KR20010080669A

KR20010080669A - 비트로넥틴 수용체 길항제

Info

Publication number: KR20010080669A
Application number: KR1020017006937A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 에이치 밀러; 피터 제이 만레이
Original assignee: 스튜어트 알. 수터, 스티븐 베네티아너, 피터 존 기딩스; 스미스클라인 비참 코포레이션
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2001-08-22
Also published as: CA2353415A1; IL143390A; US6495560B1; CZ20011963A3; EG24025A; IL143390A0; HK1042037B; ES2229798T3; NO20012732L; PL348702A1; ID28811A; UA71586C2; SK7452001A3; AR035006A1; KR100620485B1; TW482673B; BR9915879A; EP1146874A1; EP1146874A4; BG65118B1

Abstract

화학식 (I)의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염이 비트로넥틴 수용체 길항제이며, 골다공증의 치료에 유용하다는 것이 개시되어 있다.

<화학식 I>

Description

비트로넥틴 수용체 길항제 {Vitronectin Receptor Antagonist}

인테그린은 다양한 세포상에서 발현하는 막통과성 당단백질인 세포 부착 수용체의 상과이다. 이 세포 표면 부착 수용체는 gpIIb/IIIa(피브리노겐 수용체) 및 α_vβ₃(비트로넥틴 수용체)를 포함한다. 피브리노겐 수용체인 gpIIb/IIIa는 혈소판 표면에서 발현하며, 출혈이 있는 상처 부위에서 혈소판 응집 및 지혈성 혈전 형성을 매개한다 [Philips et al., Blood., 1988, 71, 831]. 비트로넥틴 수용체인 α_vβ₃은 내피, 평활근, 용골세포 (osteoclast) 및 종양 세포를 포함하는 많은 세포에서 발현하며, 따라서 다양한 기능을 가진다. 용골세포의 막에서 발현된 α_vβ₃수용체는 골흡수 과정의 주요 단계인 용골세포의 골기질로의 부착을 매개한다(로스(Ross) 등, J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703). 과다한 골흡수가 특징인 질병이 골다공증이다. 인간 동맥 평활근 세포에 발현된 α_vβ₃수용체는 이세포들의 신생내막으로의 이동을 매개하며, 이 과정은 경피 관상동맥 확장술 이후 재협착을 유도할 수 있다 [Brown et al., Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815]. 또한 [Brooks et al., Cell, 1994, 79, 1157]은 α_vβ₃길항제가 혈관유래성 혈관 세포소멸 유도로 종양 퇴행을 촉진시킬 수 있음을 보여준다. 따라서 비트로넥틴 수용체를 차단하는 물질은 골다공증, 재협착증 및 암과 같은 질병의 치료에 유용할 것이다.

비트로넥틴 수용체는 현재 α_vβ₁, α_vβ₃및 α_vβ₅로 지칭되는 3가지의 상이한 인테그린으로 알려져 있다 [Horton et al., Int. J. Exp. Pathol., 1990. 71, 741]. α_vβ₁은 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 결합한다. α_vβ₃은 피브린, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴, 본 빌레브랜드 인자, 오스테오폰틴 및 골 시알로단백질 I을 포함하는 매우 다양한 리간드와 결합한다. α_vβ₅는 비트로넥틴과 결합한다. 비트로넥틴 수용체 α_vβ₅는 미세혈관 내피세포를 포함하는 다양한 세포 유형의 세포 부착에 포함되는 것으로 보여지며 [Davis et al., J. Cell. Biol., 1993, 51, 206], 혈관 형성에 대한 역할이 확인되었다 [Brooks et al., Science, 1994, 264, 569]. 이 인테그린은 인간의 상처 육아 조직의 혈관에 발현하며, 정상 피부에는 발현하지 않는다.

비트로넥틴 수용체는 트리펩타이드 Arg-Gly-Asp(또는 RGD) 모티브를 함유하는 골기질 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있어서, 문헌 [Horton et al., Exp.Cell Res. 1991, 195, 368]은 RGD 함유 펩타이드 및 항 비트로넥틴 수용체 항체 (23C6)가 용골세포에 의한 골질 흡수 및 세포 분산을 억제한다고 개시하고 있다. 또한 문헌 [Sato et al., J. Cell Biol, 1990, 111, 1713]은 RGD 서열을 함유하는 뱀독 펩타이드인 에키스타틴이 조직 배양에서 강력한 골흡수 억제제이며, 뼈로의 용골세포의 부착을 억제한다고 개시하고 있다.

특정 화합물이 α_vβ₃및 α_vβ₅수용체의 강력한 억제제라는 것을 드디어 발견하였으며, 특히 이러한 화합물은 피브리노겐 수용체보다 비트로넥틴 수용체에 더 강력한 억제제임을 드디어 발견하였다.

<발명의 요약>

본 발명은 비트로넥틴 수용체의 억제에 대한 약리적 활성을 지니며 염증, 암 및 아테롬성 동맥경화증 및 재협착증과 같은 심혈관계 질환 및 골다공증과 같은 골흡수가 한 인자인 질병에 유용한 하기에 기술하는 화학식(I)의 화합물을 포함한다.

본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물 및 제약상의 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 비트로넥틴 수용체로 매개되는 질병의 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 화합물은 아테롬성 동맥경화증, 재협착증, 염증, 암 및 골다공증과 같은 골흡수가 한 인자인 질병의 치료에 유용하다.

본 발명은 비트로넥틴 수용체를 억제하고 염증, 암 및 아테롬성 동맥경화증 및 재협착증과 같은 심혈관계 질환, 및 골다공증과 같은 골흡수가 한 인자인 질병에 유용한 제약상 활성 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 피브리노겐 수용체보다 비트로넥틴 수용체에 보다 강력한 억제제인 신규한 화합물을 포함한다. 신규한 화합물은 질소 함유 치환기가 디벤조시클로헵텐의 방향족 6원 고리 중 하나 위에 존재하고, 산성 잔기를 함유하는 지방족 치환기가 디벤조시클로헵텐의 7원 고리 위에 존재하는 디벤조시클로헵텐 코어를 포함한다. 디벤조시클로헵텐 고리계는 6원 및 7원 고리 상의 치환기 측쇄가 비트로넥틴 수용체와 우호적으로 상호반응할 수 있도록 배향되어 있는 것으로 생각된다. 최단 분자내 경로를 경유하여 약 12 내지 14 개의 개입된 공유 결합이 디벤조시클로헵텐의 7원 고리의 지방족 치환기 상의 산성기와 디벤조시클로헵텐의 방향족 6원 고리 중 하나 위의 질소 함유 치환기의 질소 사이에 존재하는 것이 바람직하다.

본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함한다.

화학식 (I)의 화합물은 비트로넥틴 및 다른 RGD 함유 펩타이드의 비트로넥틴 수용체로의 결합을 억제한다. 용골세포상의 비트로넥틴 수용체 억제는 용골세포의 골흡수를 억제하며 골다공증 및 골관절염과 같은 그 병리가 골흡수와 관련된 질병의 치료에 유용하다.

본 발명의 또다른 면은 오스테오칼신의 분비 증가를 야기하는 화학식 (I)의 화합물의 투여를 포함하는 뼈의 형성 촉진 방법에 관한 것이다. 뼈 생성 증가는골절 치료 및 골절 예방과 같은 미네랄화된 뼈중량의 부족이 있거나 또는 뼈의 개조가 요구되는 질병 상태에 명백하게 이롭다. 뼈 구조의 감소를 야기하는 질병 및 대사성 질환도 또한 이러한 치료법으로 이로울 수 있다. 예를 들어, 부갑상선 기능항진증, 파겟병(Paget's disease), 악성 고칼슘혈증, 뼈의 대사로 인한 용골성 병변, 운동불능 또는 성호르몬 결핍으로 인한 뼈의 손실, 베체병(Behcet's disease), 골연화증, 과다골화증 및 골화석증은 본 발명의 화합물 투여가 이로울 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 많은 상이한 유형의 세포에서 비트로넥틴 수용체를 억제하기 때문에, 류마티스성 관절염 및 건선과 같은 염증성 질환, 아테롬성 동맥경화증 및 재협착증과 같은 심혈관계 질병의 치료에 유용할 것이다. 본 발명의 화학식 (I)의 화합물은 혈전색전성 질환, 천식, 알러지, 성인 호흡 곤란 증후군, 숙주의 이식거부반응, 기관 이식 거부증, 패혈성 쇼크, 습진, 접촉성 피부염, 염증성 장질병 및 기타 자가면역질병을 포함하는 다른 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있으나 이들 질병에 국한되지는 않는다. 본 발명의 화합물은 또한 상처 치료에 유용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 혈관생성성 질환의 치료(예방을 포함함)에 유용하다. 본원에서 사용되는 혈관생성성 질환이란 용어는 비정상적 신혈관 생성을 수반하는 증상을 포함한다. 새 혈관의 성장이 질병과 관련된 병리를 야기하거나 그 병리에 기여하는 경우, 혈관 생성의 억제는 질병의 해로운 효과를 감소시킬 것이다. 이러한 질병 대상의 예가 당뇨성 망막장애이다. 해로운 조직의 성장을 보조하기위해 새로운 혈관의 성장이 필요한 경우, 혈관 생성의 억제는 조직으로의 혈액 공급을 감소시켜 혈액 공급 요구에 기초한 조직 중량의 감소에 기여할 것이다. 그 예로는 종양의 성장에, 그리고 고형 종양 전이에 신혈관 생성을 지속적으로 요구하는 종양의 성장이 포함된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 종양 조직의 혈관 생성을 억제하여 종양의 전이 및 종양의 성장을 예방한다.

따라서, 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 화합물을 사용하는 혈관 생성의 억제는 질병의 증후를 개선할 수 있고, 일부 경우 질병을 치료할 수도 있다.

본 발명의 화합물의 또다른 치료 대상은 신혈관 생성을 특징으로 하는 안 질병이다. 이러한 안 질병은 각막 이식, 포진성 각막염, 매독성 각막염, 콘택트 렌즈의 사용과 관련된 표피과막(pterygium) 및 신혈관 생성 섬유화 염증(pannus)과 같은 각막 신혈관 생성 질환을 포함한다. 또다른 안 질병은 또한 노화성 반점 퇴행, 추정 안 히스토플라스마증, 미숙성 및 신혈관성 녹내장의 망막 장애를 포함한다.

또한 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 및 토포테칸 및 시스플라틴과 같은 항종양제를 차례로 또는 물리적인 조합으로 투여하는 것을 포함하는 종양 성장 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 신규한 화합물은 (S)-10,11-디히드로-3-[2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산 또는 그의 제약상 허용가능한 염이다.

본 발명에 따라서, (S) 배열의 화학식 (I) 화합물이 바람직하다.

또한 본 발명은 본 발명의 화학물의 프로드러그를 포함한다. 프로드러그는 생체 내에서 화학식 (I)의 활성 모 약물을 방출하는 어떠한 공유결합된 담체라도 가능하다. 따라서 본 발명의 또다른 면은 화학식 (I)의 화합물의 제조에 있어서 또한 중간체인 하기 화학식 (II)의 신규한 프로드러그 또는 제약상 허용가능한 그의 염이다.

본 명세서에서는 본 발명의 화합물을 기술하기 위해 펩타이드 및 화학 업계에서 흔히 사용되는 약어 및 기호를 사용한다. 일반적으로, 아미노산의 약어는 문헌 [Eur. J. Biochem., 158, 9(1984)]에 기술된 대로 아이유팩 아이유비 조인트 커미션 온 바이오케미칼 노먼클레이처(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature)를 따른다.

본 명세서에 사용된 C_1-6알킬은 임의로 치환된 탄소 원자수 1 내지 6 개의 알킬기를 의미하며 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 헥실, 및 그의 간단한 지방족 이성질체를 포함한다.

임의의 C_1-6알킬은 임의의 탄소 원자상에 있을 수 있는 R^x기로 임의로 치환되어 안정한 구조를 이루며 통상의 합성 기술로 이용가능할 수 있다. R^x에 적합한 기는 C_1-4알킬, OR", SR", C_1-4알킬술포닐, C_1-4알킬술폭실, -CN, N(R")₂, CH₂N(R")₂, -NO₂, -CF₃, -CO₂R", -CON(R")₂, -COR", -NR"C(O)R", F, Cl, Br, I 또는 CF₃S(O)_r- (여기서, r은 0, 1 또는 2이고, R"는 H 또는 C_1-6알킬임)이다.

특정 라디칼기는 본 명세서에서 약기한다. t-Bu는 3급 부틸 라디칼, Boc는 t-부틸옥시카르보닐 라디칼, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐 라디칼, Ph는 페닐 라디칼, Cbz는 벤질옥시카르보닐 라디칼, Bn은 벤질 라디칼, Me는 메틸, Et는 에틸, Ac는 아세틸, Alk는 C_1-4알킬, Nph는 1- 또는 2-나프틸, 그리고 cHex는 시클로헥실을 가리킨다. Tet는 5-테트라졸릴을 가리킨다.

특정 시약은 본 명세서에서 약기한다. DCC는 디시클로헥실카르보디이미드, DMAP는 디메틸아미노피리딘, DIEA는 디이소프로필에틸 아민, EDC는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염, HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸, THF는 테트라히드로푸란, DIEA는 디이소프로필에틸아민, DEAD는 디에틸 아조디카르복실레이트, PPh₃은 트리페닐포스핀, DIAD는 디이소프로필 아조디카르복실레이트, DME는 디메톡시에탄, DMF는 디메틸포름아마이드, NBS는 N-브로모숙신이미드, Pd/C는 탄소 상의 팔라듐 촉매, PPA는 폴리인산, DPPA는 디페닐포스포릴 아지드, BOP는 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, HF는 히드로플루오르산, TEA는 트리에틸아민, TFA는 트리플루오로아세트산, PCC는 피리디늄 클로로크로메이트를 가리킨다.

화학식 (I)의 화합물은 본원에서 전문을 참고로 인용한, 1997년 1월 16일에 공개된 본디넬 (Bondinell) 등의 PCT 공개 제WO97/01540호 (국제 공개 제PCT/US96/11108호)에 개시된 방법으로 제조될 수 있다.

또한, 화학식 (I)의 화합물은 후술되는 반응식에서 기술된 것들과 유사한 방법으로 제조된다.

반응식 I은 화학식 (I) 화합물의 제조에 유용한 중간체의 제조를 설명한다.

또한, 반응식 II는 화학식 (I) 화합물의 제조에 유용한 중간체의 제조를 설명한다.

반응식 III는 화학식 (I) 화합물의 제조를 설명한다. 알돌 유형 반응에 있어서, 적합한 아미드 염, 예를 들어 리튬 디이소프로필아미드 (LDA) 또는 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 (LiHMDS)에 노출시 에틸아세테이트로부터 생성될 수 있는 에틸아세테이트의 에놀레이트와 III-1 (반응식 I-3 화합물)을 반응시켜 III-2를 얻는다. 종종, THF는 알돌 반응에 대해 선택된 용매이며, 이는 다양한 부형제, 예를 들어 HMPA 또는 TMEDA의 존재하에도 종종 사용된다. III-3 (반응식 II-6 화합물)를 얻기 위한 III-2의 환원은 HCl과 같은 무기산의 존재하에 아세트산과 같은 적합한 용매 중에서 적합한 촉매, 예를 들어 활성 탄소 상의 팔라듐 금속 (Pd/C) 상에서, 가수소분해에 의하여 달성될 수 있다. 별법으로, 이러한 환원은 문헌 [Orfanopoulos and Smonou (Synth. Commun. 1988, 833]의 일반적인 방법에 의하여 보론 트리플루오라이드 에테레이트의 존재하에 III-2를 트리에틸실란과 반응시켜 달성될 수 있다. III-4를 얻기 위한 III-3의 메틸 에테르의 제거는 불활성 용매, 예를 들어 CH₂Cl₂중에 BBr₃로, 또는 불활성 용매, 바람직하게는 CH₂Cl₂중에 에탄티올 및 AlCl₃와 반응시켜 달성될 수 있다. 메틸 에테르의 제거에 유용한 다른 방법들이 문헌 [Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (published by John Wiley and Sons]에 개시되어 있다. 반응식 3의 화합물 4 (III-4)를 2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에탄올과 반응시켜 III-5를 얻는다. 반응은 디이소프로필 아조디카르복실레이트와 트리페닐포스핀 사이에 형성된 착물에 의해 매개되며, 이는 비양성자성 용매, 예를 들어 THF, CH₂Cl₂또는 DMF 중에서 수행된다. III-5의 에틸 에스테르는 수성 염기, 예를 들어 수성 THF 중의 LiOH 또는 수성 메탄올 또는 에탄올 중의 NaOH를 사용하여 가수분해되고, 중간체 카르복실레이트 염은 적합한 산, 예를 들어, TFA 또는 HCl로 산성화되어 카르복실산 III-6을 얻는다. 별법으로, 중간체 카르복실레이트 염은 원하는 경우 단리될 수 있거나, 또는 유리 카르복실산의 카르복실레이트 염은 당업계에 숙련자들에게 공지된 방법으로 제조될 수 있다.

상업적으로 구입가능한 2-플루오로-4-메톡시아세토페논 (IV-1)은 구리 금속 및 적합한 염기, 예를 들어 K₂CO₃의 존재하에 알콜, 예를 들어 페놀과 반응하여 디아릴 에테르 IV-2를 얻는다. 문헌 [Harris (J.Med. Chem. 1982, 25, 855)]의 일반적인 방법에 따라서, 황 및 적합한 1급 또는 2급 아민, 바람직하게는 모르폴린으로 처리하여 IV-2는 통상적인 빌게로즈-킨들러 (Willgerodt-Kindler) 반응으로 IV-3으로 전환시킨다. 또한, 수득한 티오아미드를 수성 MeOH, EtOH 또는 i-PrOH와 같은 수성 알콜계 용매 중에서 알칼리 금속 수산화물, 적합하게는 KOH와 반응시켜 상응하는 카르복실산 IV-4로 가수분해시킨다. 카르복실산 IV-4는 당업계의 숙련자들에게 공지된 조건에 따라서 SOCl₂또는 옥살릴 클로라이드와 반응시켜 상응하는 산 염화물로 전환시킨다. CH₂Cl₂또는 CS₂와 같은 불활성 용매 중의 AlCl₃또는 SnCl₄와 같은 적합한 프리델 크라프트 촉매로 이러한 산 염화물을 처리하여 시클릭 케톤 IV-5를 얻는다. 별법으로, 산 IV-4는 산 조건, 예를 들어 다가인산으로 케톤 IV-5로 직접적으로 전환시킬 수 있다. 알돌 유형 반응에 있어서, 적합한 아미드 염, 예를 들어 리튬 디이소프로필아미드 (LDA) 또는 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 (LiHMDS)에 노출시, 에틸아세테이트로부터 생성될 수 있는 에틸아세테이트의 에놀레이트와 IV-5을 반응시켜 IV-6을 얻는다. 종종, THF는 알돌 반응에 대해 선택된 용매이며, 이는 다양한 부형제, 예를 들어 HMPA 또는 TMEDA의 존재하에도 종종 사용된다. IV-7를 얻기 위한 IV-6의 환원은 문헌 [Orphanopoulos and Smonou (Synth. Commun. 1988, 833]의 일반적인 방법에 의하여 보론 트리플루오라이드 에테레이트의 존재하에 IV-6를 트리에틸실란과 반응시켜 달성될 수 있다. 알콜의 제거로 인한 임의의 올레핀계 부산물이 MeOH 또는 EtOH와 같은 적합한 용매 중에서 적합한 촉매, 예를 들어 활성화 탄소 상의 팔라듐 금속 (Pd/C) 상의 수소화에 의해 환원된다. 별법으로, IV-7을 얻기 위한 IV-6의 환원은 HCl과 같은 무기산의 존재하에 가수소분해에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 이러한 반응은 Pd/C로 촉매화되며, 이는 아세트산 중에서 최적으로 수행된다. IV-8을 얻기 위한 IV-7의 메틸 에테르의 제거는 불활성 용매, 예를 들어 CH₂Cl₂중에 BBr₃, 또는 불활성 용매, 바람직하게는 CH₂Cl₂중에 에탄티올 및 AlCl₃와 반응시켜 달성될 수 있다. 메틸 에테르의 제거에 유용한 다른 방법들이 문헌 [Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (published by John Wiley and Sons]에 개시되어 있다. 이어서, IV-8을 반응식 III에서 나타낸 방법에 따라서 화학식 (I) 화합물로 전환시킨다.

화합물의 산 부가염은 모화합물 및 염산, 브롬화수소산, 불화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 숙신산 또는 메탄술폰산과 같은 과량의 산으로부터 적합한 용매에서 표준 방식으로 제조한다. 일부 화합물은 허용가능한 내염 또는 양성이온을 형성한다. 양이온 염은 모화합물을 수산화물, 탄산염 또는 알콕시드와 같은 적절한 양이온을 함유하는 과량의 알칼리 물질로, 또는 적절한 유기아민으로 처리하여 제조한다. Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺및 NH₄ ⁺와 같은 양이온은 제약상 허용가능한 염에 존재하는 양이온의 구체적인 예이다.

본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 따라서, 화학식 (I)의 화합물은 의약 제조에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 이전에 기술한 대로 제조된 화학식 (I)의 화합물의 제약 조성물은 비경구 투여를 위한 용액 또는 동결 건조 분말로 조성될 수 있다. 분말은 사용 전에 적합한 희석제 또는 다른 제약상 허용가능한 담체를 가해 재구성될 수 있다. 액상 조성물은 완충된, 등장의 수성 용액일 수 있다. 적합한 희석제의 예는 보통의 등장의 생리식염액, 물 또는 완충된 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 중의 표준 5% 덱스트로오스 용액이다. 이러한 조성물은 특히 비경구 투여에 적합하나 또한 경구 투여에 사용되거나 또는 취입을 위한 계량 투여 흡입제 또는 분무제에 함유될 수도 있다. 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로오스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 염화나트륨 또는 시트르산나트륨과 같은 부형제를 가하는 것이 바람직할 수도 있다.

또한 이들 화합물은 경구 투여를 위한 캡슐, 정제 또는 에멀젼 또는 시럽으로 제조될 수 있다. 제약상 허용가능한 고상 또는 액상 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키기 위해, 또는 조성물의 제조를 촉진하기 위해 가할 수 있다. 고상 담체는 전분, 락토오스, 황산칼슘 이수화물, 테라 알바, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 아가 또는 젤라틴을 포함한다. 액상 담체는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 식염수 및 물을 포함한다. 담체는 또한 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 지속성 분비물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 고상 담체의 양은 다양하나, 바람직하게는 투여 단위당 약 20 mg 내지 약 1 g일 것이다. 제약 제제는 정제형을 위해 필요한 경우 분쇄, 혼합, 과립화 및 압착, 경질 젤라틴 캅셀 제형을 위한 분쇄, 혼합 및 충전을 포함하는 제약의 통상적인 기술로 제조된다. 액상 담체를 사용할 때 제제는 시럽제, 엘릭실제, 에멀젼제 또는 수성 또는 비수성 현탁액제의 형태가 될 것이다.이러한 액상 조성물은 직접 경구로 또는 연질 젤라틴 캅셀에 충전하여 투여될 것이다.

직장 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 또한 코코아 버터, 글리세린, 젤라틴 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 부형제와 합쳐 좌제로 성형될 수 있다.

본 명세서에서 기술하는 화합물은 비트로넥틴 수용체의 길항제이며 근원 병리가 비트로넥틴 수용체와 상호작용하는 리간드 또는 세포에 기인하는 질병의 치료에 유용하다. 예를 들어 이들 화합물은 골 매트릭스의 감소로 병리가 야기되는 질병의 치료에 유용하다. 따라서 본 화합물은 골다공증, 부갑상선 기능항진증, 파겟병, 악성 고칼슘혈증, 뼈의 대사로 인한 용골성 병변, 운동불능 또는 성호르몬 결핍으로 인한 뼈의 손실의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물은 또한 항종양, 항혈관생성, 항염증 및 항전이제로서 유용성이 있으며 아테롬성 동맥경화증 및 재협착증의 치료에 유용하다고 믿어진다.

이 화합물은 경구 또는 비경구로, 약의 농도가 골흡수를 억제하기에, 또는 기타 이러한 징후에 충분하도록 하여 환자에게 투여된다. 이 화합물을 함유하는 제약 조성물은 환자의 상태에 알맞도록 약 0.1 내지 약 50 mg/kg의 경구 투여량으로 투여된다. 바람직하게는 경구 투여량은 약 0.5 내지 약 20 mg/kg일 것이다. 급성 치료에서는 비경구 투여가 바람직하다. 물 중의 5% 덱스트로오스 또는 보통 생리식염수 중의 펩타이드 또는 적합한 부형제와의 유사한 조성물의 근육내 주사 역시 유효하지만, 정맥내 주입이 유용하다. 전형적으로 비경구 투여량은 약 0.01 내지 약 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 20 mg/kg일 것이다. 화합물은 총 하루 투여량이 약 0.4 내지 약 400 mg/kg/일이 되도록 하는 정도로 하루에 1 회 내지 4 회 투여한다. 화합물의 투여에 정밀한 정도 및 방법을 당 업계의 숙련자들은 치료 효과에 요구되는 농도에 대한 물질의 혈중 농도를 비교하여 용이하게 결정한다.

본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물과 비스포스포네이트(즉, 알렌드로네이트)와 같은 다른 골흡수 억제제, 호르몬 교체 치료법, 항 에스트로겐제 또는 칼시토닌을 차례로 또는 물리적 조합물로 하여 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 골다공증의 치료 또는 뼈의 손실 억제 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 화합물 및 골형태발생 단백질, 이프로플라본과 같은 동화제를 사용하는 뼈 손실의 예방 및(또는) 뼈 중량 증가에 유용한 치료 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 화학식 (I)의 화합물과 항종양제를 차례로 또는 물리적 조합물로 하여 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 토포테칸, 이리노테칸 및 9-아미노캄프토테신과 같은 캄포테신 동류체류의 화합물 및 시스플라틴, 오르마플라틴 및 테트라플라틴과 같은 백금 배위 복합체는 항종양제로 공지된 군이다. 캄포테신 동류체류의 화합물은 미국 특허 제 5,004,758호, 동 제 4,604,463호, 동 제 4,473,692호, 동 제 4,545,880호, 동 제 4,342,776호, 동 제 4,513,138호, 동 제 4,399,276호, 유럽 특허 출원 공개 번호 제0 418 099호 및 동 제0 088 642호, 문헌 [Wani et al., J. med. Chem., 1986, 29, 2358], 문헌 [Wani et al., J. med. Chem., 1980, 23, 554], 문헌 [Wani et al., J. med. Chem., 1987, 30, 1774] 및 문헌 [Nitta et al., Proc. 14th International Congr, Chemotherapy., 1985, Anticancer Section 1, 28]에 기술되어 있으며 그 각각의 개시 전체를 본 명세서에서 참고로 채택한다. 백금 배위 복합체인 시스플라틴은 브리스톨 마이어스 스퀴브사 (Bristol Myers-Squibb Corporation)가 플라티놀 (Platinol, 등록상표)로 판매한다. 시스플라틴의 유용한조성물은 미국 특허 제 5,562,925호 및 동 제 4,310,515호에 기술되어 있으며 그 각각의 개시 전체를 본 명세서에서 참고로 채택한다.

화학식 (I)의 화합물과 항종양제를 차례로 또는 물리적 조합물로 하여 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 종양 성장 억제 방법에서, 예를 들어 시스플라틴과 같은 백금 배위 화합물은 느린 정맥 주입으로 투여할 수 있다. 바람직한 담체는 만니톨을 함유하는 덱스트로오스/생리식염수액이다. 백금 배위 화합물의 투여 계획은 치료 과정당 체표면적(m²)당 약 1 내지 약 500 mg을 기준으로 할 수 있다. 백금 배위 화합물의 주입은 1 주당 1 회 또는 2 회로 할 수 있으며, 이러한 주간 치료는 몇 회 반복될 수 있다. 캄포테신 동류체류의 화합물을 비경구 투여에서 사용할 때, 일반적으로 약 5일을 연속으로 하루당 체 표면적(m²)당 약 0.1 내지 약 300.0 mg을 치료 과정에서 사용한다. 가장 바람직하게는 토포테칸으로서 약 5일을 연속으로 하루당 체표면적(m²)당 약 1.0 내지 약 2.0 mg을 치료 과정에서 사용한다. 바람직하게는, 치료 과정은 약 7 일 내지 약 28 일 간격으로 1 회 이상 반복한다.

제약 조성물은 화학식 (I)의 화합물과 항종양제를 동일 용기 안에 함께 조성할 수도 있으나, 서로 다른 용기로 한 조성물이 바람직하다. 두 물질이 용액 형태로 제공될 때, 이들은 동시 투여되는 주입/주사 시스템 또는 둘다 주입 형태로 함유될 수 있다.

화학식 (I)의 화합물 및 항종양제를 동시에 또는 따로 편리하게 투여하기 위해, 각각 상기에 기술한 대로 화학식 (I)의 화합물의 비경구 투여시의 유효량 및 상기에 기술한 대로 항종양제의 비경구 투여시의 유효량을 갖는 상자, 판지 또는 다른 용기와 같은 단일 용기, 개별 병, 백, 바이알 또는 다른 용기들을 포함함을 특징으로 하는 키트를 제조한다. 이러한 키트는 예를 들어 임의로 동결 건조된 마개로 동일 용기 또는 개별 용기 내의 두 제약 물질 모두와 재구성용 용액의 용기를 포함할 수 있다. 이것의 변화는 사용전 혼합될 수 있는 단일 용기의 2개 구역내의 재구성용 용액 및 동결 건조된 마개를 포함하는 것이다. 이러한 배열로 항종양제 및 본 발명의 화합물은 2개 용기 내에 각각 포장될 수 있거나, 분말로 함께 동결 건조되어 단일 용기로 제공될 수 있다.

두 물질 모두 용액 형태로 제공될 때, 이들은 동시 투여되는 주입/주사 시스템 또는 둘다 주입 형태로 함유될 수 있다. 예를 들어 화학식 (I)의 화합물은 정맥 주사 형태로, 또는 제2 주입백 내의 항종양제와 관을 통해 직렬로 연결된 주입백 내에 존재할 수 있다. 이러한 시스템을 사용하여 환자는 우선 화학식 (I)의 화합물의 1 회형 주사 또는 주입에 이어 항종양제를 주입받을 수 있다.

이 화합물은 여러 생체 분석법 중 하나를 이용해, 주어진 약리 효과를 지니는데 필요한 화합물의 농도를 측정하기 위해 시험할 수 있다.

비트로넥틴 결합 억제

α_νβ₃에 대한 고상 [³H]-SK&F-107260 결합: 완충액 T (2 mM CaCl₂및 1% 옥틸글루코시드 함유)중 인간 태반 또는 인간 혈소판을, 1 mM CaCl₂를 함유하는 완충액 T, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂(완충액 A) 및 0.05% NaN₃로 희석한 후, 즉시 웰 당 0.1 mL로 96-웰 ELISA 플레이트(미국 뉴욕주 뉴욕 소재, Corning 제품)에 가하였다. 웰 당 α_νβ₃0.1 내지 0.2 ㎍을 가하였다. 플레이트를 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 실험을 할 때, 웰을 완충액 A로 1 회 세척하고, 동일한 완충액중의 3.5% 소혈청 알부민 0.1 mL과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 웰을 완전히 흡인시키고, 완충액 A 0.2 mL로 2 회 세척하였다.

화합물을 100% DMSO에 용해하여 2 mM 원액으로 만들고, 결합용 완충액(15 mM 트리스(Tris)-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂))로 희석하여 100 μM의 최종 화합물 농도로 만들었다. 이어서, 이 용액을 목적하는 최종 화합물 농도로 희석하였다. 다양한 농도의 비표지 길항제(0.001 내지 100 μM)를 웰에 가하고, 3 개의 복사체를 만든 후, 5.0 nM [³H]-SK&F-107260 (65 내지 86 Ci/mmole)을 가하였다.

플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 웰을 완전히 흡인시키고, 웰 대 웰(well-to-well) 방식으로 빙냉 완충액 A 0.2 mL로 1 회 세척하였다. 수용체를 1% SDS 1 mL로 가용화하고, 효율이 40%인 LS 액체 신틸레이션 카운터(Beckman 제품)에 레디 세이프(Ready Safe) 3 mL을 가하여 결합된 [³H]-SK&F-107260를 액체 신틸레이션 계수법(liquid scintillation counting)으로 측정하였다. [³H]-SK&F-107260의 비특이적 결합을 2 μM SK&F-107260 존재하에서 측정한 결과, 총 방사리간드 유입량의 1 % 미만이었다. IC₅₀([³H]-SK&F-107260의 결합을 50% 억제하는 길항제의 농도)을 룬돈(LUNDON) 2-프로그램을 변형시킨 비선형 최소 자승 곡선-피팅 경로(nonlinear, least squares curve-fitting routine)로 결정하였다. K_i(길항제의 분해 상수)를 다음 방정식에 따라 계산하였다: K_i= IC₅₀/(1 + L/K_d)(식중, L 및 K_d는 [³H]-SK&F-107260의 농도 및 분해 상수 각각을 나타냄).

본 발명의 화합물은 약 1.7 나노몰의 K_i에서 SK&F-107260에 대한 비트로넥틴의 결합을 억제한다.

본 발명의 화합물은 또한 골 형성의 억제를 평가하기 위한 당업계의 분석 평가 표준 (쥐 용골세포 대신 인간 용골세포를 사용하여 수행할 수도 있음), 예를 들어 유럽 특허 제528 587호에 개시된 소와(小窩, pit) 형성 분석 및 문헌[Wronski et al., Cells and Materials 1991, Sup. , 69-74]에 기재된 난소절제된 쥐 모델로 생체내 및 생체외 골 흡수에 대해 시험하였다.

맥관 평활근 세포 이동 분석

쥐 또는 인간 대동맥 평활근 세포를 사용하였다. 세포 이동은 소공이 8 μm인 폴리카르보네이트 막 (코스타사 (Costar) 제품)을 사용하여 트랜스웰 세포 배양 쳄버에서 모니터하였다. 보다 작은 면적의 필터를 비트로넥틴으로 코팅하였다. 세포를 mL 당 2.5 - 5.0 x 10⁶세포의 농도로 0.2% 소혈청 알부민으로 보충된 DMEM에 현탁시키고, 다양한 농도의 시험 화합물로 20 ℃에서 20 분 동안 예비처리하였다. 대조용으로 용매만을 사용하였다. 세포 현탁액 0.2 mL을 쳄버의 상부실에 넣었다. 하부실에는 0.2% 소혈청 알부민으로 보충된 DMEM 0.6 mL이 포함되었다. 95% 공기/5% CO₂의 대기하에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 필터의 상부 표면상에 있는 이동하지 않은 세포를 서서히 떼어 내어 제거하였다. 이어서, 필터를 메탄올에서 고정시키고 10% 김사 (Giemsa) 염색으로 염색하였다. 이동율은 a) 필터의 하부 표면으로 이동한 세포 수를 계수하거나, b) 염색된 세포를 10% 아세트산으로 추출한 후 600 nM 에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.

갑상선상피소체 절제된(Thyroparathyroidectomized) 쥐 모델

각각의 실험 군은 5 내지 6 마리의 성장한 수컷 스프레그-다울리(Spargue-Dawley) 쥐(250 내지 400 g 체중)으로 구성되어 있다. 이 쥐는 사용하기 7 일 전에 갑상선상피소체 절제술을 하였다(납품업자인 타코닉 팜사 (Taconic Farms)에서 수행). 모든 쥐에 3 일 마다 대체 용량의 티록신을 수여하였다. 쥐를 받자 마자 헤파린으로 처리한 튜브로 꼬리 정맥천자에 의하여 뽑아낸 혈액 전체로 즉시 순환 이온화 칼슘 수준을 측정하였다. 이온화 Ca 수준(시바-코닝사 (Ciba-Corning) 모델 634 칼슘 pH 분석기로 측정)이 1.2 mM/L 미만인 쥐을 포함시켰다. 각각의 쥐에 각각 시험물질의 전달 및 혈액 표본 추출을 위한 내부 정맥 및 동맥 카테테르를 장착하였다. 이어서, 쥐에 무-칼슘 먹이 및 탈이온수 식이요법을 시행하였다. 기준 Ca 수준을 측정하고 각각의 쥐에 대조 담체 또는 인간 부갑상선 호르몬 1-34 펩티드(hPTH1-34, 투여량 0.1% 소혈청 알부민 염수 중의 1.25 ug/kg/h, 미국 캘리포니아주 소재 바켐사 (Bachem)) 또는 hPTH1-34 및 시험 물질의 혼합물 중의 하나를 외부 주사기 펌프를 사용하는 정맥 카테테르를 통해 연속적인 정맥내 주입으로 투여하였다. 각각의 쥐의 칼숨혈 반응을 6 내지 8 시간의 주입 기간 동안 2 시간 간격으로 측정하였다.

인간 용골세포 흡수 및 부착 분석

소아 흡수 및 부착 분석을 용골세포종 조직 세포로부터 유도된 정상적인 인간 용골세포를 사용하여 개시하고 표준화하였다. 분석 1은 레이저 동초점 현미경법에 의한 용골세포 소와 체적의 측정을 위하여 개시하였다. 분석 2는 (흡수 도중에 방출되는)콜라겐 단편을 경쟁적 ELISA로 측정하는 고처리량 스크리닝으로서 개시하였다.

분석 1 (레이저 동초점 현미경을 사용)

- 인간 용골세포종-유래 세포 현탁액의 분액을 액체 질소 저장소로부터 회수하여, 37 ℃에서 신속히 가온하고 RPMI-1640 배지 내에서 원심분리(1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분)하여 1 회 세척하였다.

- 상기 배지를 흡인하고 이어서 희석된 1:3 RPMI-1640 배지에서 쥐과 동물의 항-HLA-DR 항체로 대체하였다. 상기 현탁액을 얼음에서 30 분간 배양하고 자주 혼합하였다.

- 상기 세포를 냉각된 RPMI-1640으로 2 회 세척한 후 원심분리하고(1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분) 이어서 세포를 무균 15 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 단핵 세포의 수를 개선된 뉴바우어(Neubauer) 계수용 쳄버내에서 측정하였다.

- 염소 항-생쥐 IgG(미국 뉴욕주 그레이트젝 소재 Dynal 제품)로 코팅된 충분한 자성 비드(5/단핵세포)를 보관 병에서 회수하여 신선한 배지(독성 아지드 방부제를 씻어냄) 5 mL 내에 두었다. 상기 배지를 자석 상의 고정 비드로 제거하고 신선한 배지로 대체하였다.

- 상기 비드를 세포와 혼합하고 상기 현탁액을 얼음상에서 30 분간 배양하였다. 상기 현탁액을 자주 혼합하였다.

- 비드로 코팅된 세포를 자석 위에 고정시키고 잔류하는 세포(용골세포가 풍부한 분획)를 무균 50 mL 원심분리 튜브내로 따라내었다.

- 신선한 배지를 비드로 코팅된 세포에 가하여 임의의 포획된 용골세포를 이동시켰다. 이러한 세척 공정을 10 회 반복하였다. 상기 비드로 코팅된 세포를 버렸다.

- 생명력 있는 용골세포를 생존 세포를 표지하기 위한 플루오레세인 디아세테이트를 사용하여 계수용 쳄버내에서 측정하였다. 소공이 큰 1 회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 표본을 상기 쳄버에 가하였다.

- 용골세포를 원심분리하여 펠렛으로 만들고, 밀도를 10% 우태아 혈청 및 1.7 g/리터의 중탄산나트륨으로 보충된 EMEM 배지(용골세포의 수는 종양 마다 다름)로 조절하였다.

- 상기 세포 현탁액의 3 mL 분액(화합물 처리 당)을 15 mL 원심분리 튜브내로 따라내었다. 상기 세포를 원심분리하여 펠렛으로 만들었다.

- 각각의 튜브에, 적절한 화합물 처리를 위하여 3 mL를 가하였다(EMEM 배지중의 50 uM로 희석). 또한 적절한 담체 대조용, 양성 대조용(100 ug/mL로 희석된 항-비트로넥틴 수용체 쥐과 동물의 단일클론 항체 [87MEM1]) 및 이소타입 대조용(100 ug/mL로 희석된 IgG₂)을 포함시켰다. 상기 표본을 37 ℃에서 30 분간 배양하였다.

- 상기 세포의 0.5 mL 분액을 48-웰 플레이트 내의 무균 상아질 조각 위에 접종하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 각각의 처리를 4 번씩 스크리닝하였다.

- 상기 조각을 가온된 PBS(6-웰 플레이트 내의 10 mL/웰) 내에서 6 회 세척한 후 상기 화합물로 처리하거나 대조용 표본을 함유하는 신선한 배지 내에 두었다. 표본을 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다.

타르타르산염 내성의 산 포스파타아제(Tartrate resistant acid phosphatase; TRAP) 공정(상기 용골세포 계통의 세포에 대한 선택적인 염색)

- 부착된 용골세포를 함유하는 골 조각을 인산염 완충염수 내에서 세척하고 2% 글루테르알데히드(0.2 M 소듐 카코딜레이트중) 내에 5 분간 고정시켰다.

- 이어서, 이들을 물에서 세척하고 37 ℃에서 TRAP 완충액(N,N-디메틸포름아미드 내에 용해되고 10 mM 타르타르산 나트륨을 함유하는 0.25 M 시트르산염 완충액(pH 4.5)과 혼합된 나프톨 AS-BI 인산염 0.5 mg/mL) 내에서 4 분간 배양하였다.

- 냉수에서 세척한 후에, 상기 조각을 1 mg/mL 고정된 적색 석류석(fast red garnet)을 함유하는 냉 아세테이트 완충액(0.1 M, pH 6.2)에 침지시키고 4 ℃ 에서4 분간 배양하였다.

- 과량의 완충액을 흡인시키고, 상기 조각을 공기 중에서 건조시킨 후 물에서 세척하였다.

- TRAP 양성 용골세포(적벽돌색/자주색 침전)을 명시야 현미경으로 측정한 후 초음파 파쇄로 상아질 표면으로부터 제거하였다.

- 소아 체적을 니콘/라세텍(Nikon/Lasertec) ILM21W 동초점 현미경을 사용하여 측정하였다.

분석 2(ELISA 판독을 이용)

인간 용골세포를 분석 1의 초기 9 단계에 기재된 바와 같이 화합물 스크리닝을 수행하기 위하여 제조하였다. 명확하게 하기 위하여, 이들 단계는 하기와 같이 반복하였다.

- 인간 용골세포종-유래 세포 현탁액의 분액을 액체 질소 저장소로부터 회수하여, 37 ℃에서 신속히 가온하고 RPMI-1640 배지 내에서 원심분리(1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분)로 1 회 세척한다.

- 상기 배지를 흡인하고, 이어서 RPMI-1640 배지에서 1:3으로 희석된 쥐과의 항-HLA-DR 항체로 대체하였다. 상기 현탁액을 얼음에서 30 분간 배양하고 자주 혼합하였다.

- 상기 세포를 냉 RPMI-1640으로 2 회 세척한 후 원심분리하고(1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분), 이어서 세포를 무균 15 mL 원심분리 튜브내로 옮겼다. 단핵 세포수를 개선된 뉴바우어 계수용 쳄버내에서 측정한다.

- 염소 항-생쥐 IgG(미국 뉴욕주 그레이트넥 소재 Dynal 제품)로 코팅된 충분한 자성 비드(5/단핵세포)를 보관 병에서 회수하여 5 mL의 신선한 배지(독성 아지드 방부제를 씻어냄)에 두었다. 상기 배지를 자석 상의 고정 비드로 제거하고 신선한 배지로 대체하였다.

- 상기 비드를 세포와 혼합하고 현탁액을 얼음에서 30 분간 배양하였다.

- 생명력 있는 용골세포를 생존 세포를 표지하기 위한 플루오레세인 디아세테이트를 사용하여 계수 쳄버 내에서 측정하였다. 소공이 큰 1 회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 표본을 상기 쳄버에 가하였다.

- 용골세포를 원심분리하여 펠렛으로 만들고, 밀도를 10% 우태아 혈청 및 1.7 g/리터의 중탄산나트륨으로 보충된 EMEM 배지(용골세포의 수는 종양 마다 다름)내에서 적절한 수로 조절하였다.

분석 1에 기재된 방법과는 달리, 상기 화합물은 4 회 투여량에서 스크리닝하여 하기에 약술된 바와 같이 IC₅₀을 얻었다:

- 용골세포 제제를 시험 화합물(4 회 투여량) 또는 대조용과 함께 37 ℃에서30 분 동안 예비배양하였다.

- 이어서, 이들을 48-웰 세포 조직 배양 플레이트 내의 소 피질 골 조각 위에 접종하고 37 ℃에서 2 시간 더 배양하였다.

- 골 조각을 가온 인산염 완충 염수(PBS)로 6 번 바꿔 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 후, 신선한 화합물 또는 대조용을 함유하는 48-웰 플레이트의 웰로 되돌렸다.

- 이어서, 상기 세포 조직 배양 플레이트를 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다.

- 각 웰로부터의 부유물을 각각의 튜브내로 흡인하고, 흡수 과정 동안에 방출되는 타입 I 콜라겐의 c-텔로펩티드를 검출하는 경쟁적 ELISA 내에서 스크리닝하였다. 이것은 타입 I 콜라겐의 a1-쇄의 카르복시-말단 텔로펩티드내에 존재하는 8-아미노산 서열(Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg)과 특이적으로 반응하는 토끼 항체를 함유하는 상업적으로 구입가능한 ELISA(덴마크 소재, 오스테오메터사 (Osteometer))이다. 결과는 담체 대조용과 비교한 흡수의 억제율(%)로서 나타내었다.

인간 용골세포 부착 분석

인간 용골세포를 상기 분석 1의 초기 9단계에서 기재된 바와 같이 화합물 스크리닝을 수행하기 위하여 제조하였다. 명확히 하기 위하여, 이들 단계를 하기에 반복한다.

- 인간 용골세포종-유래 세포 현탁액의 분액을 액체 질소 저장소로부터 회수하여 37 ℃에서 신속히 가온하고, RPMI-1640 배지 내에서 원심분리(1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분)하여 1 회 세척하였다.

- 상기 배지를 흡입하고 이어서 RPMI-1640 배지에서 1:3으로 희석된 쥐과의 항-HLA-DR 항체로 대체하였다. 상기 현탁액을 얼음에서 30 분간 배양하고 자주 혼합하였다.

- 상기 세포를 냉 RPMI-1640으로 2 회 세척한 후 원심분리하고(1000 rpm, 4 ℃ 에서 5 분) 이어서 세포를 무균 15 mL 원심분리 튜브내로 옮겼다. 단핵 세포의 수를 개선된 뉴바우어 계수영 쳄버내에서 측정한다.

- 염소 항-생쥐 IgG(미국 뉴욕주 그레이트넥 소재. 다이날사 (Dynal))로 코팅된 충분한 자성 비드(5/단핵세포)를 보관 병에서 회수하여 5 mL의 신선한 배지(독성 아지드 방부제를 씻어냄) 내에 두었다. 상기 배지를 자석 상의 고정 비드로 제거하고 신선한 배지로 대체하였다.

- 상기 비드를 세포와 혼합하고 현탁액을 얼음에서 30 분간 배양하였다. 현탁액을 자주 혼합하였다.

- 비드로 코팅된 세포를 자석 위에 고정시키고 잔류하는 세포(용골세포가 풍부한 분획)을 무균 50 mL 원심분리 튜브내로 따라내었다.

- 생명력 있는 용골세포를 생존 세포를 표지하기 위한 플루오레세인 디아세테이트를 사용하여 계수 쳄버 내에서 측정하였다. 소공이 큰 1 회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 표본을 쳄버에 가하였다.

- 파골 세포종-유래 용골세포를 화합물 (4 회 투여량) 또는 대조용과 37 ℃에서 30 분 동안 예비배양하였다.

- 이어서, 세포를 골교(骨橋, osteopontin)로 코팅된 슬라이드(인간 또는 쥐의)에 접종하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다.

- 슬라이드를 인산염 완충염수에서 세게 세척하여 비부착 세포를 제거하고, 슬라이드 위에 남은 세포를 아세톤중에 고정시켰다.

- 용골세포를 타르타르산염 내성 표현형인 세포에 대한 선택적 마커인 타르타르산염 내성의 산 포스파타제(TRAP)에 대해 염색을 하였고(단계 15 내지 17 참조), 명시야 현미경으로 평가하였다.

세포 부착 분석

세포들 및 세포 배양

인간 태아의 신장세포(HEK293 세포)를 ATCC(카탈로그 번호 제CRL 1573)으로 부터 얻었다. 세포를 얼(Earl) 염, 10% 우태아 혈청, 1% 글루타민 및 1% 페니실린스텝토마이신을 함유하는 얼의 최소 필수 배지(EMEM)내에서 성장시켰다.

구축 및 형질감염

α_v서브유닛의 3.2 kb EcoRI-KpnI 단편 및 β₃서브유닛의 2.4 kb XbaI-XhoI 단편을 CMV 프로모터 및 G418 선택성 표지를 함유하는 pCDN 벡터(Aiyar 등, 1994)의 EcoRI-EcoRV 클로닝 부위내로 무딘 말단 라이게이션에 의하여 삽입하였다. 안정적인 발현을 위하여, 80 x 10⁶HEK 293세포를 진 펄서 (Gene Pulser) [Hensley et al., 1994]를 이용하여 α_v+β₃구축물(각각의 서브 유닛의 DNA 20 μg)로 전기형질전환하고, 100 mm 플레이트내에 플레이팅하였다(5 x 10⁵세포/플레이트). 48 시간 후, 성장 배지를 제네티신(Geneticin; G418 술페이트, 미국 매릴랜드주 베데스다 소재 GIBCO-BRL) 450 μg/mL으로 보충하였다. 상기 세포를 콜로니가 분석되기에 충분하도록 커질때까지 선택 배지 내에서 유지하였다.

형질감염된 세포의 면역세포화학적 분석

HEK 293 형질감염체가 비트로넥틴을 발현하는지의 여부를 판단하기 위하여, 세포를 원심분리에 의하여 유리 현미경 슬라이드 상에 고정시키고, 실온에서 2 분간 아세톤내에서 고정시키고, 공기중에서 건조시켰다. α_vβ₃복합체에 특이적인 단일클론 항체의 일종인 23C6과의 특이적 반응성을 표준적인 간접 면역형광법을 사용하여 입증하였다.

세포 부착 연구

코닝 96-웰 ELISA 플레이트를 0.1 mL의 인간 비트로넥틴(RPMI 배지 중의 0.2 μg/mL)로 4 ℃에서 밤새도록 예비코팅하였다. 실험 당시에, 플레이트를 RPMI 배지로 1 회 세척하고 RPMI 배지 내의 3.5% BSA로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 형질감염된 293 세포를 헤페스 (Hepes, pH 7.4) 20 mL 및 0.1% BSA로 보충된 RPMI 배지내에 및 0.5 x 10⁶세포/mL의 밀도로 재현탁하였다. 세포 현탁액 0.1 mL를 각각의 웰에 가하고, 다양한 α_vβ₃길항제의 존재 또는 부재하에 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 10% 포름알데히드 용액(pH 7.4) 0.025 mL을 가하고, 세포를 실온에서 10 분간 고정시켰다. 상기 플레이트를 RPMI 배지 0.2 mL로 3 회 세척하고, 부착된 세포를 0.5% 톨루이딘 불루 0.1 mL로 실온에서 20 분간 염색하였다. 과량의 염색제를 탈염수로 격렬히 세척하여 제거하였다. 세포내에 포함된 톨루이딘 불루를 50 mM의 HCl을 함유하는 50% 에탄올 0.1 mL을 가하여 용출하였다. 세포 부착을 미세적정 플레이트 판독기(미국 버지니아주 스틸링 소재, 티테텍 멀티스칸사 MC (Titertek Multiskan))에서 600 nm 광학 밀도로 정량화하였다.

고상-α _v β ₅ 결합 분석

비트로넥틴 수용체 α_vβ₅를 인간 태반으로부터 정제하였다. 수용체 제제제를 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂(완충액 A)로 희석하고, 웰 당 0.1 mL로 96-웰 ELISA 플레이트에 즉시 가하였다. α_vβ₃0.1 내지 0.2 μg을 웰 1 개 당 가하였다. 상기 플레이트를 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 실험 당시에, 상기 웰을 완충액 A로 세척하고 동일한 완충액 중에서실온에서 1 시간 동안 0.1 ml의 3.5% 소 혈청 알부민과 함께 배양하였다. 배양에 이어서, 상기 웰을 완전히 흡출하고 0.2 ml의 완충액 A로 2 회 세척하였다.

[³H]-SK&F-107260 경쟁적 분석에서, 다양한 농도의 비표지 길항제(0.001-100μM)를 웰에 가한 후, 5.0 nM [³H]-SK&F-107260를 가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양에 이어서, 상기 웰을 완전히 흡인하고, 빙냉 완충액 A 0.2 mL로 웰 대 웰 방식으로 세척하였다. 수용체를 1% SDS 0.1 mL로 용해하고, 결합된 [³H]-SK&F-107260를 벡크만(Beckman) LS 6800 액체 신틸레이션 계수기 내에 0.3 mL의 레디 세이프가 가해진 액체 신틸레이션 계수법(효율 40%)으로 측정하였다. [³H]-SK&F-107260의 비특이적 결합은 2 μM의 SK&F-107260 존재하에서 측정하였고, 그 결과 총 방사리간드 유입량의 1% 미만이었다. IC₅₀([³H]-SK&F-107260의 결합을 50% 억제하는 길항제의 농도)는 루돈-2 프로그램으로 부터 변형시된 비선형 최소 자승 곡선-피팅 경로에 의하여 측정하였다. K_i(길항제 해리 상수)는 첸 및 프루조프 수식(Cheng and Prusoff equation)의 수식에 따라 계산하였다. K_i=IC₅₀/(1+L/K_d)(여기에서, L 및 K_d는 각각 [³H]-SK&F-107260의 농도 및 해리 상수임).

RGD-매개 GPIIb-IIIa 결합의 억제

GPIIb-IIIa의 정제

오래된 세척된 인간 혈소판(적십자에서 얻음) 10 유닛을 3% 옥틸글루코시드, 20 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 140 mM NaCl, 2 mM CaCl₂내에서 4 ℃에서 2 시간 동안 온화하게 교반하여 용해하였다. 상기 용해물을 1 시간 동안 100,000 g에서 원심분리하였다. 얻어진 부유물을 20 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1% 옥틸글루코시드(완충액 A)로 예비평형시킨 50 mL 편두(lentil) 렉틴 세파로오스 4B 컬럼(E.Y.Labs)에 가하였다. 2 시간의 배양 후에, 컬럼을 냉 완충액 A 50 mL로 세척하였다. 상기 렉틴-보유 GPIIb-IIIa를 10%의 덱스트로오스를 함유하는 완충액 A로 용출하였다. 모든 공정을 4 ℃에서 수행하였다. 얻은 GPIIb-IIIa는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의하여 보여지는 바와 같이 순도가 95% 이상이었다.

리포솜으로의 GPIIb-IIIa의 혼입

포스파티딜세린(70%) 및 포스파디딜콜린(30%; Avanti Polar Lipids)의 혼합물을 질소류 하에 유리 튜브의 벽에 건조시켰다. 정제된 GPIIb-IIIa를 최종 농도 0.5 mg/ml로 희석하고, 1:3(중량:중량) 단백질:포스포리피드 비율로 포스포리피드와 혼합하였다. 상기 혼합물을 재현탁시키고 5 분 동안 초음파파쇄기로 초음파 분쇄하였다. 이어서, 상기 혼합물을 1000-배 과량의 50 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(2회 교체)에 대항하는 12,000 내지 14,000 분자량 차단 투석 튜브를 사용하여 밤새도록 투석하였다. 상기 GPIIb-IIIa 함유 리포솜을 12,000 g에서 15 분간 원심분리하고 약 1 mg/mL의 최종 단백질 농도하의 투석 완충액 내에서 재 현탁하였다. 상기 리포솜을 필요할 때까지 -70 ℃에서 보관하였다.

GPIIb-IIIa에 대한 경쟁적 결합

피브리노겐 수용체(GPIIb-IIIa)에 대한 결합을 RGD-타입 리간드로서 [³H]-SK&F-107260을 사용하는 간접 경쟁적 결합 방법을 사용하여 분석 하였다. 결합 분석은 0.22 um 친수성 듀라포어(durapore) 막을 사용하는 96-웰 여과 플레이트 조립품(미국 매릴랜드주 메드포드 소재, 밀리포어 코포레이션사 (Millipore Corporation)) 내에서 수행하였다. 상기 웰은 비특이적 결합을 방지하기 위하여 실온에서 1시간 동안 10 μg/mL 폴리리신(미국 미조리주 세인트 루이스 소재, 시그마 케미칼 코포레이션사 (Sigma Chemical Co.)) 0.2 mL로 예비코팅하였다. 다양한 농도의 비표지 벤즈아제핀을 상기 웰(4 개씩)에 부가하였다. [³H]-SK&F-107260을 각각의 웰에 최종 농도가 4.5 nM이 되도록 가한 후에 1 g의 정제된 혈소판 GPIIb-IIIa-함유 리포솜을 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. GPIIb-IIIa-결합 [³H]-SK&F-107260을 결합되지 않은 것으로부터 밀리포어(Millipore) 여과 방법을 수차례 사용하여 여과한 후, 빙냉 완충액(2 회, 각각 0.2 mL)으로 세척하였다. 필터에 잔류하는 결합된 방사능을 벡크만 액체 신틸레이션 계수기(모델 LS 6800) 내의 1.5 mL의 레디 세이프 내에서 40%의 효율로 측정하였다. 비특이적 결합을 2 μM의 비표지 SK&F-107260 존재하에서 측정하였고, 그 결과 표본에 가해된 총 방사리간드의 0.14% 미만이었다. 모든 데이터 포인트는 4 회 실험의 평균이었다.

경쟁적 결합 데이터는 비선형 최소-자승 곡선 피팅 과정을 사용하여 분석하였다. 이 방법은 길항제의 IC₅₀(평형에서 [³H]-SK&F-107260의 특이적 결합을 50%로 억제하는 길항제의 농도)을 제공한다. 상기 IC₅₀은 쳉(Cheng) 및 프루소프(Prusoff)의 식에 기초한 길항제의 평형 해리 상수(Ki)에 관련된다: K_i=IC₅₀/(1+L/K_d)(여기에서, L은 경쟁적 결합 분석에서 사용된 [³H]-SK&F-107260의 농도(4.5 nM)이고, Kd는 스캇차드(Scatchard) 분석에 의하여 측정하였을 때 4.5 nM인 SK&F-107260의 농도의 해리 상수임).

화학식 (I)의 화합물 단독 및 항종양제와 조합에서의 효율은 몇몇 이식가능한 생쥐 종양 모델을 사용하여 측정할 수 있다 (이들 모델에 대한 상세 기재는 미국특허 제5,004,758호 및 동 제5,633,016호 참조).

하기의 실시예는 본 발명을 범위를 제한하려고 의도된 것은 절대 아니며, 본원발명의 화합물을 제조하고 사용하는 방법을 열거하기 위하여 제공된다. 기타 많은 실시태양은 본 기술분야의 숙련된 기술자가 쉽게 알 수 있을 것이다.

개요

300 MHz에서 양성자핵자기공명(¹H NMR) 스펙트럼을 기록하였다. 화학적 이동(chemical shift)은 내부 표준 테트라메틸실란(TMS)으로부터의 하류장방향으로백만분율(parts per million)(δ)로 기록한다. NMR 데이터의 약어는 다음과 같다: s=단일선, d=이중선, t=삼중선, q=사중선, m=다중선, dd=이중선의 이중선, dt=삼중선의 이중선, app=명확, br=넓음. J는 헤르쯔로 측정되는 NMR 커플링 상수를 나타낸다. CDCl₃는 듀테리오클로로포름, DMSO-d₆는 헥사듀테리오디메틸술폭시드, 및 CD₃OD는 테트라듀테리오메탄올이다. 질량 스펙트럼은 전기분무(electrospray:ES) 또는 이온화 기술을 이용하여 구하였다. 원소 분석은 퀀티터티브 테크놀로지 인크사 (Quantitative Technologies Inc.)(미국 뉴저지주 소재)에 의해 수행되었다. 융점은 토마스-후버(Thomas-Hoover) 융점 기계에서 구하고 보정하지 않는다. 모든 온도는 섭씨로 기록한다. 아날테크 실리카 겔 GF 및 E. 머크 실리카 겔 60 F-254 박막 플레이트을 이용하여 박막 크로마토그래피를 하였다. 플래시 크로마토그래피는 모두 E. 머크 키젤겔60(230-400메시) 실리카 겔에서 수행하였다. 분석용 HPLC 및 제조용 HPLC는 베크만 크로마토그래프상에서 수행하였다. ODS는 옥타데실실릴 유도된 실리카 겔 크로마토그래피 지지체를 칭한다. 등록상표 YMC ODS-AQ는 ODS 크로마토그래피용 지지체이고 이는 YMC Co. Ltd. (일본 쿄토 소재)사의 등록상표이다. 등록상표 PRP-1은 중합체(스티렌-디비닐벤젠) 크로마토그래피 지지체이고, 하밀톤사(미국 네바다주 레논 소재, Hamilton Co.)의 등록상표이다. 셀라이트(등록상표)는 산-세척된 규조토 실리카로 구성된 필터 보조제이고, 만빌사(미국 콜로라도주 덴버 소재, Manvile Corp.)의 등록상표이다.

제조예 1

2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에탄올의 제조

a) 2-메틸-8-(tert-부톡시카르보닐)-5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘

2-메틸-1,8-나프티리딘 (J.Chem. Soc. (C) 1966, 315;5.13 g, 35.58 mmol), 10% Pd/C (1.14 g, 1.07 mmol) 및 무수 EtOH (70 mL)의 혼합물을 3 회 배기/H₂퍼지 주기를 통하여 탈산소화시키고, 이후 H₂의 고무풍선하에서 활발하게 교반하였다. 18.5 시간 후, 혼합물을 셀라이트 (등록 상표)를 통하여 여과하고, 이어서 여과 패드를 무수 EtOH와 EtOAc로 세척하였다. 여액을 농축하여 건조시키고, 잔류물을 EtOAc로 재농축하여 회백색 고체 (5.25 g)가 남았다.

상기 물질 (5.25 g), 디-tert-부틸 디카르보네이트 (15.53 g, 71.16 mmol) 및 CH₂Cl₂(10 mL)의 용액을 회전 증발기에서 농축시켜 용매를 제거하고, 오일성 잔류물을 55 내지 60 ℃로 설정된 오일조에서 N₂하에 가열하였다. 45 시간 후, 반응을 RT까지 냉각시키고, 잔류물을 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피하였다 (40% EtOAc/헥산). 표제 화합물 (4.90 g, 55%)을 밝은 노란색 고체로 얻었다.

b) 에틸[8-(tert-부톡시카르보닐)-5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일]아세테이트

무수 THF (50 mL) 중의 디이소프로필아민 (7.24 mL, 55.3 mmol)의 용액에 n-BuLi (헥산 중의 2.5 M, 22 mL, 55.3 mmol)을 0 ℃에서 적가하였다. 15 분 후, -78 ℃에서 이 용액을 무수 THF (50 mL) 중의 2-메틸-8-(tert-부톡시카르보닐)-5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘 (4.9 g, 19.7 mmol)와 디에틸카르보네이트 (8.86 mL, 73.0 mmol)의 용액에 적가하였다. 30 분 후, 혼합물을 포화 NH₄Cl (100 mL)로 켄칭시키고, RT로 가온하고, EtOAC (3×200 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 (40% EtOAc/헥산), 표제 화합물 (5.72 g, 91%)을 밝은 노란색 오일로 얻었다: MS (ES) m/e 321 (N+H)⁺.

c) 2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에탄올

실온에서 무수 THF (80 mL) 중의 에틸[8-(tert-부톡시카르보닐)-5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일]아세테이트 (5.72 g, 17.85 mmol) 용액에 LiBH₄(THF 중의 2.0 M, 10.7 mL, 21.42 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 환류하여 가열하였다. 18 시간 후, 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 주의깊게 물 (100 mL)로 켄칭하였다. 10 분 후, 혼합물을 EtOAc (3×100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축시켰다.

상기 잔류물 (4.9 g)을 CH₂Cl₂(10 mL) 중에 용해시켰다. 여기에 디옥산 (20 mL) 중의 4 N HCl을 RT에서 한 번에 첨가하였다. 4 후, 혼합물을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 1.0 N NaOH와 포화 NaCl의 1:1 혼합물 (100 mL) 중에서 용해시키고, CH₂Cl₂(3×100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 (1:1 EtOAc/CHCl₃중 10% MeOH) 표제 화합물 (2.09 g, 66%)을 노란색 고체로 얻었다. MS (ES) m/e 179 (M+H)⁺.

제조예 2

에틸(±)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트의 제조

a) 6-메톡시-1-페닐리덴

주위 온도에서 아르곤하에 Et₂O (680 mL, 2.04 mol) 중의 3.0 M 페닐마그네슘 브로마이드의 용액을 교반하면서 Et₂O (700 mL)로 희석하고, THF (1400 mL) 중의 6-메톡시-1-인단온 (277 g, 1.71 mol)의 용액을 1 시간 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 주변 온도에서 2 시간 동안 교반한 후, 교반하면서 포화 NH₄Cl (2.8 L)에 부었다. 물 (1.4 L)을 첨가하고, 유기상을 분리하였다. 수상을 Et₂O (2×1 L)로 추출하고, 합한 유기 추출물을 농축하여 조 6-메톡시-1-페닐-1-인단올 (445 g)을 갈색 오일로 얻었다. 이 오일을 톨루엔 (2.5 L) 중에 용해하고, p-톨루엔술폰산 일수화물 (12.3 g, 0.065 mol)을 첨가하였다. 용액을 교반하고, 16 시간 동안 콘덴서에서 딘-스탁 트랩을 사용하여 환류 가열하였다. 물 수집은 2 시간 후에 최소가 되었고, 총 28 mL가 되었다. 용액을 냉각시키고, 이어서 5% 수성 Na₂CO₃(1 L)와 물 (2 ×1 L)로 추출하였다. 유기상을 농축하여 짙은 갈색 오일 (400 g)을 얻었다. 이 오일을 진공하에 희석하여 표제 화합물 (298.2 g, 79%)을 노란색 오일로 얻었다. 비점 152-190 ℃/2.0 토르; TLC (10% EtOAc/헥산) Rf 0.75.

b) 2-벤조일-4-메톡시페닐아세트산

아세톤 (4.2 L)을 10 ℃로 냉각시키고, 아세톤 (1.8 L) 중의 6-메톡시-1-페닐리덴 (271 g, 1.22 mol)의 용액을 1.5 시간 동안 존스 시약 (1.8 L, CrO₃(470 g, 4.70 mol), 물 (1 L), 및 진한 H₂SO₄(405 mL)로 제조됨)과 함께 첨가하였다. 4% 수성 OsO₄(153 mL)를 생성된 혼합물에 부분적으로, 첨가 초기에 한 번, 중간 즈음에 2 회 첨가하고, 반응 혼합물의 온도를 15 ℃ 이하로 유지하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 22 ℃까지 가온하고, 1.5 시간 동안 교반하고, 이 동안 온화한 발열이 28 ℃까지 온도를 증가시켰다. 이후, 반응 혼합물을 20 ℃ 이하로 냉각시키고, 초기의 발열리 줄어든 후, 이소프로판올 (1 L)을 초기에 빠르게 적가시켰다. 이러한 상에서는 교반이 어려웠다. 이소프로판올 첨가 동안에 온도는 32 ℃에 이르렀다. 물 (2 L)을 첨가하고, 혼합물을 분별 깔때기로 옮겼다. 추가의 물을 첨가하여 침전된 크롬산을 용해시키고, 혼합물을 CH₂Cl₂(2 L)로 추출하였다. 유기상(윗층)을 분리하고, 수상을 CH₂Cl₂(2×1 L)로 추출하였다. 합한 CH₂Cl₂추출물을 이어서 물 (2 L)로 세척하고, 염수 (2 L)로 포화시킨 후, 농축시켜 습윤 회색 고체 (416 g)를 얻었다. 이를 아세톤과 EtOAc의 혼합물로 분쇄하고, 여과시키고 건조하여 표제 화합물 (225.4 g, 71%)을 회백색 고체로 얻었다. 융점 158-159 ℃.

c) 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산

2-벤조일-4-메톡시페닐아세트산 (215.5 g, 0.80 mol)을 2 등량으로 나누고, 각각을 2.5 L 압력병 중의 빙초산 (1.5 L) 중에서 용해시켰다. 5% Pd/C (10 g, 0.0048 mol)을 각각에 첨가하고, 각 혼합물을 파르 기구 상의 수소하에 주변 온도에서 진탕하였다. 2.5 시간 후, 혼합물을 여과하여 촉매를 제거하고, 여과 패드를 EtOAc로 세척하였다. 합한 여액을 농축시켜 표제 화합물 (215 g, 정량적)을 짙은 노란색 오일로 얻고, 방치시 결정화되었다.

d) 10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온

CH₂Cl₂(1 L) 중의 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산 (204.6 g (0.80 mol)의 순수한 물질을 함유하는 215 g의 조 물질)을 주변 온도에서 아르곤하에 교반하고, DMF (1 mL)를 첨가한 후 옥살릴클로라이드 (400 mL, 4.59 mol)를 첨가하였다. 옥살릴클로라이드를 1 시간 동안 첨가하고, 초기에 적가하여 격렬한 기체 발생을 조절하였다. 용액을 16 시간 동안 주변 온도에서 교반한 후, 농축하여 조 산 염화물 (207.7 g, 0.756 mol, 95%)을 노란색 액체로 얻었다. 이 액체를 CH₂Cl₂에 용해시켜 총 부피가 500 mL가 되게 하고, 용액 및 AlCl₃(100.8 g, 0.756 mol)을 주변 온도에서 아르곤하에 교반하며 CH₂Cl₂(3.7 L)에 1 시간 동안 함께 첨가하였다. 온도는 첨가가 끝났을 때 28 ℃였다. 반응 혼합물을 16 시간 동안 주변 온도에서 교반하고, 그 시간 동안 고체가 침전되었다. 물 (1 L)을 첨가하고, 30 분 동안 먼저 적가하였다. 이후, 혼합물을 분리하고 유기상을 물 (1 L) 및 5% 수성 NaHCO₃(1 L)로 세척하였다. 이후, CH₂Cl₂용액을 농축하여 노란색 고체 (175.3 g)를 얻었다. EtOAc/헥산으로부터 재결정하여 표제 화합물 (128 g, 71%)을 얻었다. 융점 107-109 ℃.

e) 에틸(±)-10,11-디히드로-10-히드록시-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트

헥산 중의 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드의 1.0 M 용액 (1282 mL, 1.282 mol)을 -70 ℃에서 아르곤하에 THF (4.0 L)에 첨가한 후, EtOAc (146 mL, 1.49 mol)을 20 분 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 15 분 동안 교반한 후, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (378 mL, 2.5 mol)을 20 분 동안 첨가하였다. 반응 혼합물을 10 분 동안 교반한 후, 무수 THF (1.26 L) 중의 10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]-시클로헵텐-10-온 (119.2 g, 0.50 mol)의 용액을 40 분 동안 적가하였다. 이 첨가 동안 온도를 -65 ℃ 이하로 유지하였다. 반응 혼합물을 -65 ℃ 내지 -70 ℃에서 20 분 동안 교반한 후 포화 수성 NH₄Cl (6.2 L)에 격렬하게 교반하면서 부었다. 유기층을 분리하고 수성상을 EtOAc (2×1 L)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 (2×1 L)로 세척한 후, 농축시켜 밝은 갈색 오일 (175 g)을 얻었다. 박층 크로마토그래피 (20% EtOAc/헥산)는 Rf 0.5 (대부분) (원하는 생성물) 및 Rf 0.7 (약간) (회수된 케톤)을 나타냈다. 조 생성물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 (2 kg, 10% EtOAc/헥산) 표제 화합물 (101 g, 61%)을 노란색 오일로 얻었다.

f) 에틸(±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트

에틸(±)-10,11-디히드로-10-히드록시-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 (101 g, 0.31 mol)를 빙초산 (1.8 L) 중에 용해시키고 12 N HCl (28.5 mL, 0.34 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 5% Pd/C (20 g, 0.0094 mol)를 함유한 2.5 L 압력병에 넣고, 생성된 혼합물을 쟈켓 가열기가 장착된 파르 수소화 장치 상의 수소하에 35 ℃에서 진탕하였다. 18 시간 후, 반응을 주변 온도까지 냉각시키고, 촉매를 여과하여 제거하였다. 여액을 농축시켜 밝은 노란색 오일 (85.1 g)을 얻었다. 이를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 (2 kg, 5% 내지 10% EtOAc/헥산으로 단계 구배) 표제 화합물 (69.1 g, 72%)을 오일로 얻었다.

g) 에틸(±)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트

CH₂Cl₂(150 mL) 중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 (8.5 g, 0.027 mol)의 용액을 아르곤하에 교반하여 -10 ℃까지 냉각시켰다. 에탄티올 (10.7 mL, 0.144 mol)을 첨가한 후 AlCl₃(20.6 g, 0.154 mol)을 15 분 동안 두 부분으로 첨가하였다. 첨가 후 발열이 온도를 0 ℃로 증가시키고, 이후 수조를 사용하여 온도를 25 ℃로 증가시켰다. 반응 혼합물을 2.25 시간 동안 25 내지 30 ℃에서 교반하고, 이 온도에서 빙수에 부었다. 유기상을 분리하고, 메탄올 (100 mL)을 첨가하고, 혼합물을 CH₂Cl₂(2×50 mL)로 추출하였다. 합한 CH₂Cl₂추출물을 물 (250 mL)로 세척한 후, 농축하여 점성 오일 (8.6 g)을 얻었다. 이를 Et₂O (150 mL)로 용해시키고, 에테르를 끓여 없애고 이를 헥산으로 대체하였다. 원하는 페놀은 먼저 오일로 분리하고 주변 온도에서 교반하면 결정화되었다. 고체의 두 수확물을 모아서 표제 화합물 (7.1 g, 89%)을 얻었다. 융점 110-112 ℃.

제조예 3

에틸(±)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트의 에난티오머의 HPLC 분리

a) 에틸(R)-(+)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]-시클로헵텐-10-아세테이트 및 에틸(S)-(-)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트

에틸(±)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트를 하기 조건을 사용하여 그의 에난티오머에 용해시켰다; 다이셀 키랄셀 (Daicel Chiralcel) OJ (등록상표)(21.2×250 mm), 헥산 이동상 중의 20% 에탄올, 15 mL/분 유속, 254 nm에서 uv 검출, 140 mg 주입, 에틸(S)-(-)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헥센-10-아세테이트에 대한 t_R=10.4 분, 에틸(R)-(+)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헥센-10-아세테이트에 대한 t_R= 13.1 분.

제조예 4

10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온의 제조

a) 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산

문헌 [J.Med. Chem. 1981, 24, 998]의 방법에 의해서 제조된 빙초산 (600 mL) 중의 2-벤조일-4-메톡시페닐아세트산 (13.0 g, 0.048 mol)의 용액을 아르곤하에 4.3 g의 10% Pd/C로 처리하고, 17 시간 동안 50 psi에서 수소화시켰다. 혼합물을 셀라이트 (등록 상표)를 사용하여 여과하고, 여액을 농축시키고, 톨루엔과 메틸렌클로라이드로부터 재농축하여 14.2 g의 표제 화합물을 얻었다.

b) 10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-온

벤젠 (120 mL)과 티오닐클로라이드 (28 mL) 중의 2-벤질-4-메톡시페닐아세트산 (14.2 g, 0.055 m)의 용액을 1 시간 동안 환류시키고 농축시켰다. 산 염화물을 무수 메틸렌클로라이드 (40 mL)에 용해시키고, 용액을 아르곤하에 메틸렌클로라이드 (600 mL) 중의 AlCl₃(14.7 g, 0.11 mol)의 용액에 적가하였다. 반응을 2.5 시간 동안 실온에서 아르곤하에 교반한 후, 빙수 (200 mL)로 켄칭하였다. 층을 분리시키고, 이어서 유기상을 10% NaOH 용액, 물 및 묽은 HCl로 세척하였다. 생성된 용액을 에테르 (200 mL)로 희석하고, MgSO₄로 건조시키고 농축하였다. 고체 잔유물을 에테르/헥산 (1:1)로 분쇄하고, 9.35 g의 표제 화합물을 여과하여 모았다.

제조예 5

에틸(±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트의 제조

a) 에틸(±)3-(3-메톡시페닐)인덴아세테이트

문헌 [J. Med. Chem. 1981, 24, 998]에 의해 제조된 0 ℃에서 THF (15 mL) 중의 3-(3-메톡시페닐)인덴 (4 g, 18 mmol)의 차가운 용액에 LiN(TMS)₂(20 mL, THF 중의 1M)의 용액을 5 분 동안 적가하였다. 생성된 용액을 -78 ℃에서 30 분 동안 THF (15 mL) 중의 에틸 브로모아세테이트의 용액 (3.34 g, 20 mmol)에 적가하였다. 2.5 시간 후, 혼합물을 포화 염화암모늄 용액으로 켄칭하고, 층을 분리하였다. 유기층을 MgSO₄로 건조시키고, 농축시켜 조 생성물을 얻고 이를 컬럼 크로마토그래피(SiO₂/2-4% EtOAc/헥산)로 정제하여 표제 화합물 (1.1 g)을 얻었다.

b) 에틸(±)3-[(3-메톡시벤조일)]페닐숙시네이트

문헌 [J. Org. Chem. 1993, 58, 4745]의 방법에 따라서 아세톤 (30 mL) 중의 에틸(±)3-(3-메톡시페닐)인덴아세테이트 (1.1 g, 3.6 mmol)의 용액을 사산화오스뮴 (0.5 mL)의 4% 수용액으로 처리한 후 1.2 M 존스 시약 (5 mL, 6 mmol)을 적가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 짙은 반응 혼합물을 이소프로판올 (2.5 mL)로 켄칭한 후 이황화나트륨 (0.9 g)과 물 (30 mL)로 켄칭하였다. 생성물을 에틸아세테이트로 추출하고, 염수로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고 농축시켜 고체 잔류물을 얻었다. 1:1 에테르/헥산으로 분쇄하여 0.76 g의 표제 화합물을 얻었다.

c) 에틸(±)3-[(3-메톡시벤질)]페닐숙시네이트

빙초산 (35 mL) 중의 에틸(±)3-[(3-메톡시벤조일)]페닐숙시네이트(0.76 g, 2.1 mmol)와 10% Pd/C (0.6 g)의 혼합물을 17 시간 동안 50 psi에서 수소화하였다. 혼합물을 셀라이트 (등록 상표)를 사용하여 여과하고, 여과 패드를 아세트산으로 세척하였다. 여액을 농축하고 톨루엔과 메틸렌클로라이드로부터 재농축시켜 0.65g의 표제 화합물을 얻었다.

d) 에틸(±)-10,11-디히드로-3-메톡시-11-옥소-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트

무수 메틸렌클로라이드 (10 mL) 중의 에틸 (±)3-[(3-메톡시벤질)]페닐숙시네이트 (0.65 g, 1.9 mmol)의 자기적으로 교반된 용액에 DMF (0.2 mL)와 옥살릴클로라이드 (0.2 mL, 2.28 mmol)를 첨가하였다. 1.5 시간 후, 용액을 무수 메틸렌클로라이드 (15 mL) 중의 염화알루미늄 (0.6 g, 4.5 mmol)의 현탁액에 적가하였다. 혼합물을 2 시간 후 빙수로 켄칭하고, 층들을 분리하고, 수층을 메틸렌클로라이드로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO₄로 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 컬럼크로마토그래피로 정제하여 (SiO₂/2-4% EtOAc/헥산) 표제 화합물 (0.3 g)을 얻었다.

e) 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트

빙초산 (25 mL) 중의 에틸 (±)-10,11-디히드로-3-메톡시-11-옥소-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 (0.3 g, 0.93 mmol)과 10% Pd/C의 혼합물을 18 시간 동안 50 psi에서 수소화하였다. 혼합물을 셀라이트 (등록 상표)를 사용하여 여과하고, 아세트산으로 세척하였다. 여액을 농축하고 톨루엔과 메틸렌클로라이드로부터 재농축하여 0.25 g의 표제 화합물을 얻었다.

하기 실시예는 중간체 화합물, 예를 들어 상기 제조예에 기재된 중간체 화합물로부터 생물학적으로 활성인 본 발명의 화합물을 제조하는 방법을 예시한다.

실시예 1

(S)-10,11-디히드로-3-[2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산의 제조

a) 에틸 (S)-10,11-디히드로-3-[2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트

무수 THF (5 mL) 중의 에틸(S)-10,11-디히드로-3-히드록시-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 (200 mg, 0.67 mmol), 2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에탄올 (241 mg, 1.35 mmol) 및 PPh₃(354 mg, 1.35 mmol)의 용액에 0 ℃에서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (0.27 mL, 1.35 mmol)를 첨가하였다. 조를 가온하여 혼합물을 RT까지 가온하였다. 18 시간 후, 혼합물을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 (1:4.5 헥산/Et₂O) 표제 화합물 (94 mg, 31%)을 투명한 오일로 얻었다. MS(ES) m/e 457 (M+H)⁺.

b) (S)-10,11-디히드로-3-[2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세트산

THF/물 (2 mL) 중의 에틸 (S)-10,11-디히드로-3-[2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에톡시]-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐-10-아세테이트 (131 mg, 0.29 mmol)의 용액에 1.0 N LiOH (0.43 mL, 0.43 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 50 ℃까지 가열하였다. 18 시간 후, 혼합물을 RT까지 냉각시키고, Et₂O (2×2 mL)로 세척하였다. 수층을 10% HCl을 사용하여 pH 6으로 산성화시켰다. 생성된 우윳빛 용액을 C-18 결합-용출 칼럼을 통과시켰다 (구배 용출: 용출제로서 물, 이후 20% CH₃CN/물, 이후 CHCl₃). 생성물을 포함하는 분획은 감압하에 농축시켜 표제 화합물 (30 mg, 24%)을 백색 분말로 얻었다. MS(ES) m/e 429 (M+H)⁺.

실시예 2

비경구 투여 단위 조성물

무균 건조 분말로서 실시예 1의 화합물 20 mg을 함유하는 제제를 다음과 같이 제조하였다. 이 화합물 20 mg을 증류수 15 mL에 용해시켰다. 용액을 무균 상태에서 여과하여 25 mL 수회-투여용 앰플에 넣고 동결 건조하였다. 정맥내 또는 근육내로 주사시 이 분말에 물 중 5 % 덱스트로오스(D5W) 20 mL를 첨가하여 재구성하였다. 여기서, 투여량은 주입 용적에 의해 결정된다. 또다른 용적의 주사용D5W에 계량 부피의 상기 투여 단위를 첨가함으로써 추가로 희석하거나, 또는 IV 점적 주입 또는 기타 주사-주입계용 병 또는 백에서와 같이 계량 투여량을 약물 분산용의 또다른 메카니즘에 첨가할 수 있다.

실시예 3

경구 투여 단위 조성물

실시예 1의 화합물 50 mg을 락토오스 75 mg 및 마그네슘 스테아레이트 5 mg과 함께 혼합 및 분쇄하여 경구 투여용 캅셀제를 제조하였다. 생성된 분말을 선별하여 경질의 젤라틴 캅셀에 충전하였다.

실시예 4

경구 투여 단위 조성물

수크로오스 20 mg, 황산칼슘 이수화물 150 mg 및 실시예 1의 화합물 50 mg을 10 % 젤라틴 용액과 함께 혼합 및 과립화하여 경구 투여용 정제를 제조하였다. 습윤 과립을 선별하고 건조하여 전분 10 mg, 탈크 5 mg 및 스테아르산 3 mg과 함께 혼합하여 정제로 압착하였다.

상기 설명에는 본 발명을 수행하고 이용하는 방법이 충분히 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 상기 기재된 특정 실시양태에 한정되는 것이 아니라, 하기 청구 범위내에서 그의 모든 변형을 포함한다. 본 명세서에 인용된 문헌, 특허 및 다른 간행물에 대한 여러 참조는 선행 기술을 포함하며 상기 참조 문헌은 본 명세서에 마치 전부 개시되어 있는 것처럼 참고 문헌으로 인용된다.

Claims

화학식 (I)에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.

<화학식 I>
제1항에 따른 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
제1항에 따른 화합물, 항종양제 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
제3항에 있어서, 항종양제가 토포테칸인 제약 조성물.
제3항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴인 제약 조성물.
제1항에 따른 화합물을 그를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, α_vβ₃수용체의 길항을 요하는 질병 상태의 치료 방법.
제1항에 따른 화합물을 그를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는 α_vβ₅수용체의 길항을 요하는 질병 상태의 치료 방법.
제1항에 따른 화합물을 그를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는 골다공증의 치료 방법.
제1항에 따른 화합물을 그를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는 혈관 생성의 억제 방법.
제1항에 따른 화합물을 그를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는 종양 성장 또는 종양 전이의 억제 방법.
제1항에 따른 화합물을 그를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는 아테롬성 동맥경화증 또는 재협착증의 치료 방법.
제1항에 따른 화합물을 그를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는 염증의 치료 방법.
제1항에 따른 화합물 및 항종양제를 차례로 또는 물리적 조합물로 하여 투여하는 것을 포함하는 종양 성장의 억제 방법.
제13항에 있어서, 항종양제가 토포테칸인 방법.
제13항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴인 방법.
화학식 (II)에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.

<화학식 II>
디이소프로필 아조디카르복실레이트와 트리페닐포스핀 사이에 형성된 착물로 매개된 반응으로 하기 화학식 (III)의 화합물을 2-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-1-에탄올과 반응시키고, 수성 염기를 사용하여 에스테르 가수분해시키는 것을 포함하는 제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 제조 방법.

<화학식 III>
제1항에 있어서, 의약으로서 사용되는 화합물.
제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 α_vβ₃수용체의 길항을 요하는 질병의 치료용 의약의 제조를 위한 용도.
제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 α_vβ₅수용체의 길항을 요하는 질병의 치료용 의약의 제조에서의 용도.
제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 골다공증의 치료용 의약의 제조에서의 용도.
제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 혈관 생성의 억제용 의약의 제조에서의 용도.
제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 종양 성장 또는 종양 전이 억제용 의약의 제조에서의 용도.
제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 아테롬성 동맥경화증 또는 재협착증의 치료용 의약의 제조에서의 용도.
제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 염증 치료용 의약의 제조에서의 용도.
차례로 또는 물리적 조합물로 하여 투여하는 제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 및 항종양제의 종양 성장 억제용 의약의 제조에서의 용도.
제26항에 있어서, 항종양제가 토포테칸인 용도.
제26항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴인 용도.
차례로 또는 물리적 조합물로 하여 투여하는 제1항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 및 항종양제의 골다공증 치료용 의약의 제조에서의 용도.