CZ20011963A3

CZ20011963A3 - Antagonista vitronektinového receptoru

Info

Publication number: CZ20011963A3
Application number: CZ20011963A
Authority: CZ
Inventors: William H. Miller; Peter J. Manley
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2001-11-14
Also published as: TW482673B; AP1534A; KR100620485B1; ZA200104398B; CA2353415A1; NO20012732D0; AU1750200A; CO5150166A1; IL143390A; JP2003523931A; BG65118B1; CN1147300C; US6495560B1; KR20010080669A; EA003254B1; ES2229798T3; PE20001563A1; BG105651A; EP1146874A4; HK1042037B

Description

(5 7) Anotace:

Sloučenina obecného vzorce I, která je antagonistou vitronektinového receptoru a je užitečná při léčbě osteoporosy nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

CZ 2001 -1963 A3 (I) ·'— co₂h

JUDr. Pavel ZELENY advokát ‘

Hůlková 2, Praha 2 .· j

Antagonista vitronektinového receptorů ’*” ”

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceuticky aktivní sloučeniny, která inhibuje vitronektinový receptor a je užitečná při léčbě zánětu, rakoviny a kardiovaskulárních poruch, jako je atherosklerosa a restenosa, a chorob, při kterých je faktorem resorpce kosti, jako je osteoporosa.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou nadrodinou receptorů buněčné adheze, což jsou transmembránové glykoproteiny exprimované v různých buňkách. Tyto receptory povrchové buněčné adheze zahrnují gpIIb/IIIa (fibrinogenový receptor) a α_νβ₃(vitronektinový receptor). Fibrinogenový receptor gpIIb/IIIa je exprimován na povrchu destiček a zprostředkovává agregaci destiček a tvorbu hemostatického koláče v místě krvácející rány. Philips, a kol., Blood, 71, 831 (1988). Vitronektinový receptor α_νβ₃ je exprimován v četných buňkách, včetně buněk endotheliálních, buněk hladkého svalu, osteoklastů a nádorových buněk, a má tedy četné funkce. Receptor α_νβ₃ exprimovaný na membráně buněk osteoklastů zprostředkovává adhezi osteoklastů na kostní matrix, což je klíčový krok v procesu resorpce kosti. Ross, a kol., J. Biol. Chem., 262, 7703 (1987). Choroba charakterizovaná nadměrnou resorpcí kosti je osteoporosa. Receptor α_νβ₃ exprimovaný v buňkách hladkého svalu lidské aorty zprostředkovává jejich migraci do neointimy, což je proces, který může vést k restenose po perkutánni koronární angioplastice. Brown, a kol., Cardiovuscular Res., 28, 1815 (1994). Navíc, Brooks, a kol., Cell, 79, 1157 (1994) has

- 2 ··· · · · · · · ·

•..........* • ·· · · · · ·· · , , ···· ·· , ·· ·· ·· ·· ukazal, ze antagomsta α_νρ3 je schopen napomoci regresi tumoru indukci apoptosy angiogenních cév. Činidla, která blokují vitronektinový receptor mohou tedy být užitečná při léčbě chorob, jako je osteoporosa, restenosa a rakovina.

vitronektinovém receptoru je známo, že se vztahuje ke 3 různým integrinům, označovaným α_νβ_χ, α_νβ3 a α_νβ₅, Horton, a kol., Int. J. Exp. Parhol., 71, 741 (1990). α_νβχ váže fibronektin a vitronektin. α_νβ₃ váže širokou škálu ligandů, včetně fibrinu, fibrinogenu, lamininu, thrombospondinu, vitronektinu, von Willebrandova faktoru, osteopontinu a kostního sialoproteinu I. Ονβ₅ váže vitronektin. Pro vitronektinový receptor α_νβ₅ bylo ukázáno, že se účastní buněčné adhese četných buněčných typů, včetně mikrovaskulárnách endotheliálních buněk, (Davis, a kol., J. Cell. Biol., 51, 206 (1993)), přičemž jeho role při angiogenesi byla potvrzena. Brooks, a kol., Science, 264, 569 (1994). Tento integrin je exprimován v cévách lidské jizvové granulační tkáně, nikoli však v normální kůži vitronektinovém receptoru je známo, že váže na kostní matrix proteiny, které obsahují tripeptidový motiv Arg-Gly-Asp (neboli RGD). Horton a kol., Exp. Cell Res., 195, 368 (1991) tedy popisuje, že peptidy obsahující RGD a protilátky proti vitronektinovému receprotu (23C6) inhibují resorpci dentinu a rozšiřování kosti osteoklasty. navíc Sáto a kol., J. Cell Biol., 111, 1713 (1990) popisuje, že echistatin, což je peptid z hadího jedu, který obsahuje sekvenci RGD, je mocným inhibitorem resorpce kosti v tkáňové kultuře, přičemž inhibuje napojení osteoklastu na kost.

- 3 • · · ···· · · · • · ··· · · · · · · · • ·· · · · · ♦ · · • · · 9 ·· I* ·· ·« ···

Nyní bylo nalezeno, že jistá sloučenina je mocným inhibitorem receptorů α_νβ₃ a α_νβδ, Obzvláště bylo nalezeno, že taková sloučenina je mocnějším inhibitorem vitronektinového receptorů než fibrinogenového receptorů.

Podstata vynálezu

Tento vynález zahrnuje sloučeninu obecného vzorce

I, jak je zde popsána dále, která má farm,akologickou aktivitu inhibice vitronektinového receptorů a je užitečná při léčbě zánětu, rakoviny a kardiovaskulárních poruch, jako je atherosklerosa a restenosa, a chorob, při kterých je faktorem resorpce kosti, jako je osteoporosa.

Tímto vynálezem je také farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu obecného vzorce I a farmaceutický nosič.

Tímto vynálezem je také zůsob léčby chorob, které jsou zprostředkovány vitronektinovým receptorem.

V obzvláštním aspektu je sloučenina podle tohot vynálezu užitečná při léčbě atherosklerosy, restenosy, zánětu, rakoviny a chorob, při kterých je faktorem resorpce kosti, jako je osteoporosa.

Detailní popis vynálezu

Tento vynález zahrnuje novou sloučeninu, která je mocnějším inhibitorem vitronektinového receptorů než fibrinogenového receptorů. Nová sloučenina obsahuje dibenzocykloheptenové jádro, ve kterém je na jednom aromatických šestičlenných kruhů dibenzocykloheptenu přítomen substituent obsahující atom dusíku a na sedmičlenném kruhu

- 4 dibenzocykloheptenu

• · obsahující kyselou část. 0 dibenzocykloheptenovém kruhovém systému se má za to, že orientuje vedlejší řetězce substituentů na šesti- a sedmičlenné kruhy tak, že mohou výhodně interagovat s vitronektinovým receptorem. S výhodou bude na nej kratším mezimolekulárním spojení mezi kyselou skupinou na alifatickém substituentu sedmičlenného kruhu dibenzocykloheptenu a atomem dusíku substituentu obsahujícího dusík na aromatickém šestičlenném kruhu dibenzocykloheptenu asi 12 až 14 vložených kovalentních vazeb.

Tento vynález zahrnuje sloučeninu obecného vzorce

nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl.

Sloučenina obecného vzorce I inhibuje vazbu vitronektinu a jiných peptidů obsahujících RGD na vitronektinový receptor. Inhibice vitronektinového receptoru na osteoklastech inhibuje osteoklastickou resorpci kosti a je užitečná při léčbě nemocí, při kterých je s patologií spojena resorpce kosti, jako je osteoporosa a osteoarthritida.

V dalším aspektu je tímto vynálezem způsob stimulace tvorby kosti, který zahrnuje podávání sloučeniny I, což způsobuje zvýšení uvolňování osteokalcinu. Zvýšená tvorba kosti je jasným přínosem při chorobných stavech, při kterých se objevuje nedostatek mineralizované kostní hmoty

- 5 •« ♦· ·· ·· • · · · · · · « ·, nebo při kterých je žádoucí remodelace‘kosti, ja’ko’je hojení zlomenin kosti a prevence zlomenin kosti. U chorob a metabolických poruch, které vedou ke ztrátě struktury kosti, by taková léčba také byla přínosem, například při hyperparathyroidismu, Pagetově chorobě, hyperkalcémii při malignitách, osteolytických lezích vzniklých kostními metastázami, ztrátě kosti v důsledku znehybnění nebo při nedostatku pohlavních hormonů, Behcetově chorobě, osteomalacii, hyperostose a osteoporose by bylo přínosem podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu.

Navíc, jelikož sloučenina podle předloženého vynálezu inhibuje vitronektinové receptory v četných různých typech buněk, jsou uvedené sloučeniny užitečné při léčbě zánětlivých poruch, jako je revmatiodní arthritida a psoriasa, a kardiovaskulárních poruch, jako je atherosklerosa a restenosa. Sloučenina obecného vzorce I podle předloženého vynálezu může být užitečná při léčbě nebo prevenci jiných choorb včetně, tromboembolických poruch, asthmatu, alergií, syndromu dechové tísně dospělých, chorobě navozené reakcí štěpu proti hostiteli, odmítnutí transplantátu, septickém šoku, ekzému, kontaktní dermatitidě, zánětlivé chorobě střev a jiných autoimunních chorobách, výčet tím však není omezen. Sloučenina podle tohoto vynálezu může také být užitečná při hojení ran.

Sloučenina podle předloženého vynálezu je také užitečná při léčbě, včetně prevence, angiogenních poruch. Pojem angiogenní poruchy jak je zde používán zahrnuje stavy zahrnující abnormální neovaskularizaci. Tam, kde je příčinou patologie spojené s chorobou nebo k ní přispívá, růst nových cév, sníží inhibice angiogeneze škodlivé účinky choroby. Příkladem takové cílové choroby je diabetická ” Ó ” ·«·« Λ··· · » ’ . . · .··· ·· • ··· · · ··· · ····· ·· ·· · * * retinopatie. Tam, kde je k podpoře růstu škodlivé tkáně vyžadován růst nových cév, sníží inhibice angiogeneze dodávku krve do tkáně a tím přispěje ke snížení tkáňové hmoty založenému na požadavcích dodávky krve. Příklady zahrnují růst tumorů, kde je neovaskularizace nepřetržitým poždavkem růstu tumoru a vytvoření metastáz solidního tumoru. Sloučeniony podle předloženého vynálezu tedy inhibují angiogenezi tkáně tumoru, čímž zabraňují metastáze tumoru a růstu tumoru.

Podle způsobů podle předloženého vynálezu tedy inhibice angiogeneze za použití sloučenin podle předloženého vynálezu může zlepšit symptomy choroby a v některých případech chorobu vyléčit.

Dalším terapeutickým cílem pro sloučeninu podle předloženého vynálezu jsou oční choroby charakterizované neovaskularizací. takové oční choroby zahrnují neovaskulární poruchy rohovky, jako je transplantace rohovky, herpetická keratitis, luetická keratitis, pterygium a neovaskulární pannus spjatý s používáním kontaktních čoček. Další oční choroby také zahrnují makulární degeneraci spjatou s věkem, očekávanou oční histoplasmosu, retinopatii u předčasně narozených a neovaskulární glaukom.

Tento vynález dále poskytuje způsob inhibice růstu tumoru, který zahrnuje postupné podávání nebo podávání ve fyzické kombinaci sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastického činidla, jako je topotekan nebo cisplatina.

Nová sloučenina podle tohoto vynálezu je kyselina (S)-10,ll-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l, 8-naftyridin- 7 «·· ···· · • · ··· ·· ··· ···· ·· ·· ·· ·* -2-yl) -l-ethoxy]-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-octová nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Podle předloženého vynálezu je výhodná (S) konfigurace sloučeniny obecného vzorce I.

Tento vynález také zahrnuje proléčiva sloučeniny podle tohoto vynálezu. Za proléčiva se považuji jakékoli kovalentně vázané nosiče, které in vivo uvolňuji účinné mateřské léčivo obecného vzorce I. Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou tedy nová proléčiva, které jsou také meziprodukty při přípravě sloučeniny obecného vzorce II

nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

K popisu sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou zde používány zkratky a symboly obecně používané v chemii a chemii peptidu. Obecně se zkratky aminokyselin řídí nomenklaturou IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical· Nomenclature, jak je popsána v Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984) .

Ci~6alkyl jak je zde používán znamená případně substituovanou alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a zahrnuje methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, terc.-butyl, pentyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl a hexyl a jejich jednoduché alifatické isomery.

- 8 « * · · · · ♦ • · · « « « · ··· ···· · · · • · · · » · ♦ ··· · · • ·· ···· ·· · «··« 9 9 ♦ · * · · * ··«

Kterýkoli Ci-₆alkyl může být případně substituován skupinou R^x, k čemuž může dojít na jakémkoli atomu uhlíku, kde to povede ke vzniku stabilní struktury a kde je to dostupné pomocí obvyklých syntetických postupů. Vhodnými skupinami pro R^x jsou Ci_₄alkyl, OR, SR, Ci-₄alkylsulfonyl, Ci-₄alkylsulfoxyl, -CN, N(R)₂, CH₂N(R'j₂, -N0₂,

-CF₃, -CO₂R, -CON(R)₂, -COR, NRC(O)R, F, Cl, Br, I nebo

CF₃S(O)_r, kde r je 0, 1 nebo 2 a R je H nebo Ci-6alkyl.

Jisté skupiny jsou zde uvedeny pod zkratkami. terc.-Bu odkazuje na terciární butylovou skupinu, Boc odkazuje na terč.-butyloxykarbonylovou skupinu, Fmoc odkazuje na fluorenylmethoxykarbonylovou skupinu, Ph odkazuje na fenylovou skupinu, Cbz odkazuje na benzyloxykarbonylovou skupinu, Bn odkazuje na benzylovou skupinu, Me odkazje na methyl, Et odkazuje na ethyl, Ac odkazuje na acetyl, Alk adkazuje na Ci_₄alkyl, Nph odkazuje na 1- nebo 2-naftyl a cHex odkazuje na cyklohexyl. Tet odkazuje na 5-tetrazolyl.

Jistá činidla jsou zde uvedena pod zkratkami. DCC odkazuje na dicyklohexylkarbodiimid, DMAP odkazuje na dimethylaminopyridin, DIEA odkazuje na diisopropylethylamin, EDC odkazuje na hydrochlorid 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-karbodiimidu. HOBt odkazuje na 1-hydroxybenzotriazol, THF odkazuje na tetrahydrofuran, DIEA odkazuje na diisopropylethylamin, DEAD odkazuje na diethylazodikarboxylat, PPh3 odkazuje na trifenylfosfin, DIAD odkazuje na diisopropylazodikarboxylat, DME odkazuje na dimethoxyethan, DMF odkazuje na dimethylformamid, NBS odkazuje na N-bromsukcinimid, Pd/C odkazuje na katalyzátor paladium uhlí, PPA odkazuje na kyselinu polyfosforečnou, DPPA

- 9 odkazuje na difenylfosforylazid, BOP odkazuje na benzotriazol-l-yloxy-tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluor“ fosfát, HF odkazuje na kyselinu flourovodíkovou, TEA odkazuje na triethylamin, TFA odkazuje na kyselinu trifluoroctovou, PCC odkazuje na pyridiniumchlorchromat.

Sloučenina obecného vzorce I se může připravit způsoby popsanými v Bondinell a kol., PCT publikace č. WO 97/01540 (mezinárodni přihláška č. PCT/US96/11108), publikováno 16, ledna 1997, jejíž veškeré poznatky jsou zde zahrnuty formou odkazu.

Sloučenina obecného vzorce I se navíc připraví způsoby analogickými způsobům popsaným ve schématech uvedených v detailu dále.

Schéma I

Schéma I v detailu uvádí přípravu meziproduktu • užitečného pro výrobu sloučeniny obecného vzorce I.

Schéma II

⁴

a) LiN(TMS)₂, ethylbromacetat, b) Jonesovo činidlo,

Schéma II v detailu uvádí přípravu meziproduktu užitečného pro výrobu sloučeniny obecného vzorce I.

Schéma III

(d) 2-(5.6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyridin-2-yl)-1 -ethanol, diisopropylazodikarboxylat

Schéma III v detailu uvádí výrobu sloučeniny obecného vzorce I. Reakce sloučeniny 1 ze schématu III (což je sloučenina 3 ze schématu I) v reakci aldolového typu s enolatem ethylacetátu, který se může vytvořit z ethylacetatu během expozice příhodné amidové báze, například diisopropylamidu lithnému (LDA) nebo bis(trimethylsilyl)amidu lithenému (LiHMDS), dává sloučeninu 2 ze schématu.

III. Často je rozpouštědlem volby pro aldolovou reakci THF, ačkoliv se často používá THF za přítomnosti různých přísad, například HMPA nebo TMEDA. Redukce sloučeniny 2 ze schématu III k získání sloučeniny 3 ze schématu III (což je sloučenina 6 ze schématu II) se může uskutečnit hydrogenolýzou na příslušném katalyzátoru, například kovovém

-12• · • · paladiu na aktivním uhlí jako je kyselina octové, ··· ···· ·· * ♦ · * · ·· ··· • * r · ·♦ * · · · · (Pd/C), v příhodném rozpouštědle, za přítomnosti minerální kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková. Alternativně se tato redukce může uskutečnit zpracováním sloučeniny 2 ze schématu III triethylsilanem za přítomnosti trifluoridetheratu boru obecným způsobem podle Orfanopoulose a Smonoua (Synth. Commun., 833, (1988)). Odstranění methyl etheru ze sloučeniny 3 ze schématu III k získání sloučeniny 4 ze schématu III se může uskutečnit pomocí BBr₃ v inertním rozpouštědle, například CH₂C1₂, nebo rekací s ethanthiolem a A1C1₃ v inertním rozpouštědle, výhodně CH₂C1₂, Další užitečné způsoby odstraňování methyletheru jsou popsány v Greene, Protective Groups in Organic Synthesis (publikoval John Wiley and Sons). Sloučenina 4 ze schématu 3 se nechá reagovat s 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-1-ethanolem k získáni sloučniny 5 ze schématu III. Reakce je zprostředkována komplexem vytvořeným mezi diisopropylazodikarboxylatem a trifenylfosfinem a provádí se v aprotickém rozpouštědle, například THF, 0Η₂01₂ nebo DMF. Ethylester sloučeniny 5 ze schématu III se hydrolyzuje za použití vodné báze, například LiOH ve vodném THF nebo NaOH ve vodném methanolu nebo ethanolu, přičemž meziproduktová karboxylatová sůl se okyselí vhodnou kyselinou, například TFA nebo HC1, k získání karboxylové kyseliny 6 ze schématu III. Alternativně se meziproduktová karboxylatová sůl může isolovat, pokud je to žádoucí, nebo se karboxylatová sůl volné karboxylové kyseliny může připravit způsoby odborníkovi v oboru dobře známými.

Schéma IV

-13« • · ·

(b) síra, morfolin,

Komerčně dostupný 2-fluor-4-methoxyacetofenon (sloučenina 1 ze schématu IV) reaguje s alkoholem, například fenolem, za přítomnosti kovové mědi a vhodné báze, například K₂CO₃, k získání diaryletheru 2 ze schématu

IV. Při zpracování sírou a příhodným sejkundárním aminem, výhodně morfolinem, podle obecného způsobu podle Harrise (J. Med. Chem. , 25, 855 (1982)), se sloučenina 2 ze schématu IV konverguje na sloučeninu 3 ze schématu IV klasickou Willgerodt-Kindlerovou reakcí. Takto získaný thioamid se hydrolyzuje na odpovídající karboxylovou kyselinu 4 ze schématu IV reakcí s hydroxidem alkalického kovu, vhodně

KOH, ve vodném alkoholovém rozpouštědle, jako je vodný MeOH, EtOH nebo i-PrOH. Karboxylové kyselina 4 ze schématu IV se konverguje na odpovídající chlorid kyseliny reakcí buď s SOClo nebo oxalylchloridem podle podmínek odborníkovi v oboru dobře známých. Zpracování tohoto chloridu kyseliny příhodným Friedel-Craftsovým katalyzátorem, jako je AICI3 nebo SnCU, v inertním rozpouštědle, jako je CH₂C1₂nebo CS₂, poskytne cyklický keton 5 ze schématu IV. Alternativně se kyselina 4 ze schématu IV může konvergovat přímo na keton 5 ze schématu IV za kyselých podmínek, například kyselinou polyfosforečnou. Reakce sloučeniny 5 ze schématu IV v reakci aldolového typu s enolatem ethylacetatu, který se může vytvořit z ethylacetátu zpracováním s příslušnou amidovou bází, například diisopropylamidem lithným (LDA) bis(trimethylsilyl)amidem lithným (LiHMDS), poskytne sloučeninu 6 ze schématu IV. Často je rozpouštědlem volby pro aldolovou reakci THF, ačkoliv se často používá THF za přítomnosti různých přísad, například HMPA nebo TMEDA. Redukce sloučeniny 6 ze schématu IV k získání sloučeniny 7 ze schématu IV se může uskutečnit zpracováním sloučeniny 6 ze schématu IV triethylsilanem za přítomnosti trifluoridetheratu boru obecným způsobem podle

Orfanopoulose a Smonoua (Synth. Commun., 833, (1988)).

Jakékoli olefinické vedlejší produkty, které vznikají eliminací alkoholu se sníží hydrogenací na příhodném katalyzátoru, například kovovém paladium na aktivním uhlí (Pd/C), v příhodném rozpouštědle, jako je MeOH nebo EtOH. Alternativně se redukce sloučeniny 6 ze schématu IV k získání sloučeniny 7 ze schématu IV může provádět hydrogenolýzou za přítomnosti minerální kyseliny, jako je HC1. Obvykle je tato reakce katylyzována Pd/C, přičemž se optimálně provádí v kyselině octové. Odstranění methyletheru ze sloučeniny 7 ze schématu IV k získání sloučeniny

-15·· · * · · · · * • ···· · · · ·«· ·· · · · · · • ···· ·· · ·· · · ·· ·· ·· ze schématu IV se může uskutečnit pomocí BBr₃ v inertním rozpouštědle, například CH2C12, nebo rekací s ethanthiolem a A1C1₃ v inertním rozpouštědle, výhodně CH₂C12, Další užitečné způsoby odstraňování methyletheru jsou popsány v Greene, Protective Groups in Organic Synthesis (publikoval John Wiley and Sons). Sloučenina 8 ze schématu IV se konverguje na sloučeninu obecného vzorce I podle postupu načrtnutého ve schématu III.

Adiční soli s kyselinou sloučeniny se připraví standardním způsobem ve vhodném rozpouštědle z mateřské sloučeniny a přebytku kyseliny, jak je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina fluorovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina octová, kyselina trifluoroctové, kyselina maleinová, kyselina jantarová nebo kyselina methansulfonová. Jisté sloučeniny tvoří vnitřní soli nebo-li zwitteriony, které mohou být přijatelné. Kationtové soli se připraví zpracováním mateřské sloučeniny přebytkem alkalického činidla, jako je hydroxid, uhličitan nebo alkoxid, které obsahuje příslušný kation, nebo s příhodným organickým aminem. Katinoty, jako je Li ⁺ , Na ⁺ , K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ a NH4⁺ jsou specifickými příklady katinotů přítomných ve farmaceuticky přijatelných solích.

tento vynález také poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje sloučeninu obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič. Sloučenina obecného vzorce I tudíž může být použita pro výrobu léčiva. Farmaceutické prostředky sloučeniny obecného vzorce I připravené podle výše uvedeného popisu se mohou formulovat jako roztoky nebo lyofilizované prášky pro parenterální podání. Prášky se mohou rekonstituovat přidáním vhodného ředidla nebo jiného farmaceuticky přijatelného nosiče před použitím. Kapalným

-16• · · · · · • · · · · · · ·· » ·· ·· « · ·· · prostředkem může být pufrovaný, isotonický vodný roztok. Příklady vhodných ředidel jsou normální isotonický fyziologický roztok, standardní 5% dextrosa ve vodě nebo pufrovaný roztok acetatu amonného. Takový prostředek je obzvláště vhodný pro parenterální podání, ale může být také použit pro orální podání nebo zahrnut do inhalátoru s odměřenou dávkou nebo do nebulizéru pro insuflaci. Může být žádoucí přidat pomocné látky, jako je polyvinylpyrrolidon, želatina, hydroxycelulosa, arabská guma, polyethylenglykol, mannitol, chlorid sodný nebo citrát sodný.

Alternativně může tato sloučenina být enkapsulována, tabletována nebo připravena v emulzi nebo sirupu pro orální podání. Mohou se přidat farmaceuticky přijatelné tuhé nebo kapalné nosiče k usnadnění nebo stabilizaci prostředku nebo k usnadnění přípravy prostředku. Tuhé nosiče zahrnují škrob, laktosu, dihydrát síranu vápenatého, bílou hlinku, stearat hořečnatý nebo kyselinu stearovou, mastek, pektin, arabskou gumu, agar nebo želatinu. Kapalné nosiče zahrnují sirup, olej z podzemnice olejně, olivový olej, fyziologický roztok a vodu. Nosič může také obsahovat mateiál pro prodloužené uvolňování, jako je glycerylmonostearat nebo glyceryldistearat, samotné nebo s voskem. Množství tuhého nosiče je proměnné, ale, výhodně, bude od asi 20 mg do asi 1 g na dávkovou jednotku. Farmaceutické prostředky se připraví podle obvyklých postupů farmacie zahrnujících mletí, míšení, granulaci a lisování, pokud je to nezbytné, u tabletových forem, nebo mletí, míšení a plněni u forem tvrdých želatinových kapslí. Pokud se použije kapalný nosič, bude prostředek ve formě sirupu, elixíru, emulse nebo vodné či nevodné suspenze. Takový

-17• *

9 kapalný prostředek

měkké želatinové kapsle.

Pro rektální podáni se sloučenina podle tohoto vynálezu může také kombinovat s pomocnými látkami, jako je kakaové máslo, glycerin, želatina nebo polyethylenglykoly, a odlít do čípku.

Sloučeniny zde popsané jsou antagonisty vitronektinového receptoru a jsou užitečné pro léčbu chorob, kde se základní patologie dá přičíst ligandu nebo buňce, který nebo která interaguje s vitronektinovým receptorem. Tyto sloučeniny jsou například užitečné při léčbě chorob, při kterých je patologie tvořena ztrátou kostní matrix. Předložené sloučeniny jsou tedy užitečné při léčbě osteoporosy, hyperparathyroidismu, Pagetovy choroby, hyperkalcémie při malignitách, osteolytických lézi vytvořených kostní metastázou, ztráty kosti v důsledku znehybnění nebo deficitu pohlavních hormonů. 0 sloučeninách podle tohoto vynálezu se má za to, že jsou užitečné jako protitumorová, antiangiogenní, protizánětlivá a antimetastatická činidla, a že jsou užitečná při léčbě atherosklerosy a restenosy.

Sloučenina se pacientovi podává buď orálně nebo parenterálně takovým způsobem, že koncentrace léčiva je dostatečná k inhibici resorpce kosti nebo k jiné takové indikaci. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu se podává v orální dávce od asi 0,1 do asi 50 mg/kg způsobem konsistentním se stavem pacienta.Výhodně je orální dávka od asi 0,5 do asi 20 mgúkg. Pro akutní terapii je výhodné parenterální podání. Nejúčinnější je intravenosni infuse peptidů v 5% dextrose ve vodě nebo ve fyziologickém roztoku

-18«· · · ·· nebo v podobném prostředku s vhodnými pomocnými látkami, ačkoliv intramuskulární bolusová injekce je také užitečná, typicky bude parenterální dávka od asi 0,01 do asi 100 mg/kg, výhodně od 0,1 do 20 mg/kg. Sloučenina se podává jednou až čtyřikrát denně v dávce k dosaženi celkové denní dávky od asi 0,4 do asi 400 mg/kg/den. Přesnou dávku a způsob, kterou se sloučenina podává odborník v oboru snadno zjistí srovnáním hladin činidla v krvi s koncetraci požadovanou k dosažení terapeutického účinku.

Tento vynález dále poskytuje způsob léčby osteoporosy nebo inhibice ztráty kosti, který zahrnuje postupné podávání nebo podáváni ve fyzické kombinaci sloučeniny obecného vzorce I a dalšího inhibitoru resorpce kosti, jako jsou bisfosfonaty (tj. allendronat), hormonální doplňková terapie, antiestrogeny nebo kalcitonin. Naíc tento vynález poskytuje způsob léčení využívající sloučeninu podle tohoto vynálezu a anabolické činidlo, jako je kostní morfogenní protein, iproflavon, užitečné při prevenci ztráty kosti a/nebo ke zvýšení kostní hmoty.

Navíc tento vynález poskytuje způsob inhibice růstu tumoru, který zahrnuje postupné podávání nebo podáváni ve fyzické kombinaci sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastického činidla. Sloučenina třídy analogů kamptothecinu, jako je topotekan, irinotekan a 9-aminokamptothecin, a koordinační komplexy platiny, jako je cisplatina, ormaplatina a tetraplatina, jsou dobře známými skupinami antineoplastických činidel. Sloučeniny třídy analogů kamptothecinu jsopu popsány v US patentech čísel 5 004 758, 4 604 463, 4 473 692, 4 545 880, 4 342 776, 4 513 138, 4 399 276, evropských patentových přihláškách čísel 0 418 099 a 0 088 642, Wani, a kol., J. Med. Chem., • · · · ♦ φ · · ·· · ·· · · · * · · ··· ··· ···· ·· · ·· ··· » · ··· · · • · · ···· ·· · ···« ·· ·· ·· ·♦ ···

9, 2358 (1986), Wani, a kol., J. Med. Chem., 23, 554 (1980), Wani, a kol., J. Med. Chem., 30, 1774 (1987) a Nitta, a kol., Proč. 14th International Congr.

Chemotherapy. , Anticancer Section I, 28, (1985), jejichž veškeré poznatky jsou zde zahrnuty formou odkazu.

Koordinační komplex platiny, cisplatina, je dostupný pod označením Platinol® od firmy Bristol Myers-Squibb Corporation. Užitečné formulace cisplatiny jsou popsány v US patentech čísel 5 562 925 a 4 310 515, jejichž veškeré poznatky jsou zde zahrnuty formou odkazu.

Při způsobu inhibice růstu tumoru, který zahrnuje postupné podávání nebo podáváni ve fyzické kombinaci sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastického činidla, se koordinační sloučenina platiny, například cisplatina, může podávat za použití pomalé intrvenosní infuse. Výhodným nosičem je roztok dextrosa/fyziologický roztok obsahující mannitol. Dávkové schéma koordinační sloučeniny platiny může být na bázi od asi 1 do asi 500 mg na metr čtvereční (mg/rrT) plochy tělesného povrchu na léčebnou kůru. Infuse koordinační sloučeniny platiny se mohou podávat jednou až dvakrát týdně a týdenní kůry se mohou několikrát opakovat. Při použití sloučeniny ze třídy analogů kamptothecinu při parenterálním podání je obvykle použitý průběh léčby od asi 0,1 do asi 300,0 mg/kg/m² plochy tělesného povrchu za den po dobu asi 5 po sobě následujících dní. Nejvýhodněji je použitý průběh léčby pro topotekan od asi 0,1 do asi 2,0 mg/kg/m² plochy tělesného povrchu za den po dobu 5 po sobě následujících dní. výhodně se kůry opakuje alespoň jednou v intervalu asi 7 až 28 dní.

Farmaceutický prostředek se může formulovat jak se sloučeninou obecného vzorce I a antineoplastickým

-20činidlem v jedné nádobě, nicméně formulace v různých nádobách je výhodná. Pokud se obě činidla poskytnou ve formě roztoku, mohou být obsažena v systému infuse/injekce pro současné podávání nebo v tandemovém uspořádání.

Pro příhodné podávání sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastického činidla ve stejný nebo různý čas se připraví kit, který obsahuje jedinou nádobu, jako je krabice, karton nebo jiná nádoba, jednotlivé lahvičky, sáčky, skleničky nebo jiné nádoby, přičemž každá obsahuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce I pro parenterální podání jak je popsáno výše a účinné množství antineoplastického činidla pro parenterální podání, jak je popsáno výše. Takový kit může obsahovat například obě farmaceutická činidla v oddělených nádobách nebo ve stejné nádobě, případně jako lyofilizované zátky, a nádoby roztoků pro rekonstituci. Variací tohoto řešení je zahrnutí roztoku pro rekonstituci a lyofilizované zátky ve dvou komorách jediné nádoby, které mohou být použity ke smísení před použitím. Za takového uspořádání mohou být antineoplastické činidlo a sloučenina podle tohoto vynálezu baleny odděleně, jako ve dvou nádobách, nebo lyofilizovány společně jako prášek a poskytnuty v jediné nádobě.

Pokud jsou obě činidla poskytnuta ve formě roztoku, mohou být obsažena v infusním/injekčním systému pro současné podávání nebo pro tandemové uspořádání. Například sloučenina obecného vzorce I může být ve formě injektabilní i.v. nebo v infusním vaku spojeném v sérii, prostřednictvím trubiček, s antineoplatickým činidlem v druhém infusním vaku. Za použití takového systému může pacient dostat počáteční injekci bolusového typu nebo

-21• · ·* ♦· « 4 · · · · • · 4 · · · ·!···· ·· ·· ·· ♦ infusi sloučeniny obecného vzorce I následovanou infusí antineoplastického činidla.

Sloučenina se může testovat jedním nebo několika biologickými stanoveními k určení koncentrace sloučeniny, která je vyžadována k tomu, aby měla farmakologický účinek.

Inhibice vazby vitronektinu

Vazba [³H]-SK&F-107260 na α_νβ₃ v tuhé fázi

Lidský placentární nebo lidský destičkový α_νβ₃(0,1-0,3 mg/ml) v pufru T (obsahujícím 2 mM CaCl₂ a 1 % oktylglukosidu) se naředí pufrem T obsahujícím 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (pufr A) a 0,05 % NaN₃, a poté se ihned přidá na desky ELISA s 96 jamkami (Corning, New York, NY) v dávce 0,1 ml na jamku. Na jamku se přidá 0,1 až 0,2 μς α_νβ₃. Desky se inkubují pořes noc při teplotě 4 °C. V době experimentu se jamky promyjí jedenkrát pufrem A a inkubují se 1 hodinu při teplotě místnosti s 0,1 ml 3,5% hovězího sérového albuminu ve stejném pufru. Po inkubaci se obsah jamek úplně odsaje a dvakrát se promyje 0,2 ml pufru A.

Sloučeniny se rozpustí v 100% DMSO k získání 2mM základního roztoku, který se ředí vázacím pufrem (15 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂) na konečnou koncetraci sloučeniny 100 μΜ. Tento roztok se poté ředí na požadovanou koncentraci sloučeniny. Do jamek se v triplikátech přidávají různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 až 100 μΜ), následuje přidání 5,0 μΜ [³H]-SK&F-107260 (2405 až 3182.10⁹ Bq/mmol).

-22• w »· ·· ·· • · · « ♦ · · · · · ··· · · · * · · • ·· · ·· ·· ·· ·· ♦

Desky se 1 hodinu inkubuji při teplotě místnosti. Po inkubaci se desky úplně odsají a jedenkrát promyjí 0,2 ml ledově studeného pufru A jamka po jamce. Receptory se solubilizují 0, 1 ml 1 % SDS a navázaný [³H]-SK&F-107260 se stanoví čítáním scintilace kapalin s přidáním 3 ml přípravku Ready Safe v přístroji Beckman LS Liquid

Scintillation Counter, se 40% účinností. Nespecifická vazba [³H]-SK&F-107260 se stanoví za přítomnosti 2 μΜ SK&F-107260 a je konsistentně menší než 1 % celkového vstupu radioligandu. IC$o (koncentrace antagonisty k inhibici 50 % vazby [³H]-SK&F-107260) se stanoví nelineární metodou křivky nejmenších čtverců, která je upravena z programu LUNDON-2. Ki (disociační konstanta antagonisty) se vypočítá podle rovnice: Ki = IC₅₀/(l + L/K_d) , kde L a K_d jsou koncentrace respektive disociační konstanta [³H]-SK&F107260.

Sloučenina podle předloženého vynálezu inhibuje vazbu vitronektinu na SK&F 107260 při Ki asi 1,7 nanomol.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou také testovány na resorpci kosti in vitro a in vivo ve stanoveních v oboru standardních, jako je stanovení tvorby důlku popsané v EP 528 587, které se rovněž může provádět za použití lidských osteoklastů místo krysích osteoklastů, a model na krysách s ovarektomií, který popsal Wronski a kol., Cells and Materials, Sup. 1, 69-74 (1991).

Stanovení migrace buněk hladkého svalu cév

Použijí se lidské nebo krysí buňky hladkého svalu aorty. Migrace buněk se monitoruje v komoře buněčné kultury Transwell za použití polykabonatové membrány s póry 8 μιη

-23• to · toto·» ···· «·· «9·· ♦ · · • ·· ···· ·· · ···· ·· toto ·· * · ··<

(Costar). Spodní povrch filtru se potáhne vitronektinem.

Buňky se suspendují v DMEM doplněným 0,2 % hovězího sérového albuminu v koncentraci 2,5 až 5,0 x 10⁶ buněk/ml, a předem se zpracovávají testovanou sloučeninou při různých koncentracích 20 minut při teplotě 20 °C. Jako kontrola se použije samotné rozpouštědlo. 0,2 ml buněčné suspense se umístí do horního oddílu komory. Spodní oddíl komory obsahuje 0,6 ml DMEM doplněného 0,2% hovězího sérového albuminu. Inkubace se provádí při teplotě 37 °C v atmosféře 95 % vzduch/5 % CO2 24 hodin. Po inkubaci se nemigrujíci buňky z horního povrchu filtru odstraní jemným seškrábáním. Filtr se poté upevní v methanolu a nabarví 10% Giemsovým barvivém. Migrace se měří buď a) spočítáním buněk, které migrovaly na spodní povrch filtru nebo b) extrakcí obarvených buněk 10% kyselinou octovou následovanou stanovením absorbance při 600 nm.

Model na thyroparathyroidektomizovaných krysách

Každý experiment sestává z 5 až 6 dospělých krys kmene Sprague-Dawley (tělesná hmotnost 250 až 400 g). Krysy se thyroparathyroidektomizuji (provede prodejce, Taconic Farms) 7 dní před použitím. Všechny krysy dostávají doplňovací dávku thyroxinu každé 3 dny. V den přijetí krys se z celé krve změří hladiny cirkulujícího ionizovaného vápníku ihned po jejím odebrání z ocasní cévy do heparinizovaných zkumavek. Krysy se zahrnou do experimentu pokud je hladina ionizovaného vápníku (měřeno pH analyzátorem vápníku Ciba-Corning, model 634) nižší než 1,2 mM/litr. Každá krysa se vybaví prozatímním venosním a arteriálním katetrem k dodávání testovaného materiálu respektive k odebírání vzorků krve. Krysám se poté podává krmivo prosté vápníku a deionizovaná voda. Změří se základní

-24• · · 9 e ·· · · · • · 9 ···· ·· * ···· 99 ·* «· ·· 9·· hladiny vápníku a každé kryse se podá buď kontrolní vehikulum nebo 1 až 34 peptid lidského parathyroidního hormonu (hPTHI-34, dávka 1,25 qg/kg/h ve fyziologickém roztoku/0,1 % hovězím sérovém albuminu, Bachem, Ca) nebo směs hPTHI-34 a testovaného materiálu, kontinuální intravenosní infusí venosním katetrem za použití externího stříkačkového čerpadla. Kalcemická odpověď každé krysy se měří ve dvouhodinových intervalech během doby infuse po dobu 6 až 8 hodin.

Stanovení resorpce a adhese lidských osteoklastů

Stanovení důlkové resorpce a adhese byla vyvinuta a standardizována za použití lidských osteoklastů odvozených z tkáně osteoklastomu. Stanovení 1 bylo vyvinuto pro měření objemů osteoklastového důlku laserovou konfokální mikroskopií. Stanovení 2 bylo vyvinuto jako výkonnější vyhledávání, při kterém se pomocí kompetitivní ELISA měří fragmenty kolagenu (uvolněné během resorpce).

Stanovení 1 (za použití laserovévé konfokální mikroskopie)

Alikvoty suspensí lidských buněk odvozených z osteoklastomu se vyjmou z úschovy v kapalném dusíku, rychle se ohřejí na teplotu 37 °C a jedekrát se promyjí v mediu RPMI-1640 odstředěním (frekvence otáček 1000 za minutu, 5 minut při tepotě 4 °C).

Medium se odsaje a nahradí myší protilátkou proti HLA-DR, poté se naředí 1:3 v mediu RPMI-1640. Suspense se 30 minut inkubuje na ledu a často se míchá.

-25* · · · · · · · · · ··· · · · · ·· • · ··· ·· ··· ♦ φ ·· ···· ··

Buňky se dvakrát promyji studenýflT*RřMl-ltT40 následuje odstředěni (frekvence otáček 1000 za minutu, 5 minut při teplotě 4 °C) a buňky se poté přenesou do sterilní 15ml zkumavky do odstředivky. Ve vylepšené Neubauerově čítači komůrce se vyčíslí počet mononukleárních buněk.

Ze zásobní lahve se vyjme dostatek magnetických kuliček (5/mononuklérní buňka) potažených kozím protimyším IgG (Dynal, Great Neck, NY) a umístí se do 5 ml čerstvého media (tím se odplaví toxické azidové konzervans). Medium se odstraní imobilizací kuliček ma magnetu a nahradí se čerstvým mediem.

Kuličky se smísí s buňkami a suspense se inkubuje 30 mnut na ledu. Suspense se často míchá.

Buňky potažené kuličkami se imobilizují na magnetu a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se slijí do sterilní 50ml zkumavky do odstředivky.

Ke kuličkami potaženým buňkám se přidá čerstvé medium k uvolnění jakýchkoli zachycených osteoklastů. Tento proces promyt! se opakuje desetkrát. Buňky potažené kuličkami se dají stranou.

Životaschopné osteoklasty se spočítají v čítači komůrce za použití diacetatu fluoresceinu k označení živých buněk. K přidání vzorku do komůrky se použije plastická pasteurova pipeta na jedno použití s velkým průměrem otvoru.

-26• · * · · · · • · ·· · · ··· • ···· * · · ·«· · · · ♦ · · ·

Osteoklasty se peletuji odstředďňlm *á hušlotá se” upraví na příhodné číslo v mediu EMEM (počet osteoklastů se liší tumor od tumoru) doplněném 10 % fetálního telecího séra a 1,7 g/litr hydrogenuhličitanu sodného.

3ml alikvoty buněčné suspense (na ošetření jednou sloučeninou) se slijí do 15ml zkumavek do odstředivky. Buňky se peletuji odstředěním.

Do každé zkumavky se přidají 3 ml příslušné sloučeniny (naředěné na 50 μΜ v mediu EMEM). Také se zahrnou příslušné vehikulové kontroly, positivní kontrola (myší monoklonální protilátka proti vitronektinovému receptpru [87MEM1] ředěná na koncentraci 100 pg/ml) a isotopová kontrola (IgG_2a ředěná na koncentraci 100 gg/ml). Vzorky se inkubují 30 minut při teplotě 37 °C.

0,5ml alikvoty buněk se naočkují na sterilní dentivnové řezy na desce se 48 jamkami a 2 hodiny se inkubují při teplotě 37 °C. Každá kůra se sleduje v kvadruplikátech.

Řezy se promyjí 6 várkami teplého PBS (10 ml/jamka na desce s 6 jamkami) a poté se umístí do čerstvého media obsahujícího vzorky se sloučeninou nebo kotrolou. Vzorky se inkubují 48 hodin při teplotě 37 °C.

Postup kyselé fosfatasy odolné vůči tartratu (TRAP) (selektivní barvení osteoklastové linie)

Kostní řezy obsahující napojené osteoklasty se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a 5

-27minut se fixuji ve 2% roztoku glutaraldehýífú lve 0**2M’* kakodylatu sodném).

Poté se promyji vodou a 4 minuty se inkubují v pufru TRAP při teplotě 37 °C (0,5 mg/ml naftol AS-BI fosfát rozpuštěný v N,N-dimethylformamidu) a smísí se s 0,25M citrátovým pufrem (pH 4,5) obsahujícím 10 mM tartratu sodného.

Po promytí ve studené vodě se řezy ponoří do studeného acetatového pufru (0,1 M, pH 6,2) obsahujícího 1 mg/ml stálé granátové červeně a 4 minuty se inkubují při teplotě 4 °C.

Přebytečný pufr se odsaje a řezy se po promytí vodou vysuší na vzduchu.

Osteoklasty positivní na TRAP (cihlově červená/nachová sraženina) se spočítají mikroskopií se světlým polem a poté se z povrchu dentinu odstraní ultrazvukem.

Objemy důlků se stanoví za použití konfokálního mikroskopu Nikon/Lasertec ILM21W.

Stanovení 2 (za použití odečtu ELISA)

Lidské osteoklasty se obohatí a připraví pro vyhůldávání sloučenin podle popisu uvedeného v počátečních 9 krocích stanovení 1. Pro jasnost jsou zde tyto kroky zopakovány.

Alikvoty suspensí lidských buněk odvozených z osteoklastomu se vyjmou z úschovy v kapalném dusíku,

-28·· ·· ·· ·· ·· ···· ♦··· · · · • · · · · · · • · ··· ·· · • · · · · · · _ ······ ·· ·· rychle se ohřeji na teplotu 37 Ca jedekrát se promyji v mediu RPMI-1640 odstředěním (frekvence otáček 1000 za minutu, 5 minut při tepote 4 °C).

Medium se odsaje a nahradí myši protilátkou proti

HLA-DR, poté se naředí 1:3 v mediu RPMI-1640. Suspense se minut inkubuje na ledu a často se míchá.

Buňky se dvakrát promyjí studeným RPMI-1640, následuje odstředění (frekvence otáček 1000 za minutu, 5 minut při teplotě 4 °C) a buňky se poté přenesou do sterilní 15ml zkumavky do odstředivky. Ve vylepšené Neubauerově čítači komůrce se vyčíslí počet mononukleárních buněk.

Ze zásobní lahve se vyjme dostatek magnetických kuliček (5/mononuklérní buňka) potažených kozím protimyšim IgG (Dynal, Great Neck, NY) a umístí se do 5 ml čerstvého media (tím se odplaví toxické azidové konzervans). Medium se odstraní imobilizací kuliček ma magnetu a nahradí se čerstvým mediem.

Ke kuličkami potaženým buňkám se přidá čerstvé medium k uvolnění jakýchkoli zachycených osteoklastů. Tento proces promytí se opakuje desetkrát. Buňky potažené kuličkami se dají stranou.

-29• · ·· ·· ·· . _ • · · · · · · · · · · ··· · · · · · · ·*·» · · · · ·♦ ······ ·· ·· ·♦ ·

Osteoklasty se peletují odstředěním a hustota se upraví na příhodné číslo v mediu EMEM (počet osteoklastů se liší tumor od tumoru) doplněném 10 % fetálního telecího séra a 1,7 g/litr hydrogenuhličitanu sodného.

Oproti postupu popsanému výše ve stanovení 1 se sloučenina vyhledává ve 4 dávkách k získání IC₅₀, jak je uvedeno dále.

Osteoklastové přípravky se 30 preinkubují při teplotě 37 °C s testovanou sloučeninou (4 dávky) nebo s kontrolami.

Poté se naočkují na řezy hovězí kortikální kosti v jamkách desky pro tkáňové kultury se 48 jamkami a další 2 hodiny se inkubují při teplotě 37 °C.

Kostní řezy se promyjí v 6 várkách teplého fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) k odstranění nepřisedlých buněk a poté se vrátí do jamek desky se jamkami obsahujících čerstvou sloučeninu nebo kontroly.

Deska pro tkáňové kultury se poté inkubuje 48 hodin při teplotě 37 °C.

-30• · » · · · · · · · · ··· · · · · ·· • · · · · · * ··· • · · · ^ · · · · · · * *

Supernatanty z každé jamky se odsaji do jednotlivých zkumavek a vyhledávají se pomocí kompetitivní ELISA, která detekuje c-telopeptid kolagenu typu I, který se uvolňuje během procesu resorpce. Jde o komerčně dostupnou ELISA (Osteometer, Dánsko), která obsahuje králičí protilátku, která specificky reaguje se sekvencí 8 aminokyselin (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg), která je přítomna na karboxylovém, konci telopeptidu řetězce al kolagenu typu I. Výsledky se vyjádři jako % inhibice resorpce ve srovnání s kontrolou vehikula.

Stanovení adhese lidských osteoklastů

Alikvoty suspensí lidských buněk odvozených z osteoklastomu se vyjmou z úschovy v kapalném dusíku, rychle se ohřejí na teplotu 37 °C a jedekrát se promyji v mediu RPMI-1640 odstředěním (frekvence otáček 1000 za minutu, 5 minut při tepotě 4 °C).

Buňky se dvakrát promyji studeným RPMI-1640, následuje odstředění (frekvence otáček 1000 za minutu, 5 minut při teplotě 4 °C) a buňky se poté přenesou do sterilní 15ml zkumavky do odstředivky. Ve vylepšené

-31• •·· · · · · ··· ··· »··· ·· • * · ···· ··

Neubauerově citaci komůrce se vyčíslí počét”móhonuVleárních buněk.

Ze zásobní lahve se vyjme dostatek magnetických kuliček (5/mononuklérni buňka) potažených kozím protimyším IgG (Dynal, Great Neck, NY) a umístí se do 5 ml čerstvého media (tím se odplaví toxické azidové konzervans). Medium se odstraní imobilizací kuliček ma magnetu a nahradí se čerstvým mediem.

Životaschopné osteoklasty se spočítají v čítači komůrce za použiti diacetatu fluoresceinu k označení živých buněk. K přidání vzorku do komůrky se použije plastická pasteurova pipeta na jedno použití s velkým průměrem otvoru.

Osteoklasty se peletují odstředěním a hustota se upraví na příhodné číslo v mediu EMEM (počet osteoklastů se liší tumor od tumoru) doplněném 10 % fetálniho telecího séra a 1,7 g/litr hydrogenuhličitanu sodného.

-32···· ·· · · · · · ·

Osteoklasty odvozené z osteoklastomu se 30 minut preinkubuji se sloučeninou (4 dávky) nebo s kontrolami při teplotě 37 °C.

Buňky se poté očkuji na žezy potažené osteopontinem (lidský nebo krysí osteopontin, 2,5 pg/ml) a 2 hodiny se inkubují při teplotě 37 °C.

Nepřisedlé buňky se uvolní silným promytím řezů ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku a buňky zbývající na řezech se fixují v acetonu.

Osteoklasty se obarví na kyselou fosfatasu odlonou vůči tartratu (TRAP), což je selektivní markér buněk tohoto fenotypu (viz kroky 15 až 17) a ty se spočítají světelnou mikroskopií. Výsledky se vyjádří jako % inhibice adhese ve srovnání s kontrolou vehikula.

Stanovení adhese buněk

Buňky a buněčná kultura

Lidské embryonální ledvinné buňky (buňky HEK293) se získají od ATCC (Katalogové č. CRL 1573). Buňky se vypěstují v Earlově minimálním esenciálním mediu (EMEM), což je medium obsahující Earlovy sole, 10 % fetálního hovězího séra, 1 % glutaminu a 1 % penicilinu-steptomycinu.

Konstrukty a transfekce

Fragment 3,2 kb EcoRI-KpnI podjednotky a_v a fragment 2,4 kb Xbal- Xhol podjednotky β₃ se vloží do klonovacích míst EcoRI - EcoRV vektoru pCDN (Aiyar a kol.,

-331994) který obsahuje promotor CMV a volitéTňý* markér ‘Č418 ligaci tupého konce. Pro stabilní expresi se 80 x 10⁶ buněk HEK 293 elektrotransformuje s konstrukty α_νβ₃ (20 μg DNA každé podjednotky) za použiti přístroje Gene Pulser (Hensley a kol., 1994 ) a umístí se na lOOmm desky (5 x 105 buněk/deska). Po 48 hodinách se růstové medium doplní 450 pg/ml přípravku Geneticin (G418 Sulfáte, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Buňky se udržují v mediu až jsou jsou kolonie dostatečně veliké pro stanovení.

Imunocytochemická analýza transfekovaných buněk

Ke stanovení, zda transfektanty HEK 293 exprimují vitronektinový receptor, se buňky odstředěním immobilizují na mikroskopických sklíčkách, fixují se v acetonu 2 minuty při teplotě místnosti a vysuší se na vzduchu. Za použití standardních nepřímých imunofluorescenčních metod se ukáže specifická reaktivita s 23C6, což je monoklonální protilátka specifická pro komplex α_νβ₃.

Studie buněčné adhese

Desky ELISA s 96 jamkami Corning se přes noc předem potáhnou při teplotě 4 °C 0,1 ml lidského vitronektinu (0,2 pg/ml v mediu RPMI). V čase experimentu se desky promyji jdenou mediem RPMI blokují se 3,5% BSA v mediu RPMI 1 hodinu při teplotě místnosti. Transfekované buňky 293 se resuspendují v mediu RPMI, doplní se 20 mM Hepes, pH 7,4 a 0,1% BSA na hustotu 0,5 x 10⁶ buněk/ml.

0,1 ml buněčné suspense se přidá do každé jamky a inkubuje se 1 hodinu při teplotě 37 °C za přítomnosti nebo nepřítomnosti různých antagonistů α_νβ₃. Po inkubaci se přidá 0,025 ml 10% roztoku formaldehydu, pH 7,4, a buňky se

-34• · ««.···· · · · · · · fixuji při teplote místnosti 10 minut. Desxy se třikrát promyjí 0,2 ml media RPMI a přisedlé buňky se barví 0,1 ml 0,5% toluidinové modři 20 minut při teplotě místnosti Přebytečné barvivo se odstraní důkladnýmpromytím deionizovanou vodou. Toluidinové modř inkorporovaná do buněk se vyluhuje přidáním 0,1 ml 50% ethanolu obsahujícího 50 mM kyseliny chlorovodíkové. Adhese buněk se kvantifikuje při optické hustotě 600 nm na mikrotitrovém deskovém odečítači (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).

Vazebná studie α_νβ5 v tuhé fázi

Vitronektinový receptor α_νβδ se vyčistí z lidské placenty. Receptorový přípravek se naředí 50mM TrisHCI, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂(pufr A) a ihned se přidá na desky ELISA s 96 jamkami v dávce 0,1 ml na jamku. Na jamku se přidá 0,1 až 0,2 μς α_νβ3· Desky se inkubují pořes noc při teplotě 4 °C. V době experimentu se jamky promyjí jedenkrát pufrem A a inkubují se 1 hodinu při teplotě místnosti s 0,1 ml 3,5% hovězího sérového albuminu ve stejném pufru. Po inkubaci se obsah jamek úplně odsaje a dvakrát se promyje 0,2 ml pufru A.

V kompetičním stanovení [³H]-SK&F-107260 se do jamek přidávají různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 až 100 μΜ), následuje přidání 5,0 nM [³H]-SK&F107260. Desky se 1 hodinu inkubují při teplotě místnosti. Po inkubaci se desky úplně odsají a jedenkrát promyjí 0,2 ml ledově studeného pufru A jamka po jamce. Receptory se solubilizují 0,1 ml 1 % SDS a navázaný [³H]-SK&F-107260 se stanoví čítáním scintilace kapalin s přidáním 3 ml přípravku Ready Safe v přístroji Beckman LS Liquid Scintillation Counter, se 40% účinností. Nespecifická vazba

a je konsistentně menší než 1 % celkového vstupu radioligandu. IC₅o (koncentrace antagonisty k inhibici 50 % vazby [³H]-SK&F-107260) se stanoví nelineární metodou křivky nejmenších čtverců, která je upravena z programu

LUNDON-2. Ki (disociační konstanta antagonisty) se vypočítá podle rovnice: Ki = IC50/ (1 + L/K_d) , kde L a K_d jsou koncentrace respektive disociační konstanta [³H]-SK&F

107260.

Inhibice vazby GPIIb-IIIa zprostředkované RGD

Purifíkace GPIIb-IIIa jednotek prošlých, promytých lidských destiček (získaných od Červeného kříže) se lyžuje mírným mícháním ve 3% oktylglukosidu, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ 2 jhodiny při teplotě 4 °C. lysát se 1 hodinu odstřeďuje při frekvenci otáček 100 000 za minutu. Získaný supernatant e aplikuje do 5ml sloupce čočkové lektinové sefarosy 4B (E.Y. Labs) předem vyváženého 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 % oktylglukosidu (pufr A). Po 2 hodinách inkubace se sloupec promyje 50 ml studeného pufru A. GPIIb-IIIa zadržený na lektinu se eluuje pufrem A obsahujícím 10 % dextrosy. Všechny postupy se provádějí při teplotě 4 °C. Získaný GPIIb-IIIa má čistotu vyšší než 95 %, jak je ukázáno elektroforesou na polyakrylamidovém gelu.

Inkorporace GPIIb-IIIa do liposomů

Směs fosfatidylserinu (70 %) a fosfatidylcholinu

-36• · · · · ··· · · · · ·· »* * · · ·· · · · · (30 %) (Avanti Polar Lipids) se proudem dús’íku vysuší na stěnách skleněné zkumavky. Vyčištěný GPIIb-IIIa se naředí na konečnou koncentraci 0,5 mg/ml a smísí se s fosfolipidy v poměru protein:fosfolipid 1:3 (hmotnost:hmotnost). Směs se 5 minut resuspenduje a sonikuje v lázňovém sonikátoru. Směs se poté přes noc dialyzuje za použití dialyzačního trubkoví s uzávěrem 12 000 až 14 000 molekulové hmotnosti proti 1000-násobnému přebytku 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ (se dvěma výměnami). Liposomy obsahující GPIIb-IIIa se 15 minut odstřeďují při 12 000 g a resuspendují se v dialyzačním pufru na konečnou koncentrci proteinu přibližně 1 mg/ml. Liposomy se skladují do doby potřeby při teplotě -70 °C.

Kompetitivní vazba na GPIIb-IIIa

Vazba na fibrinogenový receptor (GPIIb-IIIa) se stanoví nepřímou kompetitivní vazebnou metodou za použití [³H]-SK&F-107260 jako ligandu typu RGD. Stanovení vazby se provádí na soupravě filtrační desky s 96 jamkami (Millipore Corporation, Bedford, MA) za použití 0,22pm hydrofilních duraporových membrán. Jamky se předem potahují 0,2 ml μg/ml polylysinu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) při teplotě místnosti 1 hodinu k blokádě nespecifické vazby. Do jamek se kvadruplikátech přidají různé koncentrace neznačených benzazepinů. [³H]-SK&F-107260 se aplikuje do každé jamky v konečné koncentraci 4,5 nM, následuje přidání 1 μς purifikovaných liposomů obsahujících destičkový GPIIbIIIa. Směsi se 1 hodinu inkubují při teplotě místnosti.

[³H]-SK&F-107260 navázaný na GPIIb-IIIa se od nenavázaného oddělí filtrací za použití filtrační tvarovky s více hrdly Millipore, následuje promytí ledově studeným pufrem

-37·· · · ·· · · ·· ··· ···· · · ··· ···· ·· (dvakrát, pokaždé 0,2 ml), navázaná radioáTčfivita ‘zbýváj ici na filtrech se čitá v 1,5 ml přípravku Ready Solve (Beckman

Instruments, Fullerton, CA) v přístroji Beckman Liquid

Scintillation Counter (Model LS6800), se 40% účinností.

Nespecifická vazba se stanoví za přítomnosti 2 μΜ neznačeného SK&F-107260 a je konsistentně nižší než 0,14 % celkové radioaktivity přidané ke vzorkům. Veškeré datové body jsou střední hodnotou stanovení kvadruplikátů.

Kompetitivní vazebná dáte se analyzují nelineární metodou křivky nejmenších čtverců, Tato metoda poskytuje IC₅₀ antagonistů (koncentrace antagonisty, která inhibuje specifickou vazbu [³H]-SK&F-107260)z 50 % při rovnováze). Hodnota IC50 je vztažena k rovnovážné disociační konstantě Ki antagonisty založené na Chengově a Prusoffově rovnici: Kx = IC50/(l + L/Kd) , kde L je koncentrace [³H]-SK&F-107260 použitá při kompetitivním vazebném stanovení (4,5 nM) a Kd je disociační konstanta [³H]-SK&F-107260, která je 4,5 nM, jak se stanoví Scatchardovou analýzou.

Účinnost sloučeniny obecného vzorce I samotné nebo v kombinaci s antineoplastickým činidlem se může stanovit za použití několika modelů transplatnabilních myších tumorů. Pokud jde o detaily těchto modelů, viz US patenty čísel 5 004 758 a 5 633 016.

Příklady, které následují nejsou žádným způsobem zamýšleny k omezení rozsahu tohoto vynálezu, ale jsou poskytnuty k ilustraci, jak připravit a použít sloučeninu podle tohoto vynálezu. Odborníkovi v oboru budou snadno zřejmá mnohá další ztělesnění.

Příklady provedení vynálezu

• ·

Obecně

Spektra protonové nukleární magnetické resonance (^:Η NMR) se zaznamenávají při 300 MHz a chemické posuny jsou udávány v dílech na milion (δ) ve spodním poli vnitřního standardního tetramethylsilanu (TMS). Zkratky pro NMR data jsou následující: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet, dd = dublet dubletu, dt = dublet tripletů, app = zřejmý. J označuje NMR spojovací konstantu měřenou v hertzích. CDCI3 je deuteriochloroform, DMSO-dg je hexadeuteriodimethylsulfoxid a CD3OD je tetradeuteriomethanol. Hmotnostní spektra se získají za použití elektrorozprašovacích (ES) ionizačních technik. Prvkové analýzy provádí Quantitative Technologies lne., Whitehouse, NJ. Teploty tání se získají na přístroji pro stanovení teploty tání Thomas-Hoover a jsou neupraveny. Veškeré teploty jsou uvedeny ve stupních celsia. Pro chromatografií na tenké vrstvě se použijí tenkovrstevné desky Analtech Silica Gel GF a E. Měrek Silica Gel 60 F-254. Blesková chromatografie se provádí na silikagelu E. Měrek Kieseigel 60 (rozměr částic 0,67 až 0,038 mm). Analytická a preparativní HPLC se provádí na chromatografech Beckman. ODS odkazuje na chromatografícky nosič se silikagelem derivovaným oktadecylsilylem.

YMC ODS-AQ' je ODS chromatografický nosič a je registrovanou ochrannou známkou firmy YMC Co. Ltd., Kyoto, Japonsko. PRP-1® je polymerní (styrendivinylbenzen) chromatografický nosič a je registrovanou ochrannou známkou firmy Hamilton Co., Reno, Nevada. Celíte® je filtrační pomůcka složená z kyselinou promyté rozsivkové zeminy a je registrovanou ochrannou známkou firmy Manville Corp., Denver, Colorado.

-39Připrava 1

Příprava 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-1-ethanolu

a) 2-Methyl-8-(terč.-butoxykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-

1,8-naftyridin

Směs 2-methyl-l,8-naftyridinu (J. Chem. Soc. (C)

315, (1966), 5,13 g, 35,58 mmol), 10% Pd/C (1,14 g, 1,07 mmol) a absolutní EtOH (70 ml) se deoxygenuje třemi cykly odsátí/probublání H₂, poté se rychle míchá pod atmosférou H₂. Po 18,5 hodinách se směs se směs filtruje přes Celíte®, a filtrační podložka se sekvenčně promyje absolutním EtOH a EtOAc. Filtrát se odpaří do sucha, a odparek se znovu odpaří z EtOAc k získání bělavé tuhé látky (5,25 g).

Roztok výše uvedeného materiálu (5,25 g), di-terc.-butyldikarbonatu (15,53 g, 71,16 mmol) a CH₂C1₂ (10 ml) se odpaří na rotavapu k odstranění rozpouštědla a olejový odparek se zahřívá pod atmosférou dusíku na olejové lázni nastavené na teplotu 55 až 60 °C. Po 45 hodinách se reakční směs ochladí na teplotu místnosti a odparek se bleskově chromatografuje na silikagelu (40% EtOAc/hexany).

Sloučenina pojmenovaná	v záhlaví	(4,	90 g,	55 %) se	získá
jako světle žlutá tuhá	látka.
NMR (300 MHz, CDC1₃)	δ 7,27 (d,	J	= 7,6	Hz, 1H),	6, 81
(d, J = 7, 6 Hz, 1H) , 3,	69 - 3,79	(m,	2H) ,	2,65 - 2,	7 5 (m,

2H), 2,48 (s, 3 H), 1,83 - 1,98 (m, 2H), 1,52 (s, 9H);

MS (ES) m/e 249 (M + H)⁺.

b) Ethyl-[8-(terč.-butoxykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-

-naf tyridin-2-yl]acetat

K roztoku diisopropylaminu (7,24 ml, 55,3 mmol) v suchém THF (50 ml) se po kapkách přidá n-BuLi (2,5 M v hexanech, 22 ml, 55,3 mmol) při teplotě 0 °C. Po 15 minutách se tento roztok po kapkách přidá k roztoku 2-methyl-8-(terč.-butoxykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridinu (4,9 g, 19,7 mmol) a diethylkarbonatu (8,86 ml, 73,0 mmol) v suchém THF (50 ml) při teplotě -78 °C. Po 30 minutách se směs uhasí nasyceným roztokem NH₄C1 (100 ml), ohřeje se na teplotu místnosti a extrahuje EtOAc (3 x 200 ml). Spojené organické extrakty se vysuší síranem hořečnatým, zfiltrují a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se chromatografuje na silikagelu (40% EtOAc/hexany) k získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (5,72 g, 91 %) jako světle žlutého oleje.

MS (ES) m/e 321 (M + H)⁺.

c) 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-1-ethanol

K roztoku ethyl-[8-(terč.-butoxykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl]acetatu (5,72 g,

17,85 mmol) v suchém THF (80 ml) při teplotě místnosti se přidá LÍBH4 (2,0 M v THF, 10,7 ml, 21,42 mmol) a výsledná směs se zahřívá na teplotu zpětného toku. Po 18 hodinách se směs ochladí na teplotu 0 °C a opatrně se zalije vodou (100 ml). Po 10 minutách se směs extrahuje EtOAc (3 x 100 ml). Spojené organické extrakty se vysuší síranem hořečnatým, zfiltrují a odpaří za sníženého tlaku.

Výše uvedený odparek (4,9 g) se rozpustí v CH₂C1₂

-41• · ·· ·· ·· ·· • ·· · · · · · · ··· · · · · * • · · · · · · · ···« ·· ·· *· ·· (10 ml). K tomuto roztoku se prida 4N HC1 v dioxanu (20 ml) všechna najednou při teplotě místnosti. Po 4 se směs odpaří za sníženého tlaku. Odparek se vyjme směsi 1:1 l,0N NaOH a nasyceného roztoku NaCl (100 ml) a extrahuje se CH2CI2 (3 x 100 ml). Spojené organické extrakty se vysuší síranem hořečnatým, zfiltrují a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se chromatografuje na silikagelu (10% MeOH ve směsi 1:1 EtOAc/CHCl₃) k získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (2,09 g, 66 %) jako žluté tuhé látky.

MS (ES) m/e 179 (M + H)⁺.

Příprava 2

Příprava ethyl-[(±) -10, ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-acetatu]

a) 6-Methoxy-l-fenylinden

Roztok 3,0 M fenylmagnesiumbromidu v Et₂O (680 ml, 2,04 mol) se pod atmosférou argonu při teplotě místnosti za míchání naředi Et₂O (700 ml) a po kapkách se během 20 hodin přidá roztok 6-methoxy-l-indanonu (277 g, 1,71 mol) v THF (1400 ml). Reakční směs se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti a poté se vlije za míchání do nasyceného roztoku chloridu amonného (2,8 litru). Přidá se voda (1,4 litru) a organická fáze se oddělí. Vodná fáze se extrahuje Et₂O (2x1 litr) a spojené organické extrakty se odpaří k získání surového 6-methoxy-l-fenyl-l-indanolu (445 g) jako hnědého oleje. Tento olej se rozpustí v toluenu (2,5 litru) a přidá se mohohydrát kyseliny p-toluensulfonové (12,3 g, 0,065 mol). Roztok se míchá a zahřívá na teplotu zpětného toku 16 hodin za použití Dean-Starkova

-42···· ···· · · · · ··· ···· ·· · • · » · · · · · ·· · ···· ·· · · ·♦ ·· ··· nástavce s kondenzátorem. Po 2 hodinách bylo zachycení vody minimální a celkem tvořilo 28 ml. Roztok se ochladí a sekvenčně extrahuje 5 % vodným roztokem uhličitanu sodného (1 litr) a vodou (2x1 litr). Organická vrstva se odpaří k získáni tmavě hnědého oleje (400 g). Tento olej se destiluje ve vakuu k získáni sloučeniny pojenované v záhlaví (298,2 g, 79 %) jako žlutého oleje.

Teplota varu: 152 až 190 °C/266,6 Pa;

TLC (10% EtOAc/hexany) R_f0,75.

a b) Kyselina 2-benzoyl-4-methoxyfenyloctová

Acetone (4,2 litru) se ochladí na teplotu 10 °C, a během 1,5 hodiny se spolu s Jonesovým činidlem (1,8 litru, připraveným z CrO₃ (470 g, 4,70 mol), H₂O (1 litr) a koncentrovanou H₂SO₄ (405 ml) přidá roztok 6-methoxy-lfenylindenu (271 g, 1,22 mol) v acetonu (1,8 litru).

K výsledné směsi se ve dvou částech přidá 4% vodný roztok 0s0₄ (135 ml), jedna na počátku přidávání a druhá v polovině přidávání, přičemž teplota reakční směsi se udržuje pod 15 °C. Po přidávání se reakční směs ohřeje na teplotu 22 °C a 1,5 hodiny se míchá, během kteréžto doby mírná exothermie zvýší teplotu na 28 °C. Reakční směs se poté ochladí pod 20 °C a přidá se isopropanol (1 litr), napřed po kapkách a po zmírnění počáteční exotermie rychle. Během této fáze míchání ztěžkne. Teplota během přidáváni isoporpanolu dosáhne 32 °C. Přidá se vda (2 litry) a směs se přenese do dělicí nálevky. K rozluštění sraženiny chromové kyseliny se přidá další voda a směs se extrahuje CH₂C1₂ (2 litry). Organická (horní) vrstva se oddělí a vodná fáze se extrahuje CH2CI2 (2x1 litr). Spojené extrakty CH₂C1₂ se sekvenčně promyjí vodou (2 litry) a

-43• · • · • · • t · · · · · ·· · ···· ·· ·· ·· · · ··· nasyceným roztokem chloridu sodného (2 litry) a poté se odpaří k získání vlhké šedé tuhé látky (416 g). Ta se trituruje směsí acetonu a EtOAc a zfiltruje a vysuší k získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (225,4 g, 71 %) jako bělavé tuhé látky.

T. t.: 158 až 159 °C.

c) Kyselina 2-benzyl-4-methoxyfenyloctová

Kyselina 2-benzoyl-4-methoxyfenyloctová (215,5 g, 0,80 mol) se rozdělí na dva stejné díly a každý se rozpustí v ledové kyselině octové (1,5 litru) ve 2,51itrové tlakové nádobě. Ke každé se přidá 5% Pd/C (10 g, 0,0048 mol) a každá směs se míchá při teplotě místnosti pod atmosférou vodíku na Parrově přístroji. Po 2,5 hodinách se směsi zfiltrují k odstranění katalyzátoru a filtrační podložky se promyji EtOAc. Spojené filtráty se odpaří k získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (215 g, kvantitativně) jako sytě žlutého oleje, který během stání krystaluje.

^TH NMR (250 MHz, CDC1₃) δ 7,05 - 7,35 (m, 6 Η) , 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,76 (s, 3 Η), 3,54 (s, 2H).

d) 10,ll-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Roztok kyseliny 2-benzyl-4-methoxyfenyloctové (215 g surového materiálu, který obsahuje 204,6 g (0,80 mol) čistého materiálu) v CH₂C1₂ (1 litr) se míchá pod atmosférou argonu při teplotě místnosti a přidá se DMF (1 ml), následuje oxalylchlorid (400 ml, 4,59 mol). Oxalylchlorid se přidá během 1 hodiny, zpočátku po kapkách

-44• · · · ·· ·· ·· ·· ··· k řízeni silného vývoje plynu. Roztok se míchá 16 hodin při teplotě místnosti a poté se odpaří k získání surového chloridu kyseliny (207,7 g, 0,756 mol, 95 %) jako žluté kapaliny, tato kapalina se rozpustí v CH2CI2 na celkový objem 500 ml a k CH2CI2 (3,7 litru) se během 1 hodiny přidá současně roztok a AICI3 (100,8 g, 0,756 mol) za míchání pod atmosférou argonu při teplotě místnosti. Při dokončení přidávání je teplota 28 °C. Reakční směs se míchá 16 hodin při teplotě místnosti, během kteréžto doby se vysráží tuhá látka. Přidá se voda (1 litr), zpočátku po kapkách, během 30 minut. Směs se poté oddělí a organická fáze se sekvenčně promyje vodou (1 litr) a 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (1 litr). Roztok v CH₂C1₂ se poté odpaří k získání žluté tuhé látky (175,3 g). Rekrystalizací ze směsi EtOAc/hexan se získá sloučenina pojmenovaná v záhlaví (128 g, 71 %).

T.t. 107 až 109 °C.

e) Ethyl-((±)-10,ll-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo [a, d]cyklohepten-10-acetat l,0M roztok bis(trimethylsilyl)amidu lithného v hexanech (1282 ml, 1,282 mol) se přidá k THF (4,0 litru) při teplotě -70 °C pod atmosférou argonu, poté se po kapkách během 20 minut přidá EtOAc (146 ml, 1,49 mol).

i Reakční směs se nechá míchat 15 minut, poté se během 20 minut přidá N,N,N',N'-tetramethylethlylendiamin (378 ml,

2,5 mol). Reakční směs se míchá 10 minut, poté se během 40 minut po kapkách přidá roztok 10,ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-onu (119,2 g, 0,50 mol) v bezvodém THF (1,26 litru). Teplota se během všech těchto přidávání udržuje pod -65 °C. Reakční směs se míchá 20

-45• · · · · · · « · · · · · · • · · · · · • · · · · · * • · · · · · minut při teplotě -65 až -70 °C a poté s‘e‘vlij e do’ nasyceného roztoku chloridu amonného (6,2 litru) za silného míchání. Organická vrstva se oddělí a vodná fáze se extrahuje EtOAc (2x1 litr). Spojené organické extrakty se promyji vodou (2x1 litr) a poté se odpaří k získání světle hnědého oleje (175 g). Chromatografie na tenké vrstvě (20 % EtOAc/hexany) ukáže Rf 0,5 hlavní (požadovaný produkt) a R_f 0,7 vedlejší (obnovený keton). Surový produkt se chromatografuje na silikagelu (2 kg, 10 % EtOAc/hexany) k získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (101 g, 61 %) jako žlutého oleje.

X NMR (250 MHz, CDC1₃) δ 7,63 (d, J = 7,7 Hz, 1H) , 7,00 7,30 (m, 4H) , 6,80 (d, J = 2,6 Hz, 1H) , 6,69 (dd, J = 8,2,

2,6 Hz, 1H), 3,95 - 4,35 (m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 1H), 3,64 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 3,35 (d, J = 14,2 Hz, 1H) , 2,79 (d, J = 16,0 Hz, 1H) , 2,66 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3 H).

f) Ethyl-[ (±)-10, ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-acetat]

Ethyl-[ (±)-10,ll-dihydro-10-hydroxy-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat] (101 g, 0,31 mol) se rozpustí v ledové kyselině octové (1,8 litru) a přidá se 12N HC1 (28,5 ml, 0,34 mol). Směs se vloží do 2,51itrové tlakové lahve obsahující 5% Pd/C (20 g, 0,0094 mol) a výsledná směs se protřepává při teplotě 35 °C pod atmosférou vodíku v Parrově hydrogenačním přístroji vybaveném vyhřívačem pláště. Po 18 hodinách se reakční směs ochladí na teplotu místnosti a katalyzátor se odstraní filtrací. Filtrát se odpaří k získání světle žlutého oleje (85,1 g). Ten se chromatografuje na silikagelu (2 kg,

-46• · • · krokový gradient s 5 až 10 % EtOAc/he^á^y)’ k zi*skani sloučeniny pojmenované v záhlaví (69,1 g, 72 %) jako oleje.

Λ NMR (250 MHz, CDC1₃) δ 7,05 - 7,22 (m, 4 Η) , 7,01 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2,

2,7 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,11 - 4,25 (m,

2H) ,	3,85 (d,	J = 15,0	Hz, 1H),	3,70	- 3,90	(m,	1H) ,	3,77
(s,	3H), 3,31	(dd, J =	15,0, 4,1	Hz,	1H), 2	,93	(dd,	J =
15, 0	, 9,2 Hz,	1Ή), 2,64	(dd, J =	15,	6, 5,0	Hz,	1H) ,	2,52
(dd,	J = 15,6,	9,3 Hz,	1H) , 1,27	(t,	J = 7,	1 Hz	, 3H)	•

♦ g) Ethyl-} ( + )-10, ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a, djcyklohepten-10-acetat]

Roztok ethyl-}(±) -10, ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d)cyklohepten-10-acetatu] (8,5 g, 0,027 mol) v CH₂C1₂ (150 ml) se za míchání pod atmosférou argonu ochladí na teplotu -10 °C. Přidá se ethanthiol (10,7 ml, 0,144 mol), následuje A1C1₃ (20,6 g, 0,154 mol) ve dvou částech během 15 minut. Exothermie zvýší po přidáních teplotu na 0 °C a za pomoci vodní lázně se teplota poté zvýší na 25 °C. Reakční směs se míchá při teplotě 25 až 30 °C 2,25 hodiny, v kterémžto bodě se vlije do směsi ledvoda. Organická vrstva se oddělí, přidá se methanol (100 ml) a směs se extrahuje CH₂C1₂ (2 x 50 ml). Spojené dichlormethanové extrakty se promyjí vodou (250 ml) a poté se odpaří k získání a viskosního oleje (8,6 g). Ten se vyjme Et₂O (150 ml) a ether se odpaří varem, přičemž e nahrazuje hexanem. Požadovaný fenol se napřed oddělí jako olej, který krystaluje během míchání při teplotě místnosti. K získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (7,1 g, 89 %) se shromáždí dvě várky tuhé látky.

-47• · • ·

T.t.: 110 až 112 °C.

Příprava 3

Štěpeni enantiomerů ethyl-[ ( + )-10,ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-acetatu] pomocí HPLC

a) Ethyl-[ (R)-( + )-10,ll-dihydro-3-hydroxy-5H-diben- zo[a,d]cyklohepten-10-acetat] a ethyl-[(S|-(-)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat]

Ethyl-[ (±)-10,ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a, d] cyklohepten-10-acetat] se rozštěpí na své enantiomery za použití následujících podmínek: Sloupec Daicel Chiralcel OJ^; (21,2 x 250 mm), 20% ethanol v hexanu mobilní fáze, rychlost průtoku 15 ml/min, uv detekce při 254 nm, 140 mg injekce; t_R pro ethyl-[ (S) - (-)-10, ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a, dJcyklohexen-10-acetat] = 10,4 min.; t_R pro ethyl-[ (R) - ( + ) -10, ll-dihydro-3hydroxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohexen-10-acetat] = 13,1 min.

Příprava 4

Příprava 10,ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a, djcyklohepten-10-onu

a) Kyselina 2-benzyl-4-methoxyfenyloctová

Roztok kyseliny 2-benzoyl-4-methoxyfenyloctové (13,0 g, 0,048 mol), připravený způsobem podle J. Med. Chem., 2 4, 998 (1981) v ledové kyselině octové (600 ml) se zpracuje pod atmosférou argonu 4,3 g 10% Pd/C a hydrogenuje

-48se při tlaku 344,7 kPa 17 hodin. Směs“s*é ž’filťřuje za použití Celíte^ a filtrát se odpaří a znovu odpaří z toluenu a methylenchloridu k získání 14,2 sloučeniny pojmenované v záhlaví.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 3,52 (s, 2H) , 3,75 (s, 3H) , 4,0 (s, 3H), 6,7 (m, 2H), 7,15 (m, 6H).

b) 10,ll-Dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Roztok kyseliny 2-benzyl-4-methoxyfenyloctové (14,2 g, 0,055 mol) v benzenu (120 ml) a thionylchloridu (28 ml) se 1 hodinu zahřívá na teplotu zpětného toku a odpaří se. Chlorid kyseliny se rozpustí v suchém methylenchloridu (40 ml) a roztok se pod atmosférou argonu po kapkách přidá k roztoku A1C1₃ (14,7 g, 0,11 mol) v methylenchloridu (600 ml). Reakční směs se míchá pod atmosférou argonu 2,5 hodiny při teplotě místnosti a poté se zalije směsí led-voda (200 ml). Vrstvy se oddělí a organická fáze se sekvenčně promyje 10% roztokem NaOH, vodou a ředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Výsledný roztok se naředí etherem (200 ml), vysuší síranem horečnatým a odpaří. Tuhý odparek se trituruje směsí ether/hexan (1:1) a filtrací se shromáždí 9,35 g sloučeniny pojmenované v záhlaví.

T.t.: 105 až 106 °C;

¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 3,72 (s, 3H) , 4,1 (s, 2H) , 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, 1H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (m, 4H), 8,1 (d, 1H) .

Příprava 5

-49• ·· · · ·· · ♦ ··· • · * ···· · · · • ··· · · .... ····’

Příprava ethyl-}(±) -10, ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-acetatu]

a) Ethyl-} (±)-3-(3-methoxyfenyl)indenacetat]

Ke studenému roztoku 3-(3-methoxyfenyl)indenu (4 g, 18 mmol), připravenému způsobem podle J. Med. Chem., 24, 998 (1984), v THF (15 ml) při teplotě 0 °C se po kapkách přidá roztok LiN(TMS)₂ (20 ml, 1M v THF) během 5 minut. Výsledný roztok se po kapkách přidá k roztoku ethylbromacetatu (3,34 g, 20 mmol) v THF (15 ml) při teplotě -78 °C během 30 minut. Po 2,5 hodinách se směs zalije nasyceným roztokem chloridu amonného a vrstvy se oddělí. Organická vrstva se vysuší síranem horečnatým a odpaří k získání surového produktu, který se vyčistí sloupcovou chromatografii (SiO₂/2 až 4% EtOAc/hexan) k získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (1,1 g).

^TH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,30 (t, 3H) , 2,50 (m, 1H) , 2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H) , 6,6 (s, 1H), 6,9 (m, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 6H).

b) Ethyl-} (±)-3-[(3-methoxybenzoyl)]fenylsukcinat]

Roztok ethyl-} (±)-3-(3-methoxyfenyl)indenacetatu] (1,1 g, 3,6 mmol) v acetonu (30 ml) se zpracuje 4% vodným roztokem oxidu osmičelého (0,5 ml), následuje přidáni po kapkách 1,2M Jonesova činidla (5 ml, 6 mmol) podle způsoíbu uvedeného v literatuře (J. Org. Chem., 58, 4745 (1993)). Po celonočním míchání při teplotě místnosti se tmavá rakční směs zalije isopropanolem (2,5 ml), následuje hydrogensiřičitan sodný (0,9 g) a voda (30 ml). Produkt se extrahuje ethylacetatem, promyje roztokem chloridu sodného,

-50·· ·· ·· · · ·· * ···· ···· ···· ··· ···· ·· · • · ··· ·· ··· · · * * · * · * · *··*··· vysuší síranem hořečnatým a odpaří k žiš*káňí tuHéňo odparku. Trituraci směsi 1:1 ether/hexan se získá 0,76 g sloučeniny pojemnované v záhlaví.

NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,18 (t, 3H) , 2,90 (m, 1H) , 3,3 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m, 6H).

c) Ethyl-[ (±) -3- [(3-methoxybenzyl)]fenylsukcinat]

Směs ethyl-[ (±) -3-[(3-methoxybenzoyl)]fenylsukcinatu] (0,76 g, 2,1 mmol) a 10% Pd/C (0,6 g) v ledové kyselině octové (35 ml) se hydrogenuje při tlaku 344,7 kPa 17 hodin. Směs se zfiltruje za použiti Celíte® a filtrační podložka se promyje kyselinou octovou. Filtrát se odpaří a znovu odpaří z toluenu a methylenchloridu k získání 0,65 g sloučeniny pojemnované v záhlaví.

⁷Η NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,20 (t, 3H) , 2,20 (m, 1H)-, 3,0 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H), 6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).

d) Ethyl-[ ( + )-10,ll-dihydro-3-methoxy-ll-oxo-5H-dibenzo- [a,d]cyklohepten-10-acetat]

K magneticky míchanému roztoku ethyl-[ (±)-3-[(3-methoxybenzyl)]fenylsukcinatu] (0,65 g, 1,9 mmol) v suchém methylenchloridu (10 ml) se přidá DMF (0,2 ml) a oxalylchlorid (0,2 ml, 2,28 mmol). Po 1,5 hodině se roztok po kapkách přidá k suspensi chloridu hlinitého (0,6 g, 4,5 mmol) v suchém methylenchloridu (15 ml). Směs se po 2 hodinách zalije směsí led-voda, vrstvy se oddělí a vodná

-51vrstva

• · vrstvy se vysuší síranem hořečnatým a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografii (SÍO2/2 až 4% EtOAc/hexan) k získání sloučeniny pojmenované v záhlaví (0,3 g).

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,28 (t, 3H) , 2,88 (m, 1H) , 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,88 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,85 (d,

1H), 4,95 (m, 1H) , 5,8 (m, 2H), 7,22 (m, 4H), 8,1 (s, 1H).

e) Ethyl-[(±)-10,ll-dihydro-3-methoxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat]

Směs ethyl-[(±) -10, ll-dihydro-3-methoxy-ll-oxo-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu] (0,3 g, 0,93 mmol) a 10% Pd/C (0,3 g) v ledové kyselině octové (25 ml) se hydrogenuje 18 hodin při tlaku 344,7 kPa. Směs se zfiltruje za použití Celíte® a promyje se kyselinou octovou. Filtrát se odpaří a znovu odpaří z toluenu a methylenchloridu k získání 0,25 g sloučeniny pojemnované v záhlaví.

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,28 (t, 3H) , 2,60 (m, 2H) , 2,90 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,85 (d, 1H) , 4,18 (q, 2H) , 4,30 (d, tH), 6,70 (m, 2H), 7,0 (d, 1H), 7,22 (m, 4H) .

Následující příklad ilustruje způsob přípravy biologicky aktivní sloučeniny podle tohoto vynálezu z meziproduktů, jak jsou popsány v předchozích přípravách.

Příklad 1

-52• · · · · * ·· ·· ·· ·· ·

Příprava kyselina (S)-10, ll-dihydro-3-[2-(5, 6, 7,8-tetrahydro-l, 8-naftyridin-2-yl) -l-ethoxy]-5H-dibenzo[a, djcyklohepten-10-octová

a) Ethyl-[ (S)-10,ll-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetat]

K roztoku ethyl-[(S)-10, ll-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu] (200 mg, 0,67 mmol), 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-1-ethanolu (241 mg, 1,35 mmol) a Pph₃ (354 mg, 1,35 mmol) v suchém THF (5 ml) se přidá diisopropylazodikarboxylat (0,27 ml, 1,35 mmol) při teplotě 0 °C. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti ja kse lázeň ohřívá. Po 18 hodinách se směs odpaří za sníženého tlaku. Odparek se chromatografuje na silikagelu (1:4,5 hexany/Et₂O) k získání loučeniny pojmenované v záhlaví (94 mg, 31 %) jako čirého oleje.

MS (ES) m/e 457 (M + H)⁺.

b) Kyselina (S)-10,ll-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-ethoxy]-5H-dibenzo[a, d]cyklohepten-10-octové

K roztoku éthyl-[(S)-10,ll-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyridin-2-yl)-1-ethoxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-acetatu] (131 mg, 0,29 mmol) ve směsi THF/voda (2 ml) se přidá l,0N roztok LiOH (0,43 ml, 0,43 mmol) a směs se zahříá na teplotu 50 °C. Po 18 hodinách se směs ochladí na teplotu místnosti a promyje se Et₂O (2x2 ml). Vodná vrstva se okyselí na hodnotu pH 6 za použití 10%

-53kyseliny chlorovodíkové.

·· · · ·· ·· ·· • » · · · ·· · ·· ··· · · · ··· ·· ··· ·· ···· • · ♦ · ·· · ··

Výsledný zakaYěňý*‘roztok ‘se protlačí vázacím-vyluhovacím sloupcem C-18 (gradient eluce:

voda, poté 20 % CH₃CN/voda, poté CHC1₃ jako eluentu).

Frakce obsahující produkt se odpaří za sníženého tlaku k získáni sloučeniny pojmenované v záhlaví (30 mg, 24 %) jako bílého prášku.

MS (ES) m/e 429 (M + H)⁺.

Analyticky vypočítáno pro C27H₂8N2O₃ . 0,95 Hel: C, 70,02; H,

6,30; N, 6,05, Nalezeno: C, 70,01; H, 6,33; N, 5,71.

Příklad 2

Prostředek parenterální dávkové jednotky

Prostředek, který obsahuje 20 mg sloučeniny z příkladu 1 jako sterilní suchý prášek se připraví následovně: 20 mg sloučeniny se rozpustí v 15 ml destilované vody. Roztok se zfiltruje za sterilních podmínek do 25ml vícedávkových ampulí a lyofilizuje se. Prášek se rekonstituuje přidáním 20 ml 5% dextrosy ve vodě (D5W) pro intravenosní nebo intramuskulární injekci. Dávka se tím určí injikovaným objemem. Následné ředění se může provést přidáním odměřeného objemu této dávkové jednotky do dalšího objemu D5W pro injekci nebo se odměřená dávka může přidat k dalšímu mechanismu pro podávání léčiva, jako je lahvička nebo vak pro i.v. kapkovou infusi nebo jiný injekční-infusni systém.

Příklad 3

Prostředek orální dávkové jednotky

Kapsle pro orální podání se připraví míšením a mletím 50 mg sloučeniny z příkladu 1 se 75 mg laktosy a 5 mg stearatu hořečnatého. Výsledný prášek se proseje a plní do tvrdé želatinové kapsle.

Příklad 4

Prostředek parenterální dávkové jednotky

Tableta pro orální podání se připraví míšením a granulací 20 mg sacharosy, 150 mg dihydrátu síranu vápenatého a 50 mg sloučeniny z příkladu 1 s 10% roztokem želatiny. Vlhké granule se prosejí, vysuší, smísí s 10 mg škrobu, 5 mg mastku a 3 mg kyseliny stearové a slisují do tablety.

Výše uvedený popis plně popisuje, jak se vynález provede a použije. Předložený vynález však není omezen na jednotlivá ztělesnění zde výše popsaná, ale zahrnuje všechny jeho modifikace spadající do rozsahu následujících patentových nároků. Různé odkazy na časopisy, patenty a jiné publikace, kderé jsou zde citovány, představují stav techniky a jsou zde zahrnuty formou odkazu jako kdyby zde byly uvedeny ve své celistvosti.

Claims

PATENTOVÉ

1. Sloučenina obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
2. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
3. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1, antineoplastické činidlo a farmaceuticky přijatelný nosič.
4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznač jící se tím, že antineoplastickým činidlem je topotekan.

u—
5. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznač jící se tím, že antineoplastickým činidlem je cisplatina.
6. Způsob léčby chorobného stavu kde je indikován antagonismus receptoru α_νβ₃, vyznačující se tí že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.

u— m,
7. Způsob léčby chorobného stavu kde je indikován anta-56•» · · « ♦ · • »· · · · · · • · · · · · · • ·· · · · · · • · ♦ · · · · ·· · · ·· · · ♦ gonismus receptoru α_νβ5, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.
8. Způsob léčby osteoporosy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.
9. Způsob inhibice angiogenese, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.
10. Způsob inhibice růstu tumoru nebo metastazování tumoru, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.
11. Způsob léčby atherosklerosy nebo restenosy, vyzna- čující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.
12. Způsob léčby zánětu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.
13. Způsob inhibice růstu tumoru, vyznačující se tím, že zahrnuje postupné podávání nebo podávání ve * fyzikální kombinaci sloučeniny podle nároku 1 a antineoplastického činidla.

r
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že antineoplastickým činidlem je topotekan.
15.Způsob podle nároku 13, v'yznačující se t i m, že antineoplastickým činidlem je cisplatina.
16.Sloučenina obecného vzorce II nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
17. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I podle nároku i, vyznačující se tím, že zahrnuje reakci sloučeniny obecného vzorce III (no s 2-(5, 6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-1-ethanolem ve reakci zprostředkované komplexem vytvořeným mezi diisopropylazodikarboxylatem a trifenylfosfinem, následovanou hydrolýzou esteru za použití vodné báze.

♦
18.Sloučenina podle nároku 1 pro použití jako léčivo.
19.Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu chorob, při kterých je indikován antagonismus receptoru α_νβ₃.

• · · ·
20. Použiti sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu chorob, při kterých je indikován antagonismus receptoru a_vPs·
21. Použiti sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu osteoporosy.
22. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro inhibici angiogenese.
23. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro inhibici růstu tumoru nebo metastazování tumoru.
24. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu atherosklerosy nebo restenosy.
25. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu zánětu.
26. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 a antineoplastického činidla pro výrobu léčiva pro inhibici růstu tumoru ve fyzické kombinaci nebo pro postupné podání.
27. Použití podle nároku 26, kde antineoplastickým činidlem je topotekan.
28. Použití podle nároku 26, kde antineoplastickým činidlem je cisplatina.
29. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 a inhibitoru resorpce kosti pro výrobu léčiva pro léčbu osteoporosy ve fyzické kombinaci nebo pro postupné podání.