EA003254B1

EA003254B1 - Антагонист витронектинового рецептора

Info

Publication number: EA003254B1
Application number: EA200100618A
Authority: EA
Inventors: Вилльям Х. Миллер; Питер Дж. Мэнли
Original assignee: Смитклайн Бичам Корпорейшн
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2003-02-27
Also published as: AP1534A; PT1146874E; ID28811A; KR100620485B1; BR9915879A; ATE277043T1; KR20010080669A; BG65118B1; AR035006A1; AU1750200A; EA200100618A1; CN1147300C; NO20012732L; EG24025A; NZ511876A; SK7452001A3; ES2229798T3; DE69920518D1; CA2353415A1; HUP0104804A2

Abstract

Описано соединение формулы (I), которое является антагонистом витронектинового рецептора и может использоваться для лечения остеопороза, или его фармацевтически приемлемая соль.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к фармацевтически активному соединению, которое ингибирует витронектиновый рецептор и полезно при лечении воспалительных, раковых и сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз и рестеноз, и заболеваний, фактором которых является резорбция кости, таких как остеопороз.

Предпосылки создания изобретения

Интегрины представляют собой надсемейство рецепторов клеточной адгезии, которые являются трансмембранными гликопротеинами, экспрессируемыми на разнообразных клетках. Данные рецепторы поверхностной адгезии клеток включают др11Ь/111а (фибриногеновый рецептор) и α_νβ₃ (витронектиновый рецептор). Фибриногеновый рецептор др11Ь/111а экспрессируется на поверхности тромбоцита и опосредует агрегацию тромбоцитов и образование гемостатического сгустка в месте кровоточащей раны, РЫйрк е! а1., Βίοοά., 1988, 71, 831. Витронектиновый рецептор α_νβ₃ экспрессируется на ряде клеток, включая эндотелиальные, клетки гладких мышц, остеокластные и опухолевые клетки и, таким образом, имеет множество функций. Рецептор α_νβ₃, экспрессируемый на мембране остеокластных клеток, опосредует адгезию остеокластов к костной матрице, представляющую ключевую стадию в процессе резорбции кости, Кокк е! а1., 1. Βΐοί. СЬет,, 1987, 262, 7703. Заболеванием, характеризуемым избыточной резорбцией кости, является остеопороз. Рецептор α_νβ₃, экспрессируемый на клетках гладкой мышцы аорты человека, опосредует их миграцию в неоинтиму (внутреннюю выстилку органа), представляющую процесс, который может привести к рестенозу после чрескожной коронарной ангиопластики, Вготеп е! а1., СатЛюуакси1аг Кек., 1994, 28, 1815. Кроме того. Вгоокк е! а1., Се11, 1994, 79, 1157, показали, что α_νβ₃ антагонист способен промотировать уменьшение опухоли за счет индуцирования апоптоза ангиогенных кровеносных сосудов. Таким образом, агенты, блокирующие витронектиновый рецептор, могли бы оказаться полезными при лечении заболеваний, таких как остеопороз, рестеноз и рак.

В настоящее время известно, что витронектиновый рецептор относится к трем различным интегринам, обозначаемым α_νβ!, α_νβ₃ и α_νβ₅, Нойоп е! а1., Ιη!. I. Ехр. Ра!Ьо1., 1990, 71, 741. α_νβ! связывает фибронектин и витронектин. α_νβ₃ связывает большой ряд лигандов, включая фибрин, фибриноген, ламинин, тромбоспондин, витронектин, фактор Виллебранда (АШеЬтапЛ), остеопонтин и костный сиалопротеин I. α_νβ₅связывает витронектин. Было показано, что витронектиновый рецептор α_νβ₅ участвует в клеточной адгезии множества типов клеток, включая эндотелиальные клетки микрососудов, (ОаОк е! а1., 1. Се11. Вю1., 1993, 51, 206) и была подтверждена его роль в ангиогенезе. Данный интегрин экспрессируется на кровеносных сосудах грануляционной ткани раны у человека, но не в нормальной коже.

Известно, что витронектиновый рецептор связывается с белками костной матрицы, которые содержат трипептидный повторяющийся фрагмент Атд-61у-Акр (или Κ6Ό). Таким образом, Нойоп е! а1., Ехр. Се11 Кек., 1991, 195, 368, открыли, что ΚΟΌ-содержащие пептиды и антитело анти-витронектинового рецептора (23 С6) ингибируют резорбцию дентина и распространение клеток с помощью остеокластов. Кроме того, 8а!о е! а1., 1. Се11 Вю1., 1990, 111, 1113 описали, что эхистатин, пептид змеиного яда, который содержит ΚΟΌ последовательность, представляет собой сильный ингибитор резорбции кости в тканевой культуре и ингибирует присоединение остеокластов к кости.

В настоящее время установлено, что определенное соединение является сильным ингибитором α_νβ₃ и α_νβ₅ рецепторов. В частности, было установлено, что такое соединение является более сильным ингибитором витронектинового рецептора, чем фибриногенового рецептора.

Краткое изложение сущности изобретения

Данное изобретение включает соединение формулы (I), описанное далее, которое обладает фармакологической активностью для ингибирования витронектинового рецептора и может использоваться при лечении воспалительных, раковых и сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз и рестеноз, и заболеваний, фактором которых является резорбция костей, таких как остеопороз.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) и фармацевтический носитель.

Данное изобретение также относится к способу лечения заболеваний, которые опосредованы витронектиновым рецептором. В конкретном аспекте, соединение данного изобретения полезно для лечения атеросклероза, рестеноза, воспаления, рака и заболеваний, фактором которых является резорбция кости, таких как остеопороз.

Подробное описание

Данное изобретение включает новое соединение, которое является более сильным ингибитором витронектинового рецептора, чем фибриногенового рецептора. Новое соединение включает дибензоциклогептеновое ядро, в котором в одном из ароматических шестичленных колец дибензоциклогептена присутствует азотсодержащий заместитель, а алифатический заместитель, содержащий кислотный фрагмент, присутствует в семичленном кольце дибензоциклогептена. Предполагается, что дибензоциклогептеновая кольцевая система ориентирует боковые цепи заместителей в шести- и семи3 членных кольцах таким образом, что они могут благоприятным образом взаимодействовать с витронектиновым рецептором. Предпочтительно, чтобы между кислотной группой алифатического заместителя в семичленном кольце дибензоциклогептена и азотом в азотсодержащем заместителе одного из ароматических шестичленных колец дибензоциклогептена имелось примерно от двенадцати до четырнадцати промежуточных ковалентных связей по кратчайшему внутримолекулярному пути.

Данное изобретение включает соединение формулы (I)

или его фармацевтически приемлемую соль.

Соединение формулы (I) ингибирует связывание витронектина и других ΚΟΌсодержащих пептидов с витронектиновым рецептором. Ингибирование витронектинового рецептора на остеокластах ингибирует остеокластическую резорбцию кости и полезно при лечении заболеваний, где резорбция кости ассоциируется с патологией, таких как остеопороз и остеоартрит.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу стимулирования образования костной ткани, включающему введение соединения формулы (I), которое вызывает увеличение высвобождения остеокальцина. Увеличение продуцирования костной ткани является несомненным преимуществом при болезненных состояниях, где наблюдается недостаток минерализованной костной массы или требуется повторное моделирование кости, таких как заживление перелома и профилактика переломов костей, заболевания и метаболические нарушения, которые приводят к потере структуры кости, также выигрывают от такого лечения. Например, введение соединения данного изобретения может принести пользу при гиперпаратироидизме, болезни Пагета, гиперкальцемии злокачественной опухоли, остеолитических патологических изменениях, вызванных костными метастазами, потере костной ткани вследствие иммобилизации или недостатка полового гормона, болезни Беккета, остеомаляции (размягчении костей), гиперостозе и врожденном системном остеопетрозе.

Кроме того, так как соединение настоящего изобретения ингибирует витронектиновые рецепторы на различного типа клетках, указанное соединение может быть полезно при лечении воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и псориаз, и сердечнососудистых заболеваний, таких как атеросклероз и рестеноз. Соединение формулы (I) настоящего изобретения может быть полезно для лечения или профилактики других заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, тромбоэм болические заболевания, астму, аллергии, респираторный дистресс-синдром (дыхательная недостаточность) у взрослых, болезненное состояние трансплантат-против-хозяина, отторжение органа-трансплантата, септический шок, экзему, контактный дерматит, воспалительное заболевание кишечника и другие аутоиммунные заболевания. Соединение настоящего изобретения также может быть полезно для заживления ран.

Соединение настоящего изобретения также полезно для лечения, включая профилактику, ангиогенных заболеваний. Термин «ангиогенные заболевания», как он использован в данном описании, включает состояния, включающие анормальную неоваскуляризацию. В том случае, где рост новых кровеносных сосудов является причиной или вносит определенный вклад в патологию, связанную с заболеванием, ингибирование ангиогенеза будет снижать разрушительное действие заболевания. Примером такого целевого заболевания является диабетическая ретинопатия. Там, где рост новых кровеносных сосудов требуется для поддержки роста вредной ткани, ингибирование ангиогенеза будет снижать снабжение ткани кровью и, следовательно, способствовать снижению массы ткани на основе требований снабжения кровью. Примеры включают рост опухолей, где неоваскуляризация является постоянным требованием для роста опухоли и основой метастаз плотной опухоли. Таким образом, соединение настоящего изобретения ингибирует ангиогенез опухолевой ткани, предотвращая, таким образом, метастазы опухоли и рост опухоли.

Таким образом, в соответствии со способами настоящего изобретения, ингибирование ангиогенеза с использованием соединения настоящего изобретения может улучшать симптомы заболевания и, в некоторых случаях, может вылечить заболевание.

Другой терапевтической целью соединения настоящего изобретения являются заболевания глаза, характеризуемые неоваскуляризацией. Такие заболевания глаза включают неососудистые заболевания роговицы, такие как трансплантация роговицы, герпесный кератит, сифилитический кератит, птеригий (крыловидная плева) и неососудистый паннус (поверхностный диффузный сосудистый кератит), связанные с применение контактных линз. Дополнительно заболевания глаза также включают возрастную пятнистую дегенерацию, предопределенный глазной гистоплазмоз, ретинопатию преждевременной и неососудистой глаукомы.

Далее данное изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухоли, который включает введение постадийно или в физической комбинации соединения формулы (I) и противоопухолевого агента, такого как топотекан и цисплатин.

Новое соединение данного изобретения представляет (8)-10,11-дигидро-3-[2-(5,6,7,8тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1 -этокси]-5Ндибензо [а,б] циклогептен-10-уксусную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.

Согласно настоящему изобретению (8)конфигурация соединения формулы (I) является предпочтительной.

Настоящее изобретение также включает пролекарства соединения данного изобретения. Под пролекарствами подразумеваются любые ковалентно связанные носители, которые высвобождают активное исходное лекарственное средство согласно формуле (I) ίη νίνο. Таким образом, другим аспектом данного изобретения являются новые пролекарства формулы (II), которые также представляют собой промежуточные соединения при получении соединения формулы (I)

- СО₃С_)<«лкил (П) или их фармацевтически приемлемая соль.

В данном описании для описания соединения данного изобретения использованы сокращения и символы, обычно используемые в области пептидов и в области химии. Обычно, сокращения аминокислот следуют правилам Совместной Комиссии ИЮПАК-ИЮБ (ШРАСГОВ) по биохимической номенклатуре, описанным в Еиг. 1. ВюсЕет., 158, 9 (1984).

С_1-6алкил, как использовано в данном описании, обозначает необязательно замещенную алкильную группу из 1-6 атомов углерода и включает метил, этил, н-пропил, изопропил, нбутил, изобутил, трет-бутил, пентил, н-пентил, изопентил, неопентил и гексил и их простейшие алифатические изомеры.

Любой С1_-6алкил необязательно может быть замещен группой Р''. которая может находиться при любом атоме углерода, приводя к стабильной структуре, и доступна обычными синтетическими способами. Подходящими группами К^х являются С1_-4алкил, ОК, 8К, С_1-4алкилсульфонил, С1_-4алкилсульфоксил, -СЫ, Ν(Κ)₂, СН₂Ы(К)₂, -ЫО₂, -СЕ₃, -СО₂К,

-СОЫ(К)₂, -СОР, -ЫКС(О)К, Е, С1, Вг, I или СЕ₃8(О)_Г-, где г равно 0, 1 или 2, а К представляет Н или С1_-6алкил.

Некоторые группы радикалов сокращены в данном описании. ΐ-Ви относится к третичному бутилу, Вос относится к трет-бутилоксикарбонилу, Етос относится к флуоренилметоксикарбонилу, РЕ относится к фенилу, СЕ/ относится к бензилоксикарбонилу, Вп относится к бензилу, Ме относится к метилу, Е1 относится к этилу, Ас относится к ацетилу, А1к относится к С1_-4алкилу, ΝρΕ относится к 1- или 2-нафтилу и сНех относится к циклогексилу. Те! относится к 5-тетразолилу.

В данном описании сокращенно названы некоторые реагенты. ОСС относится к дициклогексилкарбодиимиду, ΌΜΑΡ относится к диметиламинопиридину, ОША относится к диизопропилэтиламину, ЕОС относится к гидрохлориду 1 -(3 -диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, НОВ! относится к 1-гидроксибензо триазолу, ТГФ относится к тетрагидрофурану, ОША относится к диизопропилэтиламину, ΌΕΑΌ относится к диэтилазодикарбоксилату, РРЕ₃ относится к трифенилфосфину, ΩΜΌ относится к диизопропилазодикарбоксилату, ДМЭ относится к диметоксиэтану, ДМФ относится к диметилформамиду, ЫВ8 относится к Νбромсукцинимиду, Рб/С относится к катализатору палладию-на-угле, РРА относится к полифосфорной кислоте, ЭРРА относится к дифенилфосфорилазиду, ВОР относится к гексафторфосфату бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфония, НЕ относится к фтористоводородной кислоте, ТЭА относится к триэтиламину, ТФУ относится к трифторуксусной кислоте, РСС относится к хлорхромату пиридиния.

Соединение формулы (I) может быть получено способами, описанными Вопб1пе11 е! а1., в публикации РСТ заявки № XVО 97/01540 (Международная заявка № РСТ/и8 96/11108), опубликованной 16 января 1997 г., полное описание которой включено в данное описание в качестве ссылки.

Кроме того, соединение формулы (I) получают способами, аналогичными описанным на схемах, которые подробно обсуждены ниже.

СхемаI

О

2 з

а) 10% Рб/С, НОАс; Е) 8ОС1₂, толуол; с) А1С13, СН2С12

На схеме I подробно представлено получение промежуточного соединения, полезного для получения соединения формулы (I).

Схема II

а) ΤίΝ(ΤΜ8)₂, этилбромацетат; Ь) реагент Джонса, ОкО₄; с) Н₂, 10% Рб/С, НОАс;

б) С2О2С12, ДМФ; е) А1С13, СН2С12, комнатная температура; Г) Н₂, 10% Рб/С, НОАс

На схеме II также подробно представлено получение промежуточного соединения, полезного для получения соединения формулы (I).

Схема III

4

СО,В

•СОаН (а) ЕЮАс/ЫНМЭ8, ТГФ; (Ь) Н₂, 10% Рб/С, конц. НС1, АсОН; (с) Е18Н, А1С1з, СН₂С1₂; (б) 2(5,6,7,8-тетрагидро -1,8-нафтиридин-2-ил)-1этанол, диизопропилазодикарбоксилат, (РЬ)₃Р; (е) 1,0 н. ЫОН, ЕЮН; НС1.

На схеме III подробно представлено получение соединения формулы (I). Взаимодействие Ш-1 (который является соединением 3 схемы I) в реакции альдольного типа с енолятом этилацетата, который может быть генерирован из этилацетата под действием подходящего амидного основания, например, диизопропиламида лития (ЬЭА) или бис(триметилсилил)амида лития (ЫНМЭ8), дает Ш-2. Часто для альдольной реакции выбирают в качестве растворителя ТГФ, хотя часто используют ТГФ в присутствии различных добавок, например, НМРА или ТМЕЭА. Восстановление Ш-2 с получением III3 (который является соединением 6 схемы II) может быть осуществлено гидрированием над подходящим катализатором, например, металлическим палладием на активированном угле (Рб/С), в подходящем растворителе, таком как уксусная кислота, в присутствии минеральной кислоты, такой как НС1. Альтернативно, данное восстановление можно осуществить обработкой Ш-2 триэтилсиланом в присутствии эфирата трехфтористого бора с использованием общего способа ОгГапороЫок и 8тоиои (8уп1Ь. Соттип., 1988, 833). Удаление простой эфирной метильной группы в Ш-3 с получением Ш-4 можно осуществить с помощью ВВг₃ в инертном растворителе, например СН2С12, или взаимодействием с этантиолом и А1С13 в инертном растворителе, предпочтительно СН2С12. Другие полезные способы удаления простой эфирной метильной группы описаны в Сгеепе «Рго1сскус Сгоирк ίη Отдашс 8уп111ек1К» (опубликованной боЬп ^Иеу апб 8опк). Соединение 4 схемы 3 (III4) взаимодействует с 2-(5,6,7,8-тетрагидро-1,8нафтиридин-2-ил)-1-этанолом, давая Ш-5. Реакция протекает под действием комплекса, образованного диизопропилазодикарбоксилатом и трифенилфосфином, и проходит в апротонном растворителе, например, ТГФ, СН2С12 или ДМФ. Этиловый сложный эфир Ш-5 гидролизуют с использованием водного основания, например, ЫОН в водном ТГФ или №ЮН в водном метаноле или этаноле, и промежуточную карбоксилатную соль подкисляют подходящей кислотой, например, ТФУ или НС1, для получения карбоновой кислоты Ш-6. Альтернативно, при желании промежуточная карбоксилатная соль может быть выделена, или карбоксилатная соль свободной карбоновой кислоты может быть получена способами, хорошо известными специалистам в данной области.

(с) КОН, Н2О, ί-РтОН; (б) 8ОС1₂, бензол; (е) А1С1₃, СН₂С1₂; (Г) ЕЮАс, ΤίΝ(ΤΜ8)₂, ТМЕЭА, ТГФ; (д) Е1₃81Н, ВР₃ЮЕ12, СН₂С1₂; (Ь) Н₂, Рб/С, ЕЮН; (1) ВВг₃, СН₂С1₂.

Коммерчески доступный 2-фтор-4метоксиацетофенон (IV-1) взаимодействует со спиртом, например, фенолом, в присутствии металлической меди и подходящего основания, например, К2СО3, давая диариловый простой эфир Ш-2. При обработке серой и подходящим первичным или вторичным амином, предпочтительно морфолином, согласно общему способу Нагпк (I. Меб. СЬет., 1982, 25, 855), Ш-2 превращается в Ш-3 по классической реакции \νί11дегоб1-Кшб1ег. Полученный таким образом тиоамид гидролизуют до соответствующей карбоновой кислоты Ш-4 взаимодействием с гидроксидом щелочного металла, подходящим является КОН, в водном спиртовом растворителе, таком как водный МеОН, ЕЮН или ί-РтОН. Карбоновую кислоту Ш-4 превращают в соответствующий хлорангидрид реакцией либо с 8ОС1₂, либо с оксалилхлоридом в условиях, хорошо известных специалистам в данной области. Обработка такого хлорангидрида подходящим катализатором Фриделя-Крафтса, таким как А1С1₃ или 8пС1₄, в инертном растворителе, таком как СН₂С1₂ или С8₂, дает циклический кетон ГУ-5. Альтернативно, кислота 1У-4 может быть непосредственно превращена в кетон 1У-5 в кислых условиях, например, под действием полифосфорной кислоты. Взаимодействие 1У-5 в реакции альдольного типа с енолятом этилацетата, который может быть генерирован из этилацетата под действием подходящего амидного основания, например, диизопропиламида лития (ΒΌΑ) или бис(триметилсилил)амида лития (ΤίΗΜΌδ), дает 1У-6. Часто для альдольной реакции выбирают в качестве растворителя ТГФ, хотя часто используют ТГФ в присутствии различных добавок, например, НМРА или ΤΜΕΌΑ. Восстановление 1У-6 с получением 1У7 может быть осуществлено при обработке 1У-6 триэтилсиланом в присутствии эфирата трехфтористого бора с использованием общего способа ОгГаиорои1о8 и 8топои (8уШ11. Соттип., 1988, 833). Любые олефиновые побочные продукты, которые образуются в результате элиминирования спирта, восстанавливают гидрированием над подходящим катализатором, например металлическим палладием на активированном угле (Рб/С), в подходящем растворителе, таком как МеОН или ΕΐΟΗ. Альтернативно, восстановление 1У-6 с получением 1У-7 можно проводить гидрированием в присутствии минеральной кислоты, такой как НС1. Обычно данная реакция катализируется Рб/С, и оптимальным является ее проведение в уксусной кислоте. Удаление простой эфирной метильной группы в 1У-7 с получением 1У-8 можно осуществить с помощью ВВг₃ в инертном растворителе, например СН₂С1₂, или взаимодействием с этантиолом и А1С1₃ в инертном растворителе, предпочтительно СН₂С1₂. Другие полезные способы удаления простой эфирной метильной группы описаны в Сгсспс «Рто1ес11уе Сгоирк ίη Отдашс 8уп111С515» (опубликованной 1о11п XV б су апб 8ощ). 1У-8 впоследствии превращают в соединение формулы (I) в соответствии со способом, кратко описанным для схемы III.

Кислотно-аддитивные соли соединения получают стандартным способом в подходящем растворителе из исходного соединения и избытка кислоты, такой как хлористо-водородная, бромисто-водородная, фтористо-водородная, серная, фосфорная, уксусная, трифторуксусная, малеиновая, янтарная или метансульфоновая. Некоторые соединения образуют внутренние соли или цвиттерионы, которые также могут быть приемлемыми. Катионные соли получают обработкой исходного соединения избытком щелочного реагента, такого как гидроксид, карбонат или алкоксид, содержащего подходящий катион, или подходящим органическим амином. Катионы, такие как Ы⁺, ΝαК⁺, Са⁴⁴, Мд⁴⁴ и ΝΗ₄ ⁺, являются специфическими катионами, присутствующими в фармацевтически приемлемых солях.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая включает соединение формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель. Соответственно, соединение формулы (I) может быть использовано при получении лекарственного средства. Фармацевтические композиции соединения формулы (I), полученного как описано ранее, могут быть получены в виде растворов или лиофилизованных порошков для парентерального введения. Порошки могут быть переведены в иную форму добавлением подходящего разбавителя или другого фармацевтически приемлемого носителя перед употреблением. Жидкие препаративные формы могут быть забуференными изотоническими водными растворами. Примерами подходящих разбавителей являются изотонический физиологический раствор, стандартная 5% декстроза в воде или забуференный раствор ацетата натрия или аммония. Такая препаративная форма является особенно подходящей для парентерального введения, но также может использоваться для перорального введения или содержащего контролируемую дозу ингалятора или распылителя для инсуффляции. Может быть желательным добавление эксципиентов, таких как поливинилпирролидон, желатин, гидроксицеллюлоза, аравийская камедь, полиэтиленгликоль, маннит, хлорид натрия или цитрат натрия.

Альтернативно данные соединения могут быть инкапсулированы, таблетированы или получены в виде эмульсии или сиропа для перорального введения. Фармацевтически приемлемые твердые или жидкие носители могут быть добавлены для усиления или стабилизации композиции или для облегчения получения композиции. Твердые носители включают крахмал, лактозу, дигидрат сульфата кальция, белую глину, стеарат магния или стеариновую кислоту, тальк, пектин, аравийскую камедь, агар или желатин. Жидкие носители включают сироп, арахисовое масло, оливковое масло, физиологический раствор и воду. Носитель также может включать материал замедленного высвобождения, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, сам по себе или с воском. Количество твердого носителя переменно, но предпочтительно оно составляет от примерно 20 мг до примерно 1 г на единичную препаративную лекарственную форму. Фармацевтические препаративные формы получают в соответствии с обычными способами фармацевтики, включая измельчение, смешивание, гранулирование и прессование, при необходимости, для таблетированных форм; или измельчение, смешивание и наполнение для твердых желатиновых капсулированных форм. При использовании жидкого носителя, препаративная форма будет в форме сиропа, эликсира, эмульсии или водной или неводной суспензии. Такую жидкую препаративную форму можно непосредственно вводить перорально или ею можно заполнять мягкую желатиновую капсулу.

Для ректального введения соединение данного изобретения можно сочетать с эксципиентами, такими как масло какао, глицерин, желатин или полиэтиленгликоли, и формовать в виде суппозитория.

Описанное здесь соединение является антагонистом витронектинового рецептора и может использоваться при лечении заболеваний, где базовая патология присуща лиганду или клетке, которая взаимодействует с витронектиновым рецептором. Например, данное соединение полезно при лечении заболеваний, где патологию создает потеря костной матрицы. Таким образом, настоящее соединение полезно для лечения остеопороза, гиперпаратироидизма, болезни Пагета, гиперкальцемии злокачественной опухоли, остеолитических патологических изменений, вызванных костными метастазами, потери костной ткани вследствие иммобилизации или недостатка полового гормона. Также предполагается, что соединение данного изобретения полезно в качестве противоопухолевого, антиангиогенного, противовоспалительного и противометастазного агента и может использоваться при лечении атеросклероза и рестеноза.

Соединение вводят пациенту либо перорально, либо парентерально, таким способом, чтобы концентрация лекарственного средства была достаточной для ингибирования резорбции костей или других подобных показаний. Фармацевтическую композицию, содержащую соединение, вводят в пероральной дозе от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг способом, совместимым с состоянием пациента. Предпочтительно пероральная доза будет составлять от примерно 0,5 до примерно 20 мг/кг. При острой терапии предпочтительным является парентеральное введение. Внутривенное вливание пептида в 5%-ной декстрозе в воде или в обычном физиологическом растворе, или в виде подобной композиции с подходящими эксципиентами является наиболее эффективным, хотя также можно использовать внутримышечную болюсную инъекцию. Обычно парентеральная доза будет составлять от примерно 0,01 до примерно 100 мг/кг; предпочтительно между 0,1 и 20 мг/кг. Соединение вводят от одного до четырех раз в день на уровне, необходимом для достижения общей дневной дозы от примерно 0,4 до примерно 400 мг/кг/день. Точный уровень и способ, которым вводят соединение, легко могут быть определены обычным специалистом в данной области путем сравнения уровня концентрации агента в крови с концентрацией, требуемой для достижения терапевтического эффекта.

В данном изобретении также разработан способ лечения остеопороза или ингибирования потери костной ткани, который включает введение последовательно или в физической комбинации соединения формулы (I) и других ингибиторов резорбции костей, таких как бисфосфо наты (т.е. аллендронат), гормонозамещающая терапия, антиэстрогены или кальцитонин. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ лечения с использованием соединения данного изобретения и анаболического агента, такого как костно-морфогенный белок, ипрофлавон, используемый для профилактики потери костной ткани и/или для увеличения костной массы.

Дополнительно настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухоли, включающий введение последовательно или в физической комбинации соединения формулы (I) и противоопухолевого агента. Соединение класса аналогов камптотецина, такое как топотекан, иринотекан и 9-аминокамптотецин, и координационные комплексы платины, такие как цисплатин, ормаплатин и тетраплатин, представляют собой хорошо известные группы противоопухолевых агентов. Соединения класса аналогов камптотецина описаны в патентах США №№ 5004758, 4604463, 4473692, 4545880, 4342776, 4513138, 4399276, публикациях заявок на европейский патент №№ 0418099 и 0088642, А аш е! а1., 1. Мей. СЬет., 1986, 29, 2358, \\'аш е! а1., 1. Мей. СЬет., 1980, 23, 554, \\аш е! а1., 1. Мей. СЬет., 1987, 30, 1774 и №йа е! а1., Ргос. 14^!Ь 1и!егпайоиа1 Соидг. СЬето!Ьегару., 1985, Лпйсапсег 8есйои 1, 28, полное описание каждой из данных публикаций включено в настоящее описание в качестве ссылки. Координационный комплекс платины, цисплатин, доступен под названием Р1айио1® от В Г15(о1 Муег5-8с.|шЬЬ Согрогайоп. Полезные композиции для цисплатина описаны в патентах США №№ 5562925 и 4310515, полное описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В способе ингибирования роста опухоли, который включает введение, последовательно или в физической комбинации, соединения формулы (I) и противоопухолевого агента, координационное соединение платины, например, цисплатин, можно вводить путем медленного внутривенного вливания. Предпочтительным носителем является смесь декстроза/ физиологический раствор, содержащая маннит. Схема дозировки координационного соединения платины может составлять в основе от примерно 1 до примерно 500 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела на курс лечения. Вливания координационного соединения платины можно проводить от одного до двух раз в неделю, и недельные лечения могут повторяться несколько раз. При использовании соединения класса аналогов камптотецина в парентеральном введении, в курсе терапии обычно используют от примерно 0,1 до примерно 300 мг/м²площади поверхности тела в день в течение примерно пяти последовательных дней. Наиболее предпочтительно курс терапии, используемый для топотекана, составляет от примерно 1,0 до примерно 2,0 мг/м² площади поверхности тела в день в течение пяти последовательных дней. Предпочтительно, курс терапии повторяют по крайней мере один раз с интервалом от примерно 7 дней до примерно 28 дней.

Фармацевтические композиции могут быть составлены так, чтобы содержать соединение формулы (I) и противоопухолевый агент в одном и том же контейнере, но предпочтительной является рецептура с различными контейнерами. Когда оба агента представлены в виде раствора, они могут содержаться в системе для вливания/инъекции для одновременного введения или в сдвоенной упаковке.

Для удобного введения соединения формулы (I) и противоопухолевого агента в одно и то же или в различное время готовят набор, включающий один контейнер, такой как коробка, картонная коробка или другой контейнер, индивидуальные бутылки, пакеты, ампулы или другие контейнеры, каждый из которых содержит эффективное количество соединения формулы (I) для парентерального введения, как описано выше, и эффективное количество противоопухолевого агента для парентерального введения, как описано выше. Такой набор может включать, например, оба фармацевтических агента в отдельных контейнерах или в одном и том же контейнере, необязательно в виде лиофилизованных вкладышей, и емкостей с растворами для восстановления влагосодержания. Вариация данного набора включает раствор для восстановления влагосодержания и лиофилизованный вкладыш в двух отсеках одного контейнера, что принуждает к смешиванию перед употреблением. При такой компоновке противоопухолевый агент и соединение данного изобретения могут быть запакованы отдельно, как, например, в двух контейнерах, или лиофилизованы совместно в виде порошка и обеспечены в одном контейнере.

Когда оба агента обеспечиваются в виде раствора, они могут содержаться в системе для вливания/инъекции для одновременного введения или в сдвоенной упаковке. Например, соединение формулы (I) может быть в виде инъекционной формы для внутривенного введения (ί.ν.) или емкость для вливания может быть связана в серию через трубки с противоопухолевым агентом, содержащимся во второй емкости для вливания. С использованием такой системы пациент может получать первоначально инъекцию болюсного типа соединения формулы (I) с последующим вливанием противоопухолевого агента.

Соединение может быть испытано в одном или нескольких биологических анализах для определения концентрации соединения, которая необходима для достижения данного фармакологического действия.

Ингибирование связывания витронектина

Твердофазное [³Н]-8К&Б-107260 связывание с α_νβ₃: α_νβ₃ плаценты человека или тромбоцита человека (0,1-0,3 мг/мл) в буфере Т (со держащем 2 мМ СаС1₂ и 1% октилглюкозида) разбавляли буфером Т, содержащим 1 мМ СаС1₂, 1 мМ МпС1₂ (буфер А) и 0,05% ΝαΝ₃, а затем сразу же добавляли в 96-луночные планшеты ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ) (Согшпд, Νο\ν Уогк, ΝΥ) из расчета 0,1 мл на лунку. Добавляли 0,1-0,2 мкг α_νβ₃ на лунку. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. Во время эксперимента лунки промывали один раз буфером А и инкубировали с 0,1 мл 3,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в том же буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубирования лунки отсасывали полностью и промывали дважды 0,2 мл буфера А.

Соединение растворяли в 100% ДМСО, получая 2 мМ исходный раствор, который разводили буфером связывания (15 мМ ТП5-НС1 (рН 7,4), 100 мМ ЫаС1, 1 мМ СаС1₂, 1 мМ МпС1₂, 1 мМ МдС1₂) до конечной концентрации 100 мкМ. Данный раствор затем разводили до требуемой конечной концентрации соединения. Различные концентрации немеченых антагонистов (0,001-100 мкМ) добавляли в лунки в трехкратной последовательности с последующим добавлением 5,0 нМ [³Н]-8К&Б-107260 (65-86 Кюри/ммоль).

Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубирования лунки полностью отсасывали и промывали один раз 0,2 мл охлажденного на льду буфера А способом от лунки-к-лунке. Рецепторы солюбилизировали 0,1 мл 1% 8Ό8 и связанный [³Н]8К&Б-107260 определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного считывания с добавлением 3 мл Кеабу 8аГе в жидкостном сцинтилляционном счетчике Весктап Ь8 с 40%-ной эффективностью. Неспецифическое связывание [³Н]-8К&Б-107260 определяли в присутствии 2 мМ 8К&Б-107260, и оно логично составляло менее 1% общего ввода радиоактивного лиганда. Κ.'50 (концентрация антагониста, ингибирующая 50% связывания [³Н]-8К&Б-107260) определяли с помощью общепринятого способа аппроксимации нелинейной кривой по методу наименьших квадратов, который модифицировали по программе ΕυΝΏΟΝ-2. К1 (константа диссоциации антагониста) рассчитывали по уравнению: К^СзУЦ+Ь/Ка), где Ь и К_б представляли концентрацию и константу диссоциации [³Н]-8К&Б-107260 соответственно.

Соединение настоящего изобретения ингибирует связывание витронектина с 8К&Б107260 при К₁ примерно 1,7 наномолей.

Соединение данного изобретения также тестировали ш νίίτο и ш νίνο на резорбцию кости в анализах, стандартных в данной области для оценки ингибирования образования кости, таких как анализ образования углублений, описанный в ЕР 528587, который также может быть выполнен с использованием остеокластов человека вместо крысиных остеокластов, и овариэк15 томированной модели крысы, как описано ХУгопББ с1 а1., Се11§ аиБ Ма1спа15. 1991, 8ир. 1, 69-74.

Анализ мигрирования сосудистой клетки гладкой мышцы

Использовали клетки гладкой мышцы аорты крысы или человека. Клеточную миграцию контролировали в Тгап5\\'с11 камере клеточных культур с использованием поликарбонатной мембраны с порами 8 мкм (Сойаг). Нижний уровень поверхности фильтра был покрыт витронектином. Клетки суспендировали в среде ΌΜΕΜ (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), дополненной 0,2% бычьим сывороточным альбумином, в концентрации 2,5-5,0х10⁶ клеток/мл и предварительно обрабатывали тестируемым соединением в различных концентрациях в течение 20 мин при 20°С. Растворитель сам по себе использовали в качестве контроля. В верхний отсек камеры помещали 0,2 мл суспензии клеток. Нижний отсек содержал 0,6 мл ΌΜΕΜ, дополненной 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Инкубирование проводили при 37°С в атмосфере 95% воздух/5% СО₂ в течение 24 ч. После инкубирования немигрировавшие клетки на верхней поверхности фильтра удаляли осторожным соскабливанием. Затем фильтр фиксировали в метаноле и окрашивали 10% красителем С|еш5а. Миграцию измеряли либо а) подсчетом числа клеток, которые мигрировали к нижней поверхности фильтра или Ь) экстракцией окрашенных клеток 10%ной уксусной кислотой с последующим определением поглощения при 600 нМ.

Тиропаратироидэктомированная крысиная модель

Каждая экспериментальная группа состояла из 5-6 взрослых самцов крыс 8ргадие-ОаМеу (масса тела 250-400 г). Крыс тиропаратироидэктомировали (с помощью частного врача, Тасошс Еагшк) за 7 дней перед использованием. Все крысы получали замещающую дозу тироксина каждые 3 дня. При получении крыс измеряли циркуляционные уровни ионизированного кальция в цельной крови непосредственно после ее отбора пункцией хвостовой вены в гепаринизованные пробирки. Крыс включали в эксперимент, если уровень ионизированного Са (измеренный кальциевым рН анализатором модели С1Ьа-Согшид 634) составляет <1,2 мМ/л. Каждую крысу снабжали венозным и артериальным петлей-катетером для доставки исследуемого вещества и отбора проб крови, соответственно. Затем крыс сажали на диету из еды, не содержащей кальция, и деионизированной воды. Измеряли базовые линии уровня Са и каждой крысе вводили либо контроль-носитель, либо 1-34 пептид паратироидного (паращитовидного) гормона человека (ИРТН1-34, доза 1,25 мкг/кг/ч в смеси физиологический раствор/0,1% бычий сывороточный альбумин, Васйеш, Са), либо смесь ЙРТН1-34 и тестируемого вещества с по мощью непрерывного внутривенного вливания через венозный катетер с использованием внешнего шприцевого насоса. Кальцемическую ответную реакцию каждой крысы измеряли с двухчасовыми интервалами на протяжении периода вливания в течение 6-8 ч.

Анализы резорбции и адгезии остеокласта человека

Анализы углублений резорбции и адгезии были выполнены и стандартизованы с использованием нормальных остеокластов человека, полученных из ткани остеокластомы. Анализ 1 разрабатывали для измерения объемов остеокластных углублений с помощью лазерной конфокальной микроскопии. Анализ 2, в котором коллагеновые фрагменты (высвобождающие в процессе резорбции) измеряют конкурентным ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ), разрабатывали в качестве более высокого пропускного фильтра.

Анализ 1 (с использованием лазерной конфокальной микроскопии)

Аликвоты суспензий клеток, полученных из остеокластомы человека, удаляют из места хранения в жидком азоте, быстро нагревают при 37°С и промывают в среде ΡΡΜΙ-1640 с помощью центрифугирования (1000 об/мин, 5 мин при 4°С).

Среду отсасывают и заменяют на мышиное анти-НЬА-ΌΚ. антитело, затем разбавляют 1:3 в ΚΡΜΙ-1640 среде. Суспензию инкубируют в течение 30 мин на льду и часто перемешивают.

Клетки промывают х2 холодным ΚΡΜΙ1640 с последующим центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин при 4°С), а затем клетки переносят в стерильную 15 мл центрифужную пробирку. Подсчитывают число моноядерных клеток в усовершенствованной счетной камере ИеиЬаиег.

Достаточное количество магнитных шариков (5/моноядерную клетку), покрытых козьим антимышиным 1дС (Оупа1, 6геа1 Иеск, ΝΥ), удаляют из емкости хранения и помещают в 5 мл свежей среды (это вымывает токсичный азидный консервант). Среду удаляют с помощью иммобилизации шариков на магните и замены на свежую среду.

Шарики смешивают с клетками и суспензию инкубируют в течение 30 мин на льду. Суспензию часто перемешивают.

Покрытые шариками клетки иммобилизуют на магните и оставшиеся клетки (остеокластобогащенная фракция) декантируют в стерильную 50 мл центрифужную пробирку.

К покрытым шариками клеткам добавляют свежую среду для извлечения любых захваченных остеокластов. Этот процесс промывки повторяют х10. Покрытые шариками клетки отбрасывают.

Подсчитывают видимые остеокласты в счетной камере с использованием флуоресцеин17 диацетата для метки живых клеток. Для добавления образца в камеру используют одноразовую пластиковую пастеровскую пипетку с большим внутренним диаметром.

Остеокласты осаждают центрифугированием и плотность доводят до подходящего числа в ЕМЕМ среде (число остеокластов переменно от опухоли к опухоли), дополненной 10% околоплодной телячьей сывороткой и 1,7 г/л бикарбоната натрия.

мл аликвоты клеточной суспензии (на соединение обработки) декантируют в 15 мл центрифужную пробирку. Клетки осаждают центрифугированием.

В каждую пробирку добавляют 3 мл подходящего соединения обработки (разбавленного до 50 мкМ в среде ЕМЕМ). Также включают подходящие контрольные носители, положительный контроль (антивитронектиновое мышиное моноклональное антитело [87МЕМ1], разбавленное до 100 мкг/мл) и изотипный контроль (Ι^Ομ· разбавленное до 100 мкг/мл). Образцы инкубируют при 37°С в течение 30 мин.

0,5 мл аликвоты клеток высевают на стерильные срезы дентина в 48-луночном планшете и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Каждую обработку проводят в четырехкратной повторности.

Срезы промывают в шести заменяемых объемах теплого РВ8 (10 мл/лунку в 6луночном планшете) и затем помещают в свежую среду, содержащую соединение обработки или контрольные образцы. Образцы инкубируют при 37°С в течение 48 ч.

Методика тартрат-устойчивой кислой фосфатазы (ТКАР) (селективный краситель для клеток остеокластной линии)

Срезы кости, содержащие присоединенные остеокласты, промывают в забуференном фосфатом физиологическом растворе и фиксируют в 2% глутеральдегиде (в 0,2М какодилате натрия) в течение 5 мин.

Затем их снова промывают в воде и инкубируют в течение 4 мин в ТКАР буфере при 37°С (0,5 мг/мл нафтол А8-В! фосфат, растворенный в Ν,Ν-диметилформамиде и смешанный с 0,25М нитратным буфером (рН 4,5), содержащим 10 мМ тартрат натрия).

После промывки холодной водой срезы погружают в холодный ацетатный буфер (0,1М, рН 6,2), содержащий 1 мг/мл красителя стойкого темно-красного цвета и инкубируют при 4°С в течение 4 мин.

Избыток буфера отсасывают и срезы сушат на воздухе после промывки водой.

ТКАР-положительные остеокласты (кирпично-красный/пурпурный осадок) обсчитывают с помощью светопольной микроскопии и затем удаляют с поверхности дентина с помощью ультразвука.

Объемы углублений определяли с использованием конфокального микроскопа ΝίΚοη/ Ьакейес [БМ21ГС.

Анализ 2 (считывание данных с использованием ЕЫ8А)

Остеокласты человека обогащали и готовили для обследования соединения, как описано в первых 9 стадиях анализа 1. Для ясности, данные стадии повторены ниже.

Аликвоты суспензий клеток, полученных из остеокластомы человека, удаляют из места хранения в жидком азоте, быстро нагревают при 37°С и промывают х1 в среде КРΜI-1640 с помощью центрифугирования (1000 об/мин, 5 мин при 4°С).

Среду отсасывают и заменяют на мышиное анти-НЕА-ОК. антитело, затем разбавляют 1:3 в КРМЫ640 среде. Суспензию инкубируют в течение 30 мин на льду и часто перемешивают.

Клетки промывают х2 холодным КРМ11640 с последующим центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин при 4°С), а затем клетки переносят в стерильную 15 мл центрифужную пробирку. Подсчитывают число моноядерных клеток в усовершенствованной счетной камере №иЬаиег.

Достаточное количество магнитных шариков (5/моноядерную клетку), покрытых козьим антимышиным (Όνηαΐ. Сгеа1 №ск, ΝΥ), удаляют из емкости хранения и помещают в 5 мл свежей среды (это вымывает токсичный азидный консервант). Среду удаляют с помощью иммобилизации шариков на магните и замены на свежую среду.

Подсчитывают видимые остеокласты в счетной камере с использованием флуоресцеиндиацетата для метки живых клеток. Для добавления образца в камеру используют одноразовую пластиковую пастеровскую пипетку с большим внутренним диаметром.

В противоположность способу, описанному выше в анализе 1, соединение исследуют в четырех дозах для получения как описано ниже.

Препараты остеокластов предварительно инкубируют в течение 30 мин при 37°С с обследуемым соединением (4 дозы) или контролем.

Затем их высевают на срезы бычьей кортикальной кости в лунках 48-луночного планшета для тканевых культур и инкубируют еще в течение 2 ч при 37°С.

Срезы кости промывают шесть раз теплым забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8) для удаления неприлипших клеток, а затем возвращают в лунки 48-луночного планшета, содержащие свежее соединение или контроль.

Планшет для тканевых культур затем инкубируют в течение 48 ч при 37°С.

Супернатанты из каждой лунки отсасывают в индивидуальные пробирки и обследуют конкурентным ЕЬРЗЛ, обнаруживающим стелопептид коллагена типа I, который высвобождается во время процесса резорбции. Этот ЕЫ8Л является коммерчески доступным (Ок1сошс1сг. Дания) и содержит кроличье антитело, которое специфически взаимодействует с последовательностью 8-аминокислот (ОШ-ЬукА1а-Н1к-Акр-С1у-С1у-Агд), которая присутствует в карбокси-терминальном телопептиде а1-цепи коллагена типа I. Результаты выражают в % ингибирования резорбции в сравнении с контролем-носителем.

Анализ адгезии остеокласта человека

Аликвоты суспензий клеток, полученных из остеокластомы человека, удаляют из места хранения в жидком азоте, быстро нагревают при 37°С и промывают х1 в среде КРМ1-1640 с помощью центрифугирования (1000 об/мин, 5 мин при 4°С) .

Среду отсасывают и заменяют на мышиное анти-ША-ЭК. антитело, затем разбавляют 1:3 в КРМ1-1640 среде. Суспензию инкубируют в течение 30 мин на льду и часто перемешивают.

Клетки промывают х2 холодным КРМ11640 с последующим центрифугированием (1000 об./мин, 5 мин при 4°С), а затем клетки переносят в стерильную 15 мл центрифужную пробирку. Подсчитывают число моноядерных клеток в усовершенствованной счетной камере №иЬаиет.

Достаточное количество магнитных шариков (5/моноядерную клетку), покрытых козьим антимышиным 1дС (Эупа1, Стеа! №ск, ΝΥ), удаляют из емкости хранения и помещают в 5 мл свежей среды (это вымывает токсичный азидный консервант). Среду удаляют с помощью иммобилизации шариков на магните и замены на свежую среду.

Полученные из остеокластомы остеокласты предварительно инкубируют с соединением (4 дозы) или контролем при 37°с в течение 30 мин.

Затем клетки высевают на покрытые остеопонтином предметные стекла (человеческий или крысиный остеопонтин, 2 мкг/мл) и инкубируют в течение 2 ч при 37°С.

Не прилипшие клетки удаляют интенсивной промывкой предметных стекол в забуференном фосфатом физиологическом растворе и оставшиеся на предметных стеклах клетки фиксируют в ацетоне.

Остеокласты окрашивают для тартратустойчивой кислой фосфатазы (ТКАР), селективного маркера для клеток данного фенотипа (см. стадии 15-17) и обсчитывают под световым микроскопом. Результаты выражают в % ингибирования адгезии по сравнению с контролемносителем.

Анализ адгезии клеток

Клетки и клеточные культуры

Эмбрионные клетки почки человека (НЕК283 клетки) получены от АТСС (Американская коллекция типовых культур (Каталожный № СКЬ 1573)), клетки выращивали в минимальной незаменимой среде Еаг1 (ЕМЕМ), содержащей соли Еаг1, 10% бычьей околоплодной сыворотки, 1% глутамина и 1% пенициллинастрептомицина.

Конструкты и трансфектанты

3,2 кЬ ЕсоК1-Крп1 фрагмент α_ν субъединицы и 2,4 кЬ ХЬа1-Хйо1 фрагмент β₃ субъединицы вставляли в ЕСоК1-ЕсоКУ сайты клонирования ρί'ΌΝ вектора (А1уаг е! а1., 1994), который содержит СМУ промотор и С418 селективный маркер, с помощью лигирования по «тупым» концам полинуклеотидной цепи. Для стабильной экспрессии 80х10⁶ НЕК293 клеток электротрансформировали с помощью α_ν+β₃ конструк21 тов (20 мкг ДНК каждой субъединицы) с использованием гена Ри1кег (Непк1еу с1 а1., 1994) и помещали в 100 мм планшеты (5х10⁵ клеток/планшет). Через 48 ч питательную среду снабжали 450 мкг/мл СепеНст (6418 сульфат, 61ВС0-ВЯЬ, ВеШекба, ΜΌ). Клетки выдерживали в селекционной среде до того момента, пока колонии не становились достаточно большими для анализирования.

Иммуноцитохимический анализ трансфектированных клеток

Для определения того, экспрессируют ли НЕК293 трансфектанты витронектиновый рецептор, клетки иммобилизовали на стеклянных предметных стеклах для микроскопа с помощью центрифугирования, фиксировали в ацетоне в течение 2 мин при комнатной температуре и сушили на воздухе. Специфическая реакционная способность с 23 С6, моноклональным антителом, специфическим для α_νβ₃ комплекса, была продемонстрирована с использованием стандартного косвенного иммунофлуоресцентного метода.

96-луночные планшеты ЕЫ8А Согшпд предварительно покрывали в течение ночи при 4°С 0,1 мл витронектина человека (0,2 мкг/мл в среде ΚΡΜΙ). Во время эксперимента планшеты однократно промывали средой ΚΡΜΙ и блокировали 3,5% БСА в среде ΚΡΜΙ в течение 1 ч при комнатной температуре. Трансфектированные 293 клетки повторно суспендировали в среде ΚΡΜΙ, дополненной 20 мМ Нерек, рН 7,4 и 0,1% БСА при плотности 0,5х10⁶ клеток/мл. В каждую лунку добавляли 0,1 мл клеточной суспензии и инкубировали в течение 1 ч при 37°С в присутствии или в отсутствие различных α_νβ₃антагонистов. После инкубации добавляли 0,025 мл 10%-ного раствора формальдегида, рН 7,4 и клетки фиксировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Планшеты промывали 3 раза 0,2 мл среды ΚΡΜΙ и прилипшие клетки окрашивали 0,1 мл 0,5% толуидина синего в течение 20 мин при комнатной температуре. Избыток красителя удаляли интенсивной промывкой деионизированной водой. Толуидин синий, включенный в клетки, элюировали добавлением 0,1 мл 50% этанола, содержащего 50 мМ НС1. Клеточную адгезию оценивали количественно при оптической плотности 600 нм с помощью реадера для микротитровочных планшетов (Тйейек Μιι11ί^ηη ΜΟ, 81ег1тд, УА).

Твердофазный анализ α_νβ₅ связывания

Витронектиновый рецептор α_νβ₅ очищали из плаценты человека. Препарат рецептора разводили в 50 мм ТИ8-НС1, рН 7,5, 100 мМ ИаС1, 1 мМ СаС1₂, 1 мМ ΜπΟ1₂, 1 мМ Μ§Ο₂ (буфер А) и сразу же добавляли в 96-луночные планшеты ЕЫ8А из расчета 0,1 мл на лунку. В каждую лунку добавляли 0,1-0,2 мкг α_νβ₃. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. Во время эксперимента лунки промывали один раз буфе ром А и инкубировали с 0,1 мл 3,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в том же буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубирования лунки полностью отсасывали и промывали дважды 0,2 мл буфера А.

В конкурентном [³Н]-8К&Б-107260 анализе различные концентрации немеченых антагонистов (0,001-100 мкМ) добавляли в лунки с последующим добавлением 5,0 нМ [³Н]-8К&Б107260. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубирования лунки полностью отсасывали и промывали однократно 0,2 мл охлажденного на льду буфера А способом от лунки-к лунке. Рецепторы солюбилизировали с 0,1 мл 1% 8Ό8 и связанный [³Н]-8К&Б-107260 определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного считывания с добавлением 3 мл Кеабу 8аГе в жидкостном сцинтилляционном счетчике Весктап Ь8 6800 с 40%-ной эффективностью. Неспецифическое связывание [³Н]-8К&Б-107260 определяли в присутствии 2 мМ 8К&Б-107260, и оно логично составляло менее 1% общего ввода радиоактивного лиганда. Ι6'50 (концентрация антагониста, ингибирующая 50% связывания [³Н]-8К&Б107260) определяли с помощью общепринятого способа аппроксимации нелинейной кривой по методу наименьших квадратов, который модифицировали по программе ΕυΝΏΟΝ-2. К1 (константы диссоциации антагониста) рассчитывали по уравнению Сйепд и РгикоГГ:

К^СзУЦ+Ь/Ка), где Ь и К_а представляли концентрацию и константу диссоциации [³Н]8К&Б-107260 соответственно.

Ингибирование РСИ-опосредованного

СРПЬ-Ша связывания Очистка 6РПЬ-Ша

Десять единиц отделенных промытых тромбоцитов человека (получены от Кеб Сгокк) лизировали осторожным встряхиванием в 3% октилглюкозиде, 20 мМ Тгк-НС1, рН 7,4, 140 мМ №С1, 2 мМ СаС1₂ при 4°С в течение 2 ч. Лизат центрифугировали при 100000 д в течение 1 ч. Полученный супернатант вносили на 5 мл колонку 4В с лентил-лектин-сефарозой (Ε.Υ. ЬаЬк), предварительно уравновешенную 20 мМ ТП8-НС1, рН 7,4, 100 мМ №С1, 2 мМ СаС1₂, 1% октилглюкозида (буфер А). После 2 ч инкубирования колонку промывали 50 мл холодного буфера А. Удержанный лектином 6РПЬ-Ша элюировали буфером А, содержащим 10% декстрозы. Все процедуры осуществляли при 4°С. Полученный 6РПЬ-Ша имел чистоту >95%, что было показано с помощью δΌδ-полиакриламидного гелевого электрофореза.

Внедрение 6РПЬ-Ша в липосомы

Смесь фосфатидилсерина (70%) и фосфатидилхолина (30%) (ΛνηηΙί Ро1аг ЫрШк) высушивали на стенках стеклянной пробирки в токе азота. Очищенный 6РПЬ-Ша разбавляли до конечной концентрации 0,5 мг/мл и смешивали с фосфолипидами в соотношении бе23 лок:фосфолипид, составляющем 1:3 (мас:мас). Смесь повторно суспендировали и обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Затем смесь подвергали диализу в течение ночи с использованием диализной колонки с отсечением молекулярного веса 1200014000 против 1000-кратного избытка 50 мМ ТЙ8-НС1, рН 7,4, 100 мМ ЫаС1, 2 мМ СаС1₂ (с 2 заменами). Содержащие СР1ГЬ-111а липосомы центрифугировали при 12000 д в течение 15 мин и повторно суспендировали в буфере для диализа при конечной концентрации белка приблизительно 1 мг/мл. Липосомы хранили при -70°С до употребления.

Конкурентное связывание с СРГГЬ-Ша

Связывание с фибриногеновым рецептором (СРГГЬ-Ша) анализировали с помощью способа косвенного конкурентного связывания с использованием [³Н]-8К&Р-107260 в качестве лиганда РСЭ-типа. Анализ связывания проводили в 96-луночном фильтрационном планшетном устройстве (Мййроте Согрогайоп, ВейГогй, МА) с использованием 0,22 мкм гидрофильных дурапористых мембран. Лунки предварительно покрывали 0,2 мл 10 мкг/мл полилизина (81дта Сйеш1са1 Со., 81. ЬоиЦ, МО) при комнатной температуре в течение 1 ч для блокирования не специфического связывания. В лунки в четырех повторностях добавляли различные концентрации немеченых бензазепинов. [³Н]-8К&Р107260 наносили на каждую лунку в конечной концентрации 4,5 нМ с последующим добавлением 1 мкг липосомов, содержащих очищенный тромбоцитный СРГГЬ-ГГГа. Смеси инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. СРГГЬ-Ша-связанный [³Н]-8К&Р-107260 отделяли от несвязанного фильтрованием с использованием фильтрационного распределителя Мййроге с последующей промывкой охлажденным на льду буфером (2 раза, каждый 0,2 мл). Связанную радиоактивность, оставшуюся на фильтрах, считывали в 1,5 мл Реайу 8о1уе (Весктап йМгитепК Рийейоп, СА) в жидкостном сцинтилляционном счетчике Весктап (модель Б86800) с 40% эффективностью. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 2 мкМ немеченого 8К&Р-107260, и оно составляло логично менее 0,14% общей радиоактивности, добавленной к образцам. Все полученные точки данных представляют собой среднее от четырехкратных определений.

Данные конкурентного связывания анализировали с помощью аппроксимации кривой нелинейным методом наименьших квадратов. Данный способ дает ГС50 антагонистов (концентрация антагониста, которая ингибирует при равновесии специфическое связывание [³Н]8К&Р-107260 на 50%).

ГС₅₀ находятся во взаимосвязи с равновесными константами диссоциации (К₁) антагониста на основе уравнения Сйепд и РгикоГГ:

К₁=ГС₅₀/(1+Ь/К_й), где Ь представляет концентрацию [³Н]-8К&Р-107260, использованную в анализе конкурентного связывания (4,5 нМ), а К,1 представляет константу диссоциации [³Н]8К&Р-107260, которая составляет 4,5 нМ при определении с помощью анализа 8са1сйатй.

Эффективность соединения формулы (Г) самого по себе или в сочетании с противоопухолевым агентом может быть определена с использованием нескольких моделей трансплантируемых мышиных опухолей. Подробное описание данных моделей см. в патентах США №№ 5004758 и 5633016.

Следующие далее примеры не предназначены для ограничения каким-либо образом объема данного изобретения, а приведены для иллюстрации того, каким образом получают и используют соединение данного изобретения. Многие другие варианты осуществления изобретения легко будут очевидны специалистам в данной области.

Примеры

Общая часть.

Спектры протонного ядерного магнитного резонанса ('Н ЯМР) регистрировали при 300 МГц, и химические сдвиги представлены в миллионных долях (δ) в слабом поле относительно тетраметилсилана (ТМС), используемого в качестве внутреннего стандарта. Сокращения для данных ЯМР следующие: с=синглет, д=дублет, т=триплет, кв=квартет, м=мультиплет, дд=дублет дублетов, дт=дублет триплетов, вид=видимый, ушир=уширенный. 1 указывает ЯМР константы спин-спинового взаимодействия, измеренные в Герцах. СЭС1₃ представляет дейтерохлороформ, ДМСО-йб представляет гексадейтеродиметилсульфоксид, ΟΟ₃ΟΌ представляет тетрадейтерометанол. Масс-спектры были получены с использованием ионизационных способов электрораспыления (Е8). Элементные анализы проводили Риапй1айуе 1есйпо1од1е8 Гпс., ЭДййейоике, N1. Температуры плавления получали на устройстве для определения температур плавления ТйотазНооует и не корректировали. Все температуры представлены в градусах Цельсия. Для тонкослойной хроматографии использовали тонкослойные пластины АпаИесй 8Шса Се1 СР и Е. Мегск 8Шса Се1 60 Р-254. Флэш-хроматографию проводили на силикагеле Е. Мегск Кте8е1де1 60 (230-400 меш). Аналитическую и препаративную ВЭЖХ проводили на хроматографах Весктап. ΟΌ8 относится к октадецилсилильному производному силикагелевого хроматографического носителя. УМС ОЭ8-АО® представляет ΟΌ8 хроматографический носитель и является зарегистрированной торговой маркой УМС Со. Ый., Куо1о, Япония. РРР-1® представляет полимерный (стиролдивинилбензольный) хроматографический носитель и является зарегистрированной торговой маркой Натй1оп Со., Рено, №уайа. Сей1е® представляет фильтрующую вспомогательную добавку на основе промытого кислотой диатомового диоксида крем25 ния и является зарегистрированной торговой маркой МапуШе Согр., Эептег. Со1огаЛо.

Получение 1.

Получение 2-(5,6,7,8-тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1-этанола.

a) 2-Метил-8-(трет-бутоксикарбонил)-5,6,

7.8- тетрагидро-1,8-нафтиридин.

Смесь 2-метил-1,8-нафтиридина (1. СЬет. 8ос. (С) 1966, 315; 5,13 г, 35,58 ммоль), 10% РЛ/С (1,14 г, 1,07 ммоль) и абсолютный Е!ОН (70 мл) дезоксигенировали с использованием трех циклов вакуумирование/заполнение Н2, затем интенсивно перемешивали при подсоединенном баллоне с Н2. Через 18,5 ч смесь фильтровали через целит® и слой на фильтре последовательно промывали абсолютными Е!ОН и Е!ОАс. Фильтрат концентрировали досуха, остаток повторно концентрировали из Е!ОАс, получая не совсем белое твердое вещество (5,25 г).

Раствор вышеуказанного вещества (5,25 г), ди-трет-бутилдикарбоната (15,53 г, 71,16 ммоль) и СН2С12 (10 мл) концентрировали на роторном испарителе для удаления растворителя и маслянистый остаток нагревали в атмосфере Ν₂ на масляной бане, установленной на 55-60°С. Через 45 ч реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и остаток подвергали флэш-хроматографии на силикагеле (40% ЕЮАс/гексаны). Указанное в заголовке соединение (4,90 г, 55%) получали в виде светло-желтого твердого вещества:

Ή ЯМР (300 МГц, СЭС1_;) δ 7,27 (д, 1=7,6 Гц, 1Н), 6,81 (д, 1=7,6 Гц, 1Н), 3,69-3,79 (м, 2Н), 2,65-2,75 (м, 2Н), 2,48 (с, 3Н), 1,83-1,98 (м, 2Н), 1,52 (с, 9Н). Масс-спектр (Е8) т/е 249 (М+Н)⁺.

b) Этил [8-(трет-бутоксикарбонил)-5,6,7,8тетрагидро -1,8 -нафтиридин-2-ил] ацетат.

К раствору диизопропиламина (7,24 мл, 55,3 ммоль) в сухом ТГФ (50 мл) добавляли по каплям при 0°С н-ВиЬ1 (2,5М в гексанах, 22 мл, 55,3 ммоль). Через 15 мин данный раствор добавляли по каплям к раствору 2-метил-8-(третбутоксикарбонил)-5,6,7,8-тетрагидро-1,8-нафтиридина (4,9 г, 19,7 ммоль) и диэтилкарбоната (8,86 мл, 73,0 ммоль) в сухом ТГФ (50 мл) при -78°С. Через 30 мин смесь гасили насыщенным раствором N4-0’1 (100 мл), нагревали до комнатной температуры и экстрагировали Е!ОАс (3х200 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (40% Е!ОАс/гексаны), получая указанное в заголовке соединение в виде светло-желтого масла: массспектр (Е8) т/е 321 (М+Н)⁺.

c) 2-(5,6,7,8-Тетрагидро-1,8-нафтиридин-2ил)-1-этанол.

К раствору этил [8-(трет-бутоксикарбонил)-

5.6.7.8- тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил]ацетата (5,72 г, 17,85 ммоль) в сухом ТГФ (80 мл) при комнатной температуре добавляли Ь1ВН₄ (2,0 М в ТГФ, 10,7 мл, 21,42 ммоль) и полученную смесь нагревали до температуры дефлегмации. Через 18 ч смесь охлаждали до 0°С и осторожно гасили Н₂О (100 мл). Через 10 мин смесь экстрагировали Е!ОАс (3х100 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении.

Вышеуказанный остаток (4,9 г) растворяли в СН2С12 (10 мл). К раствору при комнатной температуре за один прием добавляли 4 н. НС1 в диоксане (20 мл). После этого смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток помещали в смесь 1:1 1н. №ЮН и насыщенного №-1С1 (100 мл) и экстрагировали СН₂С1₂ (3х100 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (10% МеОН в 1:1 Е!ОАс/СНС13), получая указанное в заголовке соединение (2,09 г, 66%) в виде желтого твердого вещества: масс-спектр (Е8) т/е 179 (М+Н)⁺.

Получение 2.

Получение этил (±)-10,11-дигидро-3гидрокси-5Н-дибензо[а,Л]циклогептен-10-ацетата.

a) 6-Метокси-1-фенилинден.

3,0 М раствор фенилмагнийбромида в Е!₂О (680 мл, 2,04 моль) в атмосфере аргона при температуре окружающей среды разбавляли при перемешивании Е!₂О (700 мл) и добавляли по каплям в течение 1 ч раствор 6-метокси-1инданона (277 г, 1,71 моль) в ТГФ (1400 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при температуре окружающей среды и затем выливали при перемешивании в насыщенный N40’1 (2,8 л). Добавляли Н₂О (1,4 л) и отделяли органическую фазу. Водную фазу экстрагировали Е!2О (2х1 л) и объединенные органические экстракты концентрировали, получая сырой (неочищенный) 6-метокси-1-фенил-1-инданол (445 г) в виде коричневого масла. Данное масло растворяли в толуоле (2,5 л) и добавляли моногидрат п-толуолсульфоновой кислоты (12,3 г, 0,065 моль). Раствор перемешивали и нагревали при кипении с обратным холодильником в течение 16 ч и использованием ловушки ДинаСтарка с холодильником. Сбор Н2О был минимальным через 2 ч, и всего было собрано 28 мл. Раствор охлаждали и экстрагировали последовательно 5% водным №-ьС’О₃ (1 л) и Н₂О (2х1 л). Органический слой концентрировали, получая темно-коричневое масло (400 г). Данное масло перегоняли в вакууме, получая указанное в заголовке соединение (298,2 г, 79%) в виде желтого масла: т.кип. 152-190°С/2,0 торр; ТСХ (10% Е!ОАс/гексаны) К_£ 0,75.

b) 2-Бензоил-4-метоксифенилуксусная кислота.

Ацетон (4,2 л) охлаждали до 10°С и добавляли в течение 1,5 ч раствор 6-метокси-1фенилиндена (271 г, 1,22 моль) в ацетоне (1,8 л) параллельно с реактивом Джонса (1опек) (1,8 л, получен из СгО₃ (470 г, 4,70 моль), Н₂О (1 л) и конц. Н₂8О₄ (405 мл). К полученной смеси добавляли 4%-ный водный раствор ОзО₄ (153 мл) двумя порциями, одну в начале добавления, а вторую в середине процесса добавления, поддерживая температуру реакционной смеси ниже 15°С. После добавления реакционную смесь нагревали до 22°С и перемешивали в течение 1,5 ч, в течение данного времени наблюдалось слабое экзотермическое повышение температуры до 28°С, затем реакционную смесь охлаждали до температуры ниже 20°С и добавляли изопропанол (1 л), первоначально по каплям и быстро после уменьшения первоначального экзотермического подъема температуры. Во время данной фазы перемешивание становилось затруднительным. Во время добавления изопропанола температура достигала 32°С. Добавляли Н₂О (2 л) и смесь переносили в делительную воронку. Дополнительно добавляли Н₂О для растворения выпавшей в осадок хромовой кислоты и смесь экстрагировали СН2С12 (2 л). Органический (верхний) слой отделяли и водную фазу экстрагировали СН2С12 (2х1 л). Объединенные СН₂С1₂ экстракты промывали последовательно Н₂О (2 л) и насыщенным раствором соли (2 л), а затем концентрировали, получая влажное серое твердое вещество (416 г). Данное вещество растирали со смесью ацетона и Е!ОАс и фильтровали, получая указанное в заголовке соединение (225,4 г, 71%) в виде не совсем белого твердого вещества: т.пл. 158-159°С.

с) 2-Бензил-4-метоксифенилуксусная кислота.

2-Бензоил-4-метоксифенилуксусную кислоту (215,5 г, 0,8 моль) делили на две равные порции и каждую из них растворяли в ледяной АсОН (1,5 л) в 2,5 л толстостенной колбе. В каждую добавляли 5% Рб/С (10 г, 0,0048 моль) и каждую смесь встряхивали при температуре окружающей среды в атмосфере водорода в аппарате Парра. Через 2,5 ч смеси фильтровали для удаления катализатора и слой на фильтре промывали Е!ОАс. Объединенные фильтраты концентрировали, получая указанное в заголовке соединение (215 г, количественно) в виде тяжелого желтого масла, которое кристаллизовалось при хранении: 'Н ЯМР (250 МГц, СЭС1₃) δ 7,05-7,35 (м, 6Н), 6,77 (дд, 1=8,3, 2,7 Гц, 1Н), 6,71 (д, 1=2,7 Гц, 1Н), 4,00 (с, 2Н), 3,76 (с, 3Н), 3,54 (с, 2Н).

а) 10,11-Дигидро-3-метокси-5Н-дибензо[а, б]циклогептен-10-он.

Раствор 2-бензил-4-метоксифенилуксусной кислоты (215 г сырого вещества, которое содержало 204,6 г (0,80 моль чистого вещества)) в СН2С12 (1 л) перемешивали в атмосфере аргона при температуре окружающей среды и добавляли ДМФ (1 мл), затем оксалилхлорид (400 мл, 4,59 моль). Оксалилхлорид добавляли в течение 1 ч, первоначально по каплям для контролирования интенсивного выделения газа. Раствор перемешивали в течение 16 ч при температуре окружающей среды и затем концентрировали, получая сырой хлорангидрид (207,7 г, 0,756 моль, 95%) в виде желтой жидкости. Данную жидкость растворяли в СН₂С1₂ при общем объеме 500 мл и раствор и А1С1₃ (100,8 г, 0,756 моль) добавляли параллельно в течение 1 ч к СН2С12 при перемешивании в атмосфере аргона при температуре окружающей среды. По завершении добавления температура составляла 28°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при температуре окружающей среды, за это время происходило осаждение твердого вещества. Добавляли Н₂О, первоначально по каплям, в течение 30 мин. Затем смесь разделяли и органическую фазу промывали последовательно Н₂О (1 л) и 5%-ным водным раствором ЫаНСО₃(1 л). Затем СН2С12 раствор концентрировали, получая желтое твердое вещество (175,3 г). Перекристаллизация из смеси Е!ОАс/гексан давала указанное в заголовке соединение (128 г, 71%): т.пл. 107-109°С.

е) Этил (±)-10,11-дигидро-10-гидрокси-3метокси-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат.

1,0 М раствор бис(триметилсилил)амида лития в гексанах (1282 мл, 1,282 моль) добавляли к ТГФ (4,0 л) при -70°С в атмосфере аргона, затем добавляли по каплям в течение 20 мин Е!ОАс (146 мл, 1,49 моль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 15 мин, затем в течение 20 мин добавляли Ν,Ν,Ν',Ν'тетраметилэтилендиамин (378 мл, 2,5 моль). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, затем добавляли по каплям в течение 40 мин раствор 10,11-дигидро-3-метокси-5Ндибензо [а,б]циклогептен-10-она (119,2 г, 0,50 моль) в безводном ТГФ (1,26 л). В процессе всех указанных добавлений температуру поддерживали ниже -65°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин при -65 - -70°С, а затем выливали в насыщенный водный раствор ИН₄С1 (6,2 л) при интенсивном перемешивании. Органический слой отделяли и водную фазу экстрагировали Е!ОАс (2х1 л). Объединенные органические экстракты промывали Н2О (2х1 л), а затем концентрировали, получая светлокоричневое масло (175 г). При тонкослойной хроматографии (20% Е!ОАс/гексаны) наблюдался основной К_£ 0,5 (желаемый продукт) и минорный К_£ 0,7 (выделенный кетон). Сырой продукт хроматографировали на силикагеле (2 кг, 10% Е!ОАс/гексаны), получая указанное в заголовке соединение (101 г, 61%) в виде желтого масла. Ή ЯМР (250 МГц, С1)С1_;) δ 7,63 (д, 1=7,7 Гц, 1Н), 7,00-7,30 (м, 4Н), 6,80 (д, 1=2,6 Гц, 1Н), 6,69 (дд, 1=8,2, 2,6 Гц, 1Н), 3,95-4,35 (м, 2Н), 4,07 (с, 2Н), 3,76 (с, 3Н), 3,68 (с, 1Н), 3,64 (д, 1=14,2 Гц, 1Н), 3,35 (д, 1=14,2 Гц, 1Н), 2,79 (д, 1=16,0 Гц, 1Н), 2,66 (д, 1=16,0 Гц, 1Н), 1,22 (т, 1=7,2 Гц, 3Н).

1) Этил (±)-10,11-дигидро-3-метокси-5Ндибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат.

Этил (±)-10,11-дигидро-10-гидрокси-3метокси-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат (101 г, 0,31 моль) растворяли в ледяной уксусной кислоте (1,8 л) и добавляли 12 н. НС1 (28,5 мл, 0,34 моль). Смесь помещали в 2,5 л толстостенную колбу, содержащую 5% Рб/С (20 г, 0,0094 моль) и полученную смесь встряхивали при 35°С в атмосфере водорода на аппарате Парра для гидрирования, оборудованном нагревательной рубашкой. Через 18 ч реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды и катализатор удаляли фильтрованием. Фильтрат концентрировали, получая светложелтое масло (85,1 г). Его хроматографировали на силикагеле (2 кг, постадийно-градиентное элюирование смесью от 5% до 10% ЕЮАс/гексаны), получая указанное в заголовке соединение (69,1 г, 72%) в виде масла: ¹Н ЯМР (250 МГц, СЭС1₃) δ 7,05-7,22 (м, 4Н), 7,01 (д, 1=8,2 Гц, 1Н), 6,76 (д, 1=2,7 Гц, 1Н), 6,67 (дд, 1=8,2, 2,7 Гц, 1Н), 4,30 (д, 1=15,0 Гц, 1Н), 4,114,25 (м, 2Н), 3,85 (д, 1=15,0 Гц, 1Н), 3,70-3,90 (м, 1Н), 3,77 (с, 3Н), 3,31 (дд, 1=15,0, 4,1 Гц, 1Н), 2,93 (дд, 1=15,0, 9,2 Гц, 1Н), 2,64 (дд, 1=15,6, 5,0 Гц, 1Н), 2,52 (дд, 1=15,6, 9,3 Гц, 1Н), 1,27 (т, 1=7,1 Гц, 3Н).

д) Этил (±)-10,11-дигидро-3-гидрокси-5Ндибензо [а,б] циклогептен-10-ацетат.

Раствор этил (±)-10,11-дигидро-3-метокси5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетата (8,5 г, 0,027 моль) в СН₂С1₂ (150 мл) охлаждали до -10°С при перемешивании в атмосфере аргона. Добавляли этантиол (10,7 мл, 0,144 моль), затем А1С1₃ (20,6 г, 0,154 моль) двумя порциями за 15 мин. После добавления наблюдался экзотермический подъем температуры до 0°С, а затем температуру повышали до 25°С, используя водяную баню. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°С в течение 2,25 ч, после чего выливали в смесь лед-Н₂О. Органический слой отделяли, добавляли метанол (100 мл) и смесь экстрагировали СН₂С1₂ (2х50 мл). Объединенные СН₂С1₂ экстракты промывали Н₂О (250 мл), а затем концентрировали, получая вязкое масло (8,6 г). Это масло помещали в Е1₂О (150 мл) и эфир отгоняли кипячением, заменяя его гексаном. Целевой фенол первоначально отделяли в виде масла, которое кристаллизовалось при перемешивании при температуре окружающей среды. Собирали две порции твердого вещества, получая указанное в заголовке соединение (7,1 г, 89%); т.пл. 110-112°С.

Получение 3.

ВЭЖХ разделение энантиомеров этил (±)10,11-дигидро-3-гидрокси-5Н-дибензо[а,а]циклогептен-10-ацетата.

а) Этил (К)-(+)-10,11-дигидро-3-гидрокси5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат и этил (8)-(-)-10,11 -дигидро-3 -гидрокси-5Н-дибензо [а, б]циклогептен-10-ацетат.

Этил (±)-10,11-дигидро-3-гидрокси-5Ндибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат разделяли на энантиомеры, используя следующие условия: колонка Эа1сс1 СЫта1се1 01® (21,2х250 мм), подвижная фаза 20%-ный этанол в гексане, скорость потока 15 мл/мин, УФ обнаружение при 254 нм, впрыскивание 140 мг; Ц (время удерживания) для этил (8)-(-)-10,11-дигидро-3гидрокси-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетата=10,4 мин; Ц для этил (К.)-(+)-10,11-дигидро3-гидрокси-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетата=13,1 мин.

Получение 4.

Получение 10,11-дигидро-3-метокси-5Ндибензо[а,б]циклогептен-10-она.

a) 2-Бензил-4-метоксифенилуксусная кислота.

Раствор 2-бензоил-4-метоксифенилуксусной кислоты (13,0 г, 0,048 моль), полученной способом, описанным в 1. Меб. Сйеш., 1981, 24, 998, в ледяной уксусной кислоте (600 мл) обрабатывали в атмосфере аргона 4,3 г 10% Рб/С и гидрировали при 50 фунтах/кв.дюйм (344,74 КПа) в течение 17 ч. Смесь фильтровали с использованием се1йе® и фильтрат концентрировали и повторно концентрировали с толуолом и метиленхлоридом, получая 14,2 г указанного в заголовке соединения: ¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 3,52 (с, 2Н), 3,75 (с, 3Н), 4,0 (с, 3Н), 6,7 (м, 2Н), 7,15 (м, 6Н).

b) 10,11-Дигидро-3-метокси-5Н-дибензо[а, б]циклогептен-10-он.

Раствор 2-бензил-4-метоксифенилуксусной кислоты (14,2 г, 0,055 моль) в бензоле (120 мл) и тионилхлорид (28 мл) нагревали при кипении с обратным холодильником в течение 1 ч и концентрировали. Хлорангидрид растворяли в сухом метиленхлориде (40 мл) и раствор добавляли по каплям в атмосфере аргона к раствору А1С1₃ (14,7 г, 0,11 моль) в метиленхлориде (600 мл). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 2,5 ч при комнатной температуре, затем гасили смесью лед-вода (200 мл). Слои отделяли и органическую фазу промывали последовательно 10%-ным раствором ΝαΟΗ, водой и разбавленной НС1. Полученный раствор разбавляли простым эфиром (200 мл), сушили над Мд8О₄ и концентрировали. Твердый остаток растирали со смесью простой эфир/гексан (1:1) и собирали фильтрованием 9,25 г указанного в заголовке соединения: т.пл. 105-106°С; Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 3,72 (с, 3Н), 4,1 (с, 2Н), 4,2 (с, 2Н), 6,7 (д, 1Н), 6,82 (с, 1Н), 7,30 (м, 4Н), 8,1 (д, 1Н).

Получение 5.

Получение этил (±)-10,11-дигидро-3-метокси-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетата.

а) Этил (±)-3-(3-метоксифенил) инденацетат.

К холодному раствору 3-(3-метоксифенил)индена (4 г, 18 ммоль), полученного по способу, описанному в 1. Меб. СЬет., 1981, 24, 998, в ТГФ (15 мл) при 0°С добавляли по каплям раствор ΜΝ(ΤΜ8)₂ (20 мл, 1М в ТГФ) в течение 5 мин. Полученный раствор добавляли по каплям к раствору этилбромацетата (3,34 г, 20 ммоль) в ТГФ (15 мл) при -78°С в течение 30 мин. Через 2,5 ч смесь гасили насыщенным раствором хлорида аммония и слои разделяли. Органический слой сушили над Мд8О₄ и концентрировали, получая сырой продукт, который очищали колоночной хроматографией (81О₂/24% ЕЮАс/гексан), получая указанное в заголовке соединение (1,1 г): Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 1,30 (т, 3Н), 2,50 (м, 1Н), 2,85 (м, 1Н), 3,85 (с, 3Н), 4,0 (м, 1Н), 4,20 (кв, 2Н), 6,6 (с, 1Н), 6,9 (м, 1Н), 7,2 (с, 1Н), 7,35 (м, 6Н).

b) Этил (±)-3-[(3-метоксибензоил)]фенилсукцинат.

Раствор этил (±)-3-(3-метоксифенил) инденацетата (1,1 г, 3,6 ммоль) в ацетоне (30 мл) обрабатывали 4%-м водным раствором тетраоксида осмия (0,5 мл) с последующим добавлением по каплям 1,2М реактива Джонса (5 мл, 6 ммоль) в соответствии с литературным способом (1. Огд. СЬет., 1993, 58, 4745). После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре темную реакционную смесь гасили изопропанолом (2,5 мл), затем бисульфитом натрия (0,9 г) и водой (30 мл). Продукт экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли, сушили над Мд8О₄ и концентрировали, получая твердый остаток. Растирание со смесью 1:1 простой эфир/гексан давало 0,76 г указанного в заголовке соединения: ¹Η ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 1,18 (т, 3Н), 2,90 (м, 1Н), 3,3 (м, 1Н), 3,92 (с, 3Н), 4,1 (кв, 2Н), 4,4 (м, 1Н), 4,4 (д, 1Н), 7,25 (м, 2Н), 7,5 (м, 6Н).

c) Этил (±)-3-[(3-метоксибензил)]фенилсукцинат.

Смесь этил (±)-3-[(3-метоксибензоил)] фенилсукцината (0,76 г, 2,1 ммоль) и 10% Рб/С (0,6 г) в ледяной уксусной кислоте (35 мл) гидрировали при давлении 50 фунт/кв.дюйм (344,74 КПа) в течение 17 ч. Смесь фильтровали через сеШе® и слой на фильтре промывали уксусной кислотой. Фильтрат концентрировали и повторно концентрировали с толуолом и метиленхлоридом, получая 0,65 г указанного в заголовке соединения: ¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 1,20 (т, 3Н), 2,20 (м, 1Н), 3,0 (м, 1Н), 3,74 (с, 3Н), 4,1 (кв, 2Н), 4,18 (кв, 2Н), 4,4 (д, 1Н), 6,2 (м, 2Н),

7,22 (м, 6Н).

б) Этил (±)-10,11-дигидро-3-метокси-11оксо-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат.

К перемешиваемому на магнитной мешалке раствору этил (±)-3-[(3-метоксибензил)]фенилсукцината (0,65 г, 1,9 ммоль) в сухом метиленхлориде (10 мл) добавляли ДМФ (0,2 мл) и оксалилхлорид (0,2 мл, 2,28 ммоль). Через 1,5 ч раствор добавляли по каплям к суспензии хлорида алюминия (0,6 г, 4,5 ммоль) в сухом мети ленхлориде (15 мл). Смесь гасили через 2 ч ледяной водой, слои разделяли и водный слой экстрагировали метиленхлоридом. Объединенные органические слои сушили над Мд8О₄ и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (8Ю₃/2-4% ЕЮАс/гексан), получая указанное в заголовке соединение (0,3 г): Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 1,28 (т, 3Н), 2,88 (м, 1Н), 3,55 (м, 1Н), 3,84 (с, 3Н), 3,88 (д, 1Н), 4,18 (кв, 2Н), 4,85 (д, 1Н), 4,95 (м, 1Н), 5,8 (м, 2Н),

7,22 (м, 4Н), 8,1 (с, 1Н).

е) Этил (±)-10,11-дигидро-3-метокси-5Ндибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат.

Смесь этил (±)-10,11-дигидро-3-метокси11-оксо-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетата (0,3 г, 0,93 ммоль) и 10% Рб/С (0,3 г) в ледяной уксусной кислоте (25 мл) гидрировали при давлении 50 фунт/кв. дюйм (344,74 КПа) в течение 18 ч. Смесь фильтровали через се1йе® и слой на фильтре промывали уксусной кислотой. Фильтрат концентрировали и повторно концентрировали с толуолом и метиленхлоридом, получая 0,25 г указанного в заголовке соединения: ¹Η ЯМР (400 МГц, СЭС1₃) δ 1,28 (т, 3Н), 2,60 (м, 2Н), 2,90 (м, 1Н), 3,30 (м, 1Н), 3,80 (с, 3Н), 3,85 (д, 1Н), 4,18 (кв, 2Н), 4,30 (д, 1Н), 6,70 (м, 2Н), 7,0 (д, 1Н), 7,22 (м, 4Н).

Следующий пример иллюстрирует способ получения биологически активного соединения данного изобретения из промежуточных соединений, таких как описанные в предшествующих получениях.

Пример 1.

Получение (8)-10,11-дигидро-3-[2-(5,6,7,8тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1-этокси]-5Ндибензо[а,б]циклогептен-10-уксусной кислоты.

a) Этил (8)-10,11-дигидро-3-[2-(5,6,7,8тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1-этокси]-5Ндибензо[а,б]циклогептен-10-ацетат.

К раствору этил (8)-10,11-дигидро-3гидрокси-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10ацетата (200 мг, 0,67 ммоль), 2-(5,6,7,8тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1-этанола (241 мг, 1,35 ммоль) и РР11₃ (354 мг, 1,35 ммоль) в сухом ТГФ (5 мл) добавляли диизопропилазодикарбоксилат (0,27 мл, 1,35 ммоль) при 0°С. Смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры по мере нагревания бани. Через 18 ч смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (1:4,5 гексаны/ЕьО), получая указанное в заголовке соединение (94 мг, 31%) в виде прозрачного масла; масс-спектр (Ε8) т/е 457 (М+Н)⁺.

b) (8)-10,11-Дигидро-3-[2-(5,6,7,8-тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1-этокси]-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-уксусная кислота.

К раствору этил (8)-10,11-дигидро-3-[2(5,6,7,8-тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1этокси]-5Н-дибензо[а,б]циклогептен-10-ацетата (131 мг, 0,29 ммоль) в смеси ТГФ/Н₂О (2 мл) добавляли 1,0н. ЫОН (0,43 мл, 0,43 ммоль) и смесь нагревали при 50°С. Через 18 ч смесь охлаждали до комнатной температуры и промывали Е!₂О (2х2 мл). Водный слой подкисляли до рН 6, используя 10%-ую НС1. Полученный молочнообразный раствор пропускали через С-18колонку соединенного элюирования (градиентное элюирование: Н₂О, затем 20% СН₃СЫ/Н₂О, затем СНС13 в качестве элюента). Фракции, содержащие продукт, концентрировали при пониженном давлении, получая указанное в заголовке соединение (30 мг, 24%) в виде белого порошка: масс-спектр (Е8) т/е 429 (М+Н)⁺.

Элементный анализ для С₂7Н₂₈Ы₂Оз-0,95 НС1:

Вычислено: С 70,02; Н 6,30; N 6,05.

Найдено: С 70,01; Н 6,33; N 5,71.

Пример 2.

Парентеральная композиция единичной препаративной лекарственной формы.

Препаративную форму, которая содержит 20 мг соединения примера 1 в виде стерильного сухого порошка, получают следующим образом: 20 мг соединения растворяют в 15 мл дистиллированной воды. Раствор фильтруют в стерильных условиях в 25 мл мультидозировочную ампулу и лиофилизуют. Влагосодержание порошка восстанавливают добавлением 30 мл 5% декстрозы в воду (Ό5\ν) для внутривенной или внутримышечной инъекции. Дозировку таким образом определяют по инъецируемому объему. Последующее разбавление можно проводить, добавляя измеренный объем данной дозировки к другому объему Э5\\ для инъекции, или измеренная доза может быть добавлена к другому механизму отпуска лекарственного средства, как в бутылку или емкость для IV капельной инфузии или в другие инъекционноинфузионные системы.

Пример 3.

Пероральная композиция единичной препаративной лекарственной формы.

Капсулу для перорального введения получают смешиванием и измельчением 50 мг соединения примера 1 с 75 мг лактозы и 5 мг стеарата магния. Полученный порошок просеивают и заполняют им твердую желатиновую капсулу.

Пример 4.

Таблетку для перорального введения получают смешиванием и гранулированием 20 мг сахарозы, 150 мг дигидрата сульфата кальция и 50 мг соединения примера 1 с 10% раствором желатина. Влажные гранулы просеивают, сушат, смешивают с 10 мг крахмала, 5 мг талька и 3 мг стеариновой кислоты и прессуют в таблетку.

Вышеуказанное описание полностью раскрывает, каким образом осуществить и использовать настоящее изобретение. Однако настоящее изобретение не ограничено описанными выше конкретными вариантами его осуществ ления, но включает все модификации в объеме следующей далее формулы изобретения. Различные ссылки на журналы, патенты и другие публикации, которые процитированы в данном описании, охватывают состояние данной области и включены в описание путем ссылки, как если бы они были изложены полностью.

Claims

1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.1, противоопухолевый агент и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где противоопухолевый агент представляет собой топотекан.

5. Фармацевтическая композиция по п.3, где противоопухолевый агент представляет собой цисплатин.

6. Способ лечения болезненного состояния, при котором показан антагонизм α_νβ₃ рецептора, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту соединения по п.1.

7. Способ лечения болезненного состояния, при котором показан антагонизм α_νβ₅ рецептора, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту соединения по п.1.

8. Способ лечения остеопороза, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту соединения по п.1.

9. Способ ингибирования ангиогенеза, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту соединения по п.1.

10. Способ ингибирования роста опухоли или метастаз опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту соединения по п.1.

11. Способ лечения атеросклероза или рестеноза, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту соединения по п.1.

12. Способ лечения воспаления, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту соединения по п.1.

13. Способ ингибирования роста опухоли, включающий введение последовательно или в физической комбинации соединения по п.1 и противоопухолевого агента.

14. Способ по п.13, где противоопухолевый агент представляет собой топотекан.

15. Способ по п.13, где противоопухолевый агент представляет собой цисплатин.

16. Соединение формулы (II) <П>

или его фармацевтически приемлемая соль.

17. Способ получения соединения формулы (I), определенного в п.1, взаимодействием соединения формулы (III) ''—СО^С^, алкил (Ш) с 2-(5,6,7,8-тетрагидро-1,8-нафтиридин-2-ил)-1этанолом в реакции, опосредованной комплексом, образованным диизопропилазодикарбоксилатом и трифенилфосфином, с последующим сложноэфирным гидролизом с использованием водного основания.

18. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, при которых показан антагонизм α_νβ₃ рецептора.

19. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, при которых показан антагонизм α_νβ₅ рецептора.

20. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для лечения остеопороза.

21. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза.

22. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для ингибирования роста опухоли или метастаз опухоли.

23. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для лечения атеросклероза или рестеноза.

24. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для лечения воспаления.

25. Применение соединения формулы (I) по п.1 и противоопухолевого агента для получения лекарственного средства для ингибирования роста опухоли в физической комбинации или для последовательного введения.

26. Применение по п.25, где противоопухолевый агент представляет собой топотекан.

27. Применение по п.25, где противоопухолевый агент представляет собой цисплатин.

28. Применение соединения формулы (I) по п.1 и ингибитора резорбции костной ткани при получении лекарственного средства для лечения остеопороза в физической комбинации или для последовательного введения.