PL195973B1

PL195973B1 - Substancja antagonistyczna względem receptora witronektyny, jej ester, sposób jej wytwarzania i zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL195973B1
Application number: PL99348702A
Authority: PL
Inventors: William H. Miller; Peter J. Manley
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2007-11-30
Also published as: EA003254B1; AU754408B2; HK1042037B; IL143390A0; HUP0104804A2; AP1534A; DK1146874T3; NO20012732D0; CN1147300C; JP2003523931A; NZ511876A; EG24025A; AU1750200A; BR9915879A; CN1334730A; ID28811A; UY25824A1; CO5150166A1; ATE277043T1; EP1146874B1

Abstract

1. Substancja antagonistyczna wzgledem receptora witronektyny, zwiazek o wzorze (I): lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest substancja antagonistyczna względem receptora witronektyny, jej ester, sposób jej wytwarzania i zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna. Nowy, farmaceutycznie aktywny związek hamuje czynność inhibitora witronektyny i w związku z powyższym jest użyteczny w leczeniu stanów zapalnych, raka i zaburzeń sercowo-naczyniowych, takich jak miażdżyca tętnic i nawrót zwężenia, oraz chorób, w których czynnikiem jest resorpcja kości, takich jak osteoporoza.

Integryny stanowią nadrodzinę receptorów adhezji komórek. Są to glikoproteiny przezbłonowe i ekspresja ich zachodzi w rozmaitych komórkach. Do tych występujących na powierzchni komórek receporów adhezyjnych należą gpIIb/IIIa (receptor fibrynogenu) i avb 3 (receptor witronektyny). Do ekspresji receptora fibrynogenu gpIIb/IIIa dochodzi na powierzchni płytek. Pośredniczy on w agregacji płytek i tworzenia hemostatycznego skrzepu w miejscu krwawiącej rany. [Philips i in., Blood, 71, 831 (1988)]. Ekspresja receptora witronektyny avb 3 odbywa się na szeregu różnych komórek, włącznie z komórkami śródbłonka, komórkami mięśni gładkich, osteoklastami i komórkami nowotworowymi, a tym samym pełni on różnorakie funkcje. I tak, receptor avb 3, którego ekspresja zachodzi na błonie osteoklastów, pośredniczy w adhezji tych komórek do substancji międzykomórkowej kości, co stanowi kluczowy etap procesu resorpcji kości. [Ross i in,. J. Biol. Chem, 262, 7703 (1987)]. Chorobą charakteryzującą się nadmierną resorpcją kości jest osteoporoza. Receptor avb 3, do którego ekspresji dochodzi na ludzkich mięśniach gładkich tętnic pośredniczy w ich migracji do nowych błon wewnętrznych i jest to proces, który może doprowadzić do nawrotu zwężenia po przezskórnej angioplastyce naczyń wieńcowych. [Brown i in.,Cardiovascular Res., 28, 1815 (1994)]. Oprócz tego, Brooks i in. [Cell, 79, 1157 (1994)] wykazali, że antagon avb 3 zdolny jest do stymulowania regresji nowotworu przez wywoływanie apoptozy angiogenicznych naczyń krwionośnych. Tak więc, czynniki blokujące czynność receptora witronektyny będą użyteczne w leczeniu chorób takich jak osteoporoza, nawrót zwężenia i rak.

Jak obecnie wiadomo, receptor witronektyny dotyczy trzech różnych integryn, określanych jako avb 1, avb 3 i avb 5. [Horton i in., J. Exp. Pathol., 71, 741 (1990)]. I tak, avb 1 wiąże fibronektynę i witronektynę, avb 3 wiąże wiele rozmaitych ligandów, w tym fibrynę, fibrynogen, lamininę, trombospondynę, witronektynę, czynnik von Willebranda, osteoponinę i sjaloproteinę I kości, avb 5 wiąże witronektynę. Wykazano, że receptor avb 5 dla witronektyny zaangażowany jest w adhezji szeregu różnych typów komórek, włącznie z mikronaczyniowymi komórkami śródbłonka [Davis i in., J. Cell Biol., 51, 206 (1993)], a jego rola w angiogenezie została potwierdzona. Brooks i in. [Science, 264, 569 (1994)]. Ekspresja tej integryny zachodzi na naczyniach krwionośnych w ludzkiej zranionej tkance ziarninowej, ale nie w skórze normalnej.

Wiadomo, że receptor witronektyny wiąże się z białkami substancji międzykomórkowej kości, zawierającymi motyw tripeptydu Arg-Gly-Asp (lub RGD). I tak, Horton i in. [Exp. Cell Res., 195, 368 (1991)] ujawnili, że peptydy zawierające RGD i przeciwciało przeciw receptorowi witronektyny (23C6) hamują resorpcję zębiny i rozchodzenie się komórek powodowane przez osteoklasty. Oprócz tego, Sato i in. [J. Cell Biol., 111, 1713 (1990)] ujawnili, że echistatyna, znajdujący się w jadzie węży peptyd obejmujący sekwencję RGD, jest silnym inhibitorem resorpcji kości w hodowli tkankowej, hamującym przyłączanie się osteoklastów do kości.

Obecnie odkryto, że pewien związek jest silnym inhibitorem receptorów avb 3 i avb 5. W szczególności, odkryto, że związek ten jest silniejszym inhibitorem receptora witronektyny niż receptora fibrynogenu.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek niniejszy dotyczy związku o wzorze (I) opisanego w poniższej części niniejszego opisu, wykazującego aktywność farmakologiczną pod względem hamowania czynności receptora i użytecznego w leczeniu stanów zapalnych, raka i zaburzeń sercowo-naczyniowych, takich jak miażdżyca tętnic i nawrót zwężenia, a także chorób, w których czynnikiem jest resorpcja kości, takich jak osteoporoza.

Wynalazek niniejszy dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek o wzorze (I) i nośnik farmaceutyczny.

Wynalazek niniejszy dotyczy także sposobu leczenia chorób, w których pośredniczy receptor witronektyny. W konkretnym aspekcie, związek według niniejszego wynalazku jest użyteczny

PL 195 973 B1 w leczeniu miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, stanu zapalnego, raka i chorób, w których czynnikiem jest resorpcja kości, takich jak osteoporoza.

Opis szczegółowy

Wynalazek niniejszy dotyczy nowego związku, będącego silniejszym inhibitorem receptora witronektyny niż receptora fibrynogenu. Nowy związek obejmuje rdzeń dibenzocykloheptenowy, w którym podstawnik zawierający azot występuje przy jednym z aromatycznych sześcioczłonowych pierścieni dibenzocykloheptenu, a podstawnik alifatyczny, zawierający ugrupowanie kwasowe występuje przy siedmioczłonowym pierścieniu dibenzocykloheptenu. Uważa się, że dibenzocykloheptenowy układ pierścieni orientuje podstawniki w postaci łańcuchów bocznych przy obu pierścieniach, sześcio- i siedmioczłonowym, w taki sposób, że mogą one korzystnie wzajemnie reagować z receptorem witronektyny. Korzystnie, w układzie tym około dwunastu do czternastu wiązań kowalencyjnych (zaangażowanych poprzez najkrótszy szlak wewnątrzcząsteczkowy) istnieje między ugrupowaniem kwasowym obecnym w alifatycznym podstawniku siedmioczłonowego pierścienia dibenzocykloheptenu, a azotem zawierającego azot podstawnika obecnego przy jednym z aromatycznych sześcioczłonowych pierścieni dibenzocykloheptenu.

Wynalazek niniejszy dotyczy związku o wzorze (I)

lub jego farmaceutycznie dozwolonej soli.

Związek o wzorze (I) hamuje wiązanie się witronektyny i innych peptydów zawierających RGD z receptorem witronektyny. Zahamowanie czynności receptora witronektyny na osteoklastach zahamowuje resorpcję kości odbywającą się z udziałem osteoklastów i przez to jest użyteczne w leczeniu chorób, w których resorpcja kości związana jest z patologią, taką jak osteoporoza i zapalenie kości i stawów.

Zgodnie z inną swą cechą znamienną, wynalazek niniejszy dotyczy sposobu stymulowania tworzenia się kości, obejmującego stosowanie związku o wzorze (I), powodującego wzmożenie uwalniania się osteolaktyny. Zwiększenie tworzenia kości jest wyraźnym dobrodziejstwem w tych stanach chorobowych, w których występuje niedobór zmineralizowanej masy kostnej, lub gdy pożądana jest przebudowa kości, tak jak w przypadku leczenia złamania i przy zapobieganiu złamaniu kości. Korzyści z takiego sposobu leczenia chorzy będą odnosić także w przypadku chorób, lub zakłóceń metabolizmu, prowadzących do utraty struktury kostnej. I tak, na przykład, dobroczynne skutki, będące rezultatem stosowania związku według niniejszego wynalazku, okażą się w przypadku takich chorób, jak: nadczynność przytarczyc, choroba Pageta, hiperkalcemia związana z nowotworzeniem, uszkodzenia osteolityczne jako skutek przerzutów do kości, utrata kości w wyniku immobilizacji lub niedoboru hormonów płciowych, choroba Bechęeta, demineralizacja kości, hiperostoza i marmurowatość kości.

Oprócz tego, ponieważ związek według niniejszego wynalazku hamuje czynność receptorów witronektyny na komórkach szeregu różnych typów, związek ten będzie użyteczny w leczeniu zaburzeń połączonych ze stanem zapalnym, takich jak zapalenie stawów reumatoidalne i łuszczyca, oraz chorób sercowo-naczyniowych, takich jak miażdżyca tętnic i nawrót zwężenia. Związek o wzorze (I) według niniejszego wynalazku może być użyteczny w leczeniulub zapobieganiu innym chorobom, włączając w to, ale bez ograniczania się tylko do nich, zaburzenia na tle zakrzepu z zatorami, astma, alergie, zespół zaburzeń oddechowych dorosłych, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu, wstrząs septyczny, wyprysk, zapalenie skóry kontaktowe, zapalenie jelit i inne choroby autoimmunizacyjne. Związek według niniejszego wynalazku może być użyteczny także w leczeniu ran.

Zastosowanie związku według niniejszego wynalazku jest przydatne w leczeniu (włączając w to zapobieganie) zaburzeń naczyniotwórczych. Stosowany w niniejszym opisie termin zabu4

PL 195 973 B1 rzenia naczyniotwórcze obejmuje stany, w których dochodzi do nienormalnego tworzenia się nowych naczyń. W przypadku, gdy rozwój nowych naczyń krwionośnych jest powodem (lub przyczynia się do) patologii związanej z daną chorobą, zahamowanie rozwoju naczyń zmniejszy szkodliwe skutki tej choroby. Przykładem takiego celowo ukierunkowanego zastosowania jest leczenie retinopatii cukrzycowej. W przypadku, gdy szkodliwa tkanka wymaga (do podtrzymania swego wzrostu) rozwoju nowych naczyń krwionośnych, zahamowanie tworzenia nowych naczyń spowoduje zmniejszenia dostarczania krwi do tej szkodliwej tkanki, a tym samym przyczyni się do zmniejszenia masy tkanki, której rozwój zależy właśnie od zaspokojenia wymagań dotyczących dostarczania krwi. Przykładem tego jest rozwój nowotworów, w przypadku których tworzenie nowych naczyń jest stałym wymogiem dla rozwoju nowotworu i podstawę jego przerzutów. Stąd też, związek według niniejszego wynalazku spowoduje zahamowanie rozwoju naczyń tkanki nowotworowej, a tym samym zapobieżenie przerzutom i dalszemu rozwojowi nowotworu.

Tak więc, zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku, zahamowanie rozwoju naczyń uzyskiwane dzięki związkowi według niniejszego wynalazku może poprawić objawy choroby, a w niektórych przypadkach leczyć samą chorobę.

Innym terapeutycznym celem zastosowań związku według niniejszego wynalazku są choroby oczu, charakteryzujące się tworzeniem nowych naczyń. Do tego rodzaju chorób oczu należą zaburzenia naczyniowe rogówki, takie jak przeszczepianie rogówki, zapalenie rogówki opryszczkowe, zapalenie rogówki kiłowe, skrzydlik i nowo unaczyniona łuszczka rogówki związana z użytkowaniem soczewek kontaktowych. Dodatkowe choroby oczu obejmują związane z wiekiem zwyrodnienie plamki, domniemaną histoplazmozę oczu, retinopatię wcześniaków i jaskrę związaną z tworzeniem nowych naczyń.

Wynalazek niniejszy dotyczy także sposobu hamowania rozwoju nowotworu, który to sposób polega na podawaniu, kolejno lub w kombinacji fizycznej, związku o wzorze (I) i środka przeciwnowotworowego, takiego jak topotekam i cysplatyna.

Nowym związkiem według niniejszego wynalazku jest kwas (S)-10,11-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etoksy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowy, lub jego farmaceutycznie dozwolona sól.

Według niniejszego wynalazku, korzystna jest konfiguracja (S) związku o wzorze (I).

Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem także proleki związku według niniejszego wynalazku. Jako proleki uważa się jakiekolwiek kowalencyjnie związane nośniki, które in vivo uwalniają aktywną substancję macierzystą o wzorze (I). I tak, zgodnie ze swą inną cechą znamienną, wynalazek niniejszy dotyczy nowych proleków, będących zarazem substancjami pośrednimi w wytwarzaniu związku o wzorze (I), objętych wzorem (II):

lub ich farmaceutycznie dozwolonych soli.

W niniejszym tekście, do opisania związku według niniejszego wynalazku, użyto skrótów i symboli zwykle stosowanych w dziedzinie peptydów i chemii ogólnej. Skróty dotyczące aminokwasów ogólnie odpowiadają postanowieniom IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, jak opisano w Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984).

Stosowany w niniejszym opisie termin grupa C1-6-alkilowa oznacza ewentualnie podstawioną grupę alkilową zawierającą od 1 do 6 atomów węgla i obejmuje swym zakresem grupę metylową, grupę etylową, grupę n-propylową, grupę izopropylową, grupę n-butylową, grupę izobutylową, grupę tert-butylową, grupę pentylową, grupę n-pentylową, grupę izopentylową, grupę neopentylową i grupę heksylową oraz ich proste izomery alifatyczne.

PL 195 973 B1

Jakakolwiek grupa C1-6-alkilowa może być, ewentualnie, podstawiona grupą o symbolu R^x, która może występować przy dowolnym węglu z utworzeniem trwałej struktury i którą można wprowadzić typowymi metodami syntezy. Do odpowiednich grup o symbolu R^x należą takie grupy, jak grupa C1-4-alkilowa, grupa o wzorze OR'', grupa o wzorze SR, grupa C1-4-alkilosulfonylowa, grupa C1-4-alkilosulfoksylowa, -CN, grupa o wzorze N(R'')2, CH2N(R'')2, -NO2, -CF3, grupa o wzorze -CO2R'', grupa o wzorze -CON(R'')2, grupa o wzorze -COR, grupa o wzorze NR''C(O)R'', F, Cl, Br, J lub grupa o wzorze CF3S(O)r-, w których to wzorach r oznacza 0, 1lub 2, a R'' oznacza H lub grupę C1-6-alkilową.

W niniejszym opisie, niektóre ugrupowania typu rodników oznaczone są skrótowo. I tak, skrót t-Bu odnosi się do trzeciorzędowej grupy butylowej, Boc odnosi się do grupy tert-butoksykarbonylowej, Fmoc odnosi się do grupy fluorenylometoksykarbonylowej, Ph odnosi się do grupy fenylowej, Cbz odnosi się do grupy benzyloksykarbonylowej, Bn odnosi się do grupy benzylowej, Me odnosi się do grupy metylowej, Et odnosi się do grupy etylowej, Ac odnosi się do grupy acetylowej, Alk odnosi się do grupy C1-4-alkilowej, Nph odnosi się do grupy 1- lub 2-naftylowej i cHex odnosi się do grupy cykloheksylowej, a Tet odnosi się do grupy 5-tetrazolilowej.

W niniejszym opisie, niektóre odczynniki oznaczone są skrótowo. I tak, skrót DCC odnosi się do dicykloheksylokarbodiimidu, DMAP odnosi się do dimetyloaminopirydyny, DIEA odnosi się do diizopropyloetyloaminy, EDC odnosi się do chlorowodorku 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu, HOBt odnosi się do 1-hydroksybenzotriazolu, THF odnosi się do tetrahydrofuranu, DIEA odnosi się do diizopropyloetyloaminy, DEAD odnosi się do azodikarboksylanu dietylu, PPh3 odnosi się do trifenylofosfiny, DIAD odnosi się do azodikarboksylanu diizopropylu, DME odnosi się do dimetoksyetanu, DMF odnosi się do dimetyloformamidu, NBS odnosi się do N-bromosukcynoimidu, Pd/C odnosi się do katalizatora w postaci palladu na węglu, PPA odnosi się do poli(kwasu fosforowego), DPPA odnosi się do azydku difenylofosforylu, BOP odnosi się do heksafluorofosforanu benzotriazol-1-iloksy-tris(dimetyloamino)fosfoniowego, HF odnosi się do kwasu fluorowodorowego, TEA odnosi się do trietyloaminy, TFA odnosi się do kwasu trifluorooctowego i PCC odnosi się do chlorochromianu pirydyniowego.

Związek o wzorze (I) można wytworzyć sposobami, które opisali Bondinell i in. w PCT Publication nr WO 97/01540 (Zgłoszenie Międzynarodowe nr PCT/US96/11108, opublikowane 16 stycznia 1997), które to ujawnienie jest w całości włączone do niniejszego opisu jako odnośnik.

Oprócz tego, związek o wzorze (I) wytwarza się sposobami analogicznymi do metod przedstawionych na wyszczególnionych poniżej schematach.

Schemat I przedstawia szczegółowo otrzymywanie związku pośredniego przydatnego do wytworzenia związku o wzorze (I).

PL 195 973 B1

a) LiN(TMS)2; bromooctan etylu; b) odczynnik Jonesa, OsO4; c) H2, 10% Pd/C, HOAc; d) C2O2Cl2, DMF; e) AlCl3, CH2Cl2.

Temperatura pokojowa; f)H2, 10% Pd/C, HOAc.

Schemat II także przedstawia szczegółowo otrzymywanie związku pośredniego przydatnego do wytworzenia związku o wzorze (I).

PL 195 973 B1

(a) EtOAc/LiHMDS, THF; (b) H2, 10% Pd/C, stężony HCl, AcOH; (c) EtSH, AlCl3, CH2Cl2; (d) 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etanol, azodikarboksylan diizopropylu, (Ph)3P; (e) 1,0 N LiOH, EtOH; HCl.

Schemat III przedstawia szczegółowo otrzymywanie związku o wzorze (I). Reakcja związku 1 na schemacie III, (III-1), (który jest związkiem 3 na schemacie I, I-3) typu aldolowego enolanem octanu etylu [który można wytworzyć z octanu etylu przez ekspozycję na działanie odpowiedniej zasady typu amidku, na przykład diizopropyloamidku litu (LDA) lub bis(trimetylosililo)amidku litu (LiHMDS)], prowadzi do otrzymania związku III-2. Częstokroć, THF jest rozpuszczalnikiem z wyboru dla reakcji aldolowej, aczkolwiek często stosowany jest THF w obecności różnych dodatków, na przykład HMPA lub TMEDA. Redukcję związku III-2 z otrzymaniem związku III-3 (który jest związkiem 6 na schemacie II, II-6) można przeprowadzić na drodze hydrogenolizy z udziałem właściwego katalizatora, na przykład metalicznego palladu na węglu aktywnym (Pd/C), w środowisku stosownego rozpuszczalnika, takiego jak kwas octowy, w obecności kwasu mineralnego, takiego jak HCl. Alternatywnie, redukcję tę można przeprowadzić za pomocą podziałania na związek III-2 trietyloaminą w obecności kompleksu eterowego trifluorku boru zgodnie z ogólną metodą Orfanopoulosa i Smonou [Synth. Commun., 833 (1988)]. Usunięcia eteru metylowego ze związku III-3 z otrzymaniem związku III-4 można dokonać przy użyciu BBr3 w środowisku rozpuszczalnika obojętnego, na przykład CH2Cl2, lub na drodze reakcji

PL 195 973 B1 z etanotiolem i AlCl3 w środowisku rozpuszczalnika obojętnego, korzystnie CH2Cl2. Inne użyteczne sposoby usuwania eteru metylowego opisał Greene w: Protective Groups in Organic Synthesis (praca opublikowana przez wydawnictwo John Wiley and Sons). Związek 4 ze schematu 3 (III-4) poddaje się reakcji z 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftarydyn-2-ylo)-1-etanolem, w wyniku czego otrzymuje się związek III-5. W reakcji tej pośredniczy kompleks utworzony przez azodikarboksylan diizopropylu i trifenylofosfinę, przy czym reakcję prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika aprotonowego, na przykład THF, CH2Cl2 lub DMF. Ester etylowy związku III-5 poddaje się hydrolizie przy użyciu uwodnionej zasady, na przykład LiOH w uwodnionym THF lub NaOH w uwodnionym metanolu lub etanolu, a karboksylan, będący związkiem pośrednim, zakwasza się przy użyciu odpowiedniego kwasu, na przykład TFA lub HCl, w wyniku czego otrzymuje się kwas karboksylowy III-6. Alternatywnie, jeżeli jest to pożądane, można karboksylan będący związkiem pośrednim, wyodrębnić, albo też utworzyć karboksylan z wolnego kwasu karboksylowego sposobami dobrze znanymi specjaliście w tej dziedzinie techniki.

Schemat IV

(a) PhOH, Cu, K2CO3; (b) siarka, morfolina; (c) KOH, H2O, i-PrOH; (d) SOCl2, benzen; (e) AlCl3, CH2Cl2; (f) EtOAc, LiN(TMS)2, TMEDA, THF; (g) Et3SiH, BF3.OEt2, CH2Cl2; (h) H2, Pd/C, EtOH; (i) BBr3, CH2Cl2.

Handlowo dostępny 2-fluoro-4-metoksyacetofenon (związek IV-1) reaguje z alkoholem, na przykład z fenolem, w obecności miedzi metalicznej i stosownej zasady, na przykład K2CO3, w wyniku czego otrzymuje się eter diarylowy IV-2. Związek IV-2 poddaje się reakcji z siarką i stosowną aminą pierwszorzędową lub drugorzędową, korzystnie morfoliną, zgodnie z ogólną metodą Harrisa [J. Med.

Chem., 25, 855 (1982)] i w ten sposób przekształca się go w związek IV-3w klasycznej reakcji WillgePL 195 973 B1 rodta-Kindlera. Tak otrzymany tioamid poddaje się hydrolizie z otrzymaniem odpowiedniego kwasu karboksylowego IV-4 w reakcji z wodorotlenkiem metalu alkalicznego, stosownie KOH, w uwodnionym rozpuszczalniku alkoholowym, takim jak uwodniony MeOH, EtOH lub i-PrOH. Kwas karboksylowy IV-4 przekształca się w odpowiedni chlorek kwasowy na drodze reakcji albo z SOCl2, albo z chlorkiem oksalilu, w warunkach dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie techniki. W wyniku reakcji tego chlorku kwasowego z odpowiednim katalizatorem Friedela i Craftsa, takim jak AlCl3 lub SnCl4, w środowisku rozpuszczalnika obojętnego, takiego jak CH2Cl2 lub CS2, otrzymuje się cykliczny keton IV-5. Alternatywnie, kwas IV-4 można przekształcić w keton IV-5 bezpośrednio, w warunkach kwasowych, na przykład z udziałem poli(kwasu fosforowego). Reakcja związku IV-5 typu aldolowego z enolanem octanu etylu [który można wytworzyć z octanu etylu przez ekspozycję na działanie odpowiedniej zasady typu amidku, takiej jak, na przykład, diizopropyloamidek litu (LDA) lub bis(trimetylosililo)amidek litu (LiHMDS)], prowadzi do otrzymania związku IV-6. Częstokroć, THF jest rozpuszczalnikiem z wyboru dla reakcji aldolowej, aczkolwiek często stosowany jest THF w obecności różnych dodatków, na przykład HMPA lub TMEDA. Redukcję związku IV-6 z otrzymaniem związku IV-7 można przeprowadzić za pomocą podziałania na związek IV-6 trietylosilanem w obecności kompleksu eterowego trifluorku boru zgodnie z ogólną metodą Orfanopoulosa i Smonu [Synth. Commun., 833 (1988)]. Jakiekolwiek olefinowe produkty uboczne, powstające w wyniku eliminacji alkoholu, redukuje się metodą uwodornienia z udziałem odpowiedniego katalizatora, na przykład metalicznego palladu na węglu aktywnym (Pd/C), w środowisku stosownego rozpuszczalnika, takiego jak MeOH lub EtOH. Alternatywnie, redukcji związku IV-6 z otrzymaniem związku IV-7 można dokonać na drodze hydrogenolizy prowadzonej w obecności kwasu mineralnego, takiego jak HCl. Typowo, reakcję tę katalizuje się Pd/C i optymalnie prowadzi się ją w środowisku kwasu octowego. Usunięcia eteru metylowego ze związku IV-7 z otrzymaniem związku IV-8 można dokonać przy użyciu BBr3 w środowisku rozpuszczalnika obojętnego, na przykład CH2Cl2, lub na drodze reakcji z etanotiolem i AlCl3 w środowisku rozpuszczalnika obojętnego, korzystnie CH2Cl2. Inne użyteczne sposoby usuwania eteru metylowego opisał Greene w: Protective Groups in Organic Synthesis (praca opublikowana przez wydawnictwo John Wiley and Sons). Następnie, związek IV-8 przekształca się w związek o wzorze (I) metodą uwidocznioną na powyższym schemacie III.

Kwaśne sole addycyjne omawianego związku wytwarza się w sposób typowy, w środowisku odpowiedniego rozpuszczalnika, ze związku macierzystego i użytego w nadmiarze kwasu, takiego jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas fluorowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy, kwas octowy, kwas trifluorooctowy, kwas maleinowy, kwas bursztynowy lub kwas metanosulfonowy. Niektóre związki tworzą sole wewnętrzne lub jony obojnacze, które też mogą być w tym przypadku dopuszczalne. Sole kationowe wytwarza się za pomocą podziałania na związek macierzysty użytym w nadmiarze odczynnikiem alkalicznym, takim jak wodorotlenek, węglan lub alkoholan, zawierającym odpowiedni kation, albo podziałania odpowiednią aminą organiczną. Konkretnymi przykładowymi kationami występującymi w farmaceutycznie dozwolonych solach są kationy takie, jak Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ i NH₄ ⁺.

Wynalazek niniejszy dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek o wzorze (I) i farmaceutycznie dozwolony nośnik. Zgodnie z tym, związek o wzorze (I) można stosować do wytwarzania leku. Kompozycje farmaceutyczne zawierające związek o wzorze (I) wytworzone sposobem powyżej opisanym można formułować jako roztwory lub jako zliofilizowane proszki przeznaczone do podawania drogą pozajelitową. Proszkom można przywrócić postać pierwotną za pomocą dodania przed użyciem odpowiedniego rozcieńczalnika lub innego farmaceutycznie dozwolonego nośnika. Preparat płynny może być zbuforowanym, izotonicznym roztworem wodnym. Przykładowymi odpowiednimi rozcieńczalnikami są normalne, izotoniczne roztwory chlorku sodu, standardowy 5% roztwór D-glukozy w wodzie albo zbuforowany roztwór octanu sodu lub amonu. Preparat taki jest szczególnie odpowiedni do stosowania pozajelitowego, ale można go także stosować doustnie lub też, może być zawarty w aparacie używanym do wdmuchiwania takim jak inhalator odmierzający dawki lub rozpylacz. Może okazać się pożądane dodanie zaróbek, takich jak poliwinylopirolidon, żelatyna, hydroksyceluloza, guma arabska, poli(glikol etylenowy), mannitol, chlorek sodu lub cytrynian sodu.

Alternatywnie, omawiane związki można zaotoczkować, stabletkować lub sformułować w postać emulsji lub syropu z przeznaczeniem do podawania drogą doustną. W celu wzmocnienia lub dla ustabilizowania kompozycji, albo w celu ułatwienia przeprowadzenia samego procesu wytwarzania kompozycji, można dodać farmaceutycznie dozwolone stałe lub płynne nośniki. Do nośników stałych należą: skrobia, laktoza, dihydrat siarczanu wapnia, terra alba, stearynian magnezu lub kwas stearynowy,

PL 195 973 B1 talk, pektyna, guma arabska, agar lub żelatyna. Do nośników płynnych należą: syrop, olej arachidowy, oliwa, wodny roztwór chlorku sodu i woda. Nośnik może obejmować także substancję umożliwiającą spowolnione uwalnianie leku, taką jak monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu, albo jako taki, albo w mieszaninie z woskiem. Ilość nośnika stałego jest zmienna, ale korzystnie mieści się w zakresie od około 20 mg do około 1 g/dawkę jednostkową. Preparaty farmaceutyczne sporządza się zgodnie z typowymi technikami stosowanymi w farmacji, takimi jak:

- w przypadku tabletek mielenie, mieszanie, granulowanie i prasowanie, jeżeli jest to potrzebne;

- w przypadku kapsułek żelatynowych twardych mielenie, mieszanie i napełnianie foremek.

W przypadku użycia nośnika płynnego sporządza się preparat w postaci syropu, eliksiru, emulsji lub wodnej, albo niewodnej zawiesiny. Tego rodzaju preparaty płynne można podawać bezpośrednio p.o., albo też można napełniać nimi kapsułki żelatynowe miękkie.

W przypadku podawania doodbytniczego, związek według niniejszego wynalazku można łączyć z zaróbkami takimi jak masło kakaowe, gliceryna, żelatyna lub glikole polietylenowe i stapiać, z uformowaniem czopków.

Związki opisywane w niniejszym opisie są antagonami receptora witronektyny i są użyteczne w leczeniu chorób, w przypadku których podstawową patologię należy odnieść do liganda lub komórki oddziaływującej wzajemnie z receptorem witronektyny. I tak, na przykład, związki te są użyteczne w leczeniu chorób, w których utrata substancji międzykomórkowej kości wywołuje patologię. Tak więc, omawiane związki są użyteczne w leczeniu osteoporozy, nadczynności przytarczyc, choroby Pageta, hiperkalcemii związanej z nowotworzeniem, uszkodzeń osteolitycznych jako skutku przerzutów do kości, oraz utraty kości w wyniku immobilizacji lub niedoboru hormonów płciowych. Przyjmuje się również, że związki według wynalazku wykażą swą użyteczność jako środki przeciwnowotworowe, antyangiogeniczne, przeciwzapalne i przeciwprzerzutowe, a także będą przydatne w leczeniu miażdżycy tętnic i nawrotu zwężenia.

Związki podaje się choremu albo drogą doustną, albo pozajelitową, w taki sposób, że ilość leku wystarcza do zahamowania resorpcji kości lub innego wskazania tego rodzaju. Kompozycję farmaceutyczną zawierającą związek według wynalazku stosuje się w dawce doustnej mieszczącej się w zakresie od około 0,1 do około 50 mg/kg, tak, jak tego wymaga stan chorego. Korzystnie, wielkość dawki doustnej mieści się w zakresie od około 0,5 do około 20 mg/kg. W przypadku terapii ostrej, korzystne jest podawanie pozajelitowe. Najbardziej skuteczny jest wtedy dożylny wlew peptydu w 5% roztworze D-glukozy w wodzie lub roztworze izotonicznym chlorku sodu, albo użycie podobnego preparatu z odpowiednimi zaróbkami, aczkolwiek użyteczne jest także domięśniowe wstrzyknięcie jednej dużej dawki (bolusa). Typowo, wielkość dawki pozajelitowej mieści się w zakresie od około 0,01 do około 100 mg/kg, korzystnie w zakresie od 0,1 do 20 mg/kg. Związki podaje się od jednego do czterech razy dziennie w takiej ilości, żeby uzyskać łączną dawkę dzienną mieszczącą się w zakresie od około 0,4 do około 400 mg/kg/dzień. Dokładną stosowaną ilość leku i sposób jego podawania łatwo ustali specjalista w tej dziedzinie wiedzy, na zasadzie porównania poziomu danego środka we krwi ze stężeniem potrzebnym do wywarcia działania leczniczego.

Wynalazek niniejszy dotyczy także sposobu leczenia osteoporozy lub hamowania utraty kości, polegającego na stosowaniu, kolejno lub w kombinacji fizycznej, związku o wzorze (I)i innych inhibitorów resorpcji kości, takich jak bisfosfoniany (na przykład, alendronat), hormonalnej terapii substytucyjnej, antyestrogenów lub kalcytoniny. Oprócz tego, wynalazek niniejszy dotyczy sposobu leczenia polegającego na stosowaniu związku według niniejszego wynalazku i środka anabolicznego, takiego jak białko morfogeniczne kości, iproflawon, użytecznego w zapobieganiu utracie kości i/lub powodującego zwiększenie masy kostnej.

Wynalazek niniejszy dotyczy także sposobu hamowania rozwoju nowotworu polegającego na podawaniu, kolejno lub w kombinacji fizycznej, związku o wzorze (I) i środka przeciwnowotworowego. Dobrze poznaną grupę środków przeciwnowotworowych stanowią związki z grupy analogów kamptotecyny, takie jak topotekan, irynotekan i 9-aminokamptotecyna oraz koordynacyjne kompleksy platyny, takie jak cysplatyna, ormaplatyna i tetraplatyna. Związki należące do grupy analogów kamptotecyny opisane są w patentach Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 5004758, 4604463, 4473692, 4545880, 4342776, 4513138 i 4399276, w EP Patent Application Publication nr nr 0 418 099 i 0 088 642, w: Wani i in., J. Med Chem, 29, 2358 (1986); Wani i in., J. Med. Chem., 23, 554 (1980); Wani i in., J. Med. Chem., 30, 1774 (1987) oraz Nitta i in., Proc. 14th International Congr. Chemotherapy, Anticancer Section I, 28 (1985), przy czym ujawnienia zawarte wtych publikacjach są w całości włączone do niniejszego opisu jako odnośniki. Koordynacyjny kompleks platyny, cysplatyna, jest dostępna pod

PL 195 973 B1 _® nazwą Platinol^® zfirmyBristol Myers-Squibb Corporation. Użyteczne preparaty stosowane w przypadku cysplatyny opisano w patentach Stanów Zjednoczonych Amerykinrnr5562925i4310515,których ujawnieniasąw całości włączone do niniejszego opisu jako odnośniki.

W sposobie hamowania rozwoju nowotworu, który to sposób obejmujepodawanie,kolejnolub wkombinacjifizycznej, związku o wzorze (I) i środka przeciwnowotworowego, koordynacyjnyzwiązek platyny, na przykład cysplatynę, można podawać w powolnym wlewie dożylnym. Korzystnym nośnikiemjest wtym przypadku wodny roztwórD-glukozyi chlorkusodu, zawierający mannitol. Schemat dawkowania koordynacyjnego związku platyny może być oparty na takiej podstawie: od około 1 do około 500 mg/m² (mg/m²) powierzchni ciała/jeden przebieg. Wlewów koordynacyjnego związku platyny dokonywać możnajeden raz,lub dwa razytygodniowo, a takątygodniowąterapię możnapowtarzać szereg razy.W przypadku użycia związku należącego do klasy analogów kamptotecyny podawanego drogą pozajelitową, przyjęty, na ogół, przebieg leczenia oparty jest na następującej podstawie: od około 0,1 do około 300,0 mg/m² powierzchni ciała/dzień w ciągu 5 kolejnych dni. Najkorzystniej, przebieg terapii stosowanej w przypadku topotekanu przewiduje stosowanie od około 1,0 do około2,0 mg/m² powierzchni ciała/dzień w ciągu 5 kolejnych dni. Korzystnie,terapiętakąpowtarzasięco najmniejjedenrazz zachowaniem odstępu czasowego wynoszącego od około 7 do około 28dni.

Kompozycję farmaceutyczną można formułować z udziałem związkuowzorze(I)iśrodkaprzeciwnowotworowego w tym samympojemniku,jednakże,korzystniestosujesięosobnedla nichpojemniki.W przypadku, gdy oba te środki występują w postaci roztworu, mogą one być zawarte w układzie wlew/wstrzyknięcie do jednoczesnego podania, albo w układzie tandemowym.

Dla wygody stosowania związku o wzorze (I)i środka przeciwnowotworowego w tym samym, lubwróżnymczasie, wytwarza się zestaw mieszczący się w pojedynczym pojemniku takimjakpudełko,kartoniklubinnypojemnik,pojedyncze butelki,torebki,fiolkilubinnepojemniki,każdy zawierający skuteczną ilość związku o wzorze(I)z przeznaczeniem do podawania drogą pozajelitową, jak wyżej opisano, i skuteczną ilość środka przeciwnowotworowego przeznaczonego do podawania drogą pozajelitową, jak wyżej opisano. Zestaw taki może obejmować, na przykład, oba środki farmaceutyczne w osobnych pojemnikach, albo wtym samym pojemniku, ewentualnie w postaci zliofilizowanego słupka, orazpojemnikizroztworamidoprzywracaniapierwotnej postaci. Odmianątakiego rozwiązania jest wprowadzenie roztworu do przywracania pierwotnej postaci i zliofilizowanego słupka do dwu komór jednego i tego samego pojemnika, umożliwiającego wymieszanie zawartości przed użyciem.Wtakim układzie, środek przeciwnowotworowy i związek według wynalazku można zapakować oddzielnie, wdwóch pojemnikach,albozliofilizowaćłącznie,zotrzymaniem proszku, i dostarczyćw pojedynczym pojemniku.

W przypadku, gdy oba środki występują w postaci roztworu, mogą być zawarte w układzie wlew/wstrzyknięcie do jednoczesnego podania, lub w układzie tandemowym.Itak, na przykład, związek o wzorze (I)może występować w postaci nadającej się do wstrzyknięć dożylnych, albo do wlewów,w woreczku połączonym szeregowo, poprzez rurkę, ze środkiem przeciwnowotworowym znajdującym się w drugim woreczku do wlewów. Przy użyciu takiego układu, chory może otrzymywać wstępne wstrzyknięcie lub wlew jednorazowej dużej dawki (bolusa) związkuo wzorze (I),z następującym potem wlewem środka przeciwnowotworowego.

Związek można poddać badaniom w szeregu testów biologicznych w celu ustalenia ilości związku potrzebnej do uzyskania pożądanego efektu farmakologicznego.

Hamowaniewiązaniawitronektyny.

Wiązanie się [³H]-SK&F-107260 z avb3 w fazie stałej avb3 z ludzkich łożysk lub ludzkich płytek (0,1 - 0,3 mg/ml) w buforze T (zawierającym 2 mM CaCl2 i1% oktyloglukozydu) rozcieńczono buforem T zawierającym 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (buforA) i 0,05% NaN3, po czym bezzwłocznie wprowadzono na 96-studzienkowe płytki ELISA (Corning, Nowy Jork,NY)wilości0,1ml/studzienkę.Do jednej studzienki wprowadzono0,1-0,2 mg avb3. Następnie, płytki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. W czasie trwania eksperymentu, studzienki przemyto jeden raz buforem A i inkubowano z 0,1 ml 3,5% albuminy surowicy bydlęcej w tym samym buforze, w ciągu godziny, w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji, studzienki poddano całkowitemu odessaniu i przemyto je 2 razy po 0,2 ml buforu A.

Związek rozpuszczono w 100% DMSO, w wyniku czego otrzymano 2 mM roztwór wyjściowy, który rozcieńczono buforem do wiązania [15 mM Tris-HCl (pH 7,4),100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 1mM

MnCl2, 1 mM MgCl2) do końcowego stężenia związku wynoszącego 100 mM. Następnie, roztwór ten rozcieńczono do pożądanego końcowego stężenia związku. Do studzienek wprowadzono, w trzech

PL 195 973 B1 powtórzeniach, różne stężenia nieznakowanych antagonów (0,001 - 100 mM),a następnie dodano po 5,0 nM [³H]-SK&F-107260 (65 - 86 Ci/mmol)].

Płytki inkubowano w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji, studzienki poddano całkowitemu odessaniu i przemyto jeden raz 0,2 ml lodowato zimnego buforu A według schematu studzienka-do-studzienki. Receptory solubilizowano przy użyciu 0,1 ml 1% SDS i związany [³H]-SK&F-107260 oznaczano metodą pomiaru w cieczowym liczniku scyntylacyjnym, z dodawaniem 3 ml odczynnika Ready Safe, w aparacie Beckman Liquid Scintillation Counter LS z 40% wydajnością. Niespecyficzne wiązanie [³H]-SK&F-107260 oznaczano w obecności 2 mM SK&F-107260 i w sposób konsekwentny wynosiło ono mniej niż 1% całości wprowadzonego radioligandu. Wartość IC50 (stężenie antagonu powodujące 50% zahamowanie wiązania się [³H]-SK&F-107260) oznaczono nieliniową metodą dopasowywania krzywej najmniejszych kwadratów, zmodyfikowaną według programu LUNDON-2. Wartość Ki (stała dysocjacji antagonu) obliczono według równania:

Ki = IC50/(1 + L/Kd) w którym:

₃

LiKd oznaczały, odpowiednio, stężenie i stałą dysocjacji [³H]-SK&F-107260.

Związek według niniejszego wynalazku hamuje wiązanie się witronektyny z SK&F-107260 przy około 1,7 nanomolowej Ki.

Związki według niniejszego wynalazku przebadano także pod względem in vitro i in vivo resorpcji kości w testach typowych w dziedzinie oceniania hamowania tworzenia się kości, takich jak test tworzenia dołka, ujawniony w dokumencie patentowym EP 528 587, który można także zrealizować przy użyciu zamiast szczurzych, ludzkich osteoklastów, oraz model szczura z wyciętymi jajnikami, opisany przez Wrońskiego i in. [Cells and Materials, Sup. 1, 69 - 74 (1991)].

Test migracji włókien mięśniowych gładkich naczynia.

Użyto szczurzych lub ludzkich włókien mięśniowych gładkich aorty. Migrację komórek monitorowano w komorze Transwella do hodowli komórek z użyciem membrany poliwęglanowej o 8 mm porach (Costar). Niższa powierzchnia filtra była pokryta witronektyną. Komórki zawieszono w DMEM, uzupełnionym 0,2% albuminy surowicy bydlęcej, w stężeniu 2,5 - 5,0 x 10⁶ komórek/ml. Komórki wstępnie potraktowano związkiem badanym, użytym w różnych stężeniach, w ciągu 20 minut, wtemperaturze 20°C. Jako kontroli użyto samego rozpuszczalnika. W górnym przedziale komory umieszczono 0,2 ml zawiesiny komórek. Niższy przedział zawierał 0,6 ml DMEM uzupełnionego 0,2% albuminy surowicy bydlęcej. Inkubację przeprowadzono w temperaturze 37°C, w atmosferze o składzie: 95% powietrze/5% CO2, w ciągu 24 godzin. Po inkubacji, komórki nie migrujące, na górnej powierzchni filtra, usunięto za pomocą łagodnego zdrapania. Następnie, filtr utrwalono w metanolu i zabarwiono 10% barwnikiem Giemsy. Migrację mierzono: albo a)za pomocą liczenia ilości komórek które migrowały do niższej powierzchni filtra, albo b)za pomocą ekstrakcji zabarwionych komórek 10% kwasem octowym, z następującym po tym pomiarem absorbancji przy 600 nm. Model szczura z wyciętą tarczycą i przytarczycami.

Każda badana grupa składała się z 5-6 dorosłych szczurów, samców Sprague-Dawley (o masie ciała 250 - 400 g). Szczurom wycięto tarczyce z przytarczycami (u sprzedawcy, Taconic Farms) na 7 dni przed użyciem do badań. Wszystkie szczury otrzymywały zastępczą dawkę tyroksyny co 3 dni. Po przyjęciu szczurów, zmierzono poziom krążącego zjonizowanego wapnia w pełnej krwi, natychmiast po jej pobraniu za pomocą nakłucia żyły ogona, do probówek zawierających heparynę. Szczury włączano do testu, gdy poziom zjonizowanego Ca (zmierzony przy użyciu aparatu Ciba-Corning model 634 calcium pH analyzer) wynosił < 1,2 mM/litr. Każdego szczura zaopatrzono w założony na stałe żylny i tętniczy cewnik do, odpowiednio, dostarczania materiału testowego i pobierania próbek. Następnie, szczury przetrzymywano na diecie złożonej z karmy bezwapniowej i wody dejonizowanej. Zmierzono podstawowy poziom Ca i każdemu szczurowi podawano albo kontrolną zaróbkę, albo 1-34 peptyd ludzkiego hormonu przytarczyc (hPTH1-34, dawka 1,25 mg/kg/h, wodny roztwór chlorku sodu/0,1% albumina surowicy bydlęcej, Bachem, Ca) albo mieszaninę hPTH1-34 i badanego materiału, za pomocą ciągłego wlewu dożylnego poprzez cewnik żylny, przy użyciu umieszczonej na zewnątrz pompy wtryskowej. Kalcemiczną odpowiedź każdego szczura mierzono w dwugodzinnych przedziałach czasowych w trakcie przeprowadzania wlewu, w ciągu 6-8 godzin.

Testy resorpcji i adhezji ludzkich osteoklastów.

Opracowano i standaryzowano testy dołkowej resorpcji i adhezji przy użyciu normalnych ludzkich osteoklastów pochodzących z tkanki kościogubczaka. Test 1 opracowano dla pomiaru objętości

PL 195 973 B1 dołka kościogubnego metodą laserowej mikroskopii współogniskowej. Test 2 opracowano jako skrining o wyższej przepustowości, w którym fragmenty kolagenu (uwalniane podczas resorpcji) mierzy się konkurencyjną techniką ELISA.

Test1 (z zastosowaniem laserowej mikroskopii współogniskowej).

• Z zapasu przechowywanego w ciekłym azocie pobiera się próbki zawiesin komórek pochodzących z ludzkiego kościogubczaka, szybko ogrzewa w temperaturze 37°C i przemywa 1 raz w podłożu RPMI-1640 przez odwirowanie przy 1000 obr/min, w ciągu 5 minut, w temperaturze 4°C.

• Podłoże odsysa się i zastępuje mysim przeciwciałem anty-HLA-DR, po czym rozcieńcza w stosunku 1:3 w podłożu RPMI-1640. Powstałą zawiesinę inkubuje się w ciągu 30 minut na lodzie i często miesza.

• Komórki przemywa się 2 razy zimnym RPMI-1640, a następnie odwirowuje (1000 obr/min, 5 minut, temperatura 4°C). Komórki przenosi się do jałowej 15 ml probówki wirówkowej. Ilość komórek jednojądrowych oblicza się w ulepszonej komorze Neubauera do liczenia.

• Z butli do przechowywania pobiera się w dostatecznej ilości kulki magnetyczne (5/komórkę jednojądrową) pokryte kozią przeciwmysią IgG (Dynal, Great Neck, NY) i umieszcza w 5 ml świeżego podłoża (które odmywa toksyczny azydek będący środkiem konserwującym). Podłoże usuwa się za pomocą unieruchomienia kulek magnesem i zastępuje świeżym podłożem.

• Kulki miesza się z komórkami i powstałą zawiesinę inkubuje w ciągu 30 minut na lodzie. Zawiesinę często się miesza.

• Komórki pokryte kulkami unieruchamia się magnesem, a pozostałe komórki (frakcja bogata w osteoklasty) dekantuje się do jałowej, 50 ml probówki wirówkowej.

• Do komórek pokrytych kulkami dodaje się świeże podłoże w celu usunięcia jakichkolwiek wychwyconych osteoklastów. Operację wymywania powtarza się 10 razy. Komórki pokryte kulkami odrzuca się.

• Żywotne osteoklasty liczy się w komorze do liczenia, z zastosowaniem dioctanu fluoresceiny do znakowania żywych komórek. Do wprowadzenia próbki do komory używa się jednorazowej pipety Pasteura z tworzywa sztucznego, o dużej średnicy otworu.

• Osteoklasty osadza się za pomocą odwirowania i gęstość nastawia się do odpowiedniej liczby w podłożu EMEM (liczba osteoklastów zmienia się od nowotworu do nowotworu), uzupełnionym 10% cielęcą surowicą płodową i użytym w ilości 1,7 g/litr wodorowęglanem sodu.

• 3 ml próbki zawiesiny komórek (na jeden produkt potraktowania związku) dekantuje się do 15 ml probówek wirówkowych. Komórki osadza się za pomocą odwirowania.

• Do każdej probówki wprowadza się 3 ml odpowiedniego produktu potraktowania związku (rozcieńczonego do 50 ml w podłożu EMEM). Włączone są tu także odpowiednie kontrole w postaci zaróbek, kontrola pozytywna [mysie przeciwciało monoklonalne przeciw receptorowi witronektyny (87MEM1) rozcieńczone do 100 mg/ml) oraz kontrola izotypowa ( IgG2a rozcieńczona do 100 mg/ml). Próbki inkubuje sięw temperaturze 37°C w ciągu 30 minut.

• 0,5ml próbki wysiewa się na jałowe skrawki zębiny na 48-studzienkowej płytce i inkubuje w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin. Każdy rodzaj potraktowania poddaje się skriningowi w czterech powtórzeniach.

• Skrawki przemywa się w sześciu wymianach ciepłym PBS (10 ml/studzienkę w 6-studzienkowej płytce), po czym umieszcza w świeżym podłożu zawierającym produkt potraktowania związku lub próbki kontrolne. Próbki inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 48 godzin.

Metoda z zastosowaniem odpornej na winian fosfatazy kwaśnej (TRAP) (selektywny barwnik dla komórek rodzaju osteoklastów) • Skrawki kości zawierające przyłączone osteoklasty przemywa się roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami i w ciągu 5 minut utrwala w 2% aldehydzie glutarowym (w 0,2 M kakodylanie sodu).

• Następnie, skrawki te przemywa się wodą i inkubuje w ciągu 4 minut w buforze TRAP, w temperaturze 37°C [0,5 mg/ml fosforanu naftolu AS-BI rozpuszczonego w N,N-dimetyloformamidzie i zmieszanego z 0,25 M buforu cytrynianiowego (pH 4,5), zawierającego 10 mM winianu sodu].

• Po przemyciu zimną wodą skrawki zanurza się w zimnym buforze octanowym (0,1 M, pH 6,2) zawierającym 1 mg/ml Fast Red Garnet i inkubuje w temperaturze 4°C w ciągu 4 minut.

• Nadmiar buforu odsysa się i skrawki suszy na powietrzu, z następującym po tym przemyciem w wodzie.

PL 195 973 B1 • TRAP-pozytywne osteoklasty (osad o barwie ceglastoczerwonej/purpurowej) liczy się metodą badania mikroskopowego w jasnym polu, po czym usuwa z powierzchni zębiny za pomocą nadźwiękawiania.

• Objętość dołka oznacza się przy użyciu mikroskopu współogniskowego Nikon/Lasertec ILM21W.

Test 2 (z zastosowaniem odczytu ELISA).

Ludzkie osteoklasty wzbogaca się i przygotowuje do skriningu związku w sposób opisany w 9 wstępnych etapach testu 1. Dla przejrzystości, etapy te powtórzono, jak to podano w poniższej części niniejszego opisu.

W przeciwieństwie do sposobu opisanego powyżej w teście 1, związki poddaje się skriningowi przy stosowaniu 4 dawek, w celu otrzymania wartości IC50 jak to poniżej przedstawiono.

• Preparaty osteoklastów inkubuje się wstępnie w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C z badanym związkiem (4 dawki) lub kontrolami.

• Następnie, komórki wysiewa się na skrawki warstwy korowej kości bydlęcej w studzienkach 48-studzienkowej płytki do hodowli komórek i inkubuje w ciągu dalszych 2 godzin w temperaturze 37°C.

• Skrawki kości przemywa się w sześciu wymianach ciepłym roztworem chlorku sodu buforowanym fosforanami (PBS) w celu usunięcia komórek nie przywartych, po czym zawraca do studzienek 48-studzienkowej płytki zawierających świeży związek lub kontrole.

• Następnie, płytkę z hodowlą tkankową inkubuje się w ciągu 48 godzin w temperaturze 37°C.

• Supernatant z każdej studzienki odsysa się do osobnych probówek i poddaje skriningowi konkurencyjną techniką ELISA, pozwalającą wykryć c-telopeptyd kolagenu typu I, uwolniony podczas procesu resorpcji. Taki test ELISA jest handlowo dostępny (Osteometer, Dania) i zawiera on królicze przeciwciało swoiście reagujące z 8-aminokwasową sekwencją (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) obecną w C-końcowym telopeptydzie łańcucha a1 kolagenu typu I. Otrzymane wyniki wyraża się jako % zahamowania resorpcji w porównaniu z kontrolą w postaci zaróbki.

Test adhezji ludzkich osteoklastów.

PL 195 973 B1 • Z zapasu przechowywanego w ciekłym azocie pobiera się próbki zawiesin komórek pochodzących z ludzkiego kościogubczaka, szybko ogrzewa w temperaturze 37°C i przemywa 1 raz w podłożu RPMI-1640 przez odwirowanie przy 1000 obr/min, w ciągu 5 minut, w temperaturze 4°C.

• Do komórek pokrytych kulkami dodaje się świeże podłoże w celu usunięcia jakichkolwiek wychwyconych osteoklastów.

Operację wymywania powtarza się 10 razy. Komórki pokryte kulkami odrzuca się.

• Osteoklasty pochodzące z kościogubczaka inkubuje się wstępnie ze związkiem (4 dawki) lub kontrolami, w temperaturze 37°C, w ciągu 30 minut.

• Następnie, komórki wysiewa sięna skrawki pokryte osteopontyną (osteopontyna ludzka lub szczurza, 2,5 mg/ml) i inkubuje w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C.

• Komórki nie przywarte usuwa się za pomocą energicznego przemycia skrawków w roztworze chlorku sodu buforowanego fosforanami i komórki pozostałe na skrawkach utrwala się w acetonie.

• Osteoklasty barwi się względem odpornej na winian fosfatazy kwaśnej (TRAP), selektywnego znacznika dla komórek tego fenotypu (patrz etapy 15 - 17), po czym liczy z zastosowaniem mikroskopii optycznej. Otrzymane wyniki wyraża się jako % zahamowania adhezji w porównaniu z kontrolą w postaci zaróbki.

Test adhezji komórek

Komórki i hodowla komórek

Ludzkie embrionalne komórki nerkowe (komórki HEK293) otrzymano z ATCC (nr katalogowy CRL 1573). Komórki hodowano w minimalnym niezbędnym podłożu Earl'a (EMEM), zawierającym sole Earl'a, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny.

Konstrukty i transfekcje

Fragment 3,2 kz EcoRI-KpnI podjednostki av i fragment 2,4 kz XbaI-XhoI podjednostki b3 wstawiono w miejsca klonujące EcoRI-EcoRV wektora pCDN (Aiyar i in., 1994), obejmującego promotor CMV i dobieralny marker G418, metodą ligacji tępym końcem. Dla uzyskania trwałej ekspresji, 80 x 10⁶ komórek HEK 293 poddano elektrotransformacji z konstruktami av + b3 (20 mg DNA każdej podjednostki) przy użyciu urządzenia Gene Pulser (Hensley i in., 1994) i przeniesiono na 100 mm płytki (5x 10⁵komórek/płytkę). Po upływie 48 godzin uzupełniono podłoże wzrostowe 450 mg/ml Geneticin (G418 Sulfate, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Komórki utrzymywano w podłożu selekcyjnym, aż do osiągnięcia przez kolonie rozmiarów wystarczających do poddania ich badaniu.

Analiza immunocytochemiczna komórek transfekowanych.

W celu ustalenia, czy u transfektantów HEK 293 doszło do ekspresji receptora witronektyny, komórki immobilizowano na szkiełkach mikroskopowych za pomocą odwirowania, utrwalano w acetonie w ciągu 2 minut, w temperaturze pokojowej, i wysuszono na powietrzu. Specyficzną reaktywność z 23C6 (monoklonalnym przeciwciałem swoistym względem kompleksu avb 3 wykazano typową pośrednią metodą immunofluorescencyjną.

PL 195 973 B1

Badania nad adhezją komórek.

Płytki ELISA, 96-studzienkowe, Corning, powlekano wstępnie przez noc, w temperaturze 4°C, 0,1 ml ludzkiej witronektyny (0,2 mg/ml w podłożu RPMI). Podczas eksperymentu, płytki przemyto jeden raz podłożem RPMI i blokowano 3,5% BSA w podłożu RPMI w ciągu godziny, w temperaturze pokojowej. Transfekowane komórki 293 zawieszono w podłożu RPMI, uzupełnionym 20 mM Hepes, pH 7,4 i 0,1% BSA przy gęstości 0,5 x 10⁶ komórek/ml. Do każdej studzienki wprowadzono 0,1 ml zawiesiny komórek i płytki inkubowano w ciągu godziny w temperaturze 37°C, ewentualnie w obecności różnych antagonów avb 3. Po inkubacji, dodano 0,025 ml 10% roztworu formaldehydu, pH 7,4, i komórki utrwalano w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut. Następnie, płytki przemyto 3 razy 0,2 ml podłoża RPMI i komórki przywarte barwiono 0,1 ml 0,5% błękitu toluidynowego w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej. Nadmiar barwnika usunięto za pomocą wyczerpującego przemywania wodą dejonizowaną. Błękit toluidynowy włączony do komórek wyeluowano za pomocą dodania 0,1 ml 50% etanolu zawierającego 50 mM HCl. Adhezję komórek skwantyfikowano przy gęstości optycznej 600 nm przy użyciu czytnika płytek do mikromiareczkowania (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).

Test wiązania się z avb5 w fazie stałej.

Receptor witronektyny avb 5 oczyszczono z łożyska ludzkiego. Preparat receptora rozcieńczono 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (bufor A) i od razu wprowadzono na 96-studzienkowe płytki ELISA, po 0,1 ml/studzienkę, po czym dodano 0,1 - 0,2 mg avb3/studzienkę. Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C.W trakcie eksperymentu, studzienki przemyto jeden raz buforem A i inkubowano z 0,1 ml 3,5% albuminy surowicy bydlęcej w tym samym buforze w ciągu godziny, w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, studzienki poddano całkowitemu odessaniu i przemyto 2 razy po 0,2ml buforu A.

W konkurencyjnym teście [³H]-SK&F-107260, do studzienek wprowadzono różne stężenia nie znakowanych antagonów (0,001 -100 mM), po czym dodano 5,0 nM [³H]-SK&F-107260. Płytki inkubowano w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, studzienki poddano całkowitemu odessaniu i przemyto jeden raz 0,2 ml lodowato zimnego buforu A według schematu studzienka-do-studzienki. Receptory solubilizowano przy użyciu 0,1 ml 1% SDS i związany [³H]-SK&F-107260 oznaczano metodą pomiaru w cieczowym liczniku scyntylacyjnym z dodawaniem 3 ml odczynnika Ready Safe, w aparacie Beckman Liquid Scintillation Counter LS6800, z 40% wydajnością. Niespecyficzne wiązanie [³H]-SK&F-107260 oznaczano w obecności 2 mM SK&F-107260 i w sposób konsekwentny wynosiło ono mniej niż 1% całości wprowadzonego radioligandu. Wartość IC50 (stężenie antagonu powodujące 50% zahamowanie wiązania się [³H]-SK&F-107260) oznaczono nieliniową metodą dopasowywania krzywej najmniejszych kwadratów, zmodyfikowaną według programu LUNDON-2. Wartość Ki (stałą dysocjacji antagonu) obliczono według równania:

Ki = IC50/(1 + L/Kd), w którym:

₃

L i Kd oznaczały, odpowiednio, stężenie i stałą dysocjacji [³H]-SK&F-107260.

Hamowanie wiązania GPIIb-IIIa, w którym pośredniczy RGD.

Oczyszczanie GPIIb-IIIa.

Jednostki przestarzałych, przemytych płytek ludzkich (otrzymanych z Czerwonego Krzyża) poddano lizie za pomocą łagodnego mieszania w 3% oktyloglukozydzie, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, przy 4°C, w ciągu 2 godzin. Utworzony lizat wirowano przy 100000 x g w ciągu godziny. Otrzymany tak supernatant wprowadzono do 5 ml kolumny Lentil Lectin Sepharose 4B (E.Y. Labs) wstępnie skalibrowanej 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1% oktyloglukozydu (bufor A). Po upływie 2 godzin inkubacji, kolumnę przemyto 50 ml zimnego buforu A. Zatrzymany na lektynie GPIIb-IIIa wyeluowano buforem A zawierającym 10% D-glukozy. Wszystkie czynności wykonywano w temperaturze 4°C. Otrzymany GPIIb-IIIa miał czystość > 95 %, jak to wykazano metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylosodowym (SDS).

Włączanie GPIIb-IIIa do liposomów.

Mieszaninę 70% fosfatydyloseryny i 30% fosfatydylocholiny (Avanti Polar Lipids) przysuszono do ścian szklanej probówki w strumieniu azotu. Oczyszczony GPIIb-IIIa rozcieńczono do końcowego stężenia wynoszącego 0,5 mg/ml i zmieszano z fosfolipidami we wzajemnym wagowym stosunku ilościowym białko : fosfolipid 1:3. Powstałą mieszaninę zawieszono i poddano nadźwiękawianiu w sonikatorze łaźniowym w ciągu 5 minut. Następnie mieszaninę dializowano przez noc przy użyciu dializatora rurowego z odcięciem przy masie cząsteczkowej 12000 - 14000 wobec 1000-krotnego

PL 195 973 B1 nadmiaru50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (z2wymianami). Liposomy zawierająceGPIIb-IIIawirowanoprzy12000xgw ciągu15minutizawieszonowbuforzedodializyz otrzymaniem końcowego stężenia białka wynoszącego, w przybliżeniu, 1 mg/ml. Liposomy przechowywano wtemperaturze -70°C, ażdo zapotrzebowania.

Konkurencyjne wiązanie z GPIIb-IIIa.

Wiązanie z receptorem fibrynogenu (GPIIb-IIIa) badano pośrednią metodą konkurencyjnego wiązania przy użyciu [³H]-SK&F-107260 jako ligandu typu RGD. Test wiązania przeprowadzono w zestawie z 96-studzienkową płytką filtracyjną (Millipore Corporation, Bedford, MA) przy użyciu 0,22 mm hydrofilowych membran duraporowych. Studzienki wstępniepokryto0,2ml10 mg/mlpolilizyny(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w temperaturze pokojowej, wciągu godziny,wceluzablokowanianiespecyficznego wiązania. Do studzienekwprowadzono, w czterech powtórzeniach, różne stężenianie znakowanych benzoazepin, po czym do każdej studzienki dodano [³H]-SK&F-107260 w końcowym stężeniu 4,5 nM, a następnie po 1 mg liposomów zawierających oczyszczony płytkowy GPIIb-IIIa. Utworzoną tak mieszaninę inkubowano w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. [³H]-SK&F-107260 związany z GPIIb-IIIa oddzielono od materiału niezwiązanego zapomocąsączeniaprzy użyciu urządzenia do filtracji Millipore,znastępującympotymprzemyciem2razypo0,2ml lodowato zimnego buforu. Związaną promieniotwórczość pozostałą na filtrach oznaczano w 1,5 ml odczynnika Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA) w aparacie Beckman Liquid Scintillation Counter (Model LS68000), z40%wydajnością.Niespecyficznewiązanieoznaczanowobecności 2 mMSK&F-107260iwsposób konsekwentnywynosiłoonomniej niż0,14% całości promieniotwórczości dodanej do próbek. Wszystkie wyniki pomiarów są to wartości średnie z czterech oznaczeń.

Dane dotyczące konkurencyjnego wiązania analizowano nieliniową metodą dopasowywania krzywej najmniejszych kwadratów. Metoda ta umożliwia otrzymanie wartości IC50 dla antagonów(stężenieantagonuhamującespecyficznewiązanie [³H]-SK&F-107260 o 50% w stanie równowagi). Wartość IC50 jest związana ze stałą równowagi dysocjacji (Ki) antagonu w oparciu o równanie Chenga i Prusoffa:

Ki = IC50/(1 + L/Kd), wktórym:

₃

L oznacza stężenie [³H]-SK&F-107260 w teście konkurencyjnego wiązania (4,5 nM), oraz

Kd oznacza stałą dysocjacji [³H]-SK&F-107260, wynoszącą 4,5 nM, według oznaczenia przeprowadzonego metodą Scatchard analysis.

Efektywność działania związku o wzorze (I), czy to samego, czy w kombinacji ze środkiem przeciwnowotworowym, można oznaczyć z wykorzystaniem szeregu różnych modeli przeszczepialnych nowotworów mysich. Odnośnie do szczegółów dotyczących tych modeli, patrz: patenty Stanów Zjednoczonych Ame ry ki n r n r 5004758 i 5633016.

Następujące przykłady w żaden sposób nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku, ale służą jedynie objaśnieniu sposobów wytwarzania i zastosowania związku według niniejszego wynalazku. Dla specjalisty w tej dziedzinie wiedzy będą wprost oczywiste liczne inne sposoby wykonania niniejszego wynalazku.

Przykłady

Uwagiogólne ₁

Widma rezonansu magnetycznego protonowego (¹H NMR) rejestrowano przy 300 MHz, a przesunięcia chemiczne notowano wppm(d)poniżejsygnałuwzorcawewnętrznegowpostaci tetrametylosilanu (TMS). Znaczenia skrótów odnoszących się do danych NMR są następujące: s = singlet, d = dublet,t= tryplet,q = kwartet,m =multiplet, dd = dubletdubletów, dt = dublet tripletów, app = pozorny,br=szeroki.Joznacza stałą sprzężenia NMR mierzoną w hercach. CDCl3 oznacza deuterochloroform, DMSO-d6 oznacza sulfotlenek deuterodimetylowy, CD3OD oznacza tetradeuterometanol. Widma masowe otrzymywano z zastosowaniem metody jonizacji elektronowej (ES). Analizę elementarną przeprowadzano według Quantitative Technologies Inc., Whitehouse, NJ. Temperaturę topnieniaoznaczanoprzyużyciuaparatuThomas-Hooverado oznaczaniatemperaturytopnienia, otrzymanych wartości nie korygowano. Wszystkie wartości temperatury podano w stopniach Celsjusza. Do chromatografii cienkowarstwowej używano płytek pokrytych Analtech Silica Gel GF i płytek pokrytych E. Merck Silica Gel 60 F-254. Chromatografię szybką przeprowadzano na żelu krzemionkowym E. Merck Kieselgel 60 (230 - 400mesh). HPLC,takanalitycznąjaki preparatywną, przeprowadzano z zastosowaniem chromatografów Beckmana. ODS oznacza nośnik chromatograficzny w postaci

PL 195 973 B1 _® oktadecylosililowej pochodnej żelu krzemionkowego. Oznaczenie YMC ODS-AQ^® odnosi siędo nośnika chromatograficznego ODS i stanowi znak towarowy firmy YMC Co. Ltd, Kyoto, Japonia. Oznaczenie PRP-1^® odnosi się do polimerycznego nośnika chromatograficznego styren-diwinylobenzen i stanowi znak towarowy firmy Hamilton Co., Reno, Newada. Oznaczenie Celite^® odnosi się do pomocy filtracyjnej złożonej z przemytej kwasem ziemi okrzemkowej i jest to znak towarowy firmy Manville Corp., Denver, Kolorado.

Przykład preparatywny 1

Wytwarzanie 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftarydyn-2-ylo)etan-1-olu.

a) 2-Metylo-8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyna.

Mieszaninę złożoną z 5,13 g (35,58 mmola) 2-metylo-1,8-naftyrydyny [J. Chem. Soc., 315 (1966)], 1,14 g (1,07 mmola) 10% Pd/C i 70 ml bezwodnego EtOH odtleniono za pomocą przepłukaniaH2 w trzech cyklach ewakuacyjnych, po czym energicznie mieszano pod balonem z H2. Po upływie 18,5 godziny mieszaninę przesączono przez warstwę Celite^® i placek na filtrze przemyto kolejno bezwodnym EtOH i EtOAc. Przesącz zatężono do sucha i pozostałość ponownie zatężono z EtOAc, w wyniku czego otrzymano 5,25 g ciała stałego o barwie białawej.

Roztwór złożony z 5,25 g powyższego produktu, 15,53 g (71,16 mmola) diwęglanu di-tert-butylu i 10 ml CH2Cl2 zatężono w wyparce obrotowej w celu usunięcia rozpuszczalnika, po czym oleistą pozostałość ogrzewano w atmosferze azotu w łaźni olejowej o temperaturze ustawionej na 55 - 60°C. Po upływie 45 godzin mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i pozostałość poddano chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym (40% EtOAc/heksany), w wyniku czego otrzymano 4,90 g (55%) związku tytułowego w postaci ciała stałego o barwie jasnożółtej.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7,27 (d, J = 7,6Hz, 1H), 6,81 (d, J = 7,6Hz, 1H), 3,69 - 3,79 (m, 2H), 2,65 - 2,75 (m, 2H), 2,48 (s, 3H), 1,83 - 1,98 (m, 2H), 1,52 (s, 9H); MS (ES) m/e 249 (M + H)⁺.

b) Ester etylowy kwasu [8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftarydyn-2-ylo]octowego.

Do roztworu 7,24 ml (55,3 mmola) diizopropyloaminy w 50 ml suchego THF wkroplono, w temperaturze 0°C, 22 ml (55,3 mmoli) 2,5 M roztworu n-BuLi w heksanach. Po upływie 15 minut, otrzymany tak roztwór wkroplono, w temperaturze -78°C, do roztworu 4,9 g (19,7 mmola) 2-metylo-8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyny i 8,86 ml, 73,0 mmola) w 50 ml suchego THF. Po upływie 30 minut, otrzymaną mieszaninę szybko zadano 100 ml nasyconego NH4Cl, ogrzano do temperatury pokojowej i poddano ekstrakcji 3 razy po 200 ml EtOAc. Połączone ekstrakty organiczne osuszono MgSO4, przesączono i zatężono pod ciśnieniem zredukowanym. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (40% EtOAc/heksany), w wyniku czego otrzymano 5,72 g (91%) związku tytułowego w postaci oleju o barwie jasnożółtej. MS(ES) m/e 321 (M + H)⁺.

c) 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-1,8-naftarydyn-2-ylo)-etan-1-ol.

Do roztworu 5,72 (17,85 mmola) estru etylowego kwasu [8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo]octowego w 80 ml suchego THF wprowadzono 10,7 ml (21,42 mmola) 2,0 M roztworu LiBH4 w THF i utworzoną tak mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną. Po upływie 18 godzin, mieszaninę schłodzono do temperatury 0°C i ostrożnie szybko zadano 100 ml wody. Po upływie 10 minut, mieszaninę poddano ekstrakcji 3 razy po 100 ml EtOAc. Połączone ekstrakty organiczne osuszono siarczanem magnezu, przesączono i zatężono pod ciśnieniem zredukowanym.

W 10 ml CH2Cl2 rozpuszczono 4,9 g otrzymanej tak pozostałości i do powstałego roztworu dodano w jednej porcji, w temperaturze pokojowej, 20 ml 4 N roztworu HCl w dioksanie. Po upływie 4 godzin mieszaninę zatężono pod ciśnieniem zredukowanym. Pozostałość rozpuszczono w 100 ml mieszaniny 1,0 N NaOH i nasyconego roztworu NaCl (1:1), po czym poddano ekstrakcji 3 razy po 100 ml CH2Cl2. Połączone ekstrakty organiczne osuszono siarczanem magnezu, przesączono i zatężono pod ciśnieniem zredukowanym. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym [10% MeOH w EtOAc/CHCl3 (1:1)] w wyniku czego otrzymano 2,09 g (66%) związku tytułowego w postaci ciała stałego o barwie żółtej.

MS (ES) m/e 179 (M + H)⁺.

Przykład p r eparatywny 2

Wytwarzanie estru etylowego kwasu (±)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

a) 6-Metoksy-1-fenyloinden.

680ml 3,0M roztworu bromku metylomagnezowego (2,04 mola) w Et2O rozcieńczono, watmosferze argonu, przy mieszaniu, w temperaturze otoczenia, 700 ml Et2O, po czym wkroplono, w ciągu godziny, roztwór 277 g (1,71 mola) 6-metoksy-1-indanonu w 1400 ml THF. Utworzoną tak

PL 195 973 B1 mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej, po czym wlano, przy mieszaniu, do 2,8 litra nasyconego NH4CH. Następnie, dodano 1,4 l wody i oddzielono warstwę organiczną. Fazę wodną poddano ekstrakcji 2 razy po 1 litrze Et2O i połączone ekstrakty organiczne zatężono, w wyniku czego otrzymano 445 g 6-metoksy-1-fenylo-1-indanonu w postaci oleju o barwie brązowej. Olej ten rozpuszczono w 2,5 litra toluenu i dodano 12,3 g (0,065 mola) monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego. Powstały roztwór mieszano i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w ciągu 16 godzin, z zastosowaniem łapacza Deana-Starka ze skraplaczem. Po upływie 2 godzin zbieranie się wody było już minimalne; łącznie zebrano 28 ml wody. Następnie roztwór schłodzono i poddano ekstrakcji kolejno 1 litrem 5% wodnego roztworu Na2CO3 i 2 razy po 1 litrze wody. Warstwę organiczną zatężono, w wyniku czego otrzymano 400 g produktu o konsystencji oleju o barwie brązowej. Olej ten poddano destylacji próżniowej, w wyniku czego otrzymano 298,2 g związku tytułowego (79%) w postaci oleju o barwie żółtej.

Temperatura wrzenia: 152 - 190°C (2,66 hPa, 2,0 tora).

TLC (10% EtOAc/heksany): Rf 0,75.

b) Kwas 2-benzoilo-4-metoksyfenylooctowy.

4,2 litra acetonu schłodzono do temperatury 10°C, po czym, w ciągu 1,5 godziny, dodano roztwór 271 g (1,22 mola) 6-metoksy-1-fenyloindenu w 1,8 litra acetonu, jednocześnie z 1,8 litra odczynnika Jonesa [wytworzonego z 470 g (4,70 mola) CrO3, 1 litra H2O i 405 ml stężonego H2SO4]. Następnie, do powstałej mieszaniny dodano w dwóch porcjach 153 ml4% wodnego roztworu OsO4, przy czym jedną porcję wprowadzono na początku dodawania, a drugą w połowie dodawania, przy utrzymywaniu temperatury mieszaniny reakcyjnej poniżej 15°C. Po zakończeniu dodawania, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury 22° i mieszano w ciągu 1,5 godziny, w trakcie czego, w wyniku nieznacznej egzotermiczności procesu, temperatura podniosła się do 28°. Następnie, mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury poniżej 20°C i dodano 1 litr izopropanolu, wpierw powoli, wkraplając, a potem szybko, po ustaniu egzotermiczności procesu. W tej fazie procesu mieszanie staje się utrudnione. Podczas dodawania izopropanolu temperatura podniosła się do 32°C. Następnie, dodano 2 litry wody i utworzoną mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza. Dodano jeszcze wodę w celu rozpuszczenia wytrąconego kwasu chromawego, po czym mieszaninę poddano ekstrakcji 2 litrami CH2Cl2. Warstwę organiczną (górną) oddzielono i fazę wodną poddano ekstrakcji 2 razy po 1 litrze CH2Cl2. Połączone ekstrakty CH2Cl2 przemyto kolejno 2 litrami wody i 2 litrami nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu, po czym zatężono, w wyniku czego otrzymano 416 g wilgotnego ciała stałego o barwie szarej. Otrzymany produkt ucierano z mieszaniną acetonu i EtOAc. Po sączeniu i wysuszeniu otrzymano 225,4 g (71%) związku tytułowego w postaci ciała stałego o barwie białawej.

Temperatura topnienia: 158 - 159°C.

c) Kwas 2-benzylo-4-metoksyfenylooctowy.

Podzielono na dwie równe porcje 215,5 g (0,80 mola) kwasu 2-benzoilo-4-metoksyfenylooctowego i każdą z nich rozpuszczono w 1,5 litra kwasu octowego lodowatego w 2,5-litrowej butli ciśnieniowej. Następnie do każdej butli wprowadzono po 10 g (0,0048 mola) 5% Pd/C i obie tak utworzone mieszaniny wytrząsano w temperaturze otoczenia, w atmosferze wodoru, w aparacie Parra. Po upływie 2,5 godziny, mieszaniny te przesączono w celu usunięcia katalizatora i placki na filtrach przemyto EtOAc. Oba przesącze połączono i zatężono, w wyniku czego otrzymano 215 g (wydajność ilościowa) związku tytułowego, w postaci ciężkiego oleju o barwie żółtej, który skrystalizował po odstawieniu. ¹HNMR (250 MHz, CDCl3) d7,05 -7,35 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,7Hz, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (s, 2H).

d) 10,11-Dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on.

Roztwór 215 g surowego [zawierającego 204,6 g (0,80 mola) czystej substancji] kwasu 2-benzylo-4-metoksyfenylooctowego w 1 litrze CH2Cl2 mieszano w atmosferze argonu w temperaturze pokojowej, po czym dodano 1 ml DMF, a następnie 400 ml (4,59 mola) chlorku oksalilu. Chlorek oksalilu dodawano w ciągu godziny, początkowo wkraplając w celu opanowywania energicznego wywiązywania się gazu. Utworzony tak roztwór mieszano w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej, po czym zatężono, w wyniku czego otrzymano 207,7 g (0,756 mola, 95 %) surowego chlorku kwasowego w postaci płynu o barwie żółtej. Otrzymany płyn rozpuszczono w CH2Cl2 do łącznej objętości 500 ml, po czym powstały tak roztwór i 100,8 g (0,756 mola) AlCl3 dodano równocześnie, w ciągu godziny, przy mieszaniu, w atmosferze argonu i w temperaturze otoczenia, do 3,7 litra CH2Cl2. Pod koniec dodawania temperatura mieszaniny reakcyjnej wynosiła 28°C. Następnie, mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 16 godzin w temperaturze otoczenia i w tym czasie wytrąciła się stała substancja. Dodano

PL 195 973 B1 litr wody, wpierw wkraplając, w ciągu 30 minut. Następnie mieszaninę rozdzielono i fazę organiczną przemyto kolejno 1 litrem wody i 1 litrem 5% wodnego roztworu NaHCO3. Następnie, roztwór w CH2Cl2 zatężono, w wyniku czego otrzymano 175,3 g ciała stałego o barwie żółtej. Po rekrystalizacji z mieszaniny EtOAc/heksan otrzymano 128 g (71%) związku tytułowego.

Temperatura topnienia: 107 - 109°C.

e) Ester etylowy kwasu (±)-10,11-dihydro-10-hydroksy-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-octowego.

Do 4,0 litra THF wkroplono w ciągu 20 minut, w atmosferze argonu, w temperaturze -70°C, 1282ml1,0M roztworu bis(trimetylosililo)amidku litu (1,282 mola). Utworzoną tak mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 15 minut, po czym w ciągu 20 minut dodano 387 ml (2,5 mola) N,N,N',N'-tetrametylenodiaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 10 minut, po czym wkroplono, w ciągu 40 minut, roztwór 119,2 g (0,50 mola) 10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-onu w 1,26 litra bezwodnego THF. Podczas tych wszystkich dodawań utrzymywano temperaturę poniżej -65°C. Następnie, mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 20 minut w temperaturze mieszczącej się w zakresie od -65 do -70°C, po czym wlano, przy energicznym mieszaniu, do 6,2 litra nasyconego wodnego roztworu NH4Cl. Warstwę organiczną oddzielono i fazę wodną poddano ekstrakcji 2 razy po 1 litrze EtOAc. Połączone ekstrakty organiczne przemyto 2 razy po 1 litrze wody, a potem zatężono, w wyniku czego otrzymano 175 g produktu o konsystencji oleju, o barwie brązowej. Chromatografia cienkowarstwowa (20% EtOAc/heksany) wykazała: Rf 0,5 główny (produkt pożądany) i Rf 0,7 podrzędny (odzyskany keton). Produkt surowy poddano chromatografii na 2 kg żelu krzemionkowego (10% EtOAc/heksany), w wyniku czego otrzymano 101 g (61%) związku tytułowego w postaci oleju o barwie żółtej.

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,63 (d, J = 7,7Hz, 1H), 7,00 -7,30 (m, 4H), 6,80 (d, J = 2,6Hz, 1H), 6,69 (dd, J = 8,2, 2,6Hz, 1H), 3,95 - 4,35 (m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 1H), 3,64 (d, J = 14,2Hz, 1H), 3,35 (d, J = 14,2Hz, 1H), 2,79 (d, J = 16,0Hz, 1H), 2,66 (d, J = 16,0Hz, 1H), 1,22 (t, J = 7,2Hz, 3H).

f) Ester etylowy kwasu (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

W 1,8 litra kwasu octowego lodowatego rozpuszczono 101 g (0,31 mola) estru etylowego kwasu (±)-10,11-dihydro-10-hydroksy-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego, po czym dodano 28,5 ml (0,34 mola) 12 N HCl. Utworzoną mieszaninę umieszczono w 2,5-litrowej butli ciśnieniowej zawierającej 20g (0,0094 mola) 5% Pd/C i otrzymaną mieszaninę wytrząsano w temperaturze 35°C, w atmosferze wodoru, w aparacie Parra do uwodorniania, wyposażonego w płaszcz grzejny. Po upływie 18 godzin, mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury otoczenia i usunięto katalizator przez odsączenie. Przesącz zatężono, w wyniku czego otrzymano 85,1 g produktu o konsystencji oleju, o barwie jasnożółtej. Olej ten poddano chromatografii na 2 kg żelu krzemionkowego (gradient skokowy, 5% do 10% EtOAc/heksany), w wyniku czego otrzymano 69,1 g (72%) związku tytułowego w postaci oleju. ¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,05 - 7,22 (m, 4H), 7,01 (d, J = 8,2Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,7Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,7Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,0Hz, 1H), 4,11 - 4,25 (m, 2H), 3,85 (d, J = 15,0Hz, 1H), 3,70 - 3,90 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,31 (dd, J = 15,0, 4,1Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 5,0 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,3Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1Hz, 3H).

g) Ester etylowy kwasu (±)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

Roztwór 8,5 g (0,027 mola) estru etylowego kwasu (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]-cyklohepteno-10-octowego w 150 ml CH2Cl2 oziębiono do temperatury -10°C, przy mieszaniu, w atmosferze argonu. Następnie dodano 10,7 ml (0,144 mola) etanotiolu, a po tym, w dwóch porcjach, w ciągu 15 minut, 20,6 g (0,154 mola) AlCl3. Po dodaniu, w wyniku egzotermiczności procesu temperatura podniosła się do 0°C, a następnie temperaturę podwyższono do 25°C za pomocą ogrzewania mieszaniny reakcyjnej w łaźni wodnej. Następnie, mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze mieszczącej się w zakresie od 25 do 30°C w ciągu 2,25 godziny, po czym wlano do wody z lodem. Warstwę organiczną oddzielono, dodano 100 ml metanolu i mieszaninę poddano ekstrakcji 2 razy po 50 ml CH2Cl2. Połączone ekstrakty przemyto 250 ml wody, a następnie zatężono, w wyniku czego otrzymano 8,6 g lepkiego oleju. Olej ten rozpuszczono w 150 ml Et2O, po czym eter usunięto przez odparowanie z zastąpieniem go heksanem. Pożądany fenol wydzielił się wpierw w postaci oleju, a następnie wykrystalizował, przy mieszaniu w temperaturze otoczenia. Zebrano dwa rzuty substancji stałej, otrzymując w wyniku 7,1 g (89%) związku tytułowego.

Temperatura topnienia : 110 - 112°C.

PL 195 973 B1

Przykład preparatywny 3

Rozdzielenie metodą HPLC enancjomerów estru etylowego kwasu (±)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]-cyklohepteno-10-octowego

a) Ester etylowy kwasu R-(+)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego i ester etylowy kwasu (S)-(-)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

Ester etylowy kwasu (±)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego rozdzielono na jego enancjomery w następujących warunkach: kolumna Daicel Chiracel OJ^® (21,2 x 250 mm), faza ruchoma: 20% etanol w heksanie, szybkość przepływu 15 ml/min, detekcja UV przy 254 nm, wtrysk: 140 mg; tR dla estru etylowego kwasu (S)-(-)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklo-hekseno-10-octowego = 10,4 min; tR dla estru etylowego kwasu (R)-(+)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohekseno-10-octowego = 13,1 min.

Przykład preparatywny 4

Wytwarzanie 10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-onu a) Kwas 2-benzylo-4-metoksyfenylooctowy

Do roztworu 13,0 g (0,048 mola) kwasu 2-benzoilo-4-metoksyfenylooctowego wytworzonego sposobem opisanym w J. Med. Chem., 24, 998 (1981) w 600 ml kwasu octowego lodowatego wprowadzono, w atmosferze argonu, 4,3 g 10% Pd/C i przeprowadzono uwodornianie pod ciśnieniem 345 kPa (50 psi) w ciągu 17 godzin. Powstałą mieszaninę przesączono przez warstwę Celite^®i przesącz zatężono, po czym ponownie zatężono z mieszaniny toluenu i chlorku metylenu, w wyniku czego otrzymano 14,2 g związku tytułowego.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 3,52 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 6,7 (m, 2H), 7,15 (m, 6H).

b) 10,11-Dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Roztwór 14,2g (0,055 mola) kwasu 2-benzylo-4-metoksyfenylooctowego w 120 ml benzenu i 28 ml chlorku tionylu ogrzewano w ciągu godziny, po czym zatężono. Chlorek kwasowy rozpuszczono w 40 ml chlorku metylenu i otrzymany roztwór wkroplono, w atmosferze argonu, do roztworu 14,7 g (0,11 mola) AlCl3 w 600 ml chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze argonu w ciągu 2,5 h w temperaturze pokojowej, po czym szybko zadano 200 ml wody z lodem. Warstwy rozdzielono i fazę organiczną przemyto kolejno 10% roztworem NaOH, wodą i rozcieńczonym HCl. Otrzymany roztwór rozcieńczono 200 ml eteru, osuszono MgSO4 i zatężono. Stałą pozostałość ucierano z mieszaniną eteru i heksanu (1:1) i za pomocą odsączenia zebrano 9,35 g związku tytułowego. Temperatura topnienia: 105 - 106°C.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 3,72 (s, 3H), 4,1 (s, 2H), 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, 1H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (m, 4H), 8,1 (d, 1H).

Przykład preparatywny 5

Wytwarzanie estru etylowego kwasu (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

a) Ester etylowy kwasu (±)-3-(3-metoksyfenylo)indenooctowego.

Do zimnego roztworu 4 g (18 mmoli) 3-(3-metoksyfenylo)indenu, wytworzonego sposobem opisanym w J. Med. Chem., 24, 998 (1981), w 15ml THF, wkroplono, w temperaturze 0°C, w ciągu 5 minut, 20 ml 1 M roztworu LiN(TMS)2 w THF. Powstały roztwór wkroplono, w temperaturze -78°C, w ciągu 30 minut, do roztworu 3,34 g (20 mmoli) bromooctanu etylu w 15 ml THF. Po upływie 2,5 godziny, mieszaninę szybko zadano nasyconym roztworem chlorku amonu, po czym rozdzielono warstwy. Warstwę organiczną osuszono siarczanem magnezu i zatężono, w wyniku czego otrzymano produkt surowy, który poddano oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej (SiO2/2 - 4% EtOAc/heksan), w wyniku czego otrzymano 1,1 g związku tytułowego.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 1,30 (t, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 6,6 (s, 1H), 6,9 (m, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 6H).

b) Ester etylowy kwasu (±)-3-[(3-metoksybenzoilo)]fenylobursztynowego.

Roztwór 1,1 g (3,6 mmola) estru etylowego kwasu (±)-3-(3-metoksyfenylo)indenooctowego w 30ml acetonu zadano 0,5 ml 4% wodnego roztworu tlenku osmu(VIII), po czym wkroplono 5 ml 1,2 M roztworu odczynnika Jonesa (6 mmoli), zgodnie ze sposobem postępowania podanym w piśmiennictwie [J. Org. Chem., 58, 4745 (1993)]. Po mieszaniu przez noc w temperaturze pokojowej, do ciemno zabarwionej mieszaniny reakcyjnej szybko dodano 2,5 ml izopropanolu, a potem 0,9 g wodorosiarczanu(IV) sodu i 30 ml wody. Utworzony produkt wyekstrahowano octanem etylu, przemyto wodnym roztworem chlorku sodowego, osuszono siarczanem magnezu i zatężono, w wyniku czego otrzymano

PL 195 973 B1 stałą pozostałość. Produkt ten ucierano z mieszaniną eteru i heksanu (1:1), w wyniku czego otrzymano 0,76 g związku tytułowego.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 1,18 (t, 3H), 2,90 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m, 6H).

c) Ester etylowy kwasu (±)-3-[(3-metoksybenzylo)fenylobursztynowego.

Mieszaninę 0,76 g (2,1 mmola) estru etylowego kwasu (±)-3-[(3-metoksybenzoilo)fenylobursztynowego i 0,6 g 10% Pd/C w 35 ml kwasu octowego lodowatego poddawano uwodornieniu pod ciśnieniem 345 kPa (50 psi) w ciągu 17 godzin. Następnie, mieszaninę przesączono przy użyciu Celite^® i placek na filtrze przemyto kwasem octowym. Przesącz zatężono i ponownie zatężono z mieszaniny toluenu i chlorku metylenu, w wyniku czego otrzymano 0,64 g związku tytułowego.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 1,20 (t, 3H), 2,20 (m, 1H), 3,0 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H), 6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).

d) Ester etylowy kwasu (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-11-okso-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

Do magnetycznie mieszanego roztworu 0,65 g (1,19 mmola) estru etylowego kwasu (±)-3-[(3-metoksybenzylo)]fenylobursztynowego w 10 ml suchego chlorku metylenu wprowadzono 0,2 ml DMF i 0,2 ml (2,28 mmola) chlorku oksalilu. Po upływie 1,5 godziny, roztwór wkroplono do zawiesiny 0,6 g (4,5 mmola) chlorku glinu w 15 ml suchego chlorku metylenu. Po upływie 2 godzin, powstałą mieszaninę szybko zadano wodą z lodem, warstwy rozdzielono i warstwę wodną poddano ekstrakcji chlorkiem metylenu. Połączone warstwy organiczne osuszono siarczanem magnezu i zatężono. Pozostałość poddano oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej (SiO2/2 - 4% EtOAc/heksan), w wyniku czego otrzymano 0,3 g związku tytułowego.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 1,28 (t, 3H), 2,88 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,88 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,85 (d, 1H), 4,95 (m, 1H), 5,8 (m, 2H), 7,22 (m, 4H), 8,1 (s, 1H).

e) Ester etylowy kwasu (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

Mieszaninę 0,3 g (0,93 mmola) estru etylowego kwasu (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-11-okso-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego i 0,3 g 10% Pd/C w 25 ml kwasu octowego lodowatego poddawano uwodornianiu pod ciśnieniem 345 kPa (50 psi) w ciągu 18 godzin. Następnie mieszaninę przesączono przez warstwę Celite^® i przemyto kwasem octowym. Przesącz zatężono i ponownie zatężono z mieszaniny toluenu i chlorku metylenu, w wyniku czego otrzymano 0,25 g związku tytułowego. ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 1,28 (t, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,85 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,30 (d, 1H), 6,70 (m, 2H), 7,0 (d, 1H), 7,22 (m, 4H).

Następujący przykład objaśnia sposób wytwarzania związku biologicznie aktywnego według wynalazku ze związków pośrednich takich, jakie opisano w poprzednich przykładach wytwarzania.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie kwasu (S)-10,11-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etoksy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

a) Ester etylowy kwasu (S)-10,11-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etoksy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

Do roztworu 200 mg (0,67 mmola) estru etylowego kwasu (S)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego, 241 mg (1,35 mmola) 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftarydyn-2-ylo)-1-etanolu i 354 mg (1,35 mmola) PPh3 w 5 ml suchego THF wprowadzono, w temperaturze 0°C, 0,27 ml (1,35 mmola) azodikarboksylanu diizopropylu. Utworzonej tak mieszaninie pozwolono ogrzać się do temperatury pokojowej, w łaźni. Po upływie 18 godzin, mieszaninę zatężono pod ciśnieniem zredukowanym. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (heksany/Et2O 1:4,5), w wyniku czego otrzymano 94 mg (31%) związku tytułowego w postaci przezroczystego oleju.

MS (ES) m/e 457 (M+ H)⁺.

b) Kwas (S)-10,11-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etoksy]-5H-dibenzo[a,d]-cyklohepteno-10-octowy.

Do roztworu 131 mg (0,29 mmola) estru etylowego kwasu (S)-10,11-dihydro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etoksy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego w 2 ml mieszaniny THF/H2O wprowadzono 0,43 ml 1,0 N roztworu LiOH (0,43 mmola), po czym powstałą mieszaninę ogrzano do temperatury 50°C. Po upływie 18 godzin, mieszaninę schłodzono do temperatury pokojowej i przemyto 2 razy po 2 ml Et2O. Warstwę wodną zakwaszono do pH 6 przy użyciu 10% HCl. Powstały mleczny roztwór przepuszczono przez kolumnę typu C-18 bond-eluate (elucja gradientoPL 195 973 B1 wa: H2O, następnie 20% CH3CN/H2O, następnie CHCl3 jako eluent). Frakcje zawierające produkt zatężono pod ciśnieniem zredukowanym, w wyniku czego otrzymano 30 mg (24%) związku tytułowego w postaci proszku o barwie białej.

MS(ES) m/e 429 (M + H)⁺.

Analiza elementarna

Obliczono dla C27H28N2O3.0,95 HCl: C 70,02; H 6,30; N 6,05;

Znaleziono: C 70,01; H 6,33; N 5,71.

Przykład 2

Pozajelitowa kompozycja w postaci dawki jednostkowej

Preparat, zawierający 20 mg związku z przykładu 1, w postaci jałowego proszku, wytwarza się w sposób następujący.

mg związku rozpuszcza się w 15 ml wody destylowanej. Utworzony roztwór przesącza się w warunkach jałowych do 25 ml wielodawkowej ampułki i liofilizuje. Do wstrzyknięć dożylnych lub domięśniowych, z proszku odtwarza się pierwotną postać za pomocą dodania 20 ml 5% roztworu D-glukozy w wodzie (D5W). Tak więc, dawkowanie określone jest przez wstrzykiwaną objętość. Dalsze rozcieńczenie można uzyskać przez dodanie odmierzonej objętości takiej dawki jednostkowej do innej objętości D5W do wstrzykiwań, albo też odmierzoną dawkę można dodać do innego urządzenia przeznaczonego do dozowania leku, takiego jak butla lub worek do dożylnego wlewu kroplowego albo innego systemu wstrzykiwanie-wlew.

Przykład 3

Doustna kompozycja w postaci dawki jednostkowej

Kapsułkę przeznaczoną do podawania drogą doustną wytwarza się za pomocą zmieszania i zmielenia 50 mg związku z przykładu 1 z 75 mg laktozy i 5 mg stearynianu magnezu, przesiania otrzymanego tak proszku i napełnienia kapsułki żelatynowej twardej.

Przykład 4

Doustna kompozycja w postaci dawki jednostkowej

Tabletkę przeznaczoną do podawania drogą doustną wytwarza się za pomocą zmieszania i zgranulowania 20 mg sacharozy, 150 mg dihydratu siarczanu wapnia i 50 mg związku z przykładu 1 z 10% roztworem żelatyny. Wilgotne granulki przesiewa się, suszy, miesza z 10 mg skrobi, 5 mg talku i3 mg kwasu stearynowego, po czym prasuje w tabletkę.

Powyższy opis w pełni ujawnia sposób realizacji i zastosowania niniejszego wynalazku. Jednakże, wynalazek niniejszy nie jest ograniczony do konkretnych wykonań opisanych w powyższej części niniejszego opisu, ale obejmuje wszystkie jego modyfikacje objęte zakresem następujących zastrzeżeń patentowych. Poszczególne odniesienia się do czasopism, patentów i innych publikacji przytoczone w niniejszym opisie obejmują dotychczasowy stan techniki i są w całości włączone do niniejszego opisu jako odnośniki.

Claims

1. Substancja antagonistyczna względem receptora witronektyny, związek o wzorze (I):

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i substancję aktywną, znamienna tym, że zawiera jako substancję aktywną związek określony w zastrz. 1.

3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że dodatkowo zawiera środek przeciwnowotworowy.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako środek przeciwnowotworowy zawiera topotekan.

PL 195 973 B1

5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako środek przeciwnowotworowy zawiera cysplatynę.

6. Ester substancji antagonistycznej względem receptora witronektyny, związek o wzorze (II):

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

7. Sposób wytwarzania związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że związek o wzorze (III):

poddaje się reakcji z 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etan-1-olem, w której pośredniczy kompleks utworzony przez azodikarboksylan diizopropylu i trifenylofosfinę, z następującą po tym hydrolizą estru przy użyciu uwodnionej zasady.

8. Substancja antagonistyczna względem witronektyny, związek o wzorze (I) określony w zastrz. 1 przeznaczony do stosowania jako lek.

9. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia chorób, w przypadku których wskazany jest antagonizm względem receptora avb3.

10. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia chorób, w przypadku których wskazany jest antagonizm względem receptora avb5.

11. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia osteoporozy.

12. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do hamowania rozwoju naczyń.

13. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do hamowania wzrostu nowotworu lub przerzutów nowotworu.

14. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia miażdżycy tętnic lub nawrotu zwężenia.

15. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stanu zapalnego.

16. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 oraz środka przeciwnowotworowego, do wytwarzania leku przeznaczonego do hamowania wzrostu nowotworu, przez użycie ich w kombinacji fizycznej lub za pomocą podawania kolejno.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że środkiem przeciwnowotworowym jest topotekan.

18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że środkiem przeciwnowotworowym jest cysplatyna.

19. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 oraz inhibitora resorpcji kości, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia osteoporozy, przez użycie ich w kombinacji fizycznej lub za pomocą podawania kolejno.