • b) Ethyl-[8-(tert-butoxycarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl]acetat
  • Zu einer Lösung von Diisopropylamin (7,24 ml, 55,3 mMol) in trockenem THF (50 ml) wurde n-BuLi (2,5 M in n-Hexan, 22 ml, 55,3 mMol) bei 0 °C zugetropft. Nach 15 Min wurde diese Lösung zu einer Lösung von 2-Methyl-8-(tert-butoxycarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin (4,9 g, 19,7 mMol) und Diethylcarbonat (8,86 ml, 73,0 mMol) in trockenem THF (50 ml) bei –78 °C zugetropft. Nach 30 Min wurde das Gemisch mit gesättigter NH4Cl-Lösung (100 ml) abgeschreckt, auf RT erwärmt und mit EtOAc (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und mit Unterdruck konzentriert. Der Rückstand wurde über Kieselgel (40% EtOAc/n-Hexan) chromatographiert, was die Titelverbindung (5,72 g, 91%) als ein hellgelbes Öl ergab: MS (ES) m/e 321 (M + H)+.
  • c) 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethanol
  • Zu einer Lösung von Ethyl-8-[(tert-butoxycarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl]acetat (5,72g, 17,85 mMol) in trockenem THF (80 ml) bei RT wurde LiBH4 (2,0 M in THF, 10,7 ml, 21,42 mMol) zugegeben und das so erhaltene Gemisch wurde unter Rückfluss erhitzt. Nach 18 Std wurde das Gemisch auf 0 °C abgekühlt und vorsichtig mit H2O (100 ml) abgeschreckt. Nach 10 Min wurde das Gemisch mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte würden über MgSO4 getrocknet, filtriert und mit Unterdruck konzentriert.
  • Der obige Rückstand (4,9 g) wurde in CH2Cl2 (10 ml) gelöst. Dazu wurde bei RT 4 N HCl in Dioxan (20 ml) auf einmal zugegeben. Nach 4 wurde das Gemisch mit Unterdruck konzentriert. Der Rückstand wurde in einem 1: 1-Gemisch aus 1,0 N NaOH und gesättigter NaCl-Lösung (100 ml) aufgenommen und mit CH2Cl2 (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und mit Unterdruck konzentriert. Der Rückstand wurde über Kieselgel (10% McOH in 1:1 EtOAc/CHCl3) chromatographiert, was die Titelverbindung (2,09 g, 66%) als einen gelben Feststoff ergab: MS (ES) m/e 179 (M + H)+.
  • Präparat 2
  • Herstellung von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • a) 6-Methoxy-1-phenylinden
  • Eine Lösung von 3,0 M Phenylmagnesiumbromid in Et2O (680 ml, 2,04 Mol) unter Argon bei Umgebungstemperatur wurde mit Et2O (700 ml) unter Rühren verdünnt und eine Lösung von 6-Methoxy-1-indanon (277 g, 1,71 Mol) in THF (1400 ml) wurde über 1 Std zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 Std bei Umgebungstemperatur gerührt und wurde dann unter Rühren in gesättigte NH4Cl-Lösung (2,8 l) gegossen. H2O (1,4 l) wurde zugegeben und die organische Phase abgetrennt. Die wässrige Phase wurde mit Et2O (2 × 1 l) extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden konzentriert, was rohes 6-Methoxy-1-phenyl-1-indanol (445 g) als ein braunes Öl ergab. Dieses Öl wurde in Toluol (2,5 l) gelöst und p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (12,3 g, 0,065 Mol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde gerührt und für 16 Std unter Verwendung einer Dean-und-Stark-Falle mit einem Abscheider unter Rückfluss erhitzt. Die aufgefangene H2O-Menge war nach 2 Std minimal und erreichte insgesamt 28 ml. Die Lösung wurde abgekühlt und nacheinander mit 5 %iger wässriger Na2CO3-Lösung (1 l) und H2O (2 × 1 l) extrahiert. Die organische Schicht wurde konzentriert, was ein dunkelbraunes Öl (400 g) ergab. Dieses Öl wurde unter Vakuum destilliert; was die Titelverbindung (298,2 g, 79%) als ein gelbes Öl ergab: Sdp. 152-190°C/2,0 Torr; DC (10% EtOAc/n-Hexan) Rf 0,75.
  • b) 2-Benzoyl-4-methoxyphenylessigsäure
  • Aceton (4,2 l) wurde auf 10 °C abgekühlt und eine Lösung von 6-Methoxy-1-phenylinden (271 g, 1,22 Mol) in Aceton (1,8 l) wurde über 1,5 Std gleichzeitig mit Jones-Reagenz (1,8 l, hergestellt aus CrO3 (470 g, 4,70 Mol), H2O (1 l) und konz. H2SO4 (405 ml)) zugegeben. 4 %ige Wässrige OsO4-Lösung (153 ml) wurde zu dem so erhaltenen Gemisch in zwei Anteilen zugegeben, einen bei Beginn der Zugabe und den zweiten nach der Hälfte der Zugabe, wobei die Temperatur des Reaktionsgemischs unter 15°C gehalten wurde. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch auf 22°C erwärmt und für 1,5 Std gerührt, während welcher Zeit eine leichte Exotherme die Temperatur auf 28°C erhöhte. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf unter 20°C abgekühlt und Isopropanol (1 l) wurde zugegeben, anfangs tropfenweise und schnell, nachdem sich die anfängliche Exotherme verringert hatte. Während dieser Phase wurde das Rühren schwierig. Die Temperatur erreichte während der Isopropanol-Zugabe 32°C. H2O (2 l) wurde zugegeben und das Gemisch wurde in einen Schütteltrichter überführt. Zusätzliches H2O wurde zugegeben, um die ausgefallene Chromsäure zu lösen, und das Gemisch wurde mit CH2Cl2 (2 l) extrahiert. Die organische (obere) Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Phase wurde mit CH2Cl2 (2 × 1 l) extrahiert. Die vereinigten CH2Cl2-Extrakte wurden nacheinander mit H2O (2 l) und gesättigter Salzlösung (2 l) gewaschen und wurden dann konzentriert, was einen feuchten, grauen Feststoff (416 g) ergab. Dieser wurde mit einem Gemisch aus Aceton und EtOAc angerieben und filtriert und getrocknet, was die Titelverbindung (225,4 g, 71 %) als einen cremefarbenen Feststoff ergab: Schmp. 158-159°C.
  • c) 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure
  • 2-Benzoyl-4-methoxyphenylessigsäure (215,5 g, 0,80 Mol) wurde in zwei gleiche Anteile geteilt und jeder wurde in Eisessig (1,5 l) in einer 2,5 l-Druckflasche gelöst. 5 % Pd/C (10 g, 0,0048 Mol) wurde jeweils zugegeben und jedes Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur unter Wasserstoff auf einem Parr-Apparat geschüttelt. Nach 2,5 Std. wurden die Gemische filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und die Filterkissen wurden mit EtOAc gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden konzentriert, was die Titelverbindung (215 g, quantitativ) als ein kräftig-gelbes Öl ergab, das beim Stehen lassen kristallisierte: 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,05-7,35 (m, 6 H), 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1 H), 6,71 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 4,00 (s, 2 H), 3,76 (s, 3 H), 3,54 (s, 2H).
  • d) 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
  • Eine Lösung von 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure (215 g Rohsubstanz, die 204,6 g (0,80 Mol) Reinsubstanz enthielt) in CH2Cl2 (1 l) wurde unter Argon bei Umgebungstemperatur gerührt und DMF (1 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Oxalylchlorid (400 ml, 4,59 Mol). Das Oxalylchlorid wurde über 1 Std zugegeben, anfangs tropfenweise, um die heftige Gasentwicklung zu kontrollieren. Die Lösung wurde für 16 Std bei Umgebungstemperatur gerührt und dann konzentriert, was das rohe Säurechlorid (207,7 g, 0,756 Mol, 95 %) als eine gelbe Flüssigkeit ergab. Diese Flüssigkeit wurde in CH2Cl2 zu einem Gesamtvolumen von 500 ml gelöst und die Lösung und AlCl3 wurden gleichzeitig über 1 Std unter Rühren zu CH2Cl2 (3,7 l) unter Argon bei Umgebungstemperatur zugegeben. Die Temperatur betrug bei Abschluss der Zugabe 28°C. Das Reaktionsgemisch wurde für 16 Std bei Umgebungstemperatur gerührt, während welcher Zeit ein Feststoff ausfiel. H2O (1 l) wurde, anfangs tropfenweise, über einen Zeitraum von 30 Min. zugegeben. Das Gemisch wurde dann abgetrennt und die organische Phase wurde nacheinander mit H2O (1 l) und 5%iger, wässriger NaHCO3-Lösung (1 l) gewaschen. Die CH2Cl2-Lösung wurde dann konzentriert, was einen gelben Feststoff (175,3 g) ergab. Umkristallisation aus EtOAc/n-Hexan ergab die Titelverbindung (128 g, 71%): Schmp. 107-109°C.
  • e) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • Eine 1,0 M Lösung von Lithium-bis(trimethylsilyl)amid in n-Hexan (1282 ml, 1,282 Mol) wurde zu THF (4,01) bei –70°C unter Argon zugegeben, dann wurde EtOAc (146 ml, 1,49 Mol) über 20 Min zugetropft. Man ließ das Reaktionsgemisch für 15 Min rühren, dann wurde N,N,N',N'-Tetramethylethlylendiamin (378 ml, 2,5 Mol) über 20 Min zugegeben: Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Min gerührt, dann wurde eine Lösung von 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on (119,2 g, 0,50 Mol) in wasserfreiem THF (1,26 l) über 40 Min zugetropft. Die Temperatur wurde während allen diesen Zugaben unter –65°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Min bei –65 bis –70°C gerührt und wurde dann unter kräftigem Rühren in gesättigte, wässrige NH4Cl-Lösung (6,2 l) gegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 1 l) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H2O (2 × 1 l) gewaschen und wurden dann konzentriert, was ein hellbraunes Öl (175 g) ergab. Dünnschichtchromatographie (20 % EtOAc/n-Hexan) zeigte bei Rf-Wert 0,5 den größeren Fleck (gewünschtes Produkt) und den kleineren bei Rf-Wert 0,7 (zurückgebildetes Keton). Das Rohprodukt wurde über Kieselgel (2 kg, 10 % EtOAc/n-Hexan) chromatographiert, was die Titelverbindung (101 g, 61 %) als ein gelbes Öl gab: 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,63 (d, J = 7,7 Hz, 1 H), 7,00-7,30 (m, 4 H), 6,80 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 6,69 (dd, J = 8,2, 2,6 Hz, 1 H), 3,95-4,35 (m, 2 H), 4,07 (s, 2 H), 3,76 (s, 3 H), 3,68 (s, 1 H), 3,64 (d, J = 14, 2 Hz, 1 H), 3,35 (d, J = 14,2 Hz, 1 H), 2,79 (d, J = 16,0 Hz, 1 H), 2,66 (d, J = 16,0Hz, 1 H), 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3 H).
  • f) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • Ethyl-(±)-10,11-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (101 g, 0,31 Mol) wurde in Eisessig (1,8 l) gelöst und 12 N HCl (28,5 ml, 0,34 Mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde in eine 2,5 l-Druckflasche gefüllt, die 5% Pd/C (20 g, 0,0094 Mol) enthielt, und das so erhaltene Gemisch wurde bei 35°C unter Wasserstoff auf einem Parr-Hydrier-Apparat, ausgestattet mit eine Mantelheizung, geschüttelt. Nach 18 Std wurde der Reaktionsansatz auf Umgebungstemperatur abgekühlt und der Katalysator wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert, was ein hellgelbes Öl (85,1 g) ergab. Dieses wurde über Kieselgel (2 kg, Stufengradient mit 5 % bis 10 % EtOAc/n-Hexan) chromatographiert, was die Titelverbindung (69,1 g, 72%) als ein Öl gab: 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,05-7,22 (m, 4 H), 7,01 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 6,76 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,7 Hz, 1 H), 4,30 (d, J = 15,0 Hz, 1 H), 4,11-4,25 (m, 2 H), 3,85 (d, J = 15,0 Hz, 1 H), 3,70-3,90 (m, 1 H), 3,77 (s, 3 H), 3,31 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, 1 H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2 Hz, 1 H); 2,64 (dd, J = 15,6, 5,0 Hz, 1 H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,3 Hz, 1 H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3 H).
  • g) Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • Eine Lösung von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (8,5 g, 0,027 Mol) in CH2Cl2 (150 ml) wurde unter Rühren unter Argon auf –10°C abgekühlt. Thioethanol (10,7 ml, 0,144 Mol) wurde zugegeben, gefolgt von AlCl3 (20,6 g, 0,154 Mol) in zwei Anteilen über 15 Min. Eine Exotherme erhöhte nach den Zugaben die Temperatur auf 0°C und die Temperatur wurde dann unter Verwendung eines Wasserbads auf 25°C erhöht. Das Reaktionsgemisch wurde bei 25 bis 30°C für 2,25 Std gerührt, zu welchem Zeitpunkt es in Eis-H2O gegossen wurde. Die organische Schicht wurde abgetrennt, Methanol (100 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde mit CH2Cl2 (2 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten CH2Cl2-Extrakte wurden mit H2O (250 ml) gewaschen und wurden dann konzentriert, was ein visköses Öl (8,6 g) ergab. Dieses wurde in Et2O (150 ml) aufgenommen und der Ether wurde verkocht, während er durch n-Hexan ersetzt wurde. Das gewünschte Phenol schied sich zuerst als ein Öl ab, das beim Rühren bei Umgebungstemperatur kristallisierte. Zwei Ausbeuten des Feststoffs wurden gewonnen, was die Titelverbindung (7,1 g, 89 %) gab: Schmp. 110-112°C.
  • Präparat 3
  • HPLC-Trennung der Enantiomeren von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • a) Ethyl-(R)-(+)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat und Ethyl-(S)-(-)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d)cyclohepten-10-acetat
  • Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat wurde unter Verwendung der folgenden Bedingungen in seine Enantiomeren getrennt: Daicel Chiralcel OJ®-Säule (21,2 × 250 mm), 20% Ethanol in Hexan als mobile Phase, 15 ml/min Flussrate, UV-Detektion bei 254 nm, 140 mg Einspritzung; tR für Ethyl-(S)-(-)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohexen-10-acetat = 10,4 Min.; tR für Ethyl-(R)-(+)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohexen-10-acetat = 13,1 Min.
  • Präparat 4
  • Synthese von 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
  • a) 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure
  • Eine Lösung von 2-Benzoyl-4-methoxyphenylessigsäure (13,0 g, 0,048 mol), synthetisiert nach dem Verfahren aus J. Med Chem. 1981, 24, 998, in Eisessig (600 ml) wurde unter Argon mit 4,3 g. 10% Pd/C behandelt und bei 50 psi für 17 Stunden hydriert. Das Gemisch wurde unter Verwendung von Celite® filtriert und das Filtrat wurde konzentriert und noch einmal aus Toluol und Methylenchlorid konzentriert, was 14,2 der Titelverbindung ergab: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3,52 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 6,7 (m, 2H), 7,15 (m, 6H).
  • b) 10,11-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-on
  • Eine Lösung von 2-Benzyl-4-methoxyphenylessigsäure (14,2 g, 0,055m) in Benzol (120 ml) und Thionylchlorid (28 ml) wurde für 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt und konzentriert. Das Säurechlorid wurde in trockenem Methylenchlorid (40 ml) gelöst und die Lösung wurde unter Argon zu einer Lösung von AlCl3 (14,7 g, 0,11 mol) in Methylenchlorid (600 ml) zugetropft. Der Reaktionsansatz wurde unter einer Argonatmosphäre für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde er mit Eiswasser (200 ml) abgeschreckt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Phase wurde nacheinander mit 10%iger NaOH-Lösung, Wasser und verd. HCl gewaschen. Die so erhaltene Lösung wurde mit Ether (200 ml) verdünnt, über MgSO4 getrocknet und konzentriert. Der feste Rückstand wurde mit Ether/Hexan (1:1) angerieben und 9,35 g der Titelverbindung wurden durch Filtration gewonnen: Schmp. 105-106°C; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3,72 (s, 3H), 4,1 (s, 2H), 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, 1H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (m, 4H), 8,1 (d, 1 H).
  • Präparat 5
  • Synthese von Ethyl-(±)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d)cyclohepten-10-acetat
  • a) Ethyl-(⩲)-3-(3-methoxyphenyl)indenacetat
  • Zu einer kalten Lösung von 3-(3-Methoxyphenyl)inden (4 g, 18 mMol), synthetisiert nach dem Verfahren aus J. Med. Chem. 1981, 24, 998, in THF (15 ml) bei 0°C wurde eine Lösung von LiN(TMS)2 (20 ml, 1M in THF) über 5 Min zugetropft. Die so erhaltene Lösung wurde zu einer Lösung von Ethylbromacetat (3,34 g, 20 mMol) in THF (15 ml) bei –78°C über 30 Min zugetropft. Nach 2,5 Std wurde das Gemisch mit gesättigter Ammoniumchlorid-Lösung abgeschreckt und die Schichten wurden abgetrennt. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und konzentriert, was das Rohprodukt ergab, das mit Säulenchromatographie (SiO2/2-4% EtOAc/Hexan) gereinigt wurde, was die Titelverbindung (1,1 g) ergab: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,30 (t, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 6,6 (s, 1H), 6,9 (m, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 6H).
  • b) Ethyl-(⩲)-3-[(3-methoxybenzoyl)]phenylsuccinat
  • Eine Lösung von Ethyl-(⩲)-3-(3-methoxyphenyl)indenacetat (1,1 g, 3,6 mMol) in Aceton (30 ml) wurde gemäß dem Literatur-Verfahren (J. Org. Chem. 1993, 58, 4745) mit 4%iger, wässriger Osmiumtetroxid-Lösung (0,5 ml) behandelt, gefolgt von tropfenweiser Zugabe von 1,2 M Jones-Reagenz (5 ml, 6 mMol). Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das dunkle Reaktionsgemisch mit Isopropanol (2,5 ml) abgeschreckt, gefolgt von Natriumbisulfit (0,9 g) und Wasser (30 ml). Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, mit Salzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und konzentriert, was einen festen Rückstand ergab.
  • Anreiben mit 1:1 Ether/Hexan ergab 0,76 g der Titelverbindung: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,18 (t, 3H), 2,90 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m, 6H).
  • c) Ethyl-(⩲)-3-[(3-methoxybenzyl)]phenylsuccinat
  • Ein Gemisch aus Ethyl-(⩲)-3-[(3-methoxybenzoyl)]phenylsuccinat (0,76 g., 2,1 mMol) und 10% Pd/C (0,6 g) in Eisessig (35 ml) wurde bei 50 psi für 17 Stunden hydriert. Das Gemisch wurde unter Verwendung von Celite® filtriert und das Filterkissen wurde mit Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde konzentriert und noch einmal aus Toluol und Methylenchlorid konzentriert, was 0,65 g der Titelverbindung ergab: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,20 (t, 3H), 2,20 (m, 1H), 3,0 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H), 6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).
  • d) Ethyl-(⩲)-10,11-dihydro-3-methoxy-11-oxo-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • Zu einer magnetisch gerührten Lösung von Ethyl-(⩲)-3-[(3-methoxybenzyl)]phenylsuccinat (0,65 g, 1,9 mMol) in trockenem Methylenchlorid (10 ml) wurden DMF (0,2 ml) und Oxalylchlorid (0,2 ml, 2,28 mMol) zugegeben. Nach 1,5 Std wurde die Lösung zu einer Suspension von Aluminiumchlorid (0,6 g, 4,5 mMol) in trockenem Methylenchlorid (15 ml) zugetropft. Das Gemisch wurde nach 2 Std mit Eiswasser abgeschreckt, die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über MgSO4 getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mit Säulenchromatographie (SiO2/2-4% EtOAc/Hexan) gereinigt, was die Titelverbindung (0,3 g) ergab: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,28 (t, 3H), 2,88 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,88 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,85 (d, 1H), 4,95 (m, 1H), 5,8 (m, 2H), 7,22 (m, 4H), 8,1 (s, 1H).
  • e) Ethyl-(⩲)-10,11-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • Ein Gemisch aus Ethyl-(⩲)-10,11-dihydro-3-methoxy-11-oxo-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (0,3 g., 0,93 mMol) und 10% Pd/C (0,3 g) in Eisessig (25 ml) wurde bei 50 psi für 18 Stunden hydriert. Das Gemisch wurde unter Verwendung von Celite® filtriert und mit Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde konzentriert und noch einmal aus Toluol und Methylenchlorid konzentriert, was 0,25 g der Titelverbindung ergab: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,28 (t, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,85 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,30 (d, 1H), 6,70 (m, 2H), 7,0 (d, 1H), 7,22 (m, 4H).
  • Das folgende Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Synthese der biologisch aktiven erfindungsgemäßen Verbindung aus solchen Zwischenstufen, wie in den vorhergehenden Synthesen beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von (S)-10,11-Dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
  • a) Ethyl-(S)-10,11-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat
  • Zu einer Lösung von Ethyl-(S)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (200 mg, 0,67 mMol), 2-(5,6,7;8-Tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethanol (241 mg, 1,35 mMol) und PPh3 (354 mg, 1,35 mMol) in trockenem THF (5 ml) wurde Diisopropylazodicarboxylat (0,27 ml, 1,35 mMol) bei 0°C zugegeben. Man ließ das Gemisch auf RT erwärmen, so wie sich das Bad erwärmte. Nach 18 Std wurde das Gemisch mit Unterdruck konzentriert. Der Rückstand wurde über Kieselgel (1:4,5 n-Hexan/Et2O) chromatographiert, was die Titelverbindung (94 mg, 31%) als ein klares Öl ergab: MS (ES) m/e 457 (M + H)+.
  • b) (S)-10,11-Dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-essigsäure
  • Zu einer Lösung von Ethyl-(S)-10,11-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-10-acetat (131 mg, 0,29 mMol) in THF/H2O (2 ml) wurde 1,0 N LiOH (0,43 ml, 0,43 mMol) zugegeben und das Gemisch wurde auf 50°C erhitzt. Nach 18 Std wurde das Gemisch auf RT abgekühlt und mit Et2O (2 × 2 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde unter Verwendung von 10%iger HCl auf pH-Wert 6 angesäuert. Die so erhaltene milchige Lösung wurde durch eine C-18-Bond-Elut-Säule (Gradientenelution: H2O, dann 20 % CH3CN/H2O, dann CHCl3 als Eluent) geleitet. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden mit Unterdruck konzentriert, was die Titelverbindung (30 mg, 24 %) als ein weißes Pulver ergab: MS (ES) m/e 429 (M + H)+. Anal. Ber. für C27H28N2O3·0,95 HCl: C 70,02, H 6,30, N 6,05. Gefunden: C 70,01, H 6,33, N 5,71.
  • Beispiel 2
  • Parenterale Dosiereinheit, Zusammensetzung
  • Ein Präparat, das 20 mg der Verbindung von Beispiel 1 als ein steriles, trockenes Pulver enthält, wird wie folgt hergestellt: 20 mg der Verbindung werden in 15 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen in eine 25 ml-Mehrdosenampulle filtriert und gefriergetrocknet. Das Pulver wird durch Zugabe von 20 ml 5%iger Glucoselösung in Wasser (D5W) zur intravenösen oder intramuskulären Injektion wiederhergestellt. Die Dosierung wird dadurch durch das Injektionsvolumen bestimmt. Nachfolgende Verdünnung kann durch Zugabe eines abgemessenen Volumens dieser Dosierungseinheit zu einem anderen Volumen D5W zur Injektion erfolgen oder eine abgemessene Dosis kann einem anderen Mechanismus zur Verabreichung des Arzneistoffs, wie einer Flasche oder einem Beutel zur i.v.-Tropfinfusion oder einem anderen Injektions-Infusions-System, zugegeben werden.
  • Beispiel 3
  • Orale Dosiereinheit, Zusammensetzung
  • Eine Kapsel zur oralen Anwendung wird durch Mischen und Mahlen von 50 mg der Verbindung von Beispiel 1 mit 75 mg Lactose und 5 mg Magnesiumstearat hergestellt. Das so erhaltene Pulver wird gesiebt und in eine Hartgelatinekapsel gefüllt.
  • Beispiel 4
  • Orale Dosiereinheit, Zusammensetzung
  • Eine Tablette zur oralen Anwendung wird durch Mischen und Granulieren von 20 mg Saccharose, 150 mg Calciumsulfat-Dihydrat und 50 mg der Verbindung von Beispiel 1 mit einer 10%igen Gelatine-Lösung hergestellt. Die feuchten Granulatkörner werden gesiebt, getrocknet, mit 10 mg Stärke, 5 mg Talkum und 3 mg Stearinsäure gemischt und zu einer Tablette verpresst.

Claims (9)

  1. Verbindung gemäß Formel (I):
    Figure 00420001
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  2. Arzneimittel, welches eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  3. Arzneimittel gemäß Anspruch 2, welches zusätzlich ein Antineoplastikum umfasst.
  4. Arzneimittel gemäß Anspruch 3, wobei das Antineoplastikum Topotecan ist.
  5. Arzneimittel gemäß Anspruch 3, wobei das Antineoplastikum Cisplatin ist.
  6. Verbindung gemäß Formel (II):
    Figure 00420002
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren Umsetzen einer Verbindung der Formel (III):
    Figure 00430001
    mit 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)-1-ethanol in einer Reaktion, die durch den zwischen Diisopropylazodicarboxylat und Triphenylphosphin gebildeten Komplex vermittelt wird, gefolgt von Esterhydrolyse unter Verwendung einer wässrigen Base, umfasst.
  8. Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.
  9. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Osteoporose.
DE69920518T 1998-12-04 1999-12-03 Vitronectin-rezeptor-antagonist Expired - Lifetime DE69920518T2 (de)

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