KR20010024247A

KR20010024247A - 비트로넥틴 수용체 길항제

Info

Publication number: KR20010024247A
Application number: KR1020007003088A
Authority: KR
Inventors: 더크 히어딩
Original assignee: 스튜어트 알. 수터; 스미스클라인 비참 코포레이션; 스티븐 베네티아너; 피터 존 기딩스
Priority date: 1997-09-24
Filing date: 1998-09-24
Publication date: 2001-03-26
Also published as: NO20001514L; PL339413A1; EP1017387A1; CA2303846A1; JP2002528380A; CN1273529A; IL135189A0; TR200000792T2; AU9577498A; BR9813208A; HUP0003949A2; EP1017387A4; WO1999015170A1; NO20001514D0

Abstract

본 발명은 비트로넥틴 수용체 억제제이며, 골다공증의 치료에 유용한 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

＜화학식 I＞

Description

비트로넥틴 수용체 길항제 {Vitronectin Receptor Antagonist}

인테그린은 다양한 세포상에서 발현되는 트랜스멤브레인 당단백질인 세포유착 수용체의 슈퍼패밀리 (superfamily)이다. 이들 세포표면유착 수용체는 gpIIb/IIIa (피브리노겐 수용체) 및 α_vβ₃(비트로넥틴 수용체)를 포함한다. 피브리노겐 수용체 gpIIb/IIIa는 혈소판 표면에서 발현되고, 출혈이 있는 상처 부위에서 혈소판 응집 및 지혈성 혈병의 형성을 매개한다 (Philips, et al., Blood., 1988, 71, 831). 비트로넥틴 수용체 α_vβ₃는 내피, 평활근, 파골세포 및 종양세포를 비롯한 다수의 세포에서 발현되며, 따라서 이것은 다양한 기능을 갖는다. 파골세포의 막에서 발현되는 α_vβ₃수용체는 골흡수과정의 중심단계인 골기질에 대한 파골세포의 유착을 매개한다 (Ross, et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703). 과도한 골흡수를 특징적으로 나타내는 질병이 골다공증이다. 인간의 대동맥 평활근 세포에서 발현되는 α_vβ₃수용체는 신생맥관내막 (neointima) 내로 이들이 유주하는 것을 매개하는데, 이 과정은 경피관상혈관형성술 후에 재발협착증을 야기시킬 수 있다 (Brown, et al., Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815). 또한, 문헌 (Brooks, et al., Cell, 1994, 79, 1157)에는 α_vβ₃길항제는 맥관유래된 혈관의 세포소멸 (apoptosis)을 유도함으로써 종양퇴행을 촉진시킬 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 비트로넥틴 수용체를 차단하는 약제는 골다공증, 재발협착증 및 암과 같은 질병을 치료하는 데 유용할 수 있다.

비트로넥틴 수용체는 현재 α_vβ₁, α_vβ₃및 α_vβ₅로 명명되는 3가지의 상이한 인테그린과 관계가 있는 것으로 알려져 있다 (Horton, et al., Int. J. Exp. Pathol., 1990, 71, 741). α_vβ₁은 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 결합한다. α_vβ₃은 피브린, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴, 폰빌브란트 인자 (von Willebrand's factor), 오스테오폰틴 및 골 시알로프로테인 I을 비롯한 매우 다양한 리간드와 결합한다. α_vβ₅는 비트로넥틴과 결합한다. 비트로넥틴 수용체 α_vβ₅는 미소혈관계 내피세포를 비롯하여 다양한 형태의 세포의 세포유착에 연관되는 것으로 알려져 있으며 (Davis, et al., J. Cell. Biol., 1993, 51, 206), 혈관형성에서 그의 역할은 문헌 (Brooks, et al., Scinece, 1994, 264, 569)에서 확인되었다. 이 인테그린은 정상적인 피부가 아닌 인간의 상처난 과립형성 조직내의 혈관에서 발현된다.

비트로넥틴 수용체는 트리-펩타이드인 Arg-Gly-Asp (또는 RGD) 모티프를 함유하는 골기질 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 즉, 문헌 (Horton, et al., Exp. Cell Res. 1991, 195, 368)에는 RGD-함유 펩타이드 및 안티-비트로넥틴 수용체 항체 (23C6)가 파골세포에 의한 덴틴 흡수 및 세포확산을 억제하는 것으로 기술되어 있다. 또한, 문헌 (Sato, et al., J. Cell Biol. 1990, 111, 1713)에는 RGD 서열을 함유하는 사독 펩타이드인 에키스타틴이 조직배양물에서 골흡수의 강력한 억제제이며, 뼈에 대한 파골세포의 부착을 억제한다고 기술되어 있다.

본 발명에 이르러, 특정한 화합물이 α_vβ₃및 α_vβ₅수용체의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다. 특히, 이러한 화합물은 피브리노겐 수용체보다 비트로넥틴 수용체에 대해 더 강력한 억제제임이 발견되었다.

본 발명은 비트로넥틴 수용체를 억제하고 염증, 암, 아테롬성 동맥경화증 및 재발협착증과 같은 심혈관 질환, 및 골다공증과 같이 골흡수가 요인인 질병의 치료에 유용한 제약학적 활성 화합물에 관한 것이다.

＜발명의 요약＞

본 발명은 비트로넥틴 수용체를 억제하는 약물학적 활성을 가지며, 염증, 암, 아테롬성 동맥 경화증 및 재발협착증과 같은 심혈관 질환, 및 골다공증과 같이 골흡수가 요인인 질병의 치료에 유용한, 이하에 기술하는 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함한다.

본 발명은 또한, 화학식 I의 화합물 및 제약학적 담체를 함유하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 비트로넥틴 수용체에 의해 매개되는 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적인 일면에서, 본 발명의 화합물은 아테롬성 동맥 경화증, 재발협착증, 염증, 암, 및 골다공증과 같이 골흡수가 요인인 질병을 치료하는 데 유용하다.

상세한 설명

본 발명은 피브리노겐 수용체보다 비트로넥틴 수용체에 대해 더욱 강력한 억제제인 신규한 화합물에 관한 것이다. 신규한 화합물은 질소 함유 치환체가 벤즈아제핀의 방향족 6-원 고리에 존재하고, 산성 잔기를 함유하는 지방족 치환체가 벤즈아제핀의 7-원 고리에 존재하는 벤즈아제핀 핵을 포함하는 것을 특징으로 한다. 벤즈아제핀 고리 시스템은 비트로넥틴 수용체와 유리한 방식으로 상호작용하고, 6 및 7-원 고리의 치환체 측쇄를, 이들 역시 수용체와 유리한 방식으로 상호작용할 수 있도록 배향시키는 것으로 생각된다. 벤즈아제핀의 7-원 고리의 지방족 치환체상의 산성기와 벤즈아제핀의 방향족 6-원 고리 상의 질소 함유 치환체의 질소 사이에는 가장 짧은 분자내 경로를 통할 때 약 12 내지 14개의 공유결합이 존재하는 것이 바람직하다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 포함한다:

이 화합물은 (S)-8-[3-(4-메틸피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세트산이다.

화학식 I의 화합물은 비트로넥틴 및 그밖의 다른 RGD-함유 펩타이드의 비트로넥틴 수용체에 대한 결합을 억제한다. 파골세포상의 비트로넥틴 수용체의 저해는 파골세포성 골흡수를 억제하며, 골다공증 및 골관절염과 같이 골흡수가 발병과정과 관계있는 질병의 치료에 유용하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 오스테오칼신 방출의 증가를 야기시키는 화학식 I의 화합물을 투여함으로써 골형성을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 골생성의 증가는 골절의 치유 및 뼈 골절의 예방과 같이 무기질 침착된 골 질량이 부족하거나 뼈의 리모델링 (remodelling)이 요구되는 질병상태와 관련하여 명백한 잇점이 된다. 골구조의 손실을 야기시키는 질병 및 대사장애에도 이러한 치료가 유익할 수 있다. 예를 들어 부갑상선 기능 항진증, 파제트병, 악성 고칼슘혈증, 골전이에 의해 생성된 골용해성 병소, 부동화 또는 성호르몬 결핍에 기인한 골손실, 베세트병, 골연화증, 과골증 및 골화석증에 본 발명의 화합물을 투여하는 것이 유리할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 여러가지 상이한 형태의 세포의 비트로넥틴 수용체를 억제하기 때문에, 류마티스성 관절염 및 건선과 같은 염증성질환, 및 아테롬성 동맥 경화증 및 재발협착증과 같은 심혈관 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 화학식 I의 화합물은 혈전색전성 질환, 천식, 앨러지, 성인성 호흡 곤란 증후군, 이식편대숙주질환, 기관이식거부반응, 패혈성 쇼크, 습진, 접촉성피부염, 염증성 장질환 및 그밖의 다른 자가 면역 질환을 비롯한 다른 질병의 치료 또는 예방에도 유용할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물은 또한 상처의 치유에 유용할 수도 있다.

본 발명의 화합물은 또한, 혈관 형성성 질병의 예방을 포함한 치료에도 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 혈관 형성성 질병에는 비정상적인 혈관신생이 연루되어 있는 상태가 포함된다. 새로운 혈관의 성장이 질병과 관련된 병변의 원인이거나 그 병에 기여하는 경우에, 혈관형성의 억제는 질병의 유해한 영향을 감소시킬 수 있다. 이러한 질병 표적의 예는 당뇨병성 망막증이다. 유해한 조직이 성장하기 위해 새로운 혈관의 성장이 필요한 경우, 혈관형성의 억제는 그 조직에 대한 혈액공급을 감소시키고, 따라서 혈액공급 요건을 통해 조직 질량의 감소를 야기시킬 수 있다. 이러한 예로는 종양이 성장하기 위해서 혈관신생이 지속적으로 필요한 종양의 성장 및 고형종양의 전이 정착이 포함된다. 즉, 본 발명의 화합물은 종양조직 혈관형성을 억제함으로써 종양전이 및 종양성장을 예방한다.

즉, 본 발명의 방법에 따르면 본 발명의 화합물을 사용하는 혈관형성의 억제는 질병의 증상을 개선시킬 수 있고, 경우에 따라서는 질병을 치유시킬 수 있다.

본 발명의 화합물의 또 다른 치료학적 표적은 혈관신생을 특징적으로 나타내는 안질환이다. 이러한 안질환에는 각막이식, 포진성각막염, 매독성 각막염, 익상편, 및 컨택트렌즈의 사용과 연관된 혈관신생성 판누스 (pannus)와 같은 각막 혈관신생성 질병이 포함된다. 그밖의 안질환으로는 또한 노화-관련된 황반변성, 추정상의 안히스토플라스마증, 미숙아의 망막증 및 혈관신생성 녹내장이 포함된다.

본 발명은 또한 화학식 I의 화합물과 토포테칸 및 시스플라틴과 같은 항종양제를 단계적으로, 또는 물리적 배합물로 투여함으로써 종양성장을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 화합물의 프로드럭 (prodrug)이 포함된다. 프로드럭은 생체내에서 화학식 I에 따른 활성 모약제를 방출시키는 공유 결합된 담체로 간주된다. 즉, 본 발명의 또 다른 측면은 화학식 I의 화합물의 제조를 위한 중간체이기도 한 화학식 II의 신규한 프로드럭 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 III의 신규한 중간체 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

본 명세서에서는 본 발명의 화합물을 설명하기 위해서 펩타이드 및 화학기술 분야에서 통상적으로 사용되는 약어 및 부호가 사용된다. 일반적으로, 아미노산 약어는 문헌 (Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984))에 기술된 바와 같은 생화학명명법에 대한 IUPAC-IUB 공동협약 (IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature)에 따른다.

본 명세서에서 사용되는 것으로 C_1-6알킬은 탄소원자수 1 내지 6의 경우에 따라 치환된 알킬그룹을 의미하며, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 헥실 및 그의 간단한 지방족 이성질체를 포함한다.

특정한 시약은 본 명세서에서 약어로 표기한다. DCC는 디시클로헥실카보디이미드를 나타내며, DMAP는 디메틸아미노피리딘을 나타내고, DIEA는 디이소프로필에틸아민을 나타내며, EDC는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드를 나타낸다. HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸을 나타내고, THF는 테트라히드로푸란을 나타내며, DIEA는 디이소프로필에틸아민을 나타내고, DEAD는 디에틸아조디카르복실레이트를 나타내며, PPh₃는 트리페닐포스핀을 나타내고, DIAD는 디이소프로필아조디카르복실레이트를 나타내며, DME는 디메톡시에탄을 나타내고, DMF는 디메틸포름아미드를 나타내며, NBS는 N-브로모숙신이미드를 나타내고, Pd/C는 탄소상 팔라듐 촉매를 나타내며, PPA는 폴리인산을 나타내고, DPPA는 디페닐포스포릴아지드를 나타내며, BOP는 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 나타내고, HF는 불화수소산을 나타내며, TEA는 트리에틸아민을 나타내고, TFA는 트리플루오로아세트산을 나타내며, PCC는 피리디늄클로로크로메이트를 나타낸다.

화학식 I의 화합물은 1993년 1월 7일에 공개된 본디넬 (Bondinell) 등의 PCT 출원 WO 93/00095호 및 본디넬 등의 PCT 출원 WO 94/14776호 (이들의 전체 기술 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술된 방법에 의해 일반적으로 제조된다.

또한, 화학식 I의 화합물은 하기 반응식에 상세히 설명된 방법에 의해 제조된다.

상기 반응식에서, a) NaH, 4-(트리플루오로메틸)벤질브로마이드, DMF; b) H₂, Pd(OH)₂/C, MeOH; c) 2-[(3-하이드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드, DEAD, (Ph)₃P, CH₂Cl₂; d) 시클로헥산, 10% Pd/C, MeOH; e) 1.0N NaOH, EtOH; f) HCl, H₂O

1993년 1월 7일에 공개된 본디넬 등의 PCT 출원 WO 93/00095호 및 본디넬 등의 PCT 출원 WO 94/14776에 기술된 일반적인 방법에 따라 제조된 화합물 I-1을 비양성자성 용매, 바람직하게는 DMF, THF 또는 이들의 혼합물 중에서 적합한 염기, 일반적으로는 수소화나트륨 또는 리튬비스(트리메틸실릴)아미드의 존재하에 4-(트리플루오로메틸)벤질브로마이드와 반응시켜 비스-알킬화된 생성물 I-2를 수득한다. I-2의 4-(트리플루오로메틸)벤질 에테르를 편리하게는 가수소분해에 의해 제거하여 페놀 I-3을 수득할 수 있다. 벤질 에테르를 가수소분해시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 적절한 문헌군 (예를 들어 Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (Wiley-Interscience에서 발행))에 기술되어 있다. 미쯔노부 (Mitsunobu)-형 커플링반응 (Organic Reactions 1992, 42, 335-656; Synthesis 1981, 1-28)에 따라 화합물 I-3을 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드와 반응시켜 I-4를 수득한다. 이 반응은 디에틸아조디카르복실레이트와 트리페닐포스핀 사이에서 형성된 착물에 의해 매개되며, 비양자성 용매, 예를들어 THF, CH₂Cl₂또는 DMF 중에서 수행한다. I-4의 피리딘 N-옥시드 잔기는 불활성용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올 또는 2-프로판올 중에서 팔라듐 촉매, 바람직하게는 활성탄상의 팔라듐 금속을 사용하여 전이수소화 조건하에서 상응하는 피리딘 I-5로 환원된다. 이러한 형태의 반응에서 수소전이 시약으로는 통상적으로 시클로헥센, 1,4-시클로헥사디엔, 포름산, 및 칼륨포르메이트 또는 암모늄포르메이트와 같은 포름산의 염이 사용된다. I-5의 메틸 에스테르는 수성 염기, 예를 들어 수성 THF 중의 LiOH 또는 수성 메탄올 또는 에탄올 중의 NaOH를 사용하여 가수분해시키고, 중간체 카르복실레이트 염은 적절한 산, 예를 들어 TFA 또는 HCl로 산성화시켜 카르복실산 I-6을 수득한다. 또 다른 방법으로, 원하는 경우에 중간체 카르복실레이트 염을 단리할 수도 있고, 유리 카르복실산의 카르복실레이트 염을 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 제조할 수도 있다.

화합물의 산부가염은 적합한 용매 중에서 모화합물과 염산, 브롬화수소산, 불화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 숙신산 또는 메탄술폰산과 같은 과량의 산으로부터 표준방법으로 제조한다. 양이온성 염은 모화합물을 히드록시드, 카르보네이트 또는 알콕시드와 같이 적절한 양이온을 함유하는 과량의 알칼리성 시약으로, 또는 적절한 유기아민으로 처리함으로써 제조된다. 제약학적으로 허용되는 염에 존재하는 양이온의 구체적인 예는 Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺및 NH₄ ⁺이다.

본 발명은 또한, 화학식 I의 화합물 및 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 따라서, 화학식 I의 화합물은 의약의 제조에 사용될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 전술한 바와 같이 제조된 화학식 I의 화합물의 제약 조성물을 용액 또는 동결건조된 분말로 제제화할 수 있다. 분말은 사용하기 전에 적합한 희석제 또는 그밖의 다른 제약학적으로 적합한 담체를 첨가하여 재조제할 수 있다. 액체제제는 완충된 등장성 수용액일 수 있다. 적합한 희석제의 예는 통상의 등장성 식염수, 표준 5% 덱스트로즈 수용액 또는 완충된 나트륨 또는 암모늄아세테이트 용액이다. 이러한 제제는 특히 비경구 투여에 적합하지만, 경구 투여에 사용할 수도 있고, 흡입을 위해 계량흡입기 또는 분무기에 포함시킬 수도 있다. 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 하이드록시셀룰로즈, 아카시아, 폴리에틸렌글리콜, 만니톨, 염화나트륨 또는 나트륨시트레이트와 같은 부형제를 첨가하는 것이 바람직할 수도 있다.

또 다른 방법으로, 화합물은 캡슐제 또는 정제로 제조하거나, 경구 투여를 위한 유제 또는 시럽으로 제조할 수도 있다. 제약학적으로 허용되는 고상 또는 액상 담체를 첨가하여 조성물을 증량 또는 안정화시키거나, 조성물의 제제화를 용이하게 할 수도 있다. 고상 담체에는 전분, 락토즈, 황산칼슘 이수화물, 백도토, 마그네슘스테아레이트 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴이 포함된다. 액상 담체에는 시럽, 낙화생유, 올리브유, 식염수 및 물이 포함된다. 담체는 또한 글리세릴모노스테아레이트 또는 글리세릴디스테아레이트와 같은 서방성물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 고체담체의 양은 다양하지만, 단위 투여형 당 약 20 ㎎ 내지 약 1 g이 바람직하다. 제약 제제는 정제 형태의 경우에는 분쇄, 혼합, 과립화, 및 필요에 따라 압축; 또는 경질젤라틴 캡슐제 형태의 경우에는 분쇄, 혼합 및 충전을 포함하는 약학분야의 통상적인 기술에 따라 제조한다. 액상 담체가 사용되는 경우에, 제제는 시럽, 엘릭시르, 유제 또는 수성 또는 비수성 현탁액제의 형태이다. 이러한 액상 제제는 경구로 직접 투여하거나 연질젤라틴 캡슐에 충전시킬 수 있다.

직장투여를 위해서, 본 발명의 화합물은 또한 코코아버터, 글리세린, 젤라틴 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 부형제와 배합하여 좌제로 성형할 수도 있다.

본 명세서에 기술된 화합물은 비트로넥틴 수용체의 길항제이며, 근본적인 병변이 비트로넥틴 수용체와 상호작용하는 리간드 또는 세포에 기인하는 질병의 치료에 유용하다. 예를 들어, 이 화합물은 골기질의 손실이 병변을 야기시키는 질병의 치료에 유용하다. 즉, 본 발명의 화합물은 골다공증, 부갑상선 기능 항진증, 파제트병, 악성 고칼슘혈증, 골전이에 의해 생성된 골용해성 병소, 부동화 또는 성호르몬 결핍에 기인한 골손실의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물은 또한 항종양제, 항혈관형성제, 항염증제 및 항전이제로서의 유용성을 가지며, 아테롬성 동맥 경화증 및 재발협착증의 치료에 유용한 것으로 생각된다.

화합물은 약제의 농도가 골흡수 또는 기타 적응증을 억제하기에 충분하도록 환자에게 경구 또는 비경구적으로 투여된다. 화합물을 함유하는 제약 조성물은 환자의 상태에 알맞게 약 0.1 내지 약 50 ㎎/㎏의 경구 투여량으로 투여된다. 바람직한 경구 투여량은 약 0.5 내지 약 20 ㎎/㎏이다. 급성적인 치료의 경우에는, 비경구 투여가 바람직하다. 근육내 환괴 (bolus) 주사가 유용할 수도 있지만, 물 또는 통상의 식염수 중의 5% 덱스트로즈에 녹인 펩타이드 또는 적합한 부형제를 사용하는 유사한 제제를 정맥내 주입하는 것이 가장 효과적이다. 전형적으로 비경구용량은 약 0.01 내지 약 100 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/㎏이다. 화합물을 총일일 투여량이 약 0.4 내지 약 400 ㎎/㎏/일이 되도록 하루에 1 내지 4회 투여한다. 화합물을 투여하는 정확한 정도 및 방법은 치료학적 효과를 갖도록 하는데 필요한 농도와 약제의 혈중 수준을 비교함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정된다.

본 발명은 또한, 화학식 I의 화합물과 비스포스포네이트 (즉, 알렌드로네이트), 호르몬대체요법, 항-에스트로겐 또는 칼시토닌과 같은 그밖의 다른 골흡수 억제제를 단계적으로, 또는 물리적 배합물로 하여 투여함으로써 골다공증을 치료하거나 골손실을 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은골손실을 예방하는 데 유용하고(하거나) 골 질량을 증가시키는 데 유용한, 본 발명의 화합물과 골형태 형생성 단백질인 이프로플라본과 같은 동화성 약제를 사용하는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물과 항종양제를 단계적으로, 또는 물리적 배합물로 투여함으로써 종양성장을 억제하는 방법을 제공한다. 토포테칸, 이리노테칸 및 9-아미노캄프토테신과 같은 캄프토테신 동족체 부류의 화합물, 및 시스플라틴, 오르마플라틴 및 테트라플라틴과 같은 백금 배위착물이 잘 알려져 있는 항종양제의 그룹이다. 캄프토테신 동족체 부류의 화합물은 미국특허 제5,004,758호, 동 제4,604,463호, 동 제4,473,692호, 동 제4,545,880호, 동 제4,342,776호, 동 제4,513,138호, 동 제4,399,276호, EP 특허출원공보 제0 418 099호 및 동 제0 088 642호 및 문헌 (Wani, et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 2358; Wani, et al., J. Med. Chem., 1980, 23, 554; Wani, et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1774; 및 Nitta, et al., Proc. 14th International Congr. Chemotherapy., 1985, Anticancer Section 1, 28) (이들 각각의 기술내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. 백금 배위 착물인 시스플라틴은 플라티놀 (Platinol;등록상표) (브리스톨 마이어스-스퀴브 코아퍼레이션;Bristol Myers-Squibb Corporation 사제)을 사용할 수 있다. 시스플라틴의 유용한 제제는 미국 특허 제5,562,925호 및 4,310,515호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.

화학식 I의 화합물과 항종양제를 단계적으로 또는 물리적 배합물로 투여함으로써 종양성장을 억제하는 방법에서, 백금 배위화합물, 예를 들어 시스플라틴은 저속 정맥주입을 이용하여 투여할 수 있다. 바람직한 담체는 만니톨을 함유하는 덱스트로즈/식염수이다. 백금 배위화합물의 투여스케쥴은 치료의 과정당, 체표면적 제곱미터당 약 1 내지 약 500 ㎎ (㎎/㎡)을 기준으로 할 수 있다. 백금 배위화합물의 주입은 일주일에 1 내지 2회 수행할 수 있으며, 주간 치료를 수회 반복할 수 있다. 비경구적 투여시, 캄프토테신 동족체 부류의 화합물을 사용하는 경우에 일반적으로 사용되는 치료과정은 1일에 체표면적 ㎡당, 약 0.1 내지 약 300.0 ㎎을 약 5일 연속으로 투여하는 것이다. 토포테칸의 경우에 사용되는 치료과정은 약 5일의 연속기간 동안 1일에 체표면적 ㎡당, 약 1.0 내지 약 2.0 ㎎이 가장 바람직하다. 바람직하게는 치료과정을 약 7일 내지 약 28일에 1회 이상 반복한다.

제약 조성물은 화학식 I의 화합물과 항종양제를 모두 동일한 용기를 사용하여 제제화시킬 수 있으나, 다른 용기를 사용하여 제제화하는 것이 바람직하다. 두 가지 약제가 용액 형태로 제공되는 경우에 이들은 동시 투여를 위한 주입/주사 시스템 또는 직렬배열 (tandem arrangement)로 담을 수 있다.

화학식 I의 화합물과 항종양제를 동시에, 또는 다른 시간에 편리하게 투여하기 위해서 상자, 카톤 (carton) 또는 그밖의 다른 용기 등의 하나의 용기 내에, 각각 상술한 바와 같은 비경구 투여를 위한 유효량의 화학식 I의 화합물 및 상술한 바와 같은 비경구투여를 위한 유효량의 항종양제를 함유하는 개개의 병, 백, 바이알 또는 그밖의 다른 용기를 포함하는 키트를 제조한다. 이러한 키트는 예를 들어 경우에 따라 동결건조된 플러그로서 별개의 용기 또는 동일한 용기 내에 두 가지 제약학적 제제, 및 재조제를 위한 용액의 용기를 포함할 수 있다. 이것의 변형으로는 단일용기의 두 개의 챔버 내에 재조제를 위한 용액 및 동결건조된 플러그를 포함하는 것으로서, 이것은 사용하기 전에 혼합이 이루어질 수 있다. 이러한 배열을 갖는 경우에, 항종양제와 본 발명의 화합물은 두 개의 용기 내에 별도로 포장될 수 있거나, 분말로서 함께 동결건조되어 단일용기에 제공될 수 있다.

두 가지 약제가 용액형태로 제공되는 경우에, 이들은 동시투여를 위한 주입/주사 시스템 또는 직렬배열로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물은 정맥주사 형태, 또는 관을 통하여 제 2의 주입백 내의 항종양제에 직렬로 연결된 주입백으로 제공될 수 있다. 이러한 시스템을 사용하여 환자에게 화학식 I의 화합물을 일차적으로 환괴형 주사 또는 주입한 후에, 이어서 항종양제를 주입할 수 있다.

화합물을 몇가지 생물학적 시험중의 하나로 시험하여 소정의 약리학적 효과를 갖는데 필요한 화합물의 농도를 결정할 수 있다.

비트로넥틴 결합의 억제

α_vβ₃에 대한 고체상 [³H]-SK＆F-107260 결합: 완충액 T (2 mM CaCl₂및 1% 옥틸글루코시드 함유) 중의 인간 태반 또는 인간 혈소판 α_vβ₃(0.1-0.3 ㎎/㎖)을 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂(완충액 A) 및 0.05% NaN₃를 함유하는 완충액 T로 희석한 다음, 즉시 웰당 0.1 ㎖로 96-웰 ELISA 플레이트 (Corning, New York, NY)에 가하였다. 웰당 α_vβ₃0.1-0.2 ㎍을 가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 실험시, 웰을 완충액 A로 1회 세척하고 실온에서 한시간 동안 동일한 완충액 중의 3.5% 소혈청알부민 0.1 ㎖과 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션을 한 후, 웰을 완전히 흡인하고 완충액 A 0.2 ㎖로 2회 세척하였다.

화합물을 100% DMSO에 용해시켜 2 mM 모액을 제조하고, 이것을 결합완충액 (15 mM 트리스-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂)을 사용하여 최종 화합물 농도가 100 μM이 되도록 희석시켰다. 그런 다음, 이 용액을 필요한 최종 화합물 농도로 희석시켰다. 다양한 농도의 비표지된 길항제 (0.001-100 μM)를 웰에 3개를 한조로 하여 가하고, 이어서 [³H]-SK＆F-107260 (65-86 Ci/mmol) 5.0 nM을 첨가하였다.

플레이트를 실온에서 한시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 웰을 완전히 흡인하고 빙냉 완충액 A 0.2 ㎖로 웰-대-웰 방식 (well-to-well fashion)으로 1회 세척하였다. 수용체를 1% SDS 0.1 ㎖로 가용화시키고, 결합된 [³H]-SK＆F-107260을 40% 효율의 벡크만 LS 액체섬광계수기 (Beckman LS Liquid Scintillation Counter) 중에서 레디세이프 (Ready Safe) 3 ㎖를 첨가하여 액체섬광계수에 의해 측정하였다. [³H]-SK＆F-107260의 비특이적 결합은 2 μM SK＆F-107260의 존재하에서 측정하였으며, 일관되게 총방사성 리간드 투입량의 1% 미만이었다. IC₅₀([³H]-SK＆F-107260의 결합을 50% 억제하는 길항제의 농도)은 룬던(LUNDON)-2 프로그램으로부터 변형된 비선형 최소자승곡선-조립루틴 (nonlinear, least square curve-fitting routine)에 의해 측정하였다. K_i(길항제의 해리상수)는 식 K_i= IC₅₀/(1+L/K_d)에 따라 계산하였으며, 여기에서 L 및 K_d는 각각 [³H]-SK＆F-107260의 농도 및 해리상수이다.

본 발명의 화합물은 약 0.003 미크로몰의 농도에서 SK＆F-107260에 대한 비트로넥틴 결합을 억제한다.

본 발명의 화합물을 또한, EP 528 587에 기술된 소와 (pit) 형성시험과 같이 골형성의 억제를 평가하기 위한 본 기술분야에서의 표준 시험 방법에 의해 시험관내 및 생체내 골흡수에 대하여 시험하는데, 이 시험방법은 또한 랫트 파골세포 대신에 인간의 파골세포, 및 문헌 (Wronski et al., Cells and Materials 1991, Sup. 1, 69-74)에 기술된 난소 절제된 랫트 모델을 사용하여 수행할 수도 있다.

혈관 평활근세포 유주시험

랫트 또는 인간의 대동맥 평활근세포를 사용하였다. 세포유주는 8 ㎛의 공극이 있는 폴리카보네이트막 (Costar)을 사용하여 트랜스웰 (Transwell) 세포배양 챔버에서 관찰하였다. 필터의 하부표면을 비트로넥틴으로 피복하였다. 세포를 0.2% 소혈청 알부민이 보충된 DMEM 내에 2.5-5.0×10⁶세포/㎖의 농도로 현탁시키고, 다양한 농도의 시험화합물로 20℃에서 20분 동안 전처리하였다. 대조군으로는 용매만을 사용하였다. 세포현탁액 0.2 ㎖를 챔버의 상부구획에 넣었다. 하부구획은 0.2% 소혈청 알부민이 보충된 DMEM 0.6 ㎖를 함유하였다. 인큐베이션은 95% 공기/5% CO₂의 대기중에서 24시간 동안 37℃에서 수행하였다. 인큐베이션 후에, 필터의 상부표면상의 비유주된 세포를 부드럽게 긁어내어 제거하였다. 그 후, 필터를 메탄올 내에서 고정시키고, 10% 김사염색에 의해 염색시켰다. 유주는 a) 필터의 하부표면으로 유주한 세포의 수를 계수하거나, b) 염색된 세포를 10% 아세트산으로 추출한 다음 600 nM에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.

갑상선부갑상선절제된 랫트 모델

각각의 실험군은 5-6 마리의 성숙한 수컷 스프라그-도울리 랫트 (체중 250-400 g)로 구성하였다. 랫트를 사용하기 7일 전에 갑상선부갑상선절제하였다 (판매사 Taconic Farms에 의해). 모든 랫트에게는 매 3일마다 대체 투여량의 타이록신을 투여하였다. 랫트를 받자마자 꼬리 정맥천자에 의해 헤파린 처리된 튜브내로 혈액을 배출시킨 직후에 전혈액 중의 순환하는 이온화된 칼슘 수치를 측정하였다. 이온화된 Ca 수치 (Ciba-Corning model 634 칼슘 pH 분석기로 측정)이 ＜1.2 mM/L이면 랫트를 시험에 포함시켰다. 각각의 랫트에 각각 시험물질의 송달 및 혈액샘플 채취를 위한 내재성 정맥 및 동맥 카테터를 장착시켰다. 그 후 랫트에게 칼슘-비함유 사료 및 탈이온수로 된 식사를 제공하였다. 기본량 Ca 수치를 측정하고, 각각의 랫트에게 대조비히클 또는 인간 부갑상선호르몬 1-34 펩타이드 (hPTH1-34, 용량 식염수/0.1% 소혈청 알부민 중의 1.25 ㎍/㎏/h, Bachem, Ca) 또는 hPTH1-34와 시험물질의 혼합물을 외부 주사기펌프를 사용하여 정맥카테터를 통해 연속적으로 정맥내 주입함으로써 투여하였다. 각각의 랫트의 혈중 칼슘치 반응은 6-8시간의 주입기간 중에 2시간 간격으로 측정한다.

인간 파골세포 흡수 및 유착시험

소와 흡수 및 유착시험은 파골세포종 조직으로부터 유도된 정상적인 인간 파골세포를 사용하여 개발 및 표준화되었다. 시험 1은 레이저 동촛점 현미경검사에 의한 파골세포 소와용적의 측정을 위해 개발하였다. 시험 2는 고처리량 스크린으로서 개발하였는데, 여기에서는 콜라겐 단편 (흡수과정에서 방출됨)을 경쟁적 ELISA에 의해 측정하였다.

시험 1 (레이저 동촛점 현미경검사를 사용)

인간 파골세포종-유도된 세포현탁액의 분취량을 액체질소 저장물로부터 분리하여 37℃에서 신속하게 가온하고, RPMI-1640 배지중에서 원심분리 (1000 rpm, 4℃에서 5분)하여 1회 세척한다.

배지를 흡인하고, 쥐 안티-HLA-DR 항체로 치환시킨 다음, RPMI-1640 배지중에 1:3으로 희석시킨다. 현탁액을 얼음상에서 30분 동안 인큐베이션시키고 빈번하게 혼합한다.

세포를 냉 RPMI-1640으로 2회 세척하고, 이어서 원심분리 (1000 rpm, 4℃에서 5분)한 다음, 세포를 멸균 15 ㎖ 원심분리관에 옮긴다. 단핵세포의 수를 개량된 뉴바우어 (Neubauer) 계수챔버 내에서 센다.

염소 안티-마우스 IgG (Dynal, Great Neck, NY)로 피복된 충분량의 자기비드 (5/단핵세포)를 그들의 저장병으로부터 꺼내어 신선한 배지 5 ㎖에 넣는다 (이것은 독성 아지드 보존제를 세척제거함). 자석상에 비드를 고착시킴으로써 배지를 제거하고, 신선한 배지로 대체시킨다.

비드를 세포와 혼합시키고, 현탁액을 얼음상에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 현탁액은 빈번하게 혼합시킨다.

비드-피복된 세포를 자석상에 고착시키고, 나머지 세포 (파골세포-풍부 분획)는 멸균 50 ㎖ 원심분리관 내에 기울여 따른다.

비드-피복된 세포에 신선한 배지를 가하여 트래핑된 파골세포를 분리시킨다. 이 세척과정을 10회 반복한다. 비드-피복된 세포는 버린다.

플루오레세인디아세테이트를 사용하여 생존세포를 표지시킴으로써 생존가능한 파골세포의 수를 계수챔버 내에서 센다. 구멍이 큰 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버에 샘플을 가한다.

원심분리에 의해 파골세포를 펠렛화시키고, 10% 태자 송아지 혈청 및 중탄산나트륨 1.7 g/ℓ가 보충된 EMEM 배지내에서 밀도를 적절한 수로 조정한다 (파골세포의 수는 종양에 따라 다양하다).

세포현탁액의 3 ㎖ 분취량 (화합물 처리당)을 15 ㎖ 원심분리관에 경사시킨다. 세포는 원심분리하여 펠렛화시킨다.

각각의 관에 적절한 화합물 처리제 3 ㎖를 가한다 (EMEM 배지로 50 μM로 희석됨). 또한, 적절한 비히클 대조군, 양성대조군 (100 ㎍/㎖로 희석된 안티-비트로넥틴 수용체 쥐 모노클로날 항체 [87MEM1]) 및 동위원소 대조군 (100 ㎍/㎖로 희석된 IgG_2a)이 포함된다. 샘플은 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다.

세포의 0.5 ㎖ 분취량을 48-웰 플레이트내의 멸균 상아질 박편상에 접종하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 각각의 처리는 4개를 한조로 하여 선별한다.

박편을 가온된 PBS (6-웰 플레이트 내에서 10 ㎖/웰)를 6회 교환하여 세척한 다음, 화합물 처리제 또는 대조 샘플을 함유하는 신선한 배지에 넣는다. 샘플을 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다.

타트레이트 내성 산포스파타제 (TRAP) 방법 (파골세포 계통 세포에 대한 선택적 염색)

부착되어 있는 파골세포를 함유하는 뼈의 박편을 포스페이트 완충된 식염수로 세척하고, (0.2 M 나트륨카코딜레이트 중의) 2% 글루타르알데히드 내에서 5분 동안 고정시킨다.

그 후, 이들을 물로 세척하고, 37℃의 TRAP 완충액 (N,N-디메틸포름아미드에 용해되고 10 mM 나트륨타트레이트를 함유하는 0.25 M 시트레이트 완충액 (pH 4.5)과 혼합시킨 AS-BI 포스페이트 0.5 ㎎/㎖) 중에서 4분 동안 인큐베이션시킨다.

냉수 중에서 세척한 다음, 박편을 훼스트레드가넷 (fast red garnet) 1 ㎎/㎖를 함유하는 냉 아세테이트 완충액 (0.1 M, pH 6.2)에 침지시켜 4℃에서 4분 동안 인큐베이션시킨다.

과잉의 완충액을 흡인하고, 박편을 공기중에서 건조시킨 다음 물로 세척한다.

TRAP 양성 파골세포 (붉은 벽돌색/자주색 침전물)를 명시야 현미경 검사로 센 다음, 초음파처리하여 상아질 표면으로부터 제거한다.

소와 용적을 니콘/레이저텍 (Nikon/Lasertec) ILM21W 동촛점 현미경을 사용하여 측정한다.

시험 2 (ELISA 판독치를 이용)

인간 파골세포를 시험 1의 초기 9 단계에 기술된 바와 같이 풍부화시키고, 화합물 선별을 위해 준비한다. 명백히 하기 위해 이들 단계를 이하에 반복한다.

인간 파골세포종-유도된 세포 현탁액의 분취량을 액체질소 저장물로부터 분리하여 37℃에서 신속하게 가온하고, RPMI-1640 배지 중에서 원심분리 (1000 rpm, 4℃에서 5분)하여 1회 세척한다.

세포를 냉 RPMI-1640으로 2회 세척하고, 이어서 원심분리 (1000 rpm, 4℃에서 5분)한 다음, 세포를 멸균 15 ㎖ 원심분리관에 옮긴다. 단핵세포의 수를 개량된 뉴바우어 계수챔버 내에서 센다.

비드-피복된 세포에 신선한 배지를 가하여 트래핑된 파골세포를 분리시킨다. 이 세척과정은 10회 반복한다. 비드-피복된 세포는 버린다.

시험 1에서 상술한 방법과는 대조적으로, 화합물은 이하에 개략적으로 설명하는 바와 같이 4 가지 용량으로 선별하여 IC₅₀을 구한다.

파골세포 제제를 시험화합물 (4 가지 용량) 또는 대조군과 함께 37℃에서 30분 동안 전인큐베이션시킨다.

그후, 이들을 48-웰 조직배양 플레이트의 웰내의 소의 피질성골 박편상에 접종하고 37℃에서 추가로 2시간 동안 인큐베이션시킨다.

골박편을 가온된 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)를 6회 교환하여 세척하여 비부착세포를 제거한 다음, 신선한 화합물 또는 대조군을 함유하는 48-웰 플레이트의 웰에 다시 넣는다.

그 후, 조직배양 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다.

각각의 웰로부터 상등액을 각각의 관으로 흡인시키고, 흡수과정에서 방출되는 타입 I 콜라겐의 c-텔로펩타이드 (telopeptide)를 검출하는 경쟁적 ELISA에 의해 선별한다. 이것은 타입 I 콜라겐의 a1-쇄의 카복시-말단 텔로펩타이드에 존재하는 8-아미노산 서열 (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg)과 특이적으로 반응하는 토끼 항체를 함유하는 시판 ELISA (Osteometer, Denmark)이다. 결과는 비히클 대조군과 비교한 흡수억제율 %로 나타낸다.

인간 파골세포 유착시험

배지를 흡인하고, 쥐 안티-HLA-DR 항체로 치환시킨 다음, RPMI-1640 배지중에 1:3으로 희석한다. 현탁액을 얼음상에서 30분 동안 인큐베이션시키고 빈번하게 혼합한다.

염소 안티-마우스 IgG (Dynal, Great Neck, NY)로 피복된 충분량의 자기비드 (5/단핵세포)를 그들의 저장병으로부터 꺼내어 신선한 배지 5 ㎖에 넣는다 (이것은 독성 아지드 보존제를 세척제거한다). 자석상에 비드를 고착시킴으로써 배지를 제거하고, 신선한 배지로 대체시킨다.

원심분리에 의해 파골세포를 펠렛화시키고, 10% 태자 송아지 혈청 및 중탄산나트륨 1.7 g/ℓ가 보충된 EMEM 배지내에서 밀도를 적절한 수로 조절한다 (파골세포의 수는 종양에 따라 다양하다).

파골세포종-유도된 파골세포를 화합물 (4 가지 용량) 또는 대조군과 37℃에서 30분 동안 전인큐베이션시킨다.

그후, 세포를 오스테오폰틴-피복된 슬라이드 (인간 또는 랫트의 오스테오폰틴, 2.5 ㎍/㎖) 상에 접종하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다.

슬라이드를 포스페이트 완충된 식염수중에서 격렬히 세척함으로써 비부착세포를 제거하고, 슬라이드상에 남아있는 세포를 아세톤으로 고정시킨다.

파골세포를 이 표현형의 세포에 대한 선택적 마커인 타트레이트-내성 산포스파타제 (TRAP)에 대해 염색하고 (참조, 단계 15-17), 광학현미경 검사로 수를 센다. 결과는 비히클 대조군과 비교한 유착억제율 %로 나타낸다.

세포유착시험

세포 및 세포배양

인간의 배아신장세포 (HEK293 세포)를 ATCC (Catalog No. CRL 1573)로부터 입수하였다. 세포를 얼염 (Earl's salts), 10% 태자 소혈청, 1% 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 얼 최소필수배지 (EMEM)에서 성장시킨다.

작제물 및 형질감염 (transfection)

α_v서브유니트의 3.2 kb EcoRI-KpnI 단편 및 β₃서브유니트의 2.4 kb XbaI-XhoI 단편을 평활말단 연결에 의해 CMV 프로모터 및 G418 식별가능한 마커를 함유하는 pCDN 벡터 (Aiyar et al., 1994)의 EcoRI-EcoRV 클로닝 부위에 삽입한다. 안정적인 발현을 위해, 80×10⁶HEK 293 세포를 진펄서 (Gene Pulser; Hensley et al., 1994)를 사용하여 α_v+β₃작제물 (각각의 서브유니트 20 ㎍ DNA)로 전기적형질전환시키고, 100 ㎜ 플레이트에 도말하였다 (5×10⁵세포/플레이트). 48시간 후에, 성장배지에 제네티신 (G418 Sulfate, GIBCO-BRL, Bethesda, MD) 450 ㎍/㎖를 보충하였다. 시험하기에 충분할 정도로 콜로니가 커질 때까지 세포를 선택배지에 유지시켰다.

형질감염된 세포의 면역세포화학적 시험

HEK 293 형질감염체 (transfectant)가 비트로넥틴 수용체를 발현하였는지 여부를 측정하기 위해, 세포를 유리 현미경 슬라이드상에 원심분리에 의해 고착시키고, 실온에서 2분 동안 아세톤으로 고정시킨 다음 공기건조시켰다. α_vβ₃복합체에 대해 특이적인 모노클로날 항체인 23C6과의 특이적 반응성은 표준 간접면역형광방법을 사용하여 입증하였다.

세포유착시험

코닝 (Corning) 96-웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 인간 비트로넥틴 (RPMI 배지중의 0.2 ㎍/㎖) 0.1 ㎖로 전피복시켰다. 실험시, 플레이트를 RPMI 배지로 한 번 세척하고, RPMI 배지 중의 3.5% BSA로 실온에서 한 시간 동안 차단시켰다. 형질감염된 293 세포를 20 mM 헤페스 (Hepes), pH 7.4 및 0.1% BSA가 보충된 RPMI 배지에 0.5×10⁶세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 세포현탁액 0.1 ㎖를 각각의 웰에 가하고 다양한 α_vβ₃길항제의 존재 또는 부재하에 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후에, pH 7.4의 10% 포름알데히드 용액 0.025 ㎖를 가하고, 세포를 실온에서 10분 동안 고정시켰다. 플레이트를 RPMI 배지 0.2 ㎖로 3회 세척하고, 부착세포를 0.5% 톨루이딘블루 0.1 ㎖로 실온에서 20분 동안 염색하였다. 과잉의 염색제를 탈이온수를 사용한 집중적 세척에 의해 제거하였다. 세포내에 혼입된 톨루이딘블루를 50 mM HCl을 함유하는 50% 에탄올 0.1 ㎖를 첨가하여 용출시켰다. 세포유착은 마이크로타이터 플레이트 판독기 (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA) 상에서 600 ㎚의 흡광도를 통해 정량화하였다.

고체상 α_vβ₅결합시험:

인간의 태반으로부터 비트로넥틴 수용체 α_vβ₅를 정제하였다. 수용체 제제를 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂(완충액 A)로 희석시키고, 즉시 96-웰 ELISA 플레이트에 웰당 0.1 ㎖씩 가하였다. 웰당 α_vβ₃0.1-0.2 ㎍을 가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 실험시에, 웰을 완충액 A로 한번 세척하고, 동일한 완충액 중의 3.5% 소혈청 알부민 0.1 ㎖와 함께 실온에서 한시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후에, 웰을 완전히 흡인하고, 완충액 A 0.2 ㎖로 2회 세척하였다.

[³H]-SK＆F-107260 경쟁시험에서, 다양한 농도의 비표지된 길항제 (0.001-100 μM)를 웰에 가하고, 이어서 [³H]-SK＆F-107260 5.0 nM을 가하였다. 플레이트를 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후에, 웰을 완전히 흡인하고 웰-대-웰 방식으로 빙냉 완충액 A 0.2 ㎖로 한번 세척하였다. 수용체를 1% SDS 0.1 ㎖로 가용화시키고, 결합된 [³H]-SK＆F-107260을 40% 효율의 벡크만 LS 액체섬광계수기 중에서 레디세이프 3 ㎖를 첨가하여 액체섬광계수로 측정하였다. [³H]-SK＆F-107260의 비특이적 결합은 SK＆F-107260 2 μM의 존재하에서 측정하였으며, 일관되게 총방사성 리간드 투입량의 1% 미만이었다. IC₅₀([³H]-SK＆F-107260의 50% 결합을 억제하는 길항제의 농도)은 룬던-2 프로그램으로부터 변형된 비선형 최소자승곡선-조립루틴에 의해 측정하였다. K_i(길항제의 해리상수)는 쳉과 프루소프식 (Cheng and Prusoff equation) K_i= IC₅₀/(1+L/K_d)에 따라 계산하였으며, 여기에서 L 및 K_d는 각각 [³H]-SK＆F-107260의 농도 및 해리상수이다.

RGD-매개된 GPIIb-IIIa 결합의 억제

GPIIb-IIIa의 정제

유효기간이 지난, 세척한 인간혈소판 (Red Cross로부터 입수) 10 유니트를 4℃에서 2시간 동안 3% 옥틸글루코시드, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2mM CaCl₂중에서 온화하게 교반하여 용해시켰다. 용해물을 100,000 g으로 한 시간 동안 원심분리시켰다. 수득된 상등액을 20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2mM CaCl₂, 1% 옥틸글루코시드 (완충액 A)로 전평형화시킨 5 ㎖ 렌틸 렉틴 세파로즈 4B 칼럼 (E.Y. Labs)에서 전개시켰다. 2시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 칼럼을 냉완충액 A 50 ㎖로 세척하였다. 렉틴-보유된 GPIIb-IIIa를 10% 덱스트로즈를 함유하는 완충액 A로 용출시켰다. 모든 과정은 4℃에서 수행하였다. 수득된 GPIIb-IIIa는 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 확인되는 바와 같이 ＞95% 순수하였다.

리포좀내에 GPIIb-IIIa의 혼입

포스파티딜세린 (70%)과 포스파티딜콜린 (30%)의 혼합물 (Avanti Polar Lipids)을 질소스트림 하에서 유리관 벽에 건조시켰다. 정제된 GPIIb-IIIa를 최종농도 0.5 ㎎/㎖로 희석시키고, 1:3 (w:w)의 단백질:인지질 비로 인지질과 혼합시켰다. 혼합물을 재현탁시키고 중탕초음파기 (bath sonicator)중에서 5분 동안 초음파처리하였다. 그 후, 혼합물을 1000-배 과량의 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(2회 교환)에 대해 12,000-14,000 분자량 컷오프 (cutoff) 투석관을 사용하여 밤새 투석하였다. GPIIb-IIIa-함유 리포좀을 12000 g에서 15분 동안 원심분리시키고, 투석 완충액에 최종단백질농도가 약 1 ㎎/㎖가 되도록 재현탁시켰다. 리포좀은 필요할 때까지 -70℃에서 저장하였다.

GPIIb-IIIa에 대한 경쟁적 결합

피브리노겐 수용체 (GPIIb-IIIa)에 대한 결합은 RGD-형 리간드로서 [³H]-SK＆F-107260을 사용하여 간접 경쟁적 결합 방법에 의해 시험하였다. 결합시험은 0.22 ㎛ 친수성 듀라포어막 (durapore membrane)을 사용하여 96-웰 여과플레이트 어셈블리 (Millipore Corporation, Bedford, MA)에서 수행하였다. 웰은 10 ㎍/㎖ 폴리리신 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) 0.2 ㎖로 실온에서 한 시간 동안 전피복시켜 비특이적 결합을 차단하였다. 4개가 한조로 된 웰에 다양한 농도의 비표지된 벤즈아제핀을 가하였다. 각 웰에 [³H]-SK＆F-107260을 최종 농도 4.5 nM로 하고, 이어서 정제된 혈소판 GPIIb-IIIa-함유 리포좀 1㎍을 가하였다. 혼합물을 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션시켰다. GPIIb-IIIa-결합된 [³H]-SK＆F-107260을 밀리포어 여과 매니폴드 (manifold)를 사용하여 여과시키고, 이어서 빙냉 완충액으로 세척 (2회, 매회 0.2 ㎖)하여 비결합체로부터 분리시켰다. 필터상에 잔류하는 결합된 방사능을 40% 효율을 갖는 벡크만 액체섬광계수기 (Model LS6800) 중의 1.5 ㎖ 레디솔브 (Ready Solve; Beckman Instruments, Fullerton, CA)에서 계수하였다. 비특이적 결합은 2 μM 비표지된 SK＆F-107260의 존재하에서 측정하였으며, 일관되게 샘플에 첨가된 총방사능의 0.14% 미만이었다. 모든 데이타 포인트는 4개 한조의 측정치의 평균치이다.

경쟁적결합 데이타는 비선형 최소자승곡선 조립방법에 의해 분석하였다. 이 방법은 길항제의 IC₅₀(평형상태에서 [³H]-SK＆F-107260의 특이적 결합을 50% 까지 억제하는 길항제의 농도)을 제공한다. IC₅₀은 쳉과 프루소프식 K_i= IC₅₀/(1+L/K_d)을 기본으로 하는 길항제의 평형해리상수 (Ki)에 관한 것이며, 여기에서 L은 경쟁적 결합시험에서 사용된 [³H]-SK＆F-107260의 농도 (4.5 nM)이고, K_d는 [³H]-SK＆F-107260의 해리상수로서 스캐챠드 분석 (Scatchard analysis)에 의하면 4.5 nM이다.

본 발명의 화합물은 피브리노겐 수용체에 대비한 비트로넥틴 수용체의 친화성이 10:1 이상이다. 이 화합물은 100:1 이상의 활성비를 갖는다.

화학식 I의 화합물을 단독 사용한, 또는 항종양제와 배합한 경우의 효능은 여러가지 이식성 마우스 종양모델을 사용하여 측정할 수 있다. 이들 모델에 대한 상세한 사항은 미국 특허 제5,004,758호 및 동 제5,633,016호를 참고로 한다.

이하의 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니며, 본 발명의 화합물을 어떻게 제조하고 사용하는지를 설명하기 위해 제공된 것이다. 그밖의 다수의 실시태양은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.

일반사항

¹H NMR 스펙트럼은 250 또는 400 MHz에서 기록하였다. 화학적 이동은 내부표준 테트라메틸실란 (TMS)로부터의 하부장 (downfield) ppm (δ)으로 보고하였다. NMR 데이타에 대한 약어는 다음과 같다: s=단일피크, d=이중피크, t=삼중피크, q=사중피크, m=다중피크, dd=이중피크의 이중피크, dt=삼중피크의 이중피크, app=겉보기, br=브로드. J는 헤르쯔 (Hertz)로 측정된 NMR 커플링상수를 나타낸다. CDCl₃는 듀테리오클로로포름이며, DMSO-d₆는 헥사듀테리오디메틸설폭시드이고, CD₃OD는 테트라듀테리오메탄올이다. 적외선 (IR) 스펙트럼은 투과모드로 기록하였으며, 밴드위치는 파동수의 역수 (㎝^-1)로 보고하였다. 질량스펙트럼은 전자분사(electrospray; ER) 이온화기술을 사용하여 수득하였다. 원소분석은 퀀티타티브 테크놀로지스 인코포레이티드 (Quantitative Technologies Inc., Whitehouse, NJ)에 의해 수행하였다. 융점은 토마스-후버 (Thomas-Hoover) 융점측정장치에서 측정하였으며 보정하지 않았다. 모든 온도는 섭씨 온도로 보고하였다. 박층 크로마토그래피를 위해서는 아날테크 실리카겔 (Analtech Silica Gel) GF 및 이. 머크 실리카겔 (E. Merck Silica Gel) 60F-254 박층 플레이트를 사용하였다. 섬광 및 중력 크로마토그래피는 모두 이. 머크 키에젤겔 (E. Merck Kieselgel) 60 (230-400 메쉬) 실리카겔 상에서 수행하였다. 분석용 및 정제용 HPLC는 라이닌 (Rainin) 또는 벡크만 크로마토그래프 상에서 수행하였다. ODS는 옥타데실실릴 유도체화된 실리카겔 지지체를 나타낸다. 5μ 아펙스 (Apex)-ODS는 죤스 크로마토그래피 (Jones Chromatography, 콜로라도주 리틀레톤)에 의해 제조된 공칭 입자크기가 5 μ인 옥타데실실릴 유도체화된 실리카겔 크로마토그래피 지지체를 나타낸다. YMC ODS-AQ (등록상표)는 ODS 크로마토그래피 지지체이며, 와이엠씨 캄파니 (YMC Co., Ltd., 일본 교토)사제이다. PRP-1 (등록상표)은 중합체성 (스티렌-디비닐벤젠) 크로마토그래피 지지체이며, 해밀톤 캄파니 (Hamilton Co., 네바다주 레노)사제이다. 셀라이트 (Celite;등록상표)는 산-세척 규조토 실리카로 구성된 필터 보조제이며, 만빌 코포레이션 (Manville Corp., 콜로라도주 덴버)사제이다.

＜실시예 1＞

(S)-8-[3-(4-디메틸피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세트산의 제조

＜제조예 1＞

메틸 (±)-8-하이드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트의 제조

a) 4-브로모-3-브로모메틸아니솔

2-브로모-5-메톡시톨루엔 (20 g, 0.10 mol), N-브로모숙신이미드 (19.6 g, 0.11 mol), 벤조일퍼옥시드 (1 g, 4 mmol) 및 메틸렌클로라이드 (200 ㎖)의 혼합물을 18시간 동안 조명등을 사용하여 조사하여 온화하게 환류시켰다. 그 후, 혼합물을 여러시간에 동안 -10℃로 냉각시키고, 침전된 숙신이미드로부터 용액을 경사 분리하였다. 용액을 농축시키고, 잔류물을 클로로포름/헥산으로부터 결정화시켜 연황색 프리즘으로서 표제화합물 (19.7 g, 70%)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 7.45 (d, J=8.9 Hz, 1H), 6.99 (d, J=3 Hz, 1H), 6.74 (dd, J=8.9, 3 Hz, 1H), 4.55 (s, 2H), 3.80 (s, 3H).

b) 3-비스(t-부톡시카르보닐)아미노메틸-4-브로모아니솔

디메틸포름아미드 (200 ㎖) 중의 4-브로모-3-브로모메틸아니솔 (24 g, 86 mmol)과 칼륨 디-t-부틸이미노디카르복실레이트 (24 g, 94 mmol)의 혼합물을 아르곤하에 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응액을 진공하에서 농축시키고, 잔류물을 에틸아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기상을 물과 소금물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄) 농축시켰다. 잔류물을 헥산으로부터 재결정화시켜 백색 고체로서 표제화합물 (15 g, 42%)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 7.40 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.68 (m, 2H), 4.81 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 1.44 (s, 18H).

c) 메틸 (±)-3-카르보메톡시-4-[2-비스(t-부톡시카르보닐)아미노메틸-4-메톡시페닐]-3-부테노에이트

500 ㎖ 플라스크를 3-비스(t-부톡시카르보닐)아미노메틸-4-브로모아니솔 (15 g, 36 mmol), 디메틸이타코네이트 (7.5 g, 47 mmol), 트리-o-톨릴포스핀 (1 g, 3 mol), 팔라듐아세테이트 (0.4 g, 2 mmol), 디이소프로필에틸아민 (12.8 ㎖, 72 mmol) 및 프로피오니트릴 (150 ㎖)로 충전시켰다. 혼합물을 아르곤으로 퍼지 (수회의 배기/아르곤 플러쉬 사이클)한 다음, 아르곤하에서 가열하여 한시간 동안 환류시켰다. 반응액을 실온으로 냉각시킨 다음, 빙냉 에틸에테르 (500 ㎖)에 부었다. 생성된 침전을 여과하여 제거하고, 여과액을 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 상에서의 크로마토그래피 (10%-20% 헥산중의 에틸아세테이트)로 정제하여 연황색 오일로서 표제화합물 (11.8 g, 66%)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 7.94 (s, 1H), 7.15 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.77 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H), 4.73 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.38 (s, 2H), 1.45 (s, 18H).

d) 메틸 (±)-3-카르보메톡시-4-[2-비스(t-부톡시카르보닐)아미노메틸-4-메톡시페닐]부타노에이트

메틸 (±)-3-카르보메톡시-4-[2-비스(t-부톡시카르보닐)아미노메틸-4-메톡시페닐]-3-부테노에이트 (11.8 g), 에틸아세테이트 (120 ㎖) 및 10% 목탄상 팔라듐 (1 g)으로 충전된 압력용기를 45 psi의 수소하에서 18시간 동안 진탕하였다. 그후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축시켜 무색 오일로서 표제화합물 (12 g, 100%)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 7.00 (d, J=8.2 Hz, 1H), 6.71 (m, 2H), 4.81 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.73 (m, 2H), 2.42 (dd, J=16.0, 4.8 Hz, 1H), 1.44 (s, 18H).

e) 메틸 (±)-3-카르보메톡시-4-[2-(아미노메틸)-4-메톡시페닐]부타노에이트

클로로포름 (100 ㎖) 및 트리플루오로아세트산 (50 ㎖) 중의 메틸 (±)-3-카르보메톡시-4-[2-비스(t-부톡시카르보닐)아미노메틸-4-메톡시페닐]부타노에이트 (12 g) 의 용액을 아르곤하의 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 진공하에서 농축시켜 점성 오일로서 표제화합물 (10 g, 100%)을 수득하였다: MS (ES)m/e 296.2 (M+H)⁺.

f) 메틸 (±)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

톨루엔 (100 ㎖) 중의 메틸 (±)-3-카르보메톡시-4-[2-(아미노메틸)-4-메톡시페닐]부타노에이트 (10 g, 24 mmol) 및 트리에틸아민 (17 ㎖, 120 mmol)의 용액을 가열하여 18시간 동안 환류시켰다. 그 후, 반응액을 농축시키고, 잔류물을 에틸아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 수층을 에틸아세테이트로 2회 추출하고, 유기추출물을 합하여 소금물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄) 농축시켜 황갈색 고체로서 표제화합물 (4.8 g, 76%)을 수득하였다: MS (ES) m/e 264.2 (M+H)⁺.

g) 메틸 (±)-8-하이드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

무수 염화알루미늄 (7.6 g, 57 mmol)을 아르곤하에 0℃에서 메틸렌클로라이드 (100 ㎖) 중의 메틸 (±)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (3.0 g, 11 mmol) 및 에탄티올 (4.2 ㎖, 57 mmol)의 교반용액에 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반한 다음 농축시켰다. 잔류물을 빙수로 처리하고, 생성된 고체를 여과하여 수집하고 건조시켜 회백색 고체로서 표제화합물 (2.64 g, 91%)을 수득하였다: MS (ES) m/e 250.2 (M+H)⁺.

＜제조예 2＞

메틸 (±)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트의 에난티오머의 HPLC 분리

a) 메틸 (R)-(+)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 및 메틸 (S)-(-)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀 -4-아세테이트

메틸 (±)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트를 다음과 같은 조건을 사용한 키랄 HPLC를 사용하여 그의 에난티오머로 분할하였다: 디아셀 키랄팩 (Diacel Chiralpak) AS(등록상표) 칼럼 (21.2×250 ㎜), EtOH 이동상, 7 ㎖/분 유속, 254 ㎚에서 UV 검출, 70 ㎎ 주입; 메틸 (R)-(+)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트에 대한 t_R= 21.5 분; 메틸 (S)-(-)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트에 대한 t_R= 39.1 분.

＜제조예 3＞

메틸 (±)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트의 에난티오머의 HPLC 분리

a) 메틸 (R)-(+)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 및 메틸 (S)-(-)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

메틸 (±)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트를 다음과 같은 조건을 사용한 키랄 HPLC를 사용하여 그의 에난티오머로 분할하였다: 디아셀 키랄팩 AS (등록상표) 칼럼 (21.2×250 ㎜), CH₃CN 이동상, 15 ㎖/분 유속, 254 ㎚에서 UV 검출, 500 ㎎ 주입; 메틸 (R)-(+)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트에 대한 t_R= 10.2 분; 메틸 (S)-(-)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트에 대한 t_R= 19.0 분.

＜제조예 4＞

메틸 (S)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트의 탈메틸화

a) 메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

CHCl₃(160 ㎖) 중의 메틸 (S)-8-메톡시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (15.0 g, 0.057 mole)의 용액을 아르곤하에 -8℃에서 CHCl₃(160 ㎖) 중의 보론트리브로마이드 (20.53 ㎖, 0.217 mole)의 용액에, 온도를 -5℃ 내지 0℃로 유지시키면서 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응혼합물을 약 -8℃에서 30분 동안 교반한 다음, 온도를 약 0℃로 유지시키면서 MeOH (200 ㎖)를 처음에는 적가하였다. 반응혼합물을 농축시켜 점성 오일을 수득하고, 이것을 MeOH (100 ㎖)로부터 재농축시켰다. 오일을 H₂O/MeOH에 용해시키고, 여과하여 소량의 흑색 고체를 제거하였다. 여과액을 50% 수산화나트륨으로 중화시켜 (pH 7로) 백색 고체를 침적시켰다. 현탁액의 pH를 소량의 아세트산을 가하여 4.5로 조정하고, 고체를 수집하여 진공중에서 건조시켜 표제화합물 (9.7 g, 68%)을 수득하였다. 생성물은 HPLC를 사용하여 키랄순도에 대해 분석하였다: 키랄팩 AS (등록상표) 칼럼 (4.6×50 ㎜), 100% EtOH 이동상, 0.5 ㎖/분 유속, 215 ㎚에서 UV 검출; t_R= 7.5 분 (S-에난티오머, 99%); t_R= 4.4 분 (R-에난티오머, 1%).

＜제조예 5＞

메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트의 알킬화를 경유한 메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트의 제조

a) 메틸 (S)-3-옥소-8-[4-(트리플루오로메틸)벤질옥시]-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

DMF (10 ㎖) 중의 메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (0.31 g, 1.24 mmol) 및 4-(트리플루오로메틸)벤질브로마이드 (0.89 g, 3.72 mmol)의 용액에 NaH (오일중의 60% 현탁액, 0.11 g, 2.75 mmol)를 가하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후에, DMF의 대부분을 진공하에서 제거하였다. 잔류물을 포화 NaHCO₃와 EtOAc 사이에 분배시켰다. 수성상을 EtOAc로 추출하고, 유기추출물을 합하여 포화 NaCl로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 농축시켜 투명한 오일을 수득하였다 (0.90 g). 방사상 크로마토그래피 (5% 아세톤/CH₂Cl₂, 실리카겔, 6 m 플레이트)에 의해 백색 포말로서 표제화합물 (0.53 g)을 수득하였다. MS (ES) m/e 566.1 (M+H)⁺.

b) 메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

파르 (Parr) 수소화 플라스크를 MeOH (20 ㎖) 중의 메틸 (S)-3-옥소-8-[4-(트리플루오로메틸)벤질옥시]-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (0.78 g, 1.38 mmol) 및 펄맨 촉매 (Pearlman's catalyst) (20 ㎎)로 충전시켰다. 50 psi에서 24시간 동안 수소화시킨 후에 반응용기를 배기시키고 촉매를 여과하여 제거하였다. 용매를 제거하여 백색 포말 (0.60 g)를 수득하였다. 방사상 크로마토그래피 (5% 아세톤/CH₂Cl₂, 실리카겔, 6 m 플레이트)에 의해 백색 포말로서 표제화합물 (0.42 g)을 수득하였다.¹H NMR (250 MHz, CDCl₃) d 7.50 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.23 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.90 (d, J=7.5 Hz, 1H), 6.67 (dd, J=7.5, 3.4 Hz, 1H), 6.39 (d, J=3.4 Hz, 1H), 5.05 (m, 2H), 4.35 (d, J=15.4 Hz, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.60 (m, 1H), 2.95 (m, 4H), 2.45 (dd, J=17.1, 5.1 Hz, 1H).

＜제조예 6＞

에난티오머 선택적 합성을 경유한 메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트의 제조

a) 4-브로모-3-브로모메틸아니솔

무수 디클로로메탄 (500 ㎖) 중의 4-브로모-3-메틸아니솔 (100 g, 497 mmol)의 교반용액에 N-브로모숙신이미드 (97 g, 545 mmol)를 가하고, 이어서 벤조일퍼옥시드 (6 g, 25 mmol)를 가하였다. 반응플라스크로부터 약 12 인치 위치에 반사경을 놓고 150 와트 조명등을 사용하여 온화하게 반응액을 환류시켰다. 24시간 후에 반응액을 회전 증발시켜 그의 부피를 반으로 농축시키고, 4시간 동안 정치시켰다. 형성된 백색 침전을 여과하여 소량의 디클로로메탄으로 세척하였다. 여과액을 농축 건조시키고, 잔류 고체를 헥산으로 처리하여 여과시켰다. 진공하에서 건조시켜 백색 침상결정으로 표제화합물 (100.25 g, 72%)을 수득하였다: GC t_R= 6.56분 (HP 530 ㎛×20 m 메틸실리콘 칼럼, He 캐리어 유속 20 ㎖/분, 초기온도 100℃, 초기시간 1분, 10℃/분 속도, 최종온도 200℃, 최종시간 1분);¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.44 (d, J=10 Hz, 1H), 6.99 (d, J=3 Hz, 1H), 6.73 (dd, 1H), 4.55 (s, 2H), 3.80 (s, 3H).

b) 3-[N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-브로모아니솔

무수 DMSO (50 ㎖) 및 무수 THF (50 ㎖) 중의 4-브로모-3-브로모메틸아니솔 (35 g, 125 mmol)의 교반용액에 4-트리플루오로메틸벤질아민 (30 g, 171 mmol)을 가하고, 이어서 트리에틸아민 (18 ㎖, 129 mmol)을 가하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후에, 반응액을 농축시키고 수성 1N NaOH (250 ㎖)로 희석하여 Et₂O (2×250 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 소금물로 세척하고, 건조시키고 (Na₂SO₄), 농축건조시켰다. 잔류물을 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피 (10 내지 20% EtOAc/CHCl₃)로 정제하여 표제화합물 (34.17 g, 73%)을 수득하였다: TLC (20% EtOAc/CHCl₃) R_f0.63;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.59 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.49 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.43 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.96 (d, J=3.1 Hz, 1H), 6.70 (dd, 1H), 3.86 (s, 2H), 3.84 (s, 2H), 3.79 (s, 3H), 1.75 (br s, 1H).

c) 3-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-브로모아니솔

무수 THF (100 ㎖) 중의 3-[N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-브로모아니솔 (34.17 g, 91 mmol)의 교반용액에 디-t-부틸디카보네이트 (22 g, 101 mmol)를 가하였다. 반응액을 아르곤하에서 18시간 동안 교반시켰다 (격렬한 가스방출이 관찰되었다). 농축하고 실리카겔 크로마토그래피 (5 내지 10% EtOAc/헥산)하여 투명한 오일로서 표제화합물 (41.09 g, 95%)을 수득하였다: TLC (실리카, 20% EtOAc/헥산) R_f0.44;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.57 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.40 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.39-7.33 (m, 2H), 6.83 및 6.72 (2s, 1H), 6.71 (dd, 1H), 4.54 및 4.50 (2s, 2H), 4.43 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 1.47 (s, 9H).

d) 메틸 2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시신나메이트

아세토니트릴 (200 ㎖) 중의 3-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-브로모아니솔 (37.08 g, 78 mmol), 메틸아크릴레이트 (35 ㎖, 390 mmol), 팔라듐아세테이트 (0.88 g, 3.9 mmol), 트리-o-톨릴포스핀 (2.38 g, 7.8 mol) 및 디이소프로필에틸아민 (31 ㎖, 178 mmol)의 용액을 탈산소화 (3회 배기/아르곤 퍼지 사이클)시킨 다음, 아르곤하에서 가열하여 환류시켰다 (오일조를 80℃로 설정하였다). 6시간 후에, 추가의 팔라듐아세테이트 (0.88 g, 3.9 mmol) 및 트리-o-톨릴포스핀 (2.38 g, 7.8 mmol)을 가하고, 반응액을 추가로 18시간 동안환류하면서 교반하였다. 반응액을 농축 건조시키고, 잔류물을 1:1 Et₂O/석유에테르 (300 ㎖)에 녹인 다음, 4시간 동안 정치시켰다. 회색 침전물을 여과하여 소량의 1:1 Et₂O/석유에테르 (100 ㎖)로 세척하였다. 오렌지-적색 여과액을 농축시키고, 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피 (15% 에틸아세테이트/헥산)로 정제하였다. 생성된 잔류물을 헥산에 녹이고, 혼합물을 수시간 동안 정치시킨 다음, 여과하여 황색 침전을 제거하였다. 여과액을 농축시켜 농후한 황색 오일로서 표제화합물 (34.52 g, 92%)을 수득하였다: TLC (실리카, 20% EtOAc/헥산) R_f0.45;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.80 (br s, 1H), 7.57 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.29 (br s, 2H), 6.83 (dd, 1H), 6.72 (br s, 1H), 6.23 (d, J=15.7 Hz, 1H), 4.58 및 4.53 (2 br s, 2H), 4.46 및 4.37 (2 br s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 1.49 (s, 9H).

e) 메틸 2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시디히드로신나메이트

10% Pd/C (5 g, 4.7 mmol, DMF로 전습윤시킴)에 메탄올 (100 ㎖) 중의 메틸 2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시신나메이트 (34.52 g, 72 mmol)의 용액을 가하였다. 혼합물을 파르 장치 중에서 수소 (50 psi)하에 7시간 동안 진탕한 다음, 셀라이트(celite;등록상표)의 패드를 통해 여과하여 촉매를 제거하였다. 여과액을 농축시켜 무색 오일로서 표제화합물 (34.15 g, 98%)을 수득하였다:¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.58 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.31 (br s, 2H), 7.09 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.76 (dd, 1H), 6.66 (s, 1H), 4.47 (br s, 2H), 4.40 (br s, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 2.79 (br s, 2H), 2.47 (t, 2H), 1.48 (s, 9H).

f) 2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시디히드로신남산

디옥산 (150 ㎖) 중의 2-[N-(t-부톡시카보닐)-N-(4-트리플루오로벤질)아미노메틸]-4-메톡시디히드로신남산 (34.15 g, 71 mmol)의 교반용액에 1N NaOH (85 ㎖, 85 mmol) 수용액을 가하였다. 혼탁한 반응액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 생성된 균질한 용액을 1N HCl (85 ㎖, 85 mmol) 수용액으로 중화시키고, 에틸아세테이트 (2×250 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 소금물 (250 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄) 농축시켜 진하고 투명한 오일로서 표제화합물 (34.60 g, 100%)을 수득하였다: TLC (95:4:1 CHCl₃/MeOH/HOAc) R_f0.49;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.58 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.30 (br s, 2H), 7.09 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.78 (dd, 1H), 6.65 (d, J=2.6 Hz, 1H), 4.47 (br s, 2H), 4.42 (br s, 2H), 3.76 (s, 3H), 2.81 (br s, 2H), 2.53 (t, 2H), 1.47 (s, 9H).

g) (R)-4-벤질-2-옥사졸리디노닐 2-[N-(t-부톡시카보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시디히드로신남아미드

무수 디클로로메탄 (200 ㎖) 중의 2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시디히드로신남산 (34.60 g, 71 mmol) 및 피리딘 (6.9 ㎖, 85 mmol)의 교반용액에 아르곤하에서 주사기를 통하여 시아누릭플루오라이드 (4.4 ㎖, 48 mmol)를 가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 생성된 농후한 현탁액을 셀라이트 (등록상표)의 패드를 통해 여과하여 소량의 무수 디클로로메탄 (50 ㎖)으로 세척하였다. 투명한 여과액을 분리깔때기에 붓고 빙냉한 물 (500 ㎖)로 세척하였다. 건조시키고 (MgSO₄), 농축시켜 조 산플루오라이드 (34.70 g, 100%)를 수득하고, 이것은 더 정제하지 않고 사용하였다.

무수 THF (300 ㎖) 중의 (R)-4-벤질-2-옥사졸리디논 (13.8 g, 78 mmol)의 교반용액에 아르곤하에 -78℃에서 헥산중의 n-BuLi의 용액 (2.5 M, 30 ㎖, 75 mmol)을 주사기를 통해 가하였다. 반응액을 -78℃에서 15분 동안 교반한 다음, 무수 THF (100 ㎖) 중의 상기 산플루오라이드 (34.70 g, 71 mmol)의 용액을 주사기를 통하여 가하였다. 반응액을 -78℃에서 한시간 동안 교반한 다음, 포화 NH₄Cl로 켄칭시키고, 에틸아세테이트 (2×200 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 소금물 (400 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄) 농축건조시켰다. 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피 (20% 에틸아세테이트/헥산)에 의해 정제하여 진하고 투명한 오일로서 표제화합물 (40.34 g, 90%)을 수득하였다: TLC (20% EtOAc/헥산) R_f0.21;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.58 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.33-7.26 (m, 5H), 7.16 (m, 3H), 6.77 (dd, 1H), 6.67 (d, J=2.5 Hz, 1H), 4.62 (m, 1H), 4.60-4.40 (m, 4H), 4.16 (m, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.27 (dd, 1H), 3.21-3.10 (m, 2H), 2.88 (br s, 2H), 2.72 (dd, 1H), 1.48 (s, 9H).

h) (R)-4-벤질-2-옥사졸리디노닐 3-[2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시페닐]-2(S)-메톡시카르보닐메틸프로피온아미드

무수 THF (300 ㎖) 중의 (R)-4-벤질-2-옥사졸리디노닐 2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시디히드로신남아미드 (40.30 g, 64 mmol)의 교반용액에 -78℃에서 주사기를 통하여 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드의 용액 (70 ㎖, THF 중의 1M, 70 mmol)을 가하였다. 30분 후에, 메틸브로모아세테이트 (30 ㎖, 317 mmol)를 주사기를 통하여 가하였다. -78℃에서 추가로 30분 후에, 반응액을 -20℃로 가온하고 추가로 6시간 동안 교반하였다. 반응액을 포화 NH₄Cl (400 ㎖)로 켄칭시키고, 에틸아세테이트 (2×200 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 소금물 (300 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄) 농축건조시켰다. 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피 (20% 에틸아세테이트/헥산)로 정제하여 백색 고체로서 표제화합물 (38.62 g, 86%)을 수득하였다: HPLC (Altex Ultrasphere^TM-Si 5 μ, 20% EtOAc/헥산)는 약 20%의 알킬화되지 않은 출발물질이 그대로 존재함을 나타내었다. 조반응혼합물의 HPLC는 반응액에 대해 90%의 de를 제공하였다;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.57 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.40-7.11 (m, 8H), 6.71 (dd, 1H), 6.63 (d, J=2.7 Hz, 1H), 4.57-4.34 (m, 6H), 4.03 (d, J=8.6 Hz, 1H), 3.85 (t, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.61 (s, 3H), 3.28 (dd, 1H), 2.90 (dd, 1H), 2.86-2.71 (m, 2H), 2.70 (dd, 1H), 2.44 (m, 1H), 1.48 및 1.46 (2s, 9H).

i) 메틸 (S)-8-메톡시-3-옥소-2-(4-트리플루오로메틸벤질)-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

THF (300 ㎖) 및 물 (100 ㎖) 중의 (R)-4-벤질-2-옥사졸리디노닐 3-[2-[N-(t-부톡시카르보닐)-N-(4-트리플루오로메틸벤질)아미노메틸]-4-메톡시페닐]-2(S)-메톡시카보닐메틸-프로피온아미드 (38.0 g, 54 mmol)의 교반용액에 0℃에서 물 (62 ㎖) 중의 30% H₂O₂(18.9 ㎖) 및 LiOHㆍH₂O (2.3 g, 55 mmol)의 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 혼탁한 용액을 0℃에서 추가로 한시간 동안 교반하였다. 생성된 균질한 용액을 0℃에서 물 (175 ㎖) 중의 아황산나트륨 (34.3 g, 272 mmol)의 용액으로 서서히 처리한 다음, 물 (150 ㎖) 중의 진한 HCl (35 ㎖)의 빙냉 용액으로 산성화시켰다. 반응액을 에틸아세테이트 (2×200 ㎖)로 추출하고, 유기층을 합하여 소금물 (400 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄) 농축건고시켰다. 생성된 잔류물을 실온에서 교반하면서 디옥산중의 4.0 M HCl (400 ㎖)로 처리하였다 (느린 가스방출이 관찰되었다). 한시간 후에, 반응액을 농축시키고 1:1 CHCl₃/톨루엔 (2×)으로부터 재농축시킨 다음, 잔류물 (37.65 g)을 무수 DMF (400 ㎖)에 녹였다. 드와르 (Dewar) 플라스크 내에서 아르곤하에 0℃에서 교반하면서 이 용액에 트리에틸아민 (15.3 ㎖, 109 mmol) 및 NaHCO₃(22.9 g, 273 mmol)를 가하고, 이어서 디페닐포스포릴아지드 (13 ㎖, 60 mmol)를 가하였다. 0℃에서 24시간 동안 교반한 후에, 반응액을 농축건조시켰다. 잔류물을 에틸아세테이트 (400 ㎖)에 녹이고, 물 (300 ㎖) 및 소금물 (300 ㎖)로 연속적으로 세척하였다. 건조시키고 (MgSO₄), 농축시킨 다음, 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피 (35% 에틸아세테이트/헥산)하여 투명하고 진한 오일로서 표제화합물 (16.87 g, 74%)을 수득하였다: TLC (40% EtOAc/헥산) R_f 0.50; MS (ES) m/e 422.3 (M+H)⁺;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.52 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.29 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.02 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.75 (dd, 1H), 6.36 (d, J=2.7 Hz, 1H), 5.18 (d, J=16.5 Hz, 1H), 4.96 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.48 (d, J=15.4 Hz, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.74 (d, J=16.5 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.08 (dd, 1H), 3.02 (dd, 1H), 2.95 (dd, 1H), 2.48 (dd, 1H).

j) 메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2-(4-트리플루오로메틸벤질)-2,3,4,5-테트라히드로 -1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

CH₂Cl₂중의 보론트리브로마이드의 용액 (1.0 M, 160 ㎖, 160 mmol)을 아르곤하에 -20℃에서 무수 CH₂Cl₂(150 ㎖) 중의 메틸 (S)-8-메톡시-3-옥소-2-(4-트리플루오로메틸벤질)-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (16.67 g, 39.6 mmol)의 용액에 30분에 걸쳐 적가하였다. -15 내지 -20℃에서 추가로 1.5시간 후에, 반응액을 -20℃로 재냉각시키고, MeOH (160 ㎖)를 조심해서 적가하여 켄칭시켰다. 반응액을 -10 내지 0℃에서 한시간 동안 교반한 다음, 회전식증발기 상에서 농축시켰다. 잔류물을 MeOH (2×)로부터 재농축시켰다. 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피 (50 내지 100% 에틸아세테이트/헥산)로 정제하여 백색 고체로서 표제화합물 (14.87 g, 92%)을 수득하였다: [α]_D-81.8° (c, 1.0, MeOH); TLC (실리카, 50% EtOAc/헥산) R_f0.54; MS (ES) m/e 408.2 (M+H)⁺;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃+2% DMSO-d₆) δ 7.53 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.31 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.93 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.70 (dd, 1H), 6.41 (d, J=2.3 Hz, 1H), 5.16 (d, J=16.4 Hz, 1H), 5.01 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.39 (d, J=15.6 Hz, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.73 (d, J=16.4 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.01 (dd, 1H), 2.98 (m, 1H), 2.90 (dd, 1H), 2.47 (dd, 1H).

＜제조예 7＞

2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드의 제조

a) 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드

2-클로로-4-메틸피리딘-N-옥시드 (12.1 g, 0.068 mole) (Brown, E. V. J. Amer. Chem. Soc. 1957, 79, 3565), 3-아미노-1-프로판올 (10.33 ㎖, 0.14 mole), NaHCO₃(28 g, 0.34 mole) 및 t-아밀알콜 (70 ㎖)의 혼합물을 가열하여 환류시켰다. 16시간 후에, 반응액을 냉각시켜 CH₂Cl₂(300 ㎖)로 희석하고, 흡인여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과액을 농축시키고 톨루엔으로부터 재농축시켜 황색 오일을 수득하였다. CH₂Cl₂/Et₂O로부터 재결정화시켜 황색 고체로서 표제화합물 (10.87 g, 88%)을 수득하였다: TLC (15% MeOH/CH₂Cl₂) R_f0.44;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.92 (d, J=6.7 Hz, 1H), 7.28 (br t, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.33 (dd, J=6.6, 2.1 Hz, 1H), 3.73 (t, J=5.7 Hz, 2H), 3.47 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H), 1.82-1.88 (m, 2H); MS (ES) m/e 183 (M+H)⁺.

＜제조예 8＞

(S)-8-[3-(4-메틸피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세트산의 제조

a) 메틸 (S)-8-[3-(4-메틸-1-옥소피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

CH₂Cl₂(6 ㎖) 중의 메틸 (S)-8-히드록시-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (0.42 g, 1.03 mmol) 및 Ph₃P (0.41 g, 1.56 mmol)에 0℃에서 2-[(3-히드록시-1-프로필)아미노]-4-메틸피리딘-N-옥시드 (0.28 g, 1.54 mmol) 및 디에틸아조디카르복실레이트 (0.24 ㎖, 1.52 mmol)의 용액을 적가하였다. 첨가가 완료되면, 얼음욕을 치우고 반응액을 실온에서 교반하였다. 20시간 후에, 용매를 제거하고 생성물을 섬광크로마토그래피 (100% CHCl₃내지 10% MeOH/CHCl₃, 실리카겔)로 분리하여 투명한 오일로서 표제화합물 (0.57 g)을 수득하였다. MS (ES) m/e 572.2 (M+H)⁺.

b) 메틸 (S)-8-[3-(4-메틸피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트

MeOH (10 ㎖) 중의 메틸 (S)-8-[3-(4-메틸-1-옥소-피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (0.57 g, 1.00 mmol) 및 시클로헥산 (1.00 ㎖, 9.87 mmol)에 10% Pd/C (0.11 g)를 가하였다. 반응액을 가열하여 20시간 동안 환류시켰다. 반응액을 실온으로 냉각시킨 후에, 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 진공하에서 제거하여 백색 포말(0.49 g)를 수득하였다. 방사상 크로마토그래피 (5% MeOH/CHCl₃, 실리카겔, 6 ㎜ 플레이트)로 백색 포말로서 표제화합물 (0.42 g)을 수득하였다. MS (ES) m/e 556.1 (M+H)⁺.

c) (S)-8-[3-(4-메틸피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세트산

EtOH (2 ㎖) 중의 메틸 (S)-8-[3-(4-메틸피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-3-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-2-벤즈아제핀-4-아세테이트 (0.42 g, 0.75 mmol)에 1N NaOH (1.50 ㎖, 1.50 mmol)를 가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후에, 대부분의 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔류물을 1N HCl을 사용하여 산성 (pH=3)으로 만들고, 냉동시킨 다음, 동결건조시켰다. 잔류물에 물을 가하고 포화 NaHCO₃를 사용하여 pH=7로 중화시켰다. 수층을 CHCl₃로 추출하고, 유기추출물을 합하여 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축시켜 백색 포말 (0.47 g)를 수득하였다. 방사상 크로마토그래피 (10% MeOH/CHCl₃, 실리카겔, 6 ㎜ 플레이트)로 백색 고체로서 표제화합물 (0.30 g)을 수득하였다. MS (ES) m/e 542.2 (M+H)⁺. C₂₉H₃₀F₃N₃O₄ㆍ3.5 H₂O에 대한 분석 계산치: C, 57.61; H, 6.17; N, 6.95. 실측치: C, 57.6; H, 5.30; N, 6.38.

＜실시예 2＞

비경구 투여 단위형 조성물

멸균건조분말로서 실시예 1의 화합물 20 ㎎을 함유하는 제제는 다음과 같이 제조한다: 화합물 20 ㎎을 증류수 15 ㎖에 용해시킨다. 이 용액을 멸균조건 하에서 25 ㎖ 다용량 앰플내로 여과하여 동결건조시킨다. 정맥 또는 근육주사용 물 중의 5% 덱스트로즈(D5W) 20 ㎖를 가하여 분말을 재조제한다. 따라서, 용량은 주사 부피로 결정된다. 이 투여량 단위의 계량된 부피를 주사용 D5W의 추가의 부피에 가함으로써 연속적으로 희석할 수 있고, 계량된 용량을 정맥내 점적주입용 병 또는 백 또는 그밖의 다른 주사-주입 시스템에서와 같이 약제의 분배를 위한 다른 메카니즘에 가할 수도 있다.

＜실시예 3＞

경구 투여 단위형 조성물

경구 투여용 캡슐제는 실시예 1의 화합물 50 ㎎을 락토즈 75 ㎎ 및 마그네슘스테아레이트 5 ㎎과 함께 혼합하고 분쇄함으로써 제조한다. 생성된 분말을 체로 쳐서 경질 젤라틴 캡슐에 충전시킨다.

＜실시예 4＞

경구 투여 단위형 조성물

경구 투여용 정제는 슈크로즈 20 ㎎, 황산칼슘 이수화물 150 ㎎ 및 실시예 1의 화합물 50 ㎎을 10% 젤라틴 용액과 함께 혼합하고 과립화시킴으로써 제조한다. 습윤된 과립을 체로 치고, 건조시키고, 전분 10 ㎎, 탈크 5 ㎎ 및 스테아르산 3 ㎎과 혼합시킨 다음, 정제로 압착시킨다.

상기 설명은 본 발명의 화합물을 어떻게 제조하고 사용하는지에 대하여 상세히 기술한 것이다. 그러나, 본 발명은 상기에서 기술된 특정한 실시태양으로 제한되는 것은 아니며, 첨부된 청구범위의 범위내에 있는 모든 변형을 포함한다. 본 명세서에 인용되어 있는 잡지, 특허 및 그밖의 발행물에 대한 다양한 언급은 선행기술의 상태를 포함하며, 상세히 설명한 것처럼 참고로 본 명세서에 포함되어 있다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염.

＜화학식 I＞
제1항에 따른 화합물 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
제1항에 따른 화합물, 항종양제 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
제3항에 있어서, 항종양제가 토포테칸인 제약 조성물.
제3항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴인 제약 조성물.
α_vβ₃수용체에 대한 길항작용이 필요한 환자에게 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는, α_vβ₃수용체에 대한 길항작용이 요구되는 질병상태의 치료 방법.
α_vβ₅수용체에 대한 길항작용이 필요한 환자에게 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는, α_vβ₅수용체에 대한 길항작용이 요구되는 질병상태의 치료 방법.
골다공증의 치료가 필요한 환자에게 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 치료 방법.
혈관형성의 억제가 필요한 환자에게 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는 혈관형성의 억제 방법.
종양성장 또는 종양전이의 억제가 필요한 환자에게 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는 종양성장 또는 종양전이의 억제 방법.
아테롬성 동맥 경화증 또는 재발협착증의 치료가 필요한 환자에게 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는 아테롬성 동맥 경화증 또는 재발협착증의 치료 방법.
염증의 치료가 필요한 환자에게 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증의 치료 방법.
제1항에 따른 화합물과 항종양제를 단계적으로, 또는 물리적 배합물로 투여하는 것을 특징으로 하는 종양성장의 억제 방법.
제13항에 있어서, 항종양제가 토포테칸인 방법.
제13항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴인 방법.
하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염.

＜화학식 II＞
하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염.

＜화학식 III＞
의약으로서 사용하기 위한 제1항에 따르는 화합물.
α_vβ₃수용체에 대한 길항작용이 필요한 질병의 치료를 위한 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물의 용도.
α_vβ₅수용체에 대한 길항작용이 필요한 질병의 치료를 위한 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물의 용도.
골다공증 치료용 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물의 용도.
혈관형성 억제용 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물의 용도.
종양성장 또는 종양전이를 억제하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물의 용도.
아테롬성 동맥 경화증 또는 재발협착증 치료용 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물의 용도.
염증 치료용 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물의 용도.
물리적 배합물로, 또는 단계적으로 투여되는 종양성장 억제용 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물 및 항종양제의 용도.
제26항에 있어서, 항종양제가 토포테칸인 용도.
제26항에 있어서, 항종양제가 시스플라틴인 용도.
물리적 배합물로, 또는 단계적으로 투여되는 골다공증 치료용 의약을 제조하는 데 있어서 제1항의 화합물 및 골흡수억제제의 용도.