NO318895B1

NO318895B1 - Vitronektinreseptor-antagonist

Info

Publication number: NO318895B1
Application number: NO20012732A
Authority: NO
Inventors: William H Miller; Peter J Manley
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2005-05-18
Also published as: HUP0104804A3; KR20010080669A; PT1146874E; DE69920518D1; UA71586C2; DE69920518T2; EP1146874A4; HUP0104804A2; BR9915879A; SI1146874T1; ID28811A; ZA200104398B; PE20001563A1; HK1042037A1; AU1750200A; EP1146874B1; BG105651A; MA25265A1; EA200100618A1; DZ2954A1

Description

OPPFINNELSESOMRÅDE

Denne oppfinnelse vedrører et farmasøytisk virkestoff som inhiberer vitronektinreseptoren og er egnet til behandling av inflammasjon, cancer og kardiovaskulære forstyrrelser, så som aterosklerose og restenose, samt sykdommer hvor benresorpsjon er en faktor, så som osteoporose.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig vitronektinreseptor-antagonist, fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav, samt farmasøytisk blanding.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Integriner er en superfamilie av celleadhesjonsreseptorer som er transmembrane glykoproteiner uttrykt på en rekke celler. Disse celleoverflateadhesjonsreseptorene omfatter gpHb/ma (fibrinogenreseptoren) og avp3 (vitronektinreseptoren). Fibrinogenreseptoren gpllb/nia uttrykkes på blodplateoverflaten og medierer plateaggregasjon og dannelsen av en hemostatisk koagel på et blødende sårsted. Philips et ai, Blood, 1988,71,831. Vitronektinreseptoren ocvp3 uttrykkes på en rekke celler, inklusivt endotel-, glattmuskel-, osteoklast- og tumorceller og har således en rekke funksjoner. avP3-reseptoren uttrykt på osteoklastcellemembranen medierer adhesjonen av osteoklaster til benmatriksen, et nøkkel-trinn i benresorpsjonsprosessen. Ross, et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703. En sykdom som kjennetegnes ved overdreven benresorpsjon er osteoporose. avP3-reseptoren uttrykt på humane aorta-glattmuskelceller, medierer deres migrasjon inn i neointima, en prosess som kan føre til restenose etter perkutan koronar angioplastikk. Brown et al., Cardiovascular Res., 1994, 28,1815. Dessuten har Brooks et al, Cell, 1994, 79,1157, vist at en avpY antagonist kan fremme tumorregresjon ved å indusere apoptose i angiogene blodkar. Midler som blokkerer vitronektinreseptoren ville derfor være egnet til behandling av sykdommer, så som osteoporose, restenose og cancer.

Vitronektinreseptoren er nå kjent for å omfatte tre ulike integriner, betegnet avPi, avp3 og ctvp5. Horton et al., Int. J. Exp. Pathol., 1990, 71, 741. ctvpi binder fibronektin og vitronektin. Ovp3 binder et stort utvalg av ligander, inklusivt florin, fibrinogen, laminin, trombospondin, vitronektin, von Willebrands faktor, osteopontin og ben-sialoprotein I. otvPs binder vitronektin. Vitronektinreseptoren avp5 har vist seg å være involvert i celleadhesjonen til en rekke celletyper, inklusivt mikrovaskulære endotelceller (Davis et al., J. Cell Biol. 1993, 51, 206) og dens rolle ved angiogenese er blitt bekreftet. Brooks et al., Science 1994,264,569. Dette integrin uttrykkes på blodkar i humane sårgranulasjonsvev, men ikke i normal hud.

Vitronektinreseptoren er kjent for å bindes til benmatriksproteiner som inneholder tripeptid Arg-Gly-Asp (eller RGD) motivet. Horton et al, Exp. Cell Res. 1991,195,368, angir således at RGD-holdige peptider og et anti-vitronektinreseptor-antistoff (23C6) inhiberer dentinresorpsjon og.cellespredning ved osteoklaster. I tillegg angir Sato et al.,

J. Cell Biol. 1990, 111,1713 at echistatin, et slangegiftpeptid som inneholder RGD-sekvensen, er en potent inhibitor av benresorpsjon i vevskultur og inhiberer tilfesting av osteoklaster til ben.

Det er nå oppdaget at en bestemt forbindelse er en potent inhibitor av ctvpV og avpVreseptorene. Spesielt er det oppdaget at en slik forbindelse er en mer potent inhibitor av vitronektinreseptoren enn fibrinogenreseptoren.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Denne oppfinnelse omfatter en forbindelse med formel (I), beskrevet nedenfor, som har farmakologisk virkning på inhiberingen av vitronektinreseptoren og er anvendelig ved behandlingen av inflammasjon, cancer og kardiovaskulære forstyrrelser, så som aterosklerose og restenose, og ved sykdommer hvor benresorpsjon er en faktor, så som osteoporose.

Denne oppfinnelse vedrører også en farmasøytisk blanding som omfatter en forbindelse ifølge formel (I) og en farmasøytisk bærer.

Det er også beskrevet en farmasøytisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter en forbindelse ifølge krav 1, et anti-neoplastisk middel og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for behandling av sykdommer som medieres av vitronektinreseptoren. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet til behandling av aterosklerose, restenose, inflammasjon, cancer og sykdommer hvor benresorpsjon er en faktor, så som osteoporose.

DETALJERT BESKRIVELSE

Denne oppfinnelse omfatter en ny forbindelse som er en mer potent inhibitor av vitronektinreseptoren enn fibrinogenreseptoren. Den nye forbindelse omfatter en dibenzo-cyklohepten-kjeme, hvori en nitrogen-holdig substituent forekommer på én av de aromatiske 6-leddede ringene av dibenzocykloheptenet, og en alifatisk substituent som inneholder en sur del, forekommer på dibenzocykloheptenets 7-leddede ring. Dibenzo-cyklohepten-ringsystemet antas å orientere substituent-sidekjedene på de 6- og 7-leddede ringene slik at de kan gi en gunstig interaksjon med vitronektinreseptoren. Det er å foretrekke at det vil foreligge ca. 12 til 14 mellomliggende kovalente bindinger via den korteste intramolekylære vei mellom syregruppen på den alifatiske substituent av dibenzocykloheptenets 7-leddede ring og nitrogenet til den nitrogenholdige substituent på en av dibenzocykloheptenets aromatiske 6-leddede ring.

Oppfinnelsen omfatter en forbindelse med formel (I):

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Forbindelsen med formel (I) inhiberer bindingen av vitronektin og andre RGD-holdige peptider, til vitronektinreseptoren. Inhibering av vitronektinreseptoren på osteoklaster inhiberer osteoklastisk benresorpsjon og er egnet ved behandlingen av sykdommer hvor benresorpsjon er assosiert med sykdom, så som osteoporose og osteoartritt.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en forbindelse, kjennetegnet ved at den har formelen (IT)

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den omfatter omsetning av en forbindelse med formel (111):

med 2-(5,6,7,8-tetrahyd^o-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol i en reaksjon mediert av komplekset dannet mellom diisopropylazodikarboksylat og trifenylfosfin, etterfulgt av esterhydrolyse ved bruk av vandig base.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, ved fremstillingen av et medikament til behandling av sykdommer hvor antagonisme av ocvpVreseptoren er indisert, og hvor antagonisme av avpVreseptoren er indisert.

Det er videre beskrevet anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, ved fremstillingen av et medikament til behandling av osteoporose.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, og en inhibitor av benresorpsjon, ved fremstillingen av et medikament for behandling av osteoporose, i fysisk kombinasjon eller for trinnvis administrering.

Bendannelsen kan følgelig stimuleres ved administrering av en forbindelse med formel (I) som forårsaker en økning av osteokalsinfrigj øring. Øket benproduksjon er en klar fordel ved sykdomstilstander med manglende mineralisert benmasse, eller hvor det er ønskelig med remodellering av ben, så som frakturtilheling og forhindring av benfrakturer. Sykdommer og metabolske forstyrrelser som resulterer i tap av benstruktur ville også dra fordel av slik behandling. For eksempel kunne hyperparathyroidisme, Pagets bensykdom, hyperkalsemi, osteolytiske lesjoner frembragt ved benmetastase, bentap som følge av immobilisering eller kjønnshormonmangel, Behgets sykdom, osteomalasi, hyperostose og osteopetrose, kunne ha fordel av administrering av en forbindelse ifølge denne oppfinnelse.

Siden forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse inhiberer vitronektinreseptorer på en rekke forskjellige celletyper, ville dessuten forbindelsen være egnet ved behandling av inflammatoriske forstyrrelser, så som reumatoid artritt og psoriasis, samt kardiovaskulære sykdommer, så som aterosklerose og restenose. Forbindelsen med formel (I) ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være egnet for behandling eller forhindring av andre sykdommer, herunder, men ikke begrenset til, tromboemboliske forstyrrelser, astma, allergier, akutt lungesviktsyndrom, graft versus host sykdom, organtransplantatforkastelse, septisk sjokk, eksem, kontaktdermatitt, inflammatorisk tarmsykdom og andre autoimmun-sykdommer. Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være egnet for sår-tilheling.

Forkortelser og symboler som vanligvis benyttes innen peptidkjemien, benyttes her for å beskrive forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Generelt følger aminosyreforkortelsene IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature som beskrevet i Eur. J. Biochem., 158,9(1984).

Ci-6-alkyl betyr i denne sammenheng en eventuelt substituert alkylgruppe med 1 til 6 karbonatomer, som innbefatter metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl og heksyl og de enkle alifatiske isomerer derav.

Enkelte radikalgrupper er her forkortet. t-Bu står for det tertiære butylradikal, Boe står for t-butyloksykarbonylradikalet, Fmoc står for fluorenylmetoksykarbonylradikalet, Ph står for fenylradikalet, Cbz står for benzyloksykarbonylradikalet, Bn står for benzylradikalet, Me står for metyl, Et står for etyl, Ac står for acetyl, Alk står for Ci^-alkyl, Nph står for 1- eller 2-naftyl og cHex står for cykloheksyl. Tet står for 5-tetrazolyl.

Enkelte reagenser er her forkortet. DCC står for dicykloheksylkarbodiimid, DMAP står for dimetylaminopyridin, DIEA står for diisopropyletylamin, EDC står for l-(3-di-metylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid, HOBt står for 1-hydroksybenzotriazol, THF står for tetrahydrofuran, DEAD står for dietylazodikarboksylat, PPI13 står for trifenylfosfin, DIAD står for diisopropylazodikarboksylat, DME står for dimetoksyetan, DMF står for dimetylformamid, NBS står for N-bromsuccinimid, Pd/C står for palladium på kull katalysator, PPA står for polyfosforsyre, DPPA står for difenylfosforylazid, POB står for benzotriazol-l-yloksy-tris(dimetylamino)fosfonium-heksafluorfosfat, HF står for flussyre, TEA står for trietylamin, TFA står for trifluoreddiksyre, PCC står for pyridiniumklor-kromat.

Forbindelsen med formel (I) kan fremstilles etter fremgangsmåtene beskrevet i Bondinell et al, PCT publikasjon nr. WO 97/01540 (internasjonal søknad nr. PCT US96/11108), publisert 16. januar, 1997, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

Forøvrig fremstilles forbindelsen med formel (I) etter metoder analoge med de som er beskrevet i reaksjonsskjemaene detaljert beskrevet nedenfor.

Reaksjonsskjerna I

a) 10% Pd/C, HO Ac; b) SOCl2, toluen; c)A1C13, CH2C12

Reaksjonsskjema I beskriver fremstillingen av et mellomprodukt egnet for

fremstillingen av formel (I) forbindelsen.

Reaksjonsskjema II

a) LnN(TMS)2, etylbromacetat; b) Jones reagens, Os04; c) H2,10% Pd/C, HO Ac; d) C2O2CI2, DMF; e) AICI3, CH2C12, RT; f) H2,10% Pd/C, HOAc

Reaksjonsskjema II beskriver også fremstillingen av et mellomprodukt egnet for

fremstilling av formel (I) forbindelsen.

Reaksjonsskjema III

(a) EtOAc/LiHMDS, THF; (b) H2, 10% Pd/C, kons. HC1, AcOH; (c) EtSH, AICI3, CH2C12; (d) 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol, diisopropylazodikarboksylat, (Ph)3P; (e) 1,0N LiOH, EtOH; HC1.

Reaksjonsskjema UJ beskriver utførlig fremstillingen av en formel (I) forbindelse. Omsetning av III-l (som er en Reaksjonsskjema 1-3 forbindelse) etter en aldol-type reaksjon med enolatet av etylacetat, som kan utvikles fra etylacetat ved påvirkning på en passende amidbase, for eksempel litiumdiisopropylamid (LDA) eller litiumbis(trimetylsilyl)amid (LiHMDS), gir III-2. For en aldol-reaksjon er ofte THF det løsningsmiddel som velges, selv om THF i nærvær av forskjellige tilsetninger, som for eksempel HMPA eller TMEDA, ofte benyttes. Reduksjon av III-2 til II1-3 (som er en Reaksjonsskjema II-6 forbindelse) kan oppnås ved hydrogenolyse over en passende katalysator, for eksempel palladiummetall på aktivkull (Pd/C) i et egnet løsningsmiddel, som f.eks. eddiksyre, i nærvær av en mineralsyre, som f.eks. HC1. Alternativt kan denne reduksjonen foretas ved behandling av III-2 med trietylsilan i nærvær av bortrifluorideterat i henhold til den generelle metode til Orfanopoulos & Smonou (Synth. Commun. 1988, 833). Fjerning av metyleteren av III-3 for å gi III-4, kan oppnås med BBr3 i et inert løsningsmiddel, for eksempel CH2CI2, eller ved reaksjon med etantiol og AICI3 i et inert løsningsmiddel, fortrinnsvis CH2CI2. Andre egnede metoder for fjerning av en metyleter er beskrevet i Greene, «Protective Groups in Organic Synthesis» (publisert av John Wiley & Sons). Forbindelse 4 ifølge Reaksjonsskjema 3 (III-4) omsettes med 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol for å gi III-5. Reaksjonen befordres av det kompleks som dannes mellom diisopropylazodikarboksylat og trifenylfosfin og foretas i et aprotisk løsningsmiddel, for eksempel THF, CH2CI2 eller DMF. Etylesteren av III-5 hydrolyseres ved å benytte en vandig base, for eksempel LiOH i vandig THF, eller NaOH i vandig metanol eller etanol, og det intermediære karboksylatsalt surgjøres med en egnet syre, for eksempel TFA eller HC1, for å oppnå karboksylsyren III-6. Om ønskes kan det intermediære karboksylatsalt alternativt isoleres, eller kan et karboksylatsalt av den frie karboksylsyre fremstilles etter velkjente fremgangsmåter.

Reaksjonsskjema IV

(a) PhOH, Cu, K2C03; (b) svovel, morfolin; (c) KOH, H20, i-PrOH; (d) SOCl2, benzen; (e) AICI3, CH2C12; (f) EtOAc, LiN(TMS)2, TMEDA, THF; (g) Et3SiH, BF3, OEt2, CH2C12; (h) H2, Pd/C, EtOH; (i) BBr3, CH2C12.

Kommersielt tilgjengelig 2-fluor-4-metoksyacetofenon (IV-1) reagerer med en alkohol, for eksempel fenol, i nærvær av kobbermetall og en egnet base, for eksempel K2C03, for å gi diaryleteren IV-2. Etter behandling med svovel og et passende primært eller sekundært amin, fortrinnsvis morfolin, i henhold til den generelle metode til Harris (J. Med. Chem. 1982,25, 855), omdannes IV-2 til IV-3 etter en klassisk Willgerodt-Kindler-reaksjon. Det derved oppnådde tioamid hydrolyseres til den tilsvarende karboksylsyre IV-4, ved omsetning med et alkalimetallhydroksyd, hensiktsmessig, KOH, i vandig alkoholisk løsningsmiddel, så som vandig MeOH, EtOH eller i-PrOH. Karboksylsyre IV-4 omdannes til det tilsvarende syreklorid ved omsetning enten med SOCl2 eller oksalylklorid etter betingelser velkjent for fagmannen. Behandling av dette syreklorid med en passende Friedel-Crafts katalysator, så som A1C13 eller SnCU, i et inert løsningsmiddel, så som CH2C12 eller CS2, fører til det cykliske keton IV-5. Alternativt kan syren IV-4 omdannes direkte til ketonet IV-5 under sure betingelser, for eksempel med polyfosforsyre. Reaksjon av IV-5 etter en aldol-type reaksjon med enolatet av etylacetat, som kan utvikles fra etylacetat etter eksponering for en passende amidbase, for eksempel litiumdiisopropylamid (LDA) eller litium-bis(trimetylsilyl)amid (LiHMDS), gir IV-6. Ofte er THF det løsnings-middel som velges for en aldolreaksjon, selv om THF i nærvær av forskjellige tilsetninger, for eksempel HMPA eller TMEDA, ofte benyttes. Reduksjon av IV-6 til IV-7 kan oppnås ved behandling av IV-6 med trietylsilan i nærvær av bortrifluorideterat etter den generelle metode til Orphanopoulos & Smonu (Synth. Commun., 1988, 833). Eventuelt olefiniske biprodukter som skriver seg fra eliminering av alkoholen, reduseres ved hydrogenering over en passende katalysator, for eksempel palladiummetall på aktivkull (Pd/C) i et passende løsningsmiddel, så som MeOH eller EtOH. Alternativt kan reduksjonen av IV-6 for å gi IV-7 oppnås ved hydrogenolyse i nærvær av en mineralsyre som f.eks. HC1. Denne reaksjon katalyseres typisk av Pd/C og foretas optimalt i eddiksyre. Fjerning av metyleteren av IV-7 for å gi IV-8 kan oppnås med BBr3 i et inert løsningsmiddel, for eksempel CH2CI2 eller ved omsetning med etantiol og AICI3 i et inert løsningsmiddel, fortrinnsvis CH2C12. Andre anvendelige fremgangsmåter for fjerning av en metyleter er beskrevet i Greene, «Protective Groups in Organic Synthesis» (publisert av John Wiley & Sons). IV-8 omdannes deretter til formel (I) forbindelsen etter den fremgangsmåte som er skissert i Reaksjonsskjema Ul.

Syreaddisjonssalter av forbindelsen fremstilles på vanlig måte i et egnet løsnings-middel fra opphavsforbindelsen og et overskudd av en syre, så som saltsyre, hydrogen-bromidsyre, flussyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, trifluoreddiksyre, maleinsyre, ravsyre eller metansulfonsyre. Enkelte av forbindelsene danner indre salter eller zwitterioner, som kan være akseptable. Kationiske salter fremstilles ved å behandle opphavsforbindelsen med et overskudd av et alkalisk reagens, så som et hydroksyd, karbonat eller alkoksyd, som inneholder det passende kation; eller med et passende organisk amin. Kationer så som Li<+>, Na<+>, K<+>, Ca"1-*", Mg"1-1- og NH4<+> er spesifikke eksempler på kationer som forekommer i farmasøytisk akseptable salter.

Denne oppfinnelse tilveiebringer også en farmasøytisk blanding som omfatter en forbindelse i henhold til formel (1) og en farmasøytisk akseptabel bærer. Forbindelsen med formel (I) kan følgelig benyttes for fremstillingen av et medikament. Farmasøytiske blandinger av forbindelsen med formel (I), fremstillet som beskrevet ovenfor, kan formuleres som løsninger eller som lyofiliserte pulvere for parenteral administrering. Pulvere kan rekonstitueres ved tilsetning av et egnet fortynningsmiddel eller annen farmasøytisk akseptabel bærer før bruk. Den flytende formuleringen kan være en buffret, isotonisk vandig løsning. Eksempler på egnede fortynningsmidler er normale isotomske saltløsninger, standard 5% dekstrose i vann eller buffret natrium- eller ammoniumacetat-løsning. En slik formulering er spesielt egnet for parenteral administrering, men kan også benyttes for peroral administrering eller inngå i en doseringsinhalator eller nebulisator for innblåsning. Det kan være ønskelig å tilsette hjelpestoffer, så som polyvinylpyiTolidon, gelatin, hydroksycellulose, akasie, polyetylenglykol, mannitol, natriumklorid eller natrium-citrat.

Alternativt kan disse forbindelsene være innkapslet, tablettert eller fremstillet som en emulsjon eller sirup, for peroral administrering. Farmasøytisk akseptable faste eller flytende bærere kan tilsettes for å forbedre eller stabilisere blandingen eller for å lette fremstilling av blandingen. Faste bærere innbefatter stivelse, laktose, kalsiumsulfat-dihydrat, terra alba, magnesiumstearat eller stearinsyre, talk, pektin, akasie, agar eller gelatin. Flytende bærere innbefatter sirup, jordnøttolje, olivenolje, saltvann og vann. Bæreren kan også innbefatte et materiale med forlenget frigjøring, så som glyceryl-monostearat eller glyceryl-distearat, alene eller blandet med en voks. Mengden av fast bærer varierer, men vil fortrinnsvis være mellom ca. 20 mg og ca. 1 g per doseringsenhet. De farmasøytiske preparatene fremstilles etter konvensjonell farmasøytisk teknikk, som innebærer oppmaling, blanding, granulering og om nødvendig, komprimering for tablett-former; eller oppmaling, blanding og påfylling for hårdgelatin kapselformer. Når det benyttes en flytende bærer, vil preparatet være i form av en sirup, mikstur, emulsjon eller en vandig eller ikke-vandig suspensjon. En slik flytende formulering kan administreres direkte p.o. eller fylles over i en myk gelatinkapsel.

For rektal administrering kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen kombineres med hjelpestoffer, så som kakaosmør, glycerol, gelatin eller polyetylenglykoler og støpes til et suppositorium.

Forbindelsen som her er beskrevet er antagonister av vitronektinreseptoren og er anvendelige til behandling av sykdommer, hvor den underliggende patologi kan tilskrives en ligand eller celle som interagerer med vitronektinreseptoren. For eksempel er disse forbindelsene egnet til behandling av sykdommer hvor tap av benmatriks gir sykdom. Forbindelsene kan derfor anvendes for behandling av osteoporose, hyperparathyroidisme, Pagets sykdom, sykelig hyperkalsemi, osteolytiske lesjoner produsert av benmetastase, bentap som følge av immobilisering eller kjønnshormonmangel. Forbindelsen ifølge denne oppfinnelse antas også å være anvendelig som anti-tumor, anti-angiogene, anti-inflammatoriske og anti-metastatiske midler og være egnet til behandlingen av aterosklerose og restenose.

Forbindelsen administreres pasienten enten oralt eller parenteralt, på en slik måte at medikamentkonsentrasjonen er tilstrekkelig til å inhibere benresorpsjon eller andre slike indikasjoner. Den farmasøytiske blanding som inneholder forbindelsen, administreres som en peroral dose på mellom ca. 0,1 og 50 mg/kg, på en måte som er i overensstemmelse med pasientens tilstand. Den perorale dose utgjør fortrinnsvis fra ca. 0,5 til ca. 20 mg/kg. For akutt behandling foretrekkes parenteral administrering. En intravenøs infusjon av peptidet i 5% dekstrose i vann eller normalt saltvann eller en lignende formulering med passende hjelpestoffer, er mest effektiv, selv om en intramuskulær bolusinjeksjon også er anvendelig. Den parenterale dose vil i alminnelighet være fra ca. 0,01 til ca. 100 mg/kg; fortrinnsvis mellom 0,1 og 20 mg/kg. Forbindelsen administreres én til fire ganger per dag, i et nivå som gir en døgndose på ca. 0,4 til ca. 400 mg/kg/dag. Det nøyaktige nivå og måten som forbindelsen administreres på, bestemmes lett av fagmannen ved å sammenligne blod-nivået av midlet med den konsentrasjon som fordres for en terapeutisk effekt.

Det er videre mulig å behandle osteoporose eller inhibere bentap, som omfatter administrering trinnvis eller i en fysisk kombinasjon av en forbindelse med formel (I) og andre inhibitorer av benresorpsjon, så som bisfosfonater (dvs. allendronat), hormon-substitusjonsterapi, anti-østrogener eller kalsitonin.

INHIBERING AV VITRONEKTIN-BINDING

Fastfase [<3>H]-SK&F-107260 binding til av[J3: human placenta- eller human blodplate avp3 (0,1-0,3 mg/mL) i buffer T (inneholdende 2 mM CaCl2 og 1% oktylglukosid) ble fortynnet med buffer T inneholdende 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (buffer A) og 0,05% NaN3, og deretter umiddelbart tilsatt til 96-brønns ELISA-pIater (Corning, New York, NY) som 0,1 mL per brønn. 0,1-0,2 ug av avp3 ble tilsatt per brønn. Platene ble inkubert over natten ved 4°C. På forsøkstidspunktet ble brønnene vasket én gang med buffer A og inkubert med 0,1 mL 3,5% bovint serumalbumin i den samme buffer i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble brønnene suget fullstendig av og vasket to ganger med 0,2 mL buffer A.

Forbindelsen ble løst i 100% DMSO for å gi en 2 mM stamløsning, som ble fortynnet med bindingsbuffer (15 mM Tris-HCI (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2,1 mM MgCl2) til en endelig forbindelseskonsentrasjon på 100 uM. Denne løsningen fortynnes deretter til den nødvendige sluttkonsentrasjon av forbindelsen. Forskjellige konsentrasjoner av umerkede antagonister (0,001-100 uM) ble tilsatt brønnene i tre paralleller, etterfulgt av tilsetning av 5,0 nM [<3>H]-SK&F-107260 (65 -86 Ci/mmol).

Platene ble inkubert i l time ved romtemperatur. Etter inkubering ble brønnene suget fullstendig av og brønn etter brønn vasket én gang med 0,2 mL iskald buffer A. Reseptorene ble solubilisert med 0,1 mL 1% SDS, og det bundne [<3>H]-SK&F-107260 ble bestemt ved væskescintillasjonstelling ved tilsetningen av 3 mL Ready Safe i en Beckman LS Liquid Scintillation Counter, med 40% effektivitet. Uspesifikk binding av [<3>H]-SK&F-107260 ble bestemt i nærvær av 2 uM SK&F-107260 og var konsekvent mindre enn 1% av den innsatte totale radioligand. IC50 (den antagonistkonsentrasjon som inhiberer 50% binding av [<3>H]-SK&F-107260) ble bestemt ved en ikke-lineær, minste kvadraters kurvetilpasningsrutine, som ble modifisert fra LUNDON-2 programmet. Kj (dissosiasjonskonstant av antagonisten) ble beregnet etter ligningen: Kj=IC5o/(l+L/Kd), hvor L og var henholdsvis konsentrasjonen og dissosiasjonskonstanten av [<3>H]-SK&F-107260.

Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse inhiberer vitronektin-binding til SK&F-107260 ved en Kj på ca. 1,7 nanomolar.

Forbindelsen ifølge denne oppfinnelse ble også undersøkt i in vitro og in vivo benresorpsjon i standardtester for evaluering av inhibering av bendannelse, så som den gropdannelsestest som er omtalt i EP 528 587, som også kan foretas ved å benytte humane osteoklaster i stedet for rotteosteoklaster, og den ovariektomerte rottemodell, beskrevet av Wronksi et ai, Cells and Materials 1991, Sup. 1,69-74.

VASKULÆR GLATTMUSKELCELLE-MIGRASJONSTEST

Rotte eller humane aorta-glattmuskelceller ble benyttet. Cellemigrasjonen ble overvåket i et Transwell cellekulturkammer ved å benytte en polykarbonatmembran med porer på 8 p.m (Costar). Den nedre overflate av filteret ble dekket med vitronektin. Celler ble suspendert i DMEM supplert med 0,2% bovint serumalbumin i en konsentrasjon på 2,5-5,0x10<6> celler/mL, og ble forbehandlet med testforbindelse i forskjellige konsentrasjoner i 20 minutter ved 20°C. Bare løsningsmiddel ble benyttet som kontroll. 0,2 mL av cellesuspensjonen ble anbragt i det øvre rom i kammeret. Det nedre rommet inneholdt 0,6 mL DMEM supplert med 0,2% bovint serumalbumin. Inkubering ble foretatt ved 37°C i en atmosfære på 95% luft/5% C02 i 24 timer. Etter inkubering ble de ikke-migrerende cellene på den øvre filteroverflate fjernet ved forsiktig avskraping. Filteret ble deretter fiksert i metanol og farvet med 10% giemsafarve. Migrering ble målt enten ved a) telling av det celleantall som hadde migrert til den nedre overflate av filteret eller ved b) ekstrahering av de farvede cellene med 10% eddiksyre, etterfulgt av bestemmelse av

absorbansen ved 600 nm.

THYREOPARATHYROIDEA EKTOMISERT ROTTEMODELL

Hver forsøksgruppe består av 5-6 voksne Sprague-Dawley hannrotter (250-400 g kroppsvekt). Rottene thyreoparathyroidea ektomeres (av selgeren, Taconic Farms) 7 dager før bruk. Alle rottene får en substitusjonsdose tyroksin hver 3. dag. Ved mottak av rottene måles sirkulerende ioniserte kalsiumnivåer i helblod umiddelbart etter at det er uttatt ved halevenepunksjon og overføres til hepariniserte rør. Rotter inkluderes dersom nivået av ionisert Ca (målt med en Ciba-Corning modell 634 kalsium pH-analysator) er <1, 2 mM/L. Hver rotte forsynes med permanente vene- og arteriekatetere for henholdsvis avgivelse av testmateriale og uttak av blodprøver. Rottene settes deretter på en diett av kalsiumfritt tørrfor og deionisert vann. Basislinje Ca-nivåer måles og hver rotte administreres enten kontrollbærer eller human parathyroideahormon 1-34 peptid (hPTHl-34, dose 1,25 ^ig/kg/ time i saltvann/0,1% bovint serumalbumin, Bachem, Ca) eller en blanding av hPTHl-34 og testmateriale ved kontinuerlig intravenøs infusjon via venekatetere ved å benytte en ekstern doseringspumpe. Kalsemiresponsen til hver rotte måles med 2 timers intervaller under infusjonsperioden på 6-8 timer.

HUMANE OSTEOKLAST RESORPSJONS- OG ADHESJONSTESTER

Grop-resorpsjons- og adhesjonstester er utviklet og standardisert ved å benytte normale humane osteoklaster fira osteoklastomvev. Test 1 ble utviklet for måling av osteoklastgrop volumer ved konfokal lasermikroskopi. Test 2 ble utviklet som en hurtigere screening hvor kollagenfragmenter (frigitt under resorpsjon) måles ved kompetitiv ELISA.

TEST 1 (VED BRUK AV KONFOKAL LASERMIKROSKOP!.)

• Alikvoter av humane osteoklastom-avledede cellesuspensjoner tas ut fra oppbevaring i flytende nitrogen, oppvarmes hurtig til 37°C og vaskes lx i RPMI-1640 medium ved

sentrifugering (1000 rpm, 5 min. ved 4°C).

• Mediet suges av og erstattes med murint anti-HLA-DR antistoff og fortynnes deretter 1:3 i RPMI-1640 medium. Suspensjonen inkuberes i 30 minutter på is og blandes

hyppig.

• Cellene vaskes 2x med kald RPMI-1640 etterfulgt av sentrifugering (1000 rpm., 5 min. ved 4°C), hvorpå cellene overføres til et sterilt 15 mL sentrifugerar. Antall mono-nukleære celler telles i et forbedret Neubauer tellekammer. • Tilstrekkelig antall magnetiske kuler (5/mononukleær celle), dekket med geit-anti-mus IgG (Dynal, Great Neck, NY) uttas fra deres oppbevaringsflaske og anbringes i 5 mL ferskt medium (dette vasker bort det toksiske azid-konserveringsmidlet). Mediet

fjernes ved immobilisering av kulene på en magnet og erstattes med ferskt medium.

• Kulene blandes med cellene og suspensjonen inkuberes i 30 minutter på is.

Suspensjonen blandes hyppig.

• De kule-dekkede cellene immobiliseres på en manget, og de gjenværende cellene (osteoklast-rik fraksjon) dekanteres over i et sterilt 50 mL sentrifugerer. • Ferskt medium tilsettes til de kule-dekkede cellene for å fordrive eventuelt innfangede osteoklaster. Denne vaskeprosessen gjentas 10x. De kule-dekkede cellene kasseres. • De levende osteoklastene telles i et tellekammer ved å benytte fluorescein-diacetat for å merke levende celler. En engangs Pasteurpipette av plast og med vid lysåpning, benyttes

til å tilsette prøven til kammeret.

• Osteoklastene pelleteres ved sentrifugering og tettheten justeres til det riktige antall i EMEM-medium (antall osteoklaster varieres fra tumor til tumor), supplert med 10%

føtalt kalveserum og 1,7 g/L natriumbikarbonat.

• 3 mL alikvoter av cellesuspensjonen (per behandlingsforbindelse) dekanteres over i

15 mL sentrifugerar. Cellene pelleteres ved sentrifugering.

• Til hvert rør tilsettes 3 mL av den passende behandlingsforbindelse (fortynnet til 50 uM i EMEM-mediet). Dessuten inkluderes passende bærermiddelkontroller, en positiv kontroll (anti-vitronektinreseptor murint monoklonalt antistoff [87MEM1] fortynnet til 100 p.g/mL) og en isotype kontroll (IgG2a, fortynnet til 100 p.g/mL). Prøvene inkuberes

ved 37°C i 30 minutter.

• 0,5 mL alikvoter av cellene utsås på sterile dentinskiver i en 48-brønnsplate og inkuberes ved 37°C i 2 timer. Hver behandling underkastes screening i fire paralleller. • Skivene vaskes i seks utskiftninger med varm PBS (10 mL/brønn i en 6-brønnsplate) og anbringes deretter i ferskt medium inneholdende behandlingsforbindelsen eller kontrollprøver. Prøvene inkuberes ved 37°C i 48 timer.

TARTRAT-RESISTENT SUR FOSFATASE (TRAP) PROSEDYRE

(FARVER SELEKTIVT FOR CELLER AV OSTEOKLASTLINJEN)

• Benskivene som inneholder de tilfestede osteoklaster vaskes i fosfatbuffret saltvann og fikseres i 2% glutaraldehyd (i 0,2M natriumkakodylat) i 5 minutter.

• De vaskes deretter i vann og inkuberes i 4 minutter i TRAP-buffer ved 37°C

(0,5 mg/mL naftol AS-BI fosfat løst i N,N-dimetylformarnid og blandes med 0,25M

citratbuffer (pH 4,5) inneholdende 10 mM natriumtartrat.

• Etter en vasking i kaldt vann legges skivene i kald acetatbuffer (0,1M, pH 6,2) inneholdende 1 mg/mL «fast red garnet» og inkuberes ved 4°C i 4 minutter. Overskudd av buffer suges av og skivene lufttørkes etter en vask i vann.

De TRAP-positive osteoklastene (murstensrødt/purpur bunnfall) telles ved lysfelt-mikroskopi og fjernes deretter fra overflaten av dentinet med ultralyd.

Grop-volumer bestemmes ved å benytte det Nikon/Lasertec ILM21W konfokale

mikroskop.

TEST 2 (VED BRUK AV ELISA-AVLESNING)

De humane osteoklastene anrikes og tilberedes for forbindelses-screening som beskrevet i de første 9 trinn av Test 1. For klarhetens skyld gjentas disse trinnene nedenfor.

• Alikvoter av humane osteoklastom-avledede cellesuspensjoner tas ut fira oppbevaring i flytende nitrogen, oppvarmes hurtig til 37°C og vaskes lx i RPMI-1640 medium ved

sentrifugering (1000 rpm, 5 min. ved 4°C).

hyppig.

• Kulene blandes med cellene og suspensjonen inkuberes i 30 minutter på is.

Suspensjonen blandes hyppig.

• De kule-dekkede cellene immobiliseres på en manget, og de gjenværende cellene (osteoklast-rik fraksjon) dekanteres over i et sterilt 50 mL sentrifugerar. • Ferskt medium tilsettes til de kule-dekkede cellene for å fordrive eventuelt innfangede osteoklaster. Denne vaskeprosessen gjentas 10x. De kule-dekkede cellene kasseres. • De levende osteoklastene telles i et tellekammer ved å benytte fluorescein-diacetat for å merke levende celler. En engangs Pasteurpipette av plast og med vid lysåpning, benyttes

til å tilsette prøven til kammeret.

• Osteoklastene pelleteres ved sentrifugering og tettheten justeres til det riktige antall i EMEM-medium (antall osteoklaster varieres fra tumor til tumor), supplert med 10% føtalt kalveserum og 1,7 g/L natriumbikarbonat.

Til forskjell fra metoden beskrevet ovenfor under Test 1, underkastes forbindelsen screening i fire doser for å oppnå en ICso, som skissert nedenfor: • Osteoklastpreparatene pre-inkuberes i 30 minutter ved 37°C med testforbindelse (fire doser eller kontroller). • De utsås deretter på bovine kortikale benskiver i brønner i en 48-brønns vevskulturplate og inkuberes i ytterligere 2 timer ved 37°C. • Benskivene vaskes under seks utskiftinger av varmt fosfatbuffret saltvann (PBS) for å fjerne ikke-adhererende celler, og føres deretter tilbake til brønner i en 49-brønnsplate

inneholdende fersk forbindelse eller kontroller.

• Vevskulturplatene inkuberes deretter i 48 timer ved 37°C.

• Supematantene fra hver brønn suges over i individuelle rør og underkastes screening etter en kompetitiv ELISA som påviser det c-telopeptid av type I kollagen som frigjøres under resorpsjonsprosessen. Dette er en kommersielt tilgjengelig ELISA (Osteometer, Danmark) som inneholder et kanin-antistoff som reagerer spesifikt med en 8-aminosyresekvens (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) som forekommer i det karboksyterminale telopeptid av al-kjeden av type I kollagen. Resultatene uttrykkes som % inhibering av resorpsjon sammenlignet med en bæremiddelkontroll.

HUMAN OSTEOKLAST ADHESJONSTEST

De humane osteoklastene anrikes og tilberedes for forbindelses-screening som beskrevet ovenfor i de første 9 trinn av Test 1. For klarhetens skyld gjentas disse trinnene nedenfor.

sentrifugering (1000 rpm, 5 min. ved 4°C).

hyppig.

• Cellene vaskes 2x med kald RPMI-1640 etterfulgt av sentrifugering (1000 rpm., 5 min. ved 4°C), hvorpå cellene overføres til et sterilt 15 mL sentrifugerør. Antall mono-nukleære celler telles i et forbedret Neubauer tellekammer. • Tilstrekkelig antall magnetiske kuler (5/mononukIeær celle), dekket med geit-anti-mus IgG (Dynal, Great Neck, NY) uttas fra deres oppbevaringsflaske og anbringes i 5 mL ferskt medium (dette vasker bort det toksiske azid-konserveringsmidlet). Mediet

• Kulene blandes med cellene og suspensjonen inkuberes i 30 minutter på is.

Suspensjonen blandes hyppig.

til å tilsette prøven til kammeret.

Osteoklastom-avledede osteoklaster for-inkuberes med forbindelse (fire doser) eller kontroller ved 37°C i 30 minutter. • Cellene utsås deretter på osteopontin-dekkede objektglass (human- eller rotte-osteopontin, 2,5 p.g/mL) og inkuberes i 2 timer ved 37°C. • Ikke-adhererende celler fjernes ved å vaske obj ekt glassene grundig i fosfatbuffret saltvann, og cellene som blir igjen på glassene fikseres i aceton. • Osteoklastene farves for tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP), en selektiv markør for celler av denne fenotype (se trinn 15-17) og telles ved lysmikroskopi. Resultatene uttrykkes som % inhibering av adhesjon sammenlignet med en bæremiddelkontroll.

CELLEADHESJONSTEST

Celler og cellekultur

Humane embryoniske nyreceller (HEK293 celler) ble anskaffet fra ATCC (katalog nr. CRL 1573). Celler ble dyrket i Earls minimale essensielle medium (EMEM) inneholdende Earls salter, 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin-streptomycin.

Konstruksjoner og transfeksjoner

Et 3,2 kb EcoRI-Kpnl-fragment av cvsubenheten og et 2,4 kb Xbal-XhoI-fragment av p3-subenheten ble innskutt i EcoRI-EcoRV-kloningssetene av pCDN-vektoren (Aiyar et al., 1994) som inneholder en CMV-promoter og en G418 selekterbar markør, ved butt ende-ligering. For stabil ekspresjon ble 8xl0<6> HEK293-celler elektro-overført med Ovp3-konstruksjoner (20 p,g DNA av hver subenhet) ved å benytte en Gene Pulser (Hensley et al., 1994) og utplatet i 100 mm plater (5xl0<5> celler/plate).

Etter 48 timer ble vekstmediet supplert med 450 u.g/mL Geneticin (G418 sulfat, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Cellene ble holdt i seleksjonsmedium inntil koloniene var tilstrekkelig store til å bestemmes.

Immuncytokjemisk analyse av transfekterte celler

For å bestemme hvorvidt HEK293 transfektantene uttrykte vitronektinreseptoren, ble cellene immobilisert på objektglass ved sentrifugering, fiksert i aceton i 2 minutter ved romtemperatur og lufttørket. Spesifikk reaktivitet med 23C6, et monoklonalt antistoff spesifikt for avP3-komplekset, ble demonstrert ved å benytte en standard indirekte immunfluorescensmetode.

Celleadhesjonsundersøkelser

Coming 96-brønns ELIS A-plater ble på forutdekket over natten ved 4°C med

0,1 mL human vitronektin (0,2 ug/mL i RPMI-medium). På forsøkstidspunktet ble platene vasket én gang med RPMI medium og blokkert med 3,5% BSA i RPMI-medium i 1 time ved romtemperatur. Transfekterte 293-celler ble resuspendert i RPMI-medium, supplert med 20 mM Hepes, pH 7,4, og 0,1% BSA til en tetthet på 0,5x10<6> celler/mL. 0,1 mL

cellesuspensjon ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time ved 37°C, i eller uten nærvær av ulike avp3-antagonister. Etter inkubering ble 0,025 mL av en 10% formaldehydløsning, pH 7,4, tilsatt, og cellene ble fiksert ved romtemperatur i 10 minutter. Platene ble vasket tre ganger med 0,2 mL RPMI-medium og de adhererende cellene farvet med 0,1 mL 0,5% toluidinblått i 20 minutter ved romtemperatur. Overskytende farve ble fjernet ved grundig vasking med deionisert vann. Toluidinblått inkorporert i celler ble eluert ved tilsetning av 0,1 mL 50% etanol inneholdende 50 mM HC1. Celleadhesjon ble kvantifisert ved en optisk tetthet på 600 nm på en mikrotiterplateleser (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).

Fast-fase OvpYbindingstest

Vitronektinreseptoren ctvps ble renset fra human placenta. Reseptor-tilberedning ble fortynnet med 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2) 1 mM MgCl2 (buffer A) og umiddelbart tilsatt til 96-brønns ELIS A-plater som 0,1 mL per brønn. 0,1-0,2 p.g av avp3 ble tilsatt per brønn. Platene ble inkubert over natten ved 4°C. På forsøkstidspunktet ble brønnene vasket én gang med buffer A og inkubert med 0,1 mL 3,5% bovint serumalbumin i den samme buffer i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble brønnene suget fullstendig av og vasket to ganger med 0,2 mL buffer A.

I en [<3>H]SK&F-107260 kompetitiv test, ble forskjellige konsentrasjoner umerkede antagonister (0,001-100 uM) tilsatt til brønnene, etterfulgt av tilsetning av 5,0 nM [3H] SK&F-107260. Platene ble inkubert i 1 time ved romtempertaur. Etter inkubering ble brønnene suget fullstendig av og brønn etter brønn vasket én gang med 0,2 mL iskald buffer A. Reseptorene ble solubilisert med 0,1 mL 1% SDS og det bundne [<3>H]SK&F-107260 ble bestemt ved væskescintillasjonstelling ved tilsetning av 3 mL Ready Safe i en Beckman LS 6800 Liquid Scintillation Counter, med 40% effektivitet. Uspesifikk binding av [<3>H]SK&F-107260 ble bestemt i nærvær av 2 uM SK&F-107260 og var konsekvent mindre enn 1% av totalt innsatt radioligand. IC50 (konsentrasjon av antagonist til å inhibere 50% binding av [<3>H]SK&F-107260) ble bestemt ved en ulineær, minste kvadraters kurvetilpasningsrutine som var modifisert fra LUNDON-2 programmet. Kj-verdien (dissosiasjonskonstant av antagonisten) ble beregnet i henhold til Cheng og Prusoffs ligning: Kj=IC5o/(l+L/Kd), hvor L og Kd var henholdsvis konsentrasjonen og dissosiasjonskonstanten av [<3>H]SK&F-107260.

Inhibering av RGD-mediert GPIIb-IIIa-binding

Rensing av GPIIb-IIIa

Ti enheter datoutgåtte, vaskede humane blodplater (fra Røde Kors) ble lysert ved forsiktig omrøring i 3% oktylglukosid, 20 mM Tris-HCI, pH 7,4,140 mM NaCl, 2 mM CaCl2 ved 4°C i 2 timer. Lysatet ble sentrifugert ved 100.000 g i 1 time. Den oppnådde supernatant ble avsatt på en 5 mL lentil-lektin-sepharose 4B kolonne (E.Y. Labs) på forhånd ekvilibrert med 20 mM Tris-HCI, pH 7,4,100 mM NaCl, 2 mM CaCl2) 1% oktylglukosid (Buffer A). Etter 2 timers inkubering ble kolonnen vasket med 50 mL kald buffer A. GPnb-IHa holdt tilbake på lektinet, ble eluert med buffer A inneholdende 10% dekstrose. Alle operasjoner ble foretatt ved 4°C. Det oppnådde GPIIb-IIIa var ifølge SDS polyakrylamidgelelektroforese >95% rent.

Inkorporering av GPUb-IJJa i liposomer

En blanding av fosfatidylserin (70%) og fosfatidylkolin (30%) (Avanti Polar Lipids) ble tørket til veggene av et glassrør under en strøm av nitrogen. Renset GPIIb-IIIa ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg/mL og blandet med fosfolipidene i et protein:fosfolipid-forhold på 1:3 (vektdeler). Blandingen ble resuspendert og ultralyd-behandlet i et ultralydbad i 5 minutter. Blandingen ble deretter dialysert over natten ved å benytte et dialyserør med en molekylvektsperre på 12.000-14.000 mot et 1000 gangers overskudd av 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (med to utskiftinger). De GPUb-IUa-holdige liposomene ble sentrifugert ved 12.000 g i 15 minutter og resuspendert i dialysebufferen til en endelig proteinkonsentrasjon på ca. 1 mg/mL. Liposomene ble oppbevart ved -70°C inntil de trengtes.

Kompetitiv binding til GPIIb-IIIa

Bindingen til fibrinogenreseptoren (GPJJb-IJJa) ble bestemt ved en indirekte kompetitiv bindingsmetode under bruk av [<3>H]SK&F-107260 som en RGD-type ligand. Bindingstesten ble foretatt i en 96-brønns filtreringsplateutrustning (Millipore Corporation, Bedford, MA) ved å benytte 0,22 uM hydrofile durapore membraner. Brønnene ble forutbelagt med 0,2 mL 10 ug/mL polylysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ved romtemperatur i 1 time for blokkere uspesifikk binding. Forskjellige konsentrasjoer umerkede benzazepiner ble tilsatt til brønnene i fire paralleller. [<3>H]SK&F-107260 ble tilsatt hver brønn i en sluttkonsentrasjon på 4,5 nm, etterfulgt av tilsetning av 1 jag av de rensede blodplate-GPnb-IJJa-holdige liposomene. Blandingene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. GPIIb-UJa-bundet [<3>H]SK&F-107260 ble separert fra det ubundne ved filtrering under bruk av en Millipore filtrerings-manifold, etterfulgt av vask med iskald buffer (to ganger å 0,2 mL). Bundet radioaktivitet som var igjen på Alterene, ble tellet i 1,5 mL Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA) i en Beckman Liquid Scintillation Counter (modell LS6800) med 40% effektivitet. Uspesifikk binding ble bestemt i nærvær av 2 uM umerket SK&F-107260 og var konsekvent mindre enn 0,14% av den totale radioaktivitet tilsatt til prøvene. Alle datapunktene er gjennomsnittet av fire parallellbestemmelser.

Kompetitive bindingsdata ble analysert ved en ulineær minste kvadraters kurvetilpasning. Denne metode gir ICso-verdiene av antagonistene (konsentrasjon av antagonist som inhiberer spesifikk binding av [ H] SK&F-107260 med 50% ved likevekt. ICso er relatert til likevekts-dissosiasjonskonstanten (Kj) av antagonisten basert på Cheng og Prusoff-ligningen: Ki=IC50/(l+L/Kd), hvor L er konsentrasjonen av [<3>H]-SK&F-107260 benyttet i den kompetitive bindingstest (4,5 nM), og Kd er dissosiasjonskonstanten av [3H] SK&F-107260 som ifølge Scatchard-analyse er 4,5 nM.

Effektiviteten av forbindelsen med formel (I) alene eller i kombinasjon med et anti-neoplastisk middel, kan bestemmes ved å benytte flere transplanterbare musetumor-modeller. Se US-patent 5.004.758 og 5.633.016 angående detaljer ved disse modellene.

EKSEMPLER

Generelt

Proton-kjernemagnetisk resonans (<l>H NMR) spektra ble tatt opp ved 300 MHz, og kjemiske skift er angitt i ppm (parts per million) (6) nedstrøms fra den interne standarden tetrametylsilan (TMS). Forkortelser for NMR-data er som følger: s=singlett, d=dublett, t=triplett, q=kvartett, m=multiplett, dd=dobbeldublett, dt, dobbeltripletter, app=tilsynelatende, br=bred. J indikerer NMR-koblingskonstanten målt i Hertz. CDCb er deuteriokloroform, DMSO-de er heksadeuteriodimetylsulfoksyd og CD3OD er tetradeuteriometanol. Massespektra ble tatt opp ved å benytte elektrospray (ES) ionisasjonsteknikker. Elementanalyser ble foretatt ved Quantitative Technologies Inc., Whitehouse, NJ. Smeltepunkter ble bestemt på et Thomas-Hoover smeltepunktsapparat og er ukorrigerte. Alle temperaturer er angitt i Celcius grader. Analtech Silica Gel GF og E. Merck Silica Gel 60 F-254 tynnskiktplater ble benyttet for tynnskiktkromatografi. Hurtigkromatografi (flash chromatography) ble foretatt på E. Merck kiselgel 60 (230-

400 mesh) silikagel. Analytisk og preparativ HPLC ble foretatt på Beckman kromatografer. ODS refererer seg til en oktadekylsilyl-derivatisert silikagel-kromatografibærer.

YMC ODS AQ® er en ODS-kromatografisk bærer, og er et registrert varemerke tilhørende YMC Co. Ltd., Kyoto, Japan. PRP-1® er en polymer (styren-divinylbenzen) kromatografisk bærer og er et registrert varemerke tilhørende Hamilton Co., Reno, Nevada, Celite® er en filterhjelp sammensatt av syrevasket diatomé-silika, og er et registrert varemerke tilhørende Manville, Corp., Denver, Colorado.

Fremstilling 1

Fremstilling av 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yI)-l-etanoI

a) 2-metyl-8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyridin

35,58 mmol), 10% Pd/C (1,14 g, 1,07 mmol) og absolutt EtOH (70 mL) ble deoksygenert gjennom tre evakuerings/H2 gjennomspylingsrunder, deretter omrørt kraftig under en H2-ballong. Etter 18,5 timer ble blandingen filtrert gjennom Celite®, og filterlaget ble vasket suksessivt med absolutt EtOH og EtOAc. Filtratet ble konsentrert til tørrhet, og residuet ble rekonsentrert fra EtOAc og etterlot et hvitaktig faststoff (5,25 g).

En løsning av materialet ovenfor (5,25 g), di-tert-butyldikarbonat (15,53 g,

71,16 mmol) og CH2G2 (10 mL) ble konsentrert på en rotasjonsfordamper for å fjerne løsningsmidlet, og det oljeaktige residuet ble oppvarmet under N2 i et oljebad innstillet på 55-60°C. Etter 45 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til RT, og residuet hurtig-kromatografert på silikagel (40% EtOAc/heksaner). Tittelforbindelsen (4,90 g, 55%) ble oppnådd som et lysegult faststoff: <*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,27 (d, J=7,6Hz, 1H), 6,81 (d, J=7,6Hz, 1H), 3,69-3,79 (m, 2H), 2,65-2,75 (m, 2H), 2,48 (s, 3H), 1,83-1,98 (m, 2H), 1,52 (s, 9H); MS (ES) m/e 249

(M+H)<+>.

b) Etyl-[8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-natfyridin-2-yl]acetat

Til en løsning av diisopropylamin (7,24 mL, 55,3 mmol) i tørr THF (50 mL) ble det

dråpevis tilsatt n-BuLi (2,5M i heksaner, 22 mL, 55,3 mmol) ved 0°C. Etter 15 minutter ble denne løsningen dråpevis tilsatt til en løsning av 2-metyl-8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-

tetrahydro-l,8-naftyridin (4,9 g, 19,7 mmol) og dietylkarbonat (8,86 mL, 73,0 mmol) i tørr THF (50 mL) ved -78°C. Etter 30 minutter ble reaksjonen avbrutt med mettet NH4C1

(100 mL), blandingen oppvarmet til RT og ekstrahert med EtOAc (3 x 200 mL). De kombinerte organiske ekstraktene ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk. Residuet ble kromatografert på silikagel (40% EtOAc/heksaner) for å gi tittelforbindelsen (5,72 g, 91%) som en lysegul olje: MS (ES) m/e 321 (M+H)<+>.

c) 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l ,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol

Til en løsning av etyl-[8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yljacetat (5,72 g, 17,85 mmol) i tørr THF (80 mL) ble det ved RT tilsatt LiBH4 (2,0M i THF, 10,7 mL, 21,42 mmol), og den resulterende blanding ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til 0°C og reaksjonen forsiktig avbrutt med H20 (100 mL). Etter 10 minutter ble blandingen ekstrahert med EtOAc (3 x 100 mL). De kombinerte organiske ekstraktene ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk.

Residuet ovenfor (4,9 g) ble løst i CH2CI2 (10 mL). Til dette ble det i én porsjon tilsatt 4N HC1 i dioksan (20 mL) ved RT. Etter 4 ble blandingen konsentrert under redusert trykk. Residuet ble tatt opp i 1:1 blanding av 1,0 N NaOH og mettet NaCl (100 mL) og ekstrahert med CH2C12 (3 x 100 mL). De kombinerte organiske ekstraktene ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk. Residuet ble kromatografert på silikagel (10% MeOH i 1:1 EtOAc/CHCl3) for å gi tittelforbindelsen (2,09 g, 66%) som et gult faststoff: MS (ES) m/e 179 (M+H)<+>.

Fremstilling 2

Fremstilling av etyl-(±)-10,ll-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d|

cyklohepten-10-acetat

a) 6-metoksy-l-fenylinden

En løsning av 3,0M fenylmagnesiumbromid i Et20 (680 mL, 2,04 mol) ble under

argon ved romtemperatur fortynnet med Et20 (700 mL) under omrøring, hvorpå en løsning av 6-metoksy-l-indanon (277 g, 1,71 mol) i THF (1400 mL) dråpevis ble tilsatt i løpet av 1 time. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur og deretter under omrøring helt over i mettet NRiCl (2,8 L). H20 (1,4 L) ble tilsatt og den organiske fase fraskilt. Den vandige fase ble ekstrahert med Et20 (2x1 L), og de kombinerte organiske ekstraktene ble konsentrert for å gi rå 6-metoksy-l-fenyl-l-indanol (445 g) som en brun olje. Denne oljen ble løst i toluen (2,5 L) og tilsatt p-toluensulfonsyremonohydrat (12,3 g, 0,065 mol). Løsningen ble omrørt og kokt under tilbakeløpskjøling i 16 timer ved å benytte en Dean-Stark felle med kjøler. H20-oppsamlingen var minimal etter 2 timer og utgjorde totalt 28 mL. Løsningen ble avkjølt og ekstrahert suksessivt med 5% vandig Na2C03 (IL)

og H20 (2x1 L). Det organiske lag ble konsentrert og ga en mørkebrun olje (400 g). Denne oljen ble destillert under vakuum og førte til tittelforbindelsen (298,2 g, 79%) som en gul olje: kp 152-190°C/2,0 Torr; TLC (10% EtOAc/heksaner) Rf 0,75.

b) 2-benzoyI-4-metoksyfenyleddiksyre

Aceton (4,2 L) ble avkjølt til 10°C og en løsning av 6-metoksy-l-fenylinden (271 g,

1,22 mol) i aceton (1,8 L) tilsatt i løpet av 1,5 timer samtidig med Jones reagens (1,8 L, fremstillet fra Cr03 (470 g, 4,70 mol), H20 (1 L) og kons. H2S04 (405 mL)). 4% vandig OsC<4 (153 mL) ble tilsatt til den resulterende blanding i to porsjoner, den ene ved tilsetningsstarten og den andre midt under tilsetningen, hvorunder temperaturen av reaksjonsblandingen ble holdt lavere enn 15°C. Etter tilsetningen ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 22°C og omrørt i 1,5 timer, hvorunder en svak eksoterm økte temperaturen til 28°C. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til lavere enn 20°C og tilsatt isopropanol (1 L), til å begynne med dråpevis og etter at den innledende eksoterm hadde avtatt, hurtig. Omrøring ble vanskelig under denne fase. Temperaturen nådde 32°C under isopropanol-tilsetningen. H20 (2 L) ble tilsatt og blandingen overført til en skilletrakt. Mer H20 ble tilsatt for å løse den utfelte kromsyre, og blandingen ble ekstrahert med CH2C12 (2 L). Det organiske (øvre) lag ble fraskilt og den vandige fase ekstrahert med CH2C12 (2x1 L). De kombinerte CH2Cl2-ekstraktene ble vasket suksessivt med H20 (2 L) og mettet saltvann (2 L), og deretter konsentrert for å gi et fuktig grått faststoff (416 g). Dette ble utgnidd med en blanding av aceton og EtOAc og filtrert og tørket for å gi tittelforbindelsen (225,4 g, 71%) som et hvitaktig faststoff, smp. 158-159°C.

c) 2-benzyl-4-metoksyfenyleddiksyre

2-benzoyl-4-metoksyfenyleddiksyre (215,5 g, 0,80 mol) ble delt i to like deler og

hver del ble løst i iseddik (1,5 L) i en 2,5 L trykkflaske. 5% Pd/C (10 g, 0,0048 mol) ble tilsatt til hver, og hver blanding ble ristet ved romtemperatur under hydrogen på et Parr-apparat. Etter 2,5 timer ble blandingen filtrert for å fjerne katalysatoren, og filterlagene ble vasket med EtOAc. De kombinerte filtratene ble konsentrert for å gi tittelforbindelsen (215 g, kvantitativt) som en tung gul olje som krystalliserte ved henstand: 'H NMR (250 MHz, CDCI3) 5 7,05-7,35 (m, 6H), 6,77 (dd, J=8,3, 2,7Hz, 1H), 6,71 (d, J=2,7Hz, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (s, 2H).

d) 10,11 -dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

En løsning av 2-benzyl-4-metoksyfenyleddiksyre (215 g råmateriale som inneholdt

204,6 g (0,80 mol) rent materiale) i CH2C12 (1 L) ble omrørt under argon ved romtemperatur, hvorpå DMF (1 mL) og deretter oksalylklorid (400 mL, 4,59 mol) ble tilsatt. Oksalylkloridet ble tilsatt i løpet av 1 time, til å begynne med dråpevis for å kontrollere den

kraftige gassutviklingen. Løsningen ble omrørt i 16 timer ved romtemperatur,og ble deretter konsentrert for å gi det rå syrekloridet (207,7 g, 0,756 mol, 95%) som en gul væske. Denne væsken ble løst i CH2CI2 til et totalvolum på 500 mL, og løsningen og AICI3 (100,8 g, 0,756 mol) ble tilsatt samtidig i løpet av 1 time til CH2C12 (3,7 L) under omrøring ved romtemperatur under argon. Temperaturen var 28°C ved fullført tilsetning. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer ved romtemperatur, hvorunder et faststoff utfeltes. H20 (1 L) ble tilsatt til å begynne med dråpevis, i løpet av 30 minutter. Blandingen ble deretter separert, og den organiske fase ble vasket suksessivt med H2O (1 L) og 5% vandig NaHC03 (1 L). CH2C12-Iøsningen ble deretter konsentrert for å gi et gult faststoff (175,3 g). Omkrystallisering fra EtOAc/heksan ga tittelforbindelsen (128 g, 71%): smp. 107-109°C. e) Etyl-(±)-10,11 -dihydro-10-hydroksy-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat En 1,0M løsning av litium-bis(trimetylsilyl)amid i heksaner (1282 mL, 1,282 mol) ble tilsatt til THF (4,0 L) ved -70°C under argon, hvorpå EtOAc (146 mL, 1,49 mol) dråpevis ble tilsatt i løpet av 20 minutter. Reaksjonsblandingen fikk omrøres i 15 minutter og ble deretter tilsatt N,N,N',N'-tetrametyIetylendiamin (378 mL, 2,5 mol) i løpet av 20 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 10 minutter og deretter dråpevis tilsatt en løsning av 10,1 l-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on (119,2 g, 0,50 mol) i vannfritt THF (1,26 L) i løpet av 40 minutter. Temperaturen ble holdt lavere enn -65°C under alle disse tilsetningene. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 20 minutter ved -65 til -70°C og deretter helt over i mettet vandig NH4CI (6,2 L) under kraftig omrøring. Det organiske lag ble fraskilt og den vandige fase ekstrahert med EtOAc (2x1 L). De kombinerte organiske ekstraktene ble vasket med H2O (2 x 1 L) og ble deretter konsentrert for å gi en lysebrun olje (175 g). Tynnskiktkromatografi (20% EtOAc/heksaner) viste ved Rf 0,5 hovedflekk (ønsket produkt) og Rf 0,7 mindre flekk (gjenvunnet keton). Råproduktet ble kromatografert på silikagel (2 kg, 10% EtOAc/heksaner) for å gi tittelforbindelsen (101 g, 61%) som en gul olje: 'H NMR (250 MHz, CDCI3) 6 7,63 (d, J=7,7Hz, 1H), 7,00-7,30 (m, 4H), 6,80 (d, J=2,6Hz, 1H), 6,69 (dd, J=8,2, 2,6Hz, 1H), 3,95-4,35 (m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 1H), 3,64 (d, J=14,2Hz, 1H), 3,35 (d, J=14,2Hz, 1H), 2,79 (d, J=16,0Hz, 1H), 2,66 (d, J=16,0Hz, 1H), 1,22 (t, J=7,2Hz, 3H).

f) Etyl-(+)-10,ll-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Etyl-(±)-10,11 -dihydro-10-hydroksy-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat (101 g, 0,31 mol) ble løst i iseddik (1,8 L) og tilsatt 12N HC1 (28,5 mL, 0,34 mol). Blandingen ble anbragt i en 2,5 L trykkflaske inneholdende 5% Pd/C (20 g, 0,0094 mol), og den resulterende blanding ble ristet ved 35°C under hydrogen på et Parr-hydrogeneringsapparat forsynt med en varmekappe. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og katalysatoren fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert for å gi en lysegul olje (85,1 g). Denne ble kromatografert på silikagel (2 kg, trinn-gradient med 5% til 10% EtOAc/heksaner) for å gi tittelforbindelsen (69,1 g, 72%) som en olje: 'H NMR (250 MHz, CDC13) 5 7,05-7,22 (m, 4H), 7,01 (d, J=8,2Hz, 1H), 6,76 (d, J=2,7Hz, 1H), 6,67 (dd, J=8,2, 2,7Hz, 1H), 4,30 (d, J=15,0Hz, 1H), 4,11-4,25 (m, 2H), 3,85 (d, J=15,0Hz, 1H), 3,70-3,90 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,31 (dd, J=15,0,4,1Hz, 1H), 2,93 (dd, J=15,0, 9,2Hz, 1H), 2,64 (dd, J=15,6, 5,0Hz, 1H), 2,52 (dd, J=15,6,9,3Hz, 1H), 1,27 (t, J=7,lHz, 3H).

g) Etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

En løsning av etyl-(±)-10,ll-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat (8,5 g, 0,027 mol) i CH2C12 (150 mL) ble avkjølt til -10°C under omrøring under argon. Etantiol (10,7 mL, 0,144 mol) ble tilsatt, etterfulgt av A1C13 (20,6 g, 0,154 mol) i to porsjoer i løpet av 15 minutter. En eksoterm øket temperaturen til 0°C etter tilsetningene, og temperaturen ble deretter øket til 25°C ved å benytte et vannbad. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 25 til 30°C i 2,25 timer, og på dette tidspunkt ble den helt over i is-H20. Det organiske lag ble fraskilt, metanol (100 mL) ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert med CH2C1S (2 x 50 mL). De kombinerte CH2Cl2-ekstraktene ble vasket med H20

(250 mL) og deretter konsentrert for å gi en viskøs olje (8,6 g). Denne ble tatt opp i Et20 (150 mL), hvoretter eteren ble avkokt og erstattet med heksan. Den ønskede fenol utskiltes først som en olje, som krystalliserte ved omrøring ved romtemperatur. To faststoff-fraksjoner ble oppsamlet og ga tittelforbindelsen (7,1 g, 89%): smp. 110-112°C.

Fremstilling 3

HPLC-separasjon av enantiomerene av etyl-(±)-10,ll-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo [a,d] cyklohepten-10-acetat

a) Etyl-(R)-(+)-10,l l-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat og etyl-(S)-(-)-10,11 -dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-l 0-acetat

Etyl-(±)-10,ll-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat ble spaltet i dets enantiomerer ved å benytte følgende betingelser: Daicel Chiralcel OJ® kolonne (21,2 x 250 mm), 20% etanol i heksan som mobilfase, 15 mL/min. strømnings-hastighet, UV-deteksjon ved 254 nm, 140 mg injeksjon; tR for etyl-(S)-(-)-10,l l-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cykloheksen-10-acetat=10,4 min.; tR for etyl-(R)-(+)-10,l 1-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cykloheksen-10-acetat=13,l min.

Fremstilling 4

Fremstilling av 10,ll-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

a) 2-benzyl-4-metoksyfenyleddiksyre

En løsning av 2-benzoyl-4-metoksyfenyleddiksyre (13,0 g, 0,048 mol), fremstillet

etter metoden i J. Med. Chem., 1981, 24, 998, i iseddik (600 mL) ble under argon behandlet med 4,3 g 10% Pd/C og hydrogenert ved 3,4 atm. i 17 timer. Blandingen ble filtrert ved bruk av Celite®, og filtratet ble konsentrert og rekonsentrert fra toluen og metylenklorid for å gi 14,2 g av tittelforbindelsen: <]>H NMR (400 MHz, CDC13) 8 3,52 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 6,7 (m, 2H), 7,15 (m, 6H).

b) 10,1 l-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten- 10-on

En løsning av 2-benzyl-4-metoksyfenyleddiksyre (14,2 g, 0,055 m) i benzen

(120 mL) og tionylklorid (28 mL) ble kokt under tilbakeløpskjøling i 1 time og konsentrert. Syrekloridet ble løst i tørr metylenklorid (40 mL), og løsningen ble tilsatt dråpevis under argon til en løsning av AICI3 (14,7 g, 0,11 mol) i metylenklorid (600 mL). Reaksjonsblandingen ble omrørt under argonatmosfære i 2,5 timer ved romtemperatur, hvorpå reaksjonen ble avbrutt med is-vann (200 mL). Lagene ble separert, og den organiske fase ble vasket suksessivt med 10% NaOH-løsning, vann og fortynnet HC1. Den resulterende løsning ble fortynnet med eter (200 mL), tørket over MgSCv og konsentrert. Det faste residuet ble utgnidd med eter/heksan (1:1), og 9,35 g av tittelforbindelsen ble oppsamlet ved filtrering; smp. 105-106°C;

<]>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 3,72 (s, 3H), 4,1 (s, 2H), 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, 1H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (m, 4H), 8,1 (d, 1H).

Fremstilling 5

Fremstilling av etyl-(±)-10,ll-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]

cyklohepten-10-acetat

a) Etyl-(+)-3-(3-metoksyfenyl)indenacetat

Til en kald løsning av 3-(3-metoksyfenyl)inden (4 g, 18 mmol), fremstillet etter

metoden i J. Med. Chem., 1981,24,998, i THF (15 mL) ble det ved 0°C dråpevis tilsatt en løsning av LiN(TMS)2 (20 mL, IM i THF) i løpet av 5 minutter. Den resulterende løsning ble dråpevis tilsatt til en løsning av etylbromacetat (3,34 g, 20 mmol) i THF (15 mL) ved

-78°C i løpet av 30 minutter. Etter 2,5 timer ble reaksjonen avbrutt med mettet ammonium-kloridløsning og lagene separert. Det organiske lag ble tørket over MgS02 og konsentrert for å gi råproduktet som ble renset ved kolonnekromatografi (Si02/2-4% EtOAc/heksan) for å gi tittelforbindelsen (1,1 g): 'H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 1,30 (t, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 6,6 (s, 1H), 6,9 (m, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 6H).

b) Etyl-(±)-3-[(3-metoksybenzoyl)]fenylsuccinat

En løsning av etyl-(±)-3-(3-metoksyfenyl)indenacetat (1,1 g, 3,6 mmol) i aceton

(30 mL) ble behandlet med 4% vandig løsning av osmiumtetroksyd (0,5 mL), etterfulgt av dråpevis tilsetning av 1,2M Jones reagens (5 mL, 6 mmol) i henhold til litteraturmetoden (J. Org. Chem., 1993,58, 4745). Etter omrøring over natten ved romtemperatur, ble den mørke reaksjonsblandingen fortynnet med isopropanol (2,5 mL), etterfulgt av natrium-bisulfitt (0,9 g) og vann (30 mL). Produktet ble ekstrahert med etylacetat, vasket med saltvann, tørket over MgS04 og konsentrert for å gi et fast residuum. Utgnidning med 1:1 eter/heksan ga 0,76 g av tittelforbindelsen: 'H NMR (400 MHz, CDC13) 5 1,18 (t, 3H), 2,90 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m, 6H).

c) Etyl-(±)-3-[(3-metoksybenzyl)]fenylsuccinat

En blanding av etyl-(±)-3-[(3-metoksybenzoyl)]fenylsuccinat (0,76 g, 2,1 mmol) og

10% Pd/C (0,6 g) i iseddik (35 mL) ble hydrogenert ved 3,4 atm. i 17 timer. Blandingen ble filtrert ved å benytte Celite®, og filterlaget ble vasket med eddiksyre. Filtratet ble konsentrert og rekonsentrert fra toluen og metylenklorid for å gi 0,65 g av tittelforbindelsen: <*>H NMR (400 MHz, CDC13) 8 1,20 (t, 3H), 2,20 (m, 1H), 3,0 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H), 6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).

d) Etyl-(±)-10,l l-dihydro-3-metoksy-l l-okso-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat

Til en magnetomrørt løsning av etyl-(±)-3-[(3-metoksybenzyl)]fenylsuccinat

(0,65 g, 1,9 mmol) i tørr metylenklorid (10 mL) ble det tilsatt DMF (0,2 mL) og oksalylklorid (0,2 mL, 2,28 mmol). Etter 1,5 timer ble løsningen dråpevis tilsatt til en suspensjon av aluminiumklorid (0,6 g, 4,5 mmol) i tørr metylenklorid (15 mL). Reaksjonen ble etter 2 timer avbrutt med isvann, lagene separert og det vandige lag ekstrahert med metylenklorid. De kombinerte organiske lagene ble tørket over MgS04 og konsentrert. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi (Si02/2-4% EtOAc/heksan) for å gi tittelforbindelsen (0,3 g): 'H NMR (400 MHz, CDCI3) 8 1,28 (t, 3H), 2,88 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,88 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,85 (d, 1H), 4,95 (m, 1H), 5,8 (m, 2H), 7,22 (m, 4H), 8,1 (s, 1H).

e) Etyl-(±)-l 0,11 -dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-l 0-acetat

En blanding av etyl-(±)-10,l l-dihydro-3-metoksy-l l-okso-5H-dibenzo-[a,d]cyklohepten-l0-acetat (0,3 g, 0,93 mmol) og 10% Pd/C (0,3 g) i iseddik (25 mL) ble hydrogenert ved 3,4 atm. i 18 timer. Blandingen ble filtrert ved bruk av Celite® og vasket med eddiksyre. Filtratet ble konsentrert og rekonsentrert fra toluen og metylenklorid for å gi 0,25 g av tittelforbindelsen: <]>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 1,28 (t, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,85 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,30 (d, 1H), 6,70 (m, 2H), 7,0 (d, 1H), 7,22 (m, 4H).

Det følgende eksempel illustrerer en fremgangsmåte for fremstilling av den biologisk virksomme forbindelse ifølge denne oppfinnelse fra mellomprodukter beskrevet under Fremstillingene foran.

Eksempel 1

Fremstilling av (S)-10,ll-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etoksy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-eddiksyre

a) Etyl-(S)-10,ll-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tet^ dibenzo[a,d] cyklohepten-10-acetat

Til en løsning av etyl-(S)-10,l l-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat (200 mg, 0,67 mmol), 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-nafl<y>ridin-2-yl)-l-etanol (241 mg, 1,35 mmol) og PPh3 (354 mg, 1,35 mmol) i tørr THF (5 mL) ble det tilsatt diisopropylazodikarboksylat (0,27 mL, 1,35 mmol) ved 0°C. Blandingen fikk oppvarmes til RT etter som badet ble oppvarmet. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert under redusert trykk. Residuet ble kromatografert på silikagel (1:4,5 heksaner/Et20) for å gi tittelforbindelsen (94 mg, 31%) som en klar olje: MS (ES) m/e 457 (M+H)<+.>

b) (S)-10,ll-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tefrahy dibenzo[a,d] cyklohepten-10-eddiksyre

Til en løsning av etyl-(S)-10,l l-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naflyridin-2-yl)-l-etoksy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat (131 mg, 0,29 mmol) i THF/H20

(2 mL) ble det tilsatt 1,0N LiOH (0,43 mL, 0,43 mmol), hvorpå blandingen ble oppvarmet til 50°C. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til RT og vasket med Et20 (2x2 mL). Det vandige lag ble surgjort til pH 6 ved å benytte 10% HC1. Den resulterende melkeaktige løsning ble sendt gjennom en C-l 8 bond-elute kolonne (gradient-eluering: H20, deretter 20% CH3CN/H20, deretter CHC13 som eluent). Prodduktholdige fraksjoner ble konsentrert under redusert trykk for å gi tittelforbindelsen (30 mg, 24%) som et hvitt pulver: MS (ES) m/e429(M+H)<+>.

Analyse beregnet for C27H28N2O3-0,95HCl: C, 70,02; H, 6,30; N, 6,05.

Funnet: C, 70,01; H, 6,33; N, 5,71.

Eksempel 2

Parenteral enhetsdoseblanding

Et preparat som inneholder 20 mg av forbidnelsen ifølge Eksempel 1 som et sterilt tørt pulver, fremstilles som følger: 20 mg av forbindelsen løses i 15 mL destillert vann. Oppløsningen filtreres under sterile betingelser over i et 25 mL hetteglass og lyofiliseres. Pulveret rekonstitueres ved tilsetning av 20 mL 5% dekstrose i vann (D5W) for intravenøs eller intramuskulær injeksjon. Doseringen bestemmes derved av injeksjonsvolumet. Senere fortynning kan foretas ved tilsetning av et avmålt volum av enhetsdosen til et annet volum av DSW for injeksjon, eller en avmålt dose kan tilsettes til en annen avleveringsanordning for medikamentet, for eksempel til en flaske eller pose for i.v. dråpeinfusjon eller et annet inj eksj ons- infusj ons system.

Eksempel 3

Oral enhetsdoseblanding

En kapsel for peroral administrering fremstilles ved blanding og oppmaling av

50 mg av forbindelsen ifølge Eksempel 1 med 75 mg laktose og 5 mg magnesiumstearat. Det resulterende pulver siktes og fylles over i en hårdgelatinkapsel.

Eksempel 4

Oral enhetsdoseblanding

En tablett for peroral administrering fremstilles ved å blande og granulere 20 mg sakkarose, 150 mg kalsiumsulfat-dihydrat og 50 mg av forbindelsen ifølge Eksempel 1 med en 10% gelatinløsning. De fuktige granulene siktes, tørkes, og blandes med 10 mg stivelse, 5 mg talk og 3 mg stearinsyre og presses til en tablett.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge krav 1, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

3. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge krav 1, et anti-neoplastisk middel og en farmasøytisk akseptabel bærer.

4. Farmasøytisk blanding ifølge krav 3, karakterisert ved at det anti-neoplastiske middel er topotecan.

5. Farmasøytisk blanding ifølge krav 3, karakterisert ved at det anti-neoplastiske middel er cisplatin.

6. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen (U) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1,karakterisert ved at den omfatter omsetning av en forbindelse med formel (IH): med 2-(5,6 J,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol i en reaksjon mediert av komplekset dannet mellom diisopropylazodikarboksylat og trifenylfosfin, etterfulgt av esterhydrolyse ved bruk av vandig base.

8. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den benyttes som et medikament.

9. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, ved fremstillingen av et medikament til behandling av sykdommer hvor antagonisme av OvpVreseptoren er indisert.

10. Anvendelse av en forbindelse med formel ( T) ifølge krav 1, ved fremstillingen av et medikament til behandling av sykdommer hvor antagonisme av avpVreseptoren er indisert.

11. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, ved fremstillingen av et medikament til behandling av osteoporose.

12. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, og en inhibitor av benresorpsjon, ved fremstillingen av et medikament for behandling av osteoporose, i fysisk kombinasjon eller for trinnvis administrering.