CZ20001060A3 - Antagonista receptoru vitronektinu - Google Patents

Abstract

Je popsána sloučenina vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, kteráje antagonistou receptoru vitronektinu aje vhodná k léčbě osteoporózy.

Description

fl/ &WAntagonista receptorů vitronektinu

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceuticky aktivních sloučenin, které inhibují receptor vitronektinu a jsou vhodné k léčbě zánětu, zhoubných nádorů a kardiovaskulárních poruch, jako je ateroskleróza a restenóza, a onemocnění, na kterých se podílí kostní resorbce, jako je osteoporóza.

Dosavadní stav techniky

Integriny, což jsou transmembránové glykoproteiny exprimované na řadě buněk, jsou nadtřídou receptorů buněčné adheze. Tyto receptory povrchové buněčné adheze zahrnuj í gpIIb/IIIa (receptor fibrinogenu) a ce_vS₃ (receptor vitronektinu) . Receptor fibrinogenu gpIIb/IIIa je exprimován na povrchu krevních destiček a zprostředkovává agregaci destiček a vytvoření hemostatické zátky v místě krvácející rány (Philips a kol., Blood, 71, 831 (1988)). Receptor vitronektinu cM/ je exprimován na řadě buněk včetně buněk endotelu, hladké svaloviny, osteoklastů a nádorových buněk a má tedy řadu funkcí. Receptor vitronektinu cMS₃ exprimovaný na membráně osteoklastů zprostředkovává adhezi osteoklastů ke kostní hmotě, což je klíčová fáze procesu resorbce kosti (Ross a kol., J. Biol. Ch.em., 262. 7703 (1987)). Chorobou vyznačující se nadměrnou resorbcí kosti je osteoporóza. Receptor a_vS₃ exprimovaný na povrchu lidských aortálních buněk hladké svaloviny zprostředkovává jejich migraci do neointimy, což je proces, který může vést k restenóze po perkutánní koronární angioplastice (Brown a kol., Cardiovascular. Res., 28., 1815 (1994)). Brooks a kol., Cell, 79. H57 (1994) navíc ukázal, že antagonista • ·

cMS₃ je schopen indukcí apoptózy angiogenních krevních cév vyvolat nádorovou regresi. Proto by látka blokující receptor vitronektinu byla vhodná k léčbě chorob, jako jsou osteoporóza, restenóza a zhoubné nádory.

Pod názvem receptor vitronektinu j sou nyní známy tři různé integriny označované jako α^β_χ, a cM3₅ (Horton a kol., Int. J. Exp., Pathol., 71. 741 (1990)). α^β^ váže fibronektin a vitronektin. váže velké množství ligandů, včetně fibrinu, fibrinogenu, lamininu, trombospondinu, vitronektinu, von Willebrandova faktoru, osteopontinu a kostního sialoproteinu I. a_vS_s váže vitronektin. Ukázalo se, že receptor vitronektinu se účastní buněčné adheze u řady buněčných typů včetně buněk mikrovaskulárního endotelu (Davis a kol., J. Cell. Biol., 51. 206 (1993)), a byla potvrzena jeho úloha při angiogeneži (Brooks a kol., Cell, 264. 569 (1994)). Tento integrin je exprimován na krevních cévách granulační tkáně lidských poranění, nikoliv však v normální kůži.

Je známo, že se receptor vitronektinu váže na proteiny kostní hmoty, které obsahují tripeptidovou sekvenci Arg-Gly-Asp (neboli RGD). Horton a kol., Exp. Cell Res., 195. 368 (1991) tak popsal, že peptidy obsahující RGD a protilátky proti receptoru vitronektinu (23C6) inhibuji resorbci dentinu a rozestupování se buněk způsobované osteoklasty. Sáto a kol., J. Cell Biol., 111. 1713 (1990) dále popsal, že echistatin, peptid hadího jedu obsahující sekvenci RGD, je ve tkáňové kultuře účinným inhibitorem kostní resorbce a inhibuje přilnutí osteoklastů ke kosti.

Nyní bylo zjištěno, že určitá sloučenina je účinným inhibitorem receptorů c<JS₃ a α_νβ₅. Zejména bylo zjištěno, že • ·

to ·· • to taková sloučenina je účinnějším inhibitorem receptoru vitronektinu nežli receptor fibrinogenu.

Podstata vynálezu

Souhrn vynálezu

Tento vynález zahrnuje sloučeninu vzorce (I), jak je dále popsána, která má farmaceutickou aktivitu při inhibici receptoru vitronektinu a je vhodná k léčbě zánětu, zhoubných nádorů a kardiovaskulárních poruch, jako je ateroskleróza a restenóza, a onemocnění, na kterých se podílí kostní resorbce, jako je,osteoporóza.

Tímto vynálezem je rovněž farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu vzorce (I) a farmaceutický nosič.

Tento vynález je rovněž způsobem léčby onemocnění zprostředkovaných receptorem vitronektinu. Z určitého aspektu je sloučenina podle tohoto vynálezu vhodná k léčbě aterosklerózy a restenózy, zánětu, zhoubných nádorů a onemocnění, na kterých se podílí kostní resorbce, jako je osteoporóza.

Detailní popis

Tento vynález obsahuje novou sloučeninu, která je účinnějším inhibitorem receptoru vitronektinu nežli receptor fibrinogenu. Nová sloučenina obsahuje benzazepinové jádro, ve kterém je na aromatickém šestičlenném benzazepinovém kruhu přítomen substituent obsahující atom dusíku a na sedmičlenném benzazepinovém kruhu je přítomen alifatický substituent obsahující kyselou skupinu. Soudí se, že • · systém benzadiazepinových kruhů přednostně interaguje s receptorem vitronektinu a orientuje substitující postranní řetězce na šesti a sedmičlenném benzazepinovém kruhu tak, že mohou rovněž přednostně interagovat s receptorem.Je výhodné, aby mezi kyselou skupinou na alifatickém substituentu sedmičlenného benzadiazepinového kruhu a atomem dusíku v substituentu obsahujícím atom dusíku na aromatickém šestičlenném benzazepinovém kruhu existovalo asi dvanáct až čtrnáct intervenujících kovalentních vazeb přes nejkratší intramolekulární cestu.

Tento vynález zahrnuje sloučeninu obecného vzorce (I):

nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl. Touto sloučeninou je kyselina (S)-8-[3-methylpyridin-2-ylamino)-1-propoxy]-3-oxo-2- [4- (trifluoromethyl)benzyl] -2,3,4,5-tetrahydro- 1H-2-benzazepin-4-octová.

Sloučenina vzorce (I) inhibuje vazbu vitronektinu a dalších peptidů obsahujících RDG na receptor vitronektinu. Inhibice receptoru vitronektinu na osteoklastech inhibuje osteoklastickou resorbci kosti a je vhodná v léčbě onemocnění, u kterých je kostní resorbce spojena s patologickým procesem, jako je osteoporóza a osteoartritida.

• · · · · · • · • ··

V jiném aspektu je tento vynález způsobem stimulace tvorby kosti, který zahrnuje podávání sloučeniny vzorce (I) , což zvyšuje uvolňování kalcitoninu. Zvýšená produkce kosti je jasným přínosem u chorobných stavů, které se vyznačují nedostatkem mineralizované kostní hmoty nebo u kterých je žádoucí remodelace kosti, jako je hojení zlomenin a prevence kostních zlomenin. U onemocnění a metabolických poruch, které vedou k úbytku kostní hmoty, může být taková léčba rovněž přínosem. Podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu by mohlo být přínosné například u hyperparathyroidismu, Pagetovy choroby, malignitami způsobené hyperkalcémie, osteolytických lézí způsobených nádorovými metastázami, úbytek kostí z imobilizace nebo deficience pohlavních hormonů, Behcetově chorobě, osteomalacii, hyperostóze a osteopetróze.

Navíc vzhledem k tomu, že sloučenina podle tohoto vynálezu inhibuje receptory vitornektinu na řadě buněčných typů, mohla by být uvedená sloučenina vhodná k léčbě zánětlivých onemocnění, jako jsou reumatoidní artritida a psoriáza, a kardiovaskulárních onemocnění jako jsou ateroskleróza a restenóza. Sloučenina vzorce (I) podle tohoto vynálezu může být vhodná k léčbě nebo prevenci dalších onemocnění včetně tromboembolických poruch, astmatu, alergií, syndromu dechové tísné dospělých, reakce štěpu proti hostiteli, rejekce orgánových transplantátů, septického šoku, ekzému, kontaktní dermatitidy, zánětlivých onemocnění střev a dalších autoimunitních onemocnění, na které však výčet není omezen. Sloučenina podle tohoto vynálezu může být rovněž vhodná k léčení ran.

Sloučenina podle tohoto vynálezu je rovněž vhodná k léčbě angiogenních poruch, včetně jejich prevence. Pojem ·· ··«· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · ···· • · · · · ·· · · · · — £ — ··· ···· ···· ·· · · · ·« · · ·· angiogenní poruchy, jak je zde používán, zahrnuje stavy s abnormální neovaskularizací. Tam, kde je příčinou patologického stavu spojeného s onemocněním růst nových krevních cév, nebo k němu přispívá, bude inhibice angiogeneze redukovat škodlivé účinky onemocnění. Příkladem takovéhoto cílového onemocnění je diabetická retinopatie. Tam, kde se požaduje růst nových krevních cév k podpoře růstu poškozené tkáně, bude inhibice angiogeneze snižovat krevní zásobení tkáně a tím přispívat ke snížení množství tkáňové hmoty vyžadující krevní zásobení. Příklady zahrnují růst nádorů, kde je neovaskularizace neustále vyžadována k růstu nádoru a vzniku solidních nádorových metastáz. Proto sloučenina podle tohoto vynálezu inhibuje angiogenezi v nádorové tkáni a tím zabraňuje nádorovým metastázám a růstu nádoru.

Proto podle způsobů podle tohoto vynálezu inhibice angiogeneze za použití sloučeniny podle tohoto vynálezu může zlepšit symptomy onemocnění, a v některých případech může léčit onemocnění.

Dalším terapeutickým cílem sloučenin podle tohoto vynálezu jsou oční choroby charakterizované neovaskularizací. Takové oční onemocnění zahrnují poruchy neovaskularizace rohovky, jako transplantaci rohovky, herpetickou keratitidu, luetickou keratitidu, pterygium a neovaskulární pannus spojené s užíváním kontaktních čoček. Další oční onemocnění zahrnují rovněž makulární degeneraci související s věkem, suspektní histoplasmózu oka, retinopatii nedonošenců a neurovaskulární glaukom.

Tento vynález poskytuje dále způsob inhibice růstu tumorů, který zahrnuje postupné podávání fyzické kombinace φφ φφφφ

Φ· ·Φ φ* ·· · ♦ · · · · · · · · * • · · φ φ Φ· φφφφ • ·· φ φ ·· φφφ · φ φ φφφ φφφφ φφφφ φφ φ φφ φφ φφ φφ sloučeniny vzorce (I) a protinádorově působící látky, jako je topotekan a cisplatina.

Tento vynález zahrnuje rovněž prekurzory sloučenin podle tohoto vynálezu. Za prekurzory se považují jakékoliv kovalentně navázané nosiče, které in vivo uvolňují mateřský lék podle vzorce (I) . Proto dalším aspektem tohoto vynálezu jsou nové'prekurzory, které jsou rovněž při přípravě prostředku vzorce (I) meziprodukty vyjádřené obecným vzorcem (II) :

(II) nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou nové meziprodukty obecného vzorce (III):

CO₂C^aikyl (III)

0·00

0 0 0 · · 0 «000 ·· · » 0 ·· 00«0 nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.

K popisu sloučenin podle tohoto vynálezu jsou používány zkratky a symboly běžně používané v oboru u proteinů a v oboru chemie. Obecně zkratky aminokyselin odpovídají IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature jak je popsáno v Eur. J. Biochem, £L, 158 (1984) .

Pojem alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, jak je zde používán, znamená popřípadě substituovanou alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a zahrnuje methylovou, ethylovou, n-propylovou, isopropylovou, n-butylovou, isobutylovou, terč.-butylovou, n-pentylovou, išopentylovou, neopentylovou a hexylovou skupinu a jejich jednoduché alifatické izomery.

Některá reagencia jsou zde někdy zkrácena. DCC znamená dicyklohexylkarbodiimid, DMAP znamená dimethylaminopyridin, DIEA znamená diisopropylethylamin, EDC znamená hydrochlorid 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu. HOBt znamená l-hydroxybenztriazol, THF znamená tetrahydrofuran, DIEA znamená diisopropylethylamin, DEAD znamená diethylazodikarboxylát, PPh₃ znamená trifenylfosfin, DIAD znamená diisopropylazodikarboxylát, DME znamená dimethoxyethan, DMF znamená dimethylformamid, NBS znamená N-bromsukcinimid,

Pd/C znamená palládium na uhlí jako katalyzátor, PPA znamená kyselinu polyfosforečnou, DPPA znamená difenylfosforylazid, BOP znamená benztriazol-l-yloxy-tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát, HF znamená kyselinu fluorovodíkovou, TEA znamená triethylamin, TFA znamená kyselinu trifluoroctovou a PCC znamená pyridiniumchlorchromát.

Sloučeniny vzorce (I) se obecně připravují způsoby

- 9 ·· toto • · · < to to to to »· ·· popsanými v PCT přihlášce Bondinella a kol. číslo WO 93/00095 publikované 7. ledna 1993 a v PCT přihlášce Bondinella a kol. číslo WO 94/14776 jejichž popisy jsou zde zařazeny formou literálního odkazu.

Sloučenina obecného vzorce (I) se dále připravuje způsobem upřesněným dále uvedeným schématem.

e,f to · · • · • ·

a) NaH, 4-(trifluormethyl)benzylbromid, DMF; b) H₂, Pd(OH)_z/C, methanol; c) 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid, DEAD, Ph₃P, CH₂C1₂; d) cyklohexen,

10% Pd/C, methanol; e) l,0N NaOH, ethanol; f) HCI, H₂O.

Sloučenina 1-1, připravená podle obecných postupů popsaných Bondinellem a kol. v PCT přihlášce č. WO 93/00095 publikované 7. ledna 1993 a Bondinellem a kol. v PCT přihlášce č. WO 94/14776, reaguje v aprotickém rozpouštědle, výhodně v DMF, THF nebo v jejich směsích, za přítomnosti vhodné báze, obecně hydridu sodného nebo bis(trimethylsilyl) amidu lithia, s 4-(fluormethyl)benzylbromidem, čímž se získá bisalkylovaný produkt 1-2. 4-(Trifluormethyl)benzylether z 1-2 může být pohodlně odstraněn hydrogenolýzou, čímž poskytne fenol 1-3. Způsoby hydrogenolýzy benzyletheru jsou odborníkovi v oboru dobře známy a jsou popsány v příslušných referenčních publikacích například v Green, Protéctive Groups in Organic Synthesis (vydané Wiley-Interscience). Sloučenina 1-3 reaguje s. 2-[ (3-hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxidem v konjugační reakci podle Mitsonobua (Organic Reactions,

42, 335 - 656 (1992); Synthesis, 1-28 (1981)), čímž se získá produkt 1-4. Reakce je zprostředkovaná komplexem vytvořeným z diethylazodikarboxylátu a trifenylfosfinu a provádí se v aprotickém rozpouštědle, například v THF, CH₂C1₂ nebo DMF. Pyridin-N-oxidová složka produktu 1-4 je redukována na odpovídající pyridin 1-5 za podmínek přenosové hydrogenace při použití palladiového katalyzátoru, výhodně kovového palladia na aktivním uhlí, v inertním rozpouštědle, například v methanolu, ethanolu nebo 2-propanolu. Jako reakční látka přenášející atom vodíku se u tohoto typu reakcí běžně používají cyklohexen, 1,4-cyklohexadien, kyselina mravenčí a soli kyseliny mravenčí, jako jsou • · · ·

mravenčan draselný nebo mravenčan amonný. Methylester produktu 1-5 je za použití vodné báze, například hydroxidu lithného ve vodném roztoku THF nebo hydroxidu sodného ve vodném methanolu nebo ethanolu, hydrolyzován a intermediární sůl karboxylové kyseliny se okyselí vhodnou kyselinou, například TFA nebo HC1, čímž se získá karboxylová kyselina 1-6. Popřípadě, pokud je to žádoucí, může být meziproduktová sůl karboxylové kyseliny izolována, nebo může být sůl karboxylové kyseliny nebo volná karboxylová kyselina připravena způsoby dobře známými odborníkovi v oboru.

Adiční soli sloučeniny s kyselinou se připravují standardním způsobem ve vhodném rozpouštědle z mateřské sloučeniny a přebytku kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, fluorovodíková, sírová, fosforečná, octová, trifluoroctová, jablečná, jantarová nebo methansulfonová. Kationové soli se připravují působením přebytku alkalických reagencií jako jsou hydroxid, uhličitan nebo alkoxid obsahujících příslušný kation nebo působením příslušného organického aminu. Specifickými příklady kationtů přítomných ve farmaceuticky přijatelných solích jsou kationty, jako jsou lithný, sodný, draselný, vápenatý, hořečnatý a amoniový kation.

Tento vynález poskytuje rovněž farmaceutický prostředek, který obsahuje sloučeninu podle vzorce (I) a farmaceuticky přijatelný nosič. V souladu s tím může být sloučenina vzorce (I) použita při výrobě léku. Farmaceutický prostředek ze sloučeniny vzorce (I), jak byl popsán výše, může být vytvořen jako roztok nebo lyofilizovaný prášek k parenterálnímu podání. Prášky mohou být před použitím rekonstituovány přidáním vhodného ředidla nebo jiného farmaceuticky přijatelného nosiče. Tekutým přípravkem může

0 ·· 99 • 0 0 ·

0 0 · být pufrovaný isotonický vodný roztok. Příklady vhodných ředidel jsou běžný izotonický fyziologický roztok, standardní 5% roztok glukózy ve vodě nebo pufrovaný roztok acetatu amonného nebo sodného. Takovýto přípravek je zvláště vhodný k parenterálnímu podávání, ale může být použit rovněž pro orální podávání nebo může být obsažen v dávkovácím inhalátoru nebo nebulizéru ke vdechování. Může být žádoucí přidat excipiencia jako je polyvinylpyrrolidon, želatina, hydroxycelulóza, arabská guma, polyethylenglykol, mannitol, chlorid sodný nebo citrát sodný.

Sloučenina může být alternativně enkapsulována, tabletována nebo připravena v emulzi nebo sirupu k orálnímu podání. K posílení nebo stabilizaci prostředku nebo k usnadnění přípravy prostředku mohou být přidány pevné nebo kapalné nosiče. Pevné nosiče zahrnují škrob, laktózu, dihydrát síranu vápenatého, bílou hlinku, stearat hořečnatý nebo kyselinu stearovou, mastek, pektin, arabskou gumu, agar nebo želatinu. Tekuté nosiče zahrnují sirup, arašídový olej, olivový olej, fyziologický roztok a vodu. Nosiče mohou rovněž zahrnovat materiál s pozvolným uvolňováním, jako je glycerylmonostearát nebo glyceryldistearát, samotné nebo s voskem. Množství pevných nosičů je pohyblivé, ale výhodně bude mezi asi 20 mg a asi 1 g na dávkovou jednotku. Farmaceutické přípravky se vyrábějí konvenčními farmaceutickými technikami zahrnujícími u tabletových forem, pokud je nutné, mletí, míchání, granulování a lisování; nebo u forem tvrdých želatlnových tobolek mletí, míchání a plnění. Pokud se použije tekutého nosiče, bude přípravek ve formě sirupu, elixíru, emulze nebo vodné či nevodné suspenze. Takové tekuté přípravky mohou být podávány přímo per os nebo plněny do měkkých želatinových tobolek.

fc fc • · · · fc ·

K rektálnímu podání může být sloučenina podle tohoto vynálezu kombinována rovněž s excipienty, jako jsou kakaové máslo, glycerin, želatina nebo polyethylenglykoly a vytvarován do čípku.

Zde popsaná sloučenina je antagonistou receptoru vitronektinu a je vhodná k léčbě onemocnění podložených patologickým stavem, který lze přičítat ligandů nebo buňce interagující s receptorem vitronektinu. Tato sloučenina je vhodná například k léčbě onemocnění, ve kterých je patologický stav vytvářen úbytkem kostní hmoty. Takto je tato sloučenina vhodná k léčbě osteoporózy, hyperparathyroidismu, Pagetovy choroby, malignit způsobených hyperkalcémií, osteolytických lézí způsobených nádorovými metastázami nebo úbytku kostí z imobilizace nebo z deficience pohlavních hormonů. Soudí se, že sloučenina podle tohoto vynálezu má rovněž využití jako protinádorové, antiangiogenní, protizánětlivá nebo antimetastatická látka a je vhodná k léčbě aterosklerózy a restenózy.

Sloučenina se pacientovi podává buď orálně nebo parenterálně takovým způsobem, aby koncentrace léku byla dostatečná k inhibici kostní resorpce nebo k jiné takové indikaci. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu se podává v orálních dávkách mezi asi 0,1 a asi 50 mg/kg způsobem, který odpovídá stavu pacienta. Výhodně by orální dávky byly od asi 0,5 do asi 20 mg/kg. Při akutní terapii se dává přednost parenterálnímu podávání. Nejúčinnější je intravenózní infuze peptidu v 5% roztoku glukózy ve vodě nebo ve fyziologickém roztoku nebo podobné přípravky s vhodnými excipíens, avšak intramuskulární injekční bolus je rovněž vhodný. Parenterální dávka bude typicky od asi 0,01 do asi 100 mg/kg; výhodně mezi 0,1 a 20 mg/kg. Sloučenina se

podává jednou až čtyřikrát denně tak, aby se dosáhlo celkové denní dávky od asi 0,4 do asi 400 mg/kg za den. Přesnou hladinu a způsob, kterým se sloučenina podává, snadno určí odborník v oboru porovnáním hladiny látky v krvi s koncentrací požadovanou k dosažení terapeutického účinku.

Tento vynález dále poskytuje způsob léčby osteoporózy nebo inhibice úbytku kosti, který zahrnuje postupné podávání nebo fyzickou kombinaci sloučeniny vzorce (I) a jiných inhibitorů kostní resorpce, jako jsou bisfosfonáty (například allendronát), substituční terapii hormony, antiestrogeny nebo kalcitonin. Tento vynález dále poskytuje způsob léčby využívající sloučeninu podle tohoto vynálezu a anabolickou látku, jako je kostní morfogenní protein nebo iproflavon, vhodné k prevenci úbytku kosti a/nebo ke zvýšení kostní hmoty.

Tento vynález navíc poskytuje způsob inhibice nádorového růstu, který zahrnuje postupné podávání nebo fyzickou kombinaci sloučeniny vzorce (I) a jiné protinádorové působící látky. Sloučeniny ze skupiny analog kamptotecinu, jako jsou topotekan, irinotekan a 9-aminokamptotecin, a komplexy tvořené platinou, jako jsou cisplatina, ormaplatina nebo tetraplatina jsou dobře známými skupinami antineoplastik. Sloučeniny ze skupiny analog kamptotecinu jsou popsány v US patentech č. 5 004 758,

604 463, 4 473 692, 4 545 880, 4 342 776, 4 513 138 a 4 3 99 2 76, v publikovaných patentových přihláškách EP č.

418 099 a 0 088 642, v publikacích Wani a kol., J. Med. Chem., 22, 2358 (1986), Wani a kol., J. Med., Chem., 23, 554 (1980), Wani a kol., J. Med. Chem., 10, 1774 (1987) a Nitta a kol., Proč. 14th International Congr. Chemotherapy, Anticancer Section 1, 28 (1985), které jsou zde všechny • ·· ·

tímto zařazeny jako celek formou literálního odkazu. Komplex tvořený platinou, cisplatina, je dostupný pod jménem Platinol^<R> od Bristol Myers-Squibb Corporation. Vhodné přípravky cisplatiny jsou popsány v US patentech č.

562 925 a 4 310 515, které jsou zde tímto zařazeny jako celek formou literálního odkazu.

Při způsobu inhibice nádorového růstu, který zahrnuje postupné podávání nebo fyzickou kombinaci sloučeniny vzorce (I) a protinádorově působící látky, může být sloučenina s koordinovanou platinou, například cisplatina, podávána za použití pomalé intravenózní infuze. Výhodným nosičem je roztok glukózy ve fyziologickém roztoku obsahující mannitol. Dávkovači schéma sloučenin s koordinovanou platinou může být na bázi od asi 1 do asi 500 mg na čtverečný metr tělesného povrchu (mg/m²) během léčebné kůry. Infuze komplexních sloučenin platiny může být podávána jednou až dvakrát týdně a týdenní léčba může být opakována několikrát. Při použití parenterálního podávání sloučeniny ze skupiny analog kamptotecinu činí obecně používaná léčebná kůra od asi 0,1 do asi 300,0 mg/m² tělesného povrchu na den po dobu asi pěti po sobě následujících dnů. Výhodněji činí používaná léčebná kůra u topotekanu od asi 1,0 do asi 2,0 mg/m² tělesného povrchu na den po dobu asi pěti po sobě následujících dnů. Výhodně se léčebná kůra nejméně jednou opakuje po asi sedmi až asi dvacetiosmidennim intervalu.

Farmaceutický prostředek může být připraven tak, že jak sloučenina vzorce (I) tak protinádorově působící látka jsou v jednom zásobníku, ale přednost se dává přípravku v odlišných zásobnících. Pokud jsou obě látky poskytnuty ve formě roztoku, mohou být obsaženy v systému infuze/injekce k simultánnímu podání nebo v tandemovém provedení.

• · • · · · • * · 4 • · ··

Pro pohodlné podáni sloučeniny vzorce (I) a protinádově působící látky současně nebo v různou dobu se připraví kit obsahující v jednom zásobníku jako je krabice, papírová krabička nebo jiný zásobník, jednotlivé lahvičky, vaky, ampule nebo jiné zásobníky, z nichž každý obsahuje účinné množství sloučeniny vzorce (I) pro parenterální podání, jak bylo popsáno výše a účinné množství protinádorově působící látky pro parenterální podání, jak bylo popsáno výše. Takový kit může obsahovat například obě farmaceutické látky ve zvláštních zásobnících nebo ve stejném zásobníku, popřípadě jako lyofilizované náplně a zásobníky s roztoky k rekonstituci. Variantou tohoto je zahrnutí roztoku k rekonstituci a lyofilizované náplně do dvou komor jednoho zásobníku, kde může před použitím dojít ke smísení. V takovém provedení mohou být protinádorově působící látka a sloučenina podle tohoto vynálezu baleny odděleně, jako ve dvou zásobnících, nebo dohromady lyofilizovány jako prášek a poskytnuty v jednom zásobníku.

Pokud jsou obě látky poskytnuty ve formě roztoku, mohou být obsaženy v systému infuze/injekce k simultánnímu podání nebo v tandemovém provedení. Sloučenina vzorce (I) může být například v intravenózní injekční formě, nebo v infúzním vaku propojeném v řadách pomocí hadiček S protinádorově působící látkou v jiném infúzním vaku. Při použití takovéhoto systému může pacient obdržet počáteční bolusovou injekci nebo infúzi sloučeniny vzorce (I) následovanou infúzí protinádorově působící látky.

Sloučenina může být testována v jednom nebo několika biologických testech za účelem určení koncentrace sloučeniny, která je potřebná k dosažení farmakologického • · · · ·

0 * 0 0

0 0 • 00 • 0 *0 účinku.

Inhibice vazby vitronektinu

Vazba [³H]-SK&F-107260 v pevné fázi na : a_vS₃ z lidské placenty nebo lidských krevních destiček v koncentraci 0,1 až 0,3 mg/ml v pufru T (obsahujícím 2mM CaCl₂ a 1% oktylglukosid) se zředí pufrem T obsahujícím 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (pufr A) a 0,05 % NaN₃ a bezprostředně poté se přidá k ELISA plotnám o 96 jamkách (Corning, New York, New York) v množství 0,1 ml na jamku.

Dále se na jamku přidá 0,1 až 0,2 gg a_vS₃. Destičky se přes noc inkubují při teplotě 4 °C. V době pokusu se jamky jedenkrát propláchnou pufrem A a inkubují se v témže pufru jednu hodinu za teploty místnosti s 0,1 ml 3,5% roztokem albuminu bovinního séra. Po inkubaci se jamky kompletně odsají a promyjí dvakrát 0,2 ml pufru A.

Sloučeniny se rozpustí ve 100% DMSO, čímž se získá 2 mM zásobního roztoku, který se naředí vazebným pufrem (15 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, lmM MgCl₂), čímž se obdrží konečná koncentrace sloučeniny 100 gM. Tento roztok se pak zředí na požadovanou výslednou koncentraci sloučeniny. Různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 až 100 gM) se přidají k jamkám ve třech provedeních, poté se přidá 5,0 nM [³H]-SK&F-107260 (2,405 až 3,182 TBq/mmol).

Destičky se inkubují 1 hodinu za teploty místnosti. Po inkubaci se jamky kompletně odsají a jedenkrát promyjí 0,2 ml ledově chladného pufru A způsobem od jamky k jamce. Receptory se solubilizují v 0,1 ml 1% SDS a vazby [³H]-SK&F-107260 se se 40% účinností určí kapalným ·· · · · · ·· ·· ·· ·· ·· 4 4 4 4 4 φφφφ • · 4 Φ Φ ΦΦ 4444 • 4· 4 Φ 44 Φ · Φ φφ φ ·· · · · Φ · φφφφ ·· 4 Φ4 φφ φφ φφ scintilačním čítáním na Beckman LS Liquid Scintillation Counter za přidání 3 ml Ready Safe. Nespecifické vázání [³H]-SK&F-107260 se určí za přítomnosti 2 μΜ SK&F-107260 a tvoří v zásadě méně než 1% celkového vstupu radioligandů. IC_so (koncentrace antagonisty, která ihibuje 50 % vázání [³H]-SK&F-107260) se stanoví běžným vynesením křivky nelineární metodou nejmenších čtverců, která je modifikací programu LUNDON-2. K (disociační konstanta antagonisty) se vypočítá z rovnice: K. = IC /(1+L/K ) , ve které L je ^J *· 3_ £5 o ca.

koncentrace a K je disociační konstanta [³H]-SK&F-107260.

<3 ^u

Sloučenina podle tohoto vynálezu inhibuje vazbu vitronektinu na SK&F 107260 v asi 0,003 mikromolární koncentraci.

Sloučenina podle tohoto vynálezu je testována rovněž na resorbci kosti in vitro a in vivo pomocí standardních testů užívaných v oboru k vyhodnocení inhibice tvorby kosti, jako je test tvorby prohlubní popsaný v EP 528 587, který může být prováděn rovněž za použití lidských osteoklastů namísto osteoklastů krysích a model ovarektomizováných krys popsaný Wronskim a kol., Cells a Materials, Supi. 1, 69 až 74 (1991).

Test migrace vaskulárních buněk hladké svaloviny

Použije se krysích nebo lidských buněk hladké svaloviny aorty. Buněčná migrace se sleduje v Transwellové komůrce buněčných kultur za použití polykarbonátové membrány s póry o velikosti 8 μτη (Costar) . Spodní povrch filtru se potáhne vitronektinem. Buňky se v koncentraci 2,5 až 5,0 x 10^e buněk/ml suspendují v DMEM obohaceném 0,2 % albuminu bovinního séra a nechá se na ně po 20 min při teplotě 20 °C

0* 00 ► ♦ 0 « » 0 0 <

• ·· · působit testovaná sloučenina v různých koncentracích. Jako kontrola se použije samotné rozpouštědlo. 0,2 ml buněčné suspenze se umístí do horního oddílu komůrky. Spodní oddíl obsahuje 0,6 ml DMEM obohaceného 0,2 % albuminu bovinního séra. Inkubace se provádí po 24 hodin za teploty 37 °C v atmosféře obsahující 95 % vzduchu a 5 % oxidu uhličitého. Po inkubaci se neodmigrované buňky odstraní z horního povrchu filtru jemným seškrábnutím. Poté se filtr fixuje v methanolu a barví 10% Giemsovým barvivém. Migrace se měří buď a) čítáním počtu buněk, které migrovaly na spodní povrch filtru nebo b) extrakcí obarvených buněk 10 % kyselinou octovou a následným určením absorbance při vlnové délce 600 nm.

Model thyroparathyroidektomizovaných krys

Každá pokusná skupina obsahuje 5 až 6 dospělých samců krysy linie Sprague-Dawley o tělesné hmotnosti 250 až 400 g. 7 dní před použitím jsou krysy thyroparathyroidektomizovány (prodejcem Taconic Farms). Každé tři dny dostávají všechny krysy substituční dávku thyroxinu. Při příjmu krys se měří celkové hladiny ionizovaného vápníku v cirkulující krvi bezprostředně po vysazení, punkci ocasní vény do heparinizovaných zkumavek. Do pokusu se zahrnou krysy, u kterých je hladina ionizovaného vápníku (měřeno na Ciba-Cornig model 634 calcium pH analyzer) menší než 1,2 mmol/1. Každá z krys se opatří permanentním venózním a arteriálním katetrem pro získávání testovaného materiálu, respektive krevních vzorků. Krysy jsou poté drženy na dietě s nízkým obsahem vápníku v krmivu a s destilovanou vodou. Měří se základní hladiny vápníku a každé z krys je pomocí kontinuální intravenózní infuze venózním katetrem za použití externí infúzní pumpy podáván buď kontrolní prostředek nebo lidský parathyroidní ·· ···· ·« ·· ·· ·» • · · · · · · · · · · • · · · · ·· t · · · • · · · · fcfc · · · · · · ··· · · · · · · · · ·· · ·· · · ·· ·· hormon peptid 1-34 (hPTHl-34 v dávce 1,25 jzg/kg/h ve fyziologickém roztoku/0,1% albumin bovinního séra, Bachem, Kalifornie) nebo směs hPTHl-34 a testovaného materiálu.

Během období infuze v trvání 6 až 8 hodin se u každé s krys měří ve dvouhodinových intervalech kalcemická odpověď.

Testy resorpce a adheze lidských osteoklastů

Testy resorpce prohlubní a adheze byly vyvinuty a standardizovány za použití normálních lidských osteoklastů odvbozených z tkáně osteoklastomu. Test 1) byl vyvinut k měření objemu osteoklastických prohlubní pomocí laserové konfokální mikroskopie. Test 2) byl vyvinut jako účinnější test, ve kterém jsou pomocí kompetitivní ELISA metody měřeny fragmenty kolagenu (uvolňované během resorpce).

Test 1 (s použitím laserové konfokální mikroskopie)

Alikvoty buněčných suspenzí odvozené z lidského osteoklastomu se vyjmou ze zásobníku s tekutým dusíkem, rychle ohřejí na teplotu 37 °C a jedenkrát se při odstředění (frekvence otáček 1000 za minutu po dobu 5 minut při 4 °C) promyjí v médiu RPMI-1640.

Médium se odsaje a nahradí myší anti-HLA-DR protilátkou a poté zředí médiem RPMI-1640 na poměr 1:3. Suspenze se 30 minut inkubuje na ledu a často míchá.

Buňky se dvakrát promyjí chladným RPMI-1640, poté se odstředí (frekvence otáček 1000 za minutu po dobu 5 minut při 4 °C) a pak se buňky převedou do 15ml odstřeďovací zkumavky. Počet mononukleárních buněk se spočítá ve vylepšené Neubauerově čítači komůrce.

• · • fe • · ··· · fefe fe· fefe • fe · · 9 · · · • · · · · fefe fe ··· · · · · fefefefe •fefe fefe ·· ·· ··

Ze zásobní lahve se vyjme dostatečné množství magnetických perliček {5 na mononukleární buňku) potažených kozími protilátkami proti myším IgG protilátkám (Dynal,

Great Neck, New York) a vloží se do 5 ml čerstvého média (tím se vymyje toxické azidové konzervační činidlo). Médium se odstraní imobilizací perliček na magnet a nahradí se čerstvým médiem.

Perličky se smíchají s buňkami a suspenze se 30 minut inkubuje na ledu. Suspenze se často míchá.

Buňky potažené perličkami se imobilizují na magnet a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se nechají usadit v 50ml odstřeďovací zkumavce.

K buňkám potaženým perličkami se přidá Čerstvé médium za účelem uvolnění jakýchkoli zachycených osteoklastů. Tento promývací postup se opakuje desetkrát. Buňky potažené perličkami se vyřadí.

Životaschopné osteoklasty se spočítají v čítači komůrce, k označení živých buněk se použije fluoresceindiacetátu. K dodání vzorku do komůrky se použije plastická pasteurova pipeta s velkým průměrem pro jedno použití.

Osteoklasty se odstředěním peletují a hustota se nastaví na správné množství (počet osteoklastů je nádor od nádoru různý) v mediu EMEM obohaceném 10 % fetálního telecího séra a hydrogenuhličitanem sodným v koncentraci

1,7 g/1.

3ml alikvoty buněčné suspenze (na zpracování slou- 22 • · 4 ·4 4 • 4 »· ·· 44 • 4 · · 4 4 4 4 4 · 4

4 44 44 4444

44 ·· 44 444 44 4 • · · · 4 4 4 4 · · 4

9t · 44 44 44 44 čeniny) se nechají usadit v 15ml odstřeďovacích zkumavkách. Buňky se peletují odstřeďováním.

Do každé zkumavky se přidají 3 ml příslušné sloučeniny k ošetření (zředěné v médiu EMEM na 50 μΜ). Zařazeny jsou rovněž kontroly s příslušným vehikulem, pozitivní kontrola (myší monoklonální protilátka proti receptoru vitronektinu [87MEM1] zředěná na 100 /zg/ml) a isotypová kontrola (IgG^^ zředěná na 100 /zg/ml) . Vzorky se inkubují 30 min při 37 °C.

0,5 ml buněčných alikvótů se osadí na sterilní dentinové plátky na plotnu o 48 jamkách a 2 hodiny se inkubuje při 37 °C. Každé zpracování se testuje čtyřikrát.

Plátky se šestkrát promyjí šestkrát vyměněným teplým PBS (10 ml/jamku na plotně o 6 jamkách) a poté se umístí do čerstvého média obsahujícího sloučeniny k ošetření nebo kontrolní vzorky. Vzorky se inkubují 48 h při 37 °C.

Postup s tartrát rezistentní kyselou fosfatázou (TRAP) (barvivo selektivní pro buňky linie osteoklastů)

Kostní plátky obsahující připojené osteoklasty se promyjí ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku a 5 min fixuji ve 2% roztoku gluteraldehydu (v 0,2M kakodylatu sodném).

Poté se promyjí ve vodě a 4 min inkubují při teplotě 37 °C v pufru TRAP (0,5 mg/ml naftol AS-BI fosfátu rozpuštěného v N,N-dimethylformamidu a smíchaného s 0,25M citrátovým pufrem o pH 4,5, obsahujícím 10 mM tartrátu sodného).

• to ·· to ·· to • ·· ·

« · to · · · • to· • to · ·· ··

Po promytí ve studené vodě se plátky ponoří do studeného acetátového pufru (O,1M, pH 6,2) obsahujícího 0,1 mg/ml rychle červenajícího granátu a inkubují 4 min při teplotě 4 °C.

Přebytečný pufr se odsaje a plátky se suší vzduchem a poté promyjí ve vodě.

TRAP pozitivní osteoklasty (sraženina cihlově červené/ nachové barvy) se spočítají mikroskopií v osvitu a poté se utrazvukem odstraní s povrchu dentinu.

Objemy prohlubní se určí za použití konfokálního mikroskopu Nicon/Lasertec ILM21W.

Test 2 (za použití vyloučení pomocí metody ELISA)

Lidské osteoklasty se upraví a připraví pro testování sloučeniny, jak bylo popsáno v úvodních devíti krocích testu 1. Z důvodu srozumitelnosti se tyto kroky dále opakují.

Alikvoty buněčných suspenzí odvozených z lidského osteoklastomu se vyjmou ze zásobníku s tekutým dusíkem, rychle ohřejí na teplotu 37 °C a jedenkrát se při odstředění (frekvence otáček 1000 za minutu po dobu 5 minut při 4 °C) promyjí v médiu RPMI-1640.

Médium se odsaje a nahradí myší anti-HLA-DR protilátkou a poté zředí médiem RPMI-1640 v poměru 1:3. Suspenze se 30 minut inkubuje na ledu a často míchá.

Buňky se dvakrát promyjí chladným RPMI-1640, poté se β φ · * φ φ φφ ·» ·· ·φ • · » ΦΦΦΦ 9 · · i ♦ · « Φ Φ ΦΦ ΦΦΦΦ

Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ Φ φ · ΦΦ Φ ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ

ΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ Φ· ΦΦ odstředí (frekvence otáček 1000 za minutu po dobu 5 minut při 4 °C) a pak se buňky převedou do 15ml odstřeďovací zkumavky. Počet mononukleárních buněk se spočítá ve vylepšené Neubauerově čítači komůrce.

Ze zásobní láhve se vyjme dostatečné množství magnetických perliček (5 na mononukleární buňku) potažených kozími protilátkami proti myším IgG protilátkám (Dynal,

Great Neck, New York) a vloží se do 5 ml čerstvého média (tím se vymyje toxické azidové konzervační činidlo). Médium se odstraní imobilizací perliček na magnet a nahradí se čerstvým médiem.

Perličky se smíchají s buňkami a suspenze se 30 minut inkubuje ná ledu. Suspenze se často míchá.

Buňky potažené perličkami se imobilizují na magnet a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se nechají usadit v 50ml odstřeďovací zkumavce.

K buňkám potaženým perličkami se přidá čerstvé médium za účelem uvolnění jakýchkoli zachycených osteoklastů. Tento promývací postup se opakuje desetkrát. Buňky potažené perličkami se vyřadí.

Životaschopné osteoklasty se spočítají v citací komůrce, k označení živých buněk se použije fluoresceindiacetátu. K dodání vzorku do komůrky se použije plastická pasteurova pipeta s velkým průměrem pro jedno použití.

Osteoklasty se odstřeďováním zpeletují a hustota se nastaví na správné množství (počet osteoklastů je nádor od • · · · • · • · • · · toto· nádoru různý) v mediu EMEM obohaceném 10 % fetálního telecího séra a hydrogenuhličitaném sodným v koncentraci

1,7 g/1.

Na rozdíl od způsobu popsaného v testu 1 se sloučenina za účelem získání IC_so testuje ve čtyřech dávkách, jak je nastíněno dále:

Připravené osteoklasty se preinkubují 30 min při teplotě 37 °C s testovanou sloučeninou (ve čtyřech dávkách) nebo s kontrolami.

Poté se osadí na bovinní plátky kortikální kosti na plotnu tkáňových kultur o 48 jamkách a další 2 hodiny se inkubují při 37 °C.

Plátky se promyjí šestkrát vyměněným teplým fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), aby se odstranily neadherované osteoklasty a poté se vrátí do jamek plotny o 48 jamkách, obsahujících čerstvou sloučeninu nebo kontroly.

Plotna s tkáňovou kulturou se poté inkubuje 48 h při 37 °C.

Z každé jamky se odsaje supernatant do zvláštní zkumavky a testuje se pomocí kompetitivní ELISA metody, která detekuje c-koncový peptid kolagenu typu I, který se uvolňuje během resorpčního procesu. Jde o ELISA dostupnou na trhu (Osteometer, Dánsko), která obsahuje králičí protilátky specificky reagující se sekvencí o osmi aminokyselinách (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) přítomnou na karboxylovém konci koncového peptidu al-řetězce kolagenu typu I. Výsledky se vyjádří jako % inhibice resorbce ve srovnání s kontrolními vehikuly.

Test adheze lidských osteoklastů

Lidské osteoklasty se obohatí a připraví pro testování sloučeniny, jak bylo popsáno v úvodních devíti krocích testu 1. Z důvodu srozumitelnosti se tyto kroky dále opakují.

Alikvoty buněčných suspenzí odvozených z lidského osteoklastomu se vyjmou ze zásobníku s tekutým dusíkem, rychle ohřejí na teplotu 37 °C a jedenkrát se při odstředění (frekvence otáček 1000 za minutu po dobu 5 minut při 4 °C) promyjí v médiu RPMI-1640.

Médium se odsaje a nahradí myší anti-HLA-DR protilátkou a poté zředí médiem RPMI-1640 v poměru 1:3. Suspenze se 30 minut inkubuje na ledu a často míchá.

Buňky se dvakrát promyjí chladným RPMI-1640, poté se odstředí (1000 otáček za minutu po dobu 5 minut při 4 °C) a pak se buňky převedou do 15ml odstřeďovací zkumavky. Počet mononukleárních buněk se spočítá ve vylepšené Neubauerově čítači komůrce.

Ze zásobní láhve se vyjme dostatečné množství magnetických perliček (5 na mononukleární buňku) potažených kozími protilátkami proti myším IgG protilátkám (Dynal,

Great Neck, New York) a vloží se do 5 ml čerstvého média (tím se vymyje toxické azidové konzervační činidlo). Médium se odstraní imobilizací perliček na magnet a nahradí se čerstvým médiem.

• · · · • * fe ·· · · ·· · · · fe *' V fe fefe

Perličky se smíchají s buňkami a suspenze se 30 minut inkubuje na ledu. Suspenze se často míchá.

Buňky potažené perličkami se imobilizují na magnet a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se nechají usadit v 50ml odstřeďovací zkumavce.

K buňkám potaženým perličkami se přidá čerstvé médium za účelem uvolnění jakýchkoli zachycených osteoklastů. Tento promývací postup se opakuje desetkrát. Buňky potažené perličkami se vyřadí.

Životaschopné osteoklasty se spočítají v čítači komůrce, k označení živých buněk se použije fluoresceindiacetátu. K dodání vzorku do komůrky se použije plastická pasteurova pipeta s velkým průměrem pro jedno použití.

Osteoklasty se odstředěním zpeletují a hustota se nastaví na správné množství (počet osteoklastů je nádor od nádoru různý) v mediu EMEM obohaceném 10 % fetálního telecího séra a hydrogenuhličitanem sodným v koncentraci

1,7 g/1.

Osteoklasty odvozené z osteoklastomu se preinkubují 30 min při teplotě 37 °C s testovanou sloučeninou (ve čtyřech dávkách) nebo s kontrolami.

Poté se buňky osadí na plátky pokryté ostěopontinem (lidský nebo krysí osteopontin, koncentrace 2,5 gg/ml) a inkubují 2 h při teplotě 37 °C.

Neadherováné buňky se odstraní silným promytím plátků • to • · to · * · · · · · · « · to to··· ···· • to· ·· ·· ··· ·· · • toto ···· ··«« ·· to · · * a> to· >· fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), a buňky zbylé na plátcích se fixují v acetonu.

Osteoklasty se barví na tartrát resistentní kyselou fosfatázu, selektivní markér buněk tohoto fenotypu (viz krok 15 až 17) a spočítají se mikroskopií v osvitu. Výsledky se vyjádří jako % inhibice adhese ve srovnání s kontrolními vehikuly.

Test buněčné adheze

Buňky a buněčné kultury

Lidské buňky embryonálních ledvin se získají s ATCC (Katalog č. CRL 1573). Buňky se nechají růst v Earlově minimálním základním mediu (EMEM), obsahujícím Earlovy soli, 10 % bovinního séra, 1 % glutaminu a 1 % penicilinu streptomycinu.

Konstrukty a transfekce

EcoRI-KpnI fragment podjednotky o velikosti 3,2 kb a Xbal-Xhol fragment podjednotky S₃ o velikosti 2,4 kb se vloží do EcoRI-EcoRV klonovacího místa vektoru pCDN (Aiyar a kol. (1994)), který obsahuje CMV promotor a markér G418 identifikovatelný podle blunt konce vazby. Pro stabilní expresi se nechá 80 x 10^e buněk HEK 293 elektrotransformovat a_v + &₃ konstrukty (20 μ<3 DNA od každé podjednotky) za použití pulseru Gene Pulseru (Hensley a kol. (1994)) a umístit na lOOmm plotny (5 x 10^s buněk na plotnu). Po 48 h se růstové médium obobohatí roztokem Geneticinu o koncentraci 450 /xg/ml (G418 sulfáte, GIBCO-BRL, Bethesda, Maryland). Buňky se udržují v selektivním mediu, dokud fc · i · i :

*· ·· • * · ♦ <

• · «· « » ·· ··<

·*·· · ·· ·<

nejsou buněčné kolonie dostatečně veliké pro testování.

Imunocytochemická analýza transfektováných buněk

Za účelem stanovení, zda HEK 2 93 transfektované buňky exprimují receptor vitronektinu se buňky odstřeďováním imobilizují na mikroskopických sklíčcích, fixují 2 min v acetonu za teploty místnosti a usuší na vzduchu.

Specifická reaktivita vůči 23C6, monoklonální protilátce specifické pro komplex cM&₃ se demonstruje použitím metody standardní nepřímé imunofluorescence.

Studie buněčné adheze

Cornigovi ELISA plotny s 96 jamkami se nechají předem přes noc potáhnout při teplotě 4 °C 0,1 ml lidského vitronektinu (0,2 μg/ml v mediu RPMI). V době experimentu se plotny jedenkrát promyjí mediem RPMI a po 1 h blokují za teploty místnosti pomocí 3,5% roztoku BSA v mediu RPMI. Transfektované HEK 293 buňky se resuspendují v mediu RPMI, obohaceným 20 mM Hepes o pH 7,4 a 0,1 % BSA, na hustotu 0,5 x 10^s buněk/ml. 0,1 ml buněčné suspenze se přidá do každé jamky a inkubuje 1 h při teplotě 37 °C za přítomnosti nebo nepřítomnosti různých antagonistů. Po inkubaci se přidá 0,025 ml 10% roztoku formaldehydu o pH 7,4 a buňky se fixují 10 min za teploty místnosti. Plotny se třikrát promyjí 0,2 ml média RPMI a adherované buňky se barví 0,1 ml 0,5% toluidinové modři po dobu 20 min za teploty místnosti. Přebytečné barvivo se odstraní extenzivním promýváním v deionizované vodě. Toluidinová modř inkorporovaná v buňkách se vymyje přidáním 0,1 ml 50% ethanolu obsahujícího 50 mM HCI. Buněčná adheze se kvantitativně určí jako optická hustota na vlnové délce • · · ·

0« • 0 * «0 * .0

0 •

0

0 0 0 ·· 00

600 nm na mikrotitrační čtečce plotny (Titertek Multiskan MC, Sterlink, Virginia).

Test vazby pevné fáze

Receptor vitronektinu se získá purifikací z lidské placenty. Receptorový preparát se naředí 50 mM Tris-HCl o pH 7,5, 100 mM chloridu sodného, 1 mM chloridu vápenatého, 1 mM chloridu manganatého, 1 mM chloridu horečnatého (pufr A) a okamžitě se přidá na ELISA plotnu o 96 jamkách v množství 0,1 ml na jamku. Na jamku se přidá 0,1 až 0,2 gg .

Plotny se přes noc inkubují při teplotě 4 °C. V době experimentu se jamky jedenkrát promyjí pufrem A a inkubují se 1 h při teplotě místnosti s 0,1 ml 3,5% albuminu bovinního séra v témže pufru. Po inkubaci se buňky kompletně odsají a dvakrát promyjí 0,2 ml pufru A.

Při kompetičním testu [³H]SK&F-107260 se přidají do jamek různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 až 100 μΜ) , poté se přidá 5,0 nM [³H]SK&F-107260. Plotny se inkubují jednu hodinu při teplotě místnosti. Po inkubaci se se buňky kompletně odsají a jedenkrát promyjí 0,2 ml ledově chladného pufru A způsobem od jamky k jamce. Receptory se solubilizují v 0,1 ml 1% SDS a vazba [³H]SK&F-107260 se stanoví s přidáním 3 ml Ready Safe se 40% účinností metodou kapalného scintilačního čítání na Beckman LS 6800 Liquid Scintillation Counter. Nespecifické vázání [³H]-SK&F-107260 se určí za přítomnosti 2 μΜ SK&F-107260 a tvoří v zásadě méně než 1 % celkového vstupu radioligandů. ICso (koncentrace antagonisty, která inhibuje 50 % vázání [³H]-SK&F-107260) se stanoví běžným vynesením křivky nelineární metodou nejmenších čtverců, která je modifikací programu LUNDON-2. Κχ (disociační konstanta antagonisty) se φ ♦ a

« · φ · · φ * φ φ φ φ φφφφ φ a φ < φ φ φ · φ»· φ·φ φφφφ φ • · · < · · * zpočítá z rovnice Chenga a Prussofa: K = IC /(l+L/K^), ve které L je koncentrace a K_d je disociační konstanta [³H]-SK&F-107260.

Inhibice RGD zprostředkovaného vázání GPIIb-IIIa

Purifikace GPIIb-IIIa

Deset jednotek starších, promytých lidských krevních destiček (získané od Červeného kříže) se nechá lyžovat za jemného míchání 2 h při 4 °C ve 3% oktylglukosidu, 20 mM Tris-HCl o pH 7,4, 140 mM chloridu sodného a 2 mM chloridu vápenatého. Lysát se jednu hodinu odstřeďuje při 100 000 x g. Získaný supernatant se dá do 5ml kolony s čočkovou lektin sefarosou 4B (E.Y.Labs) předekvilibrované 20 mM Tris-HCl o pH 7,4, 100 mM chloridu sodného, 2 mM chloridu vápenatého, 1 % oktylglukosidu (pufr A). Po 2h inkubaci se kolona promyje 50 ml chladného pufru A. Lektinem zachycený GPIIb-IIIa se vymyje pufrem A obsahujícím 10 % glukózy. Všechny postupy se provádí při teplotě 4 °C. Jak ukazuje SDS elektroforéza na polyakrylovém gelu, získaný GPIIb-IIIa má >95% čistotu.

Inkorporace GPIIb-IIIa v liposomech

Směs 70 % fosfatidylserinu a 30 % fosfatidylcholinu (Avanti Polar Lipids) se suší v proudu dusíku při stěně skleněné zkumavky. Purifikovaný GPIIb-IIIa se zředí na konečnou koncentraci 0,5 mg/ml a smíchá s fosfolipidy v hmotnostním poměru proteinů k fosfolipidům 1:3. Směs se resuspenduje a vystaví na 5 minut ultrazvukovým vlnám v ultrazvukové lázni. Poté se směs nechá přes noc dialyzovat za použití dialyzační trubice pro oddělení látek o molekulových hmotnostech 12 000 až 14 000 proti tisícinásobnému přebytku 50 mM Tris-HCl o pH 7,4, 100 mM chloridu sodného a 2 mM chloridu vápenatého (s dvěma výměnami). Liposomy wee obsahující GPIIb-IIIa se odstřeďují 15 min při 12 000 x g a resuspendují v dialyzačním pufru v konečné koncentraci proteinu asi 1 mg/ml. Liposomy se, až do doby, kdy jsou potřebné, skladují při teplotě -70°C.

Kompetitivní vázání na GPIIb-IIIa

Vázání na receptor fibrinogenu (GPIIb-IIIa) se testuje metodou nepřímého kompetitivního vázání za použití [³H]-SK&F-107260 jako ligandu typu RGD. Test vázání se provádí na sadě filtrační plotny o 96 jamkách (Millipore Corporation, Bedford, MA) za použití hydrofilní durapontové membrány o velikosti pórů 0,22 gm. Jamky se předem potahují 1 h při teplotě místnosti 0,2 ml polylysinu o koncentraci 10 gg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missoury), aby se zabránilo nespecifickým vazbám. Do jamek se přidají různé koncentrace neznačených benzazepinů, každá ve čtyřech provedeních. Do každé z jamek se přidá [³H]-SK&F-107260 v konečné koncentraci 4,5 nM a poté 1 gg purifikovaných liposomů obsahujících destičkový GPIIb-IIIa. Směs se 1 h inkubuje při teplotě místnosti. GPIIb-IIIa vázaný na [³H]-SK&F-107260 se oddělí od nevázaného filtrací za použití filtračního papíru Millipore a poté se promyje dvakrát 0,2 ml ledově chladného pufru. Radioaktivita vazeb, které zůstávají na filtrech se čítá se 40% účinností v 1,5 ml Ready Solve (Beckman Instruments, Fulerton, Kalifornie) na čítači Bekman Liquid Scintillation Counter (Model LS6800). Nespecifické vázání se stanoví za přítomnosti 22 gM neznačeného SK&F-107260 a tvoří v zásadě méně než 0,14 % celkové radioaktivity přidané k vzorkům. Všechny údaje jsou ♦

• «4 střední hodnotou výsledků čtyřech provedení.

Data kompetitivního vázání se analyzují nelineární metodou nejmenších čtverců. Tato metoda poskytuje IC_so antagonistů (koncentrace antagonisty, která inhibuje v rovnovážném stavu 50 % specifického vázání [³H]-SK&F-107260) . IC má vztah k rovnovážné disociační konstantě (K_±) antagonisty založené na rovnici Chenga a Prussofa: Κ_χ = IC_so/(1+L/K^), ve které L je koncentrace [³H]-SK&F-107260 použitá v testu kompetitivního vázání (4,5 nM) a K_d je disociační konstanta [³H]-SK&F-107260, která je 4,5 nM, jak se určí Scatchard analýzou.

Sloučenina podle tohoto vynálezu má poměr afinity pro receptor vitronektinu k receptoru fibrinogenu v hodnotě věětší než 10 : 1. Poměr aktivity je u této sloučeniny vyšší než 100 : 1.

Účinnost sloučeniny vzorce (I) samotné nebo v kombinaci s protinádorové působící látkou může být stanovena za použití několika myších modelů transplantovatelných tumorů. Podrobnosti o těchto modelech viz US patenty č. 5 004 758 a 5 633 016.

Následující příklady nejsou v žádném případě zamýšleny, aby omezily rozsah tohoto vynálezu, nýbrž mají poskytnout obrázek, jak vyrobit a použít sloučeninu podle tohoto vynálezu. Mnoho dalších provedení vynálezu bude zřetelně zjevné odborníkovi v oboru.

Příklady provedení vynálezu

Obecné údaje «9 ···· ·· ·Φ ΦΦ Φφ » · φ 9 9 9 9 9 9 9 9

9 Φ Φ ΦΦ · φ φ ·

Φ Φ Φ ·Φ ΦΦ φφφ φφ Φ ΦΦΦ φφφφ φφφφ « · * 4 Φ Φ · Φ Φ «Φ ¹Η spektra magnetické rezonance (NMR) se zaznamenávají buď na frekvenci 250 nebo 400 MHz. Chemické posuny byly zaznamenány v dílech na milion (δ) polí z vnitřního standardu tetramethylsilanu (TMS). Zkratky používané pro NMR hodnoty jsou následující: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet, dd = dvojice dubletů, dt = dvojice tripletů, app = zjevný, br = široký. J znamená NMR konjugační konstantu v měřenou v Hz. CDC1₃ je deuteriochloroform, DMSO-d_s je hexadeuteriomethylsulfoxid a CD^OD je tetradeuteriomethanol. Infračervená spektra (IR) se zaznamenávají v transmisním modu a umístění vazeb jsou uváděna v převráceném vlnočetu (cm^-1). Hmotnostní spektra se získají za použití elektrosprejových (ES) ionizačních technik. Elementární analýzy byly provedeny společností Quantitative Technologies lne., Whitehouse, New Jersey. Teploty tání jsou získány Thomass Hooverovým přístrojem ke stanovování teplot tání a jsou nekorigovány. Všechny teploty jsou uváděny ve stupních celsia. Při chromatografii na tenké vrstvě jsou použity plotny s tenkou vrstvou Analtech Silica Gel GF a E. Merck Silica Gel 60 F-254. Jak velmi rychlá chromatografie, tak gravitační chromatografie jsou provedeny na silikagelu E. Merck Kieselgel 60 (rozměr částice 0,066 až 0,038 mm). Analytické a preparatorní HPLC jsou provedeny na Raininově nebo Beckmanově chromatografu. ODS znamená oktadecylsilylem modifikovaný silikagel jako nosič pro chromatografii. 5 μ Apex-ODS znamená oktadecylsilylem modifikovaný silikageljako nosič pro chromatografii, u něhož je velikost základních částic 5 μτη, -vyráběný firmou Jones Chromatografy, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ^(R) je ODS chromatografický nosič a je registrovanou ochrannou známkou společnosti YMC Co. Ltd., Kyoto, Japonsko. PRP-1^<R> je polymerní (styren-divinyl- benzenový) chromatografický • ·

základ, a je registrovanou ochrannou známkou společnosti Hamilton Co., Reno, Nevada. Celite^<R> je filtrační pomůcka složená z kyselinou promyté rozsivkové zeminy na bázi oxidu křemičitého a je registrovanou ochrannou známkou společnosti Manville Corp., Denver, Colorado.

Příklad 1

Příprava kyseliny (S)-8-[3-methylpyrid-2-ylamino)-1-propoxy]-3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2-benzazepin-4-octové

Příprava 1

Příprava methylesteru kyseliny ( + )-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2-benzazepin-4-octové

a) 4-Brom-3-brommethylanisol

Směs 20 g (0,10 mol) 2-brom-5-methoxytoluenu, 19,6 g (0,11 mol) N-bromsukcinimidu, 1 g (4 mmol) benzoylperoxidu a 200 ml methylenchloridu se na 18 h ozařuje flood lampou za účelem dosažení jemného refluxu. Poté se směs na několik hodin ochladí na -10 °C a roztok se dekantací oddělí od vysráženého sukcinimidu. Roztok se odpaří a odparek se nechá krystalovat ze směsi chloroformu a hexanu, čímž se získá

19,7 g (70 %) sloučeniny uvedé v nadpise v podobě světle žlutých hranolů.

^XH NMR (CDC1₃) δ 7,45 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 3 Hz, 1H), 6,74 (dd, J = 8,93 Hz, 1H), 4,55 (s, 2H), 3,80 (S, 3H).

• to • toto to * to · » • · to • toto » a· · · · · toto to· «to

b) 3-Bis (terč. -butoxykarbonyl) aminomethyl-4-bromanizol

Směs 24 g (86 mmol) 4-brom-3-brommethylanisolu a 24 g (94 mmol) di-terč.-butyliminodikarboxylátu draselného ve 200 ml dimethylformanidu se za teploty místnosti míchá 18 hodin pod argonem. Poté se reakční směs odpaří ve vakuu a odparek se rozdělí mezi ethylacetát a vodu. Organická fáze se promyje vodou a roztokem chloridu sodného, suší síranem hořečnatým a odpaří. Odparek se nechá rekrystalizovat z hexanu, čímž se získá 15 g (42 %) sloučeniny uvede v nadpise v podobě bílé pevné látky.

^XH NMR (CDC1₃) δ 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,68 (m, J = 2 Η), 4,81 (S, 2H), 3,74 (s, 3H), 1,44 (s, 18 H).

c) Methylester kyseliny (+)-3-karbomethoxy-4-[2-bis(terč.-butoxykarbonyl)aminomethyl-4-methoxyfenyl]-3-butenové

500ml kádinka se naplní 15 g (36 mmol) 3-bis(terč.butoxykarbonyl)aminomethyl-4-bromanisolu, 7,5 g (47 mmol) dimethylitakonatu, 1 g (3 mol) tri-o-tolylfosfinu, 0,4 g (2 mmol) octanu palladnatého, 12,8 ml (72 mmol) diisopropylethylaminu a 150 ml propionitrilu. Směs se profukuje argonem (několik evakuací a cyklů profouknutí argonem) a poté se v argonové atmosféře zahřívá pod zpětným chladičem po dobu jedné hodiny. Reakční směs se nechá schladnout na teplotu místnosti a poté se přilije 500 ml ledově chladného ethyletheru. Výsledná sraženina se odstraní filtrací a filtrát se odpaří. Odparek se čistí chromatografií na silikagelu (10% až 20% ethylacetát v hexanu), čímž se získá

11,8 g (66 %) sloučeniny uvedé v nadpise v podobě světle žluté olejovité látky.

0000 00 00 ·· 00 »0 0 · 0 · 0 0 0»· • · « 0 0 0 0 0*0« 0 0· 0 · 00 0 · 0 00 0 0 0 0 »000 0000

0 · 0« 00 00 00 ^ΧΗ NMR (CDC1₃) δ 7,94 (s, ΙΗ), 7,15 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,76 (s, 1H), 4,73 (s, 2H),

3,81 (S, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,38 (s, 2H), 1,45 (s, 18 H).

d) Methylester kyseliny (+)-3-karbomethoxy-4-[2-bis(terč.-butoxykarbonyl) aminomethyl-4-methoxyfenyl] butanové

Tlaková nádoba naplněná 11,8 g methylesteru kyseliny (+)-3-karbomethoxy-4-[2-bis(terč.-butoxykarbonyl)aminomethyl-4-methoxyfenyl]-3-butenové, 120 ml ethylacetátu a 1 g 10% palladia na aktivním uhlí se po 18 h protřepává ve vodíkové atmosféře za tlaku 316,3 kPa. Poté se směs zfiltruje a filtrát se odpaří, čímž se získá 12 g (100 %) sloučeniny uvedé v nadpise v podobě bezbarvé olejovité látky.

^XH NMR (CDC1₃) δ 7,00 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,71 (m, 2H),

4,81 (S, 2H) , 3,75 (s, 3H), 3,66 (s, 3H), 3,63 (s, 3H) ,

3,05 (m, 2H) , 2,73 (m, 2H)., 2,42 (dd, J = 16,0, 4,8 Hz,

Η), 1,44 (S, 18 H).

e) Methylester kyseliny (+)-3-karbomethoxy-4-[2-(aminomethyl) -4-methoxyfenyl]butanové

Roztok 12 g methylesteru kyseliny(+)-3-karbomethoxy-4-[2-bis(terč.-butoxykarbonyl)aminomethyl-4-methoxyfenyl]butanové ve 100 ml chloroformu a 50 ml kyseliny trifluoroctové se 4 hodiny míchá pod argonem za teploty místnosti. Poté se roztok odpaří ve vakuu, čímž se získá 10 g (100 %) sloučeniny uvedé v nadpise v podobě viskózní olej ovité látky.

• · • « fc · * · · · • fc · fcfcfcfc · • fcfc fc · · · fcfcfcfc •· · fcfc ·· fcfc fcfc

MS (ES) m/e 296,2 (Μ + H)*.

f) Methylester kyseliny (+)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

Roztok 10 g (24 mmol) methylesterů kyseliny ( + )-3-karbomethoxy-4-[2-(aminomethyl)-4-methoxyfenyl] butanové a 17 ml ( 120 nmol) triethylaminu ve 100 ml toluenu se zahřívá pod zpětným chladičem po dobu 18 h. Poté se reakční směs odpaří a odparek se rozdělí mezi ethylacetát a vodu. Vodná vrstva se dvakrát extrahuje ethylacetátem a kombinované organické extrakty se promyjí roztokem chloridu sodného, suší síranem hořečnatým a odpaří, čímž se získá 4,8 g (76 %) sloučeniny uvedé v nadpise v podobě hnědé pevné látky.

MS (ES) m/e 264,2 (Μ + H)*.

g) Methylester kyseliny ( + )-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

K roztoku 3,0 g (11 mmol) methylesterů kyseliny (+)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové a 4,2 ml (77 mmol) ethanthiolu ve 100 ml methylenchloridu se při 0 °C přidá za stálého míchání pod argonem po částech 7,6 g (57 mmol) bezvodého chloridu hlinitého. Výsledná směs se nechá ohřát na teplotu místnosti, přes noc se míchá a poté se odpaří. Odparek se trituruje v ledové vodě a výsledná pevná látka se zachytí filtrací a usuší, čímž se získá 2,64 g (91 %) sloučeniny uvedé v nadpise v podobě bělavé pevné látky.

MS (ES) m/e 250,2 (Μ + H)*.

toto*· to » • to • to to · · to · ·»·· ·· · ·<·· tt*· • ·· ·· »· ·«· ·* · • · · ···· «toto· ·· · ·· · · toto ·>

Příprava 2

HPLC oddělení enantiomerů methylesteru kyseliny (+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

a) Methylester kyseliny (R)-(+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové a methylester kyseliny (S)-(+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

Methylester kyseliny (+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové se rozštěpí pomocí chirální HPLC na své enantiomery, a to za těchto podmínek: kolona Diacel Chiralpak AS^K (21,2 x 250 mm), pohyblivá fáze ethanol, rychlost průtoku 7 ml/min, UV detekce při 254 nm, injekce 70 mg; t_R pro methylester kyseliny (R)-(+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové = 21,5 min; t_R promethylster kyseliny (S)-(+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové = 39,1 min.

Příprava 3

HPLC oddělení enantiomerů methylesteru kyseliny (+)-8methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

a) Methylester kyseliny (R)-( + )-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové a methylester kyseliny (S)-(+)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

Methylester kyseliny ( + )-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,54 · · 4 · 4

99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 4 · 4 4 44 4*4« • · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 « · 4 · 4 4 · «4

-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové se rozštěpí pomocí chirální HPLC na své enantiomery, a to za následujících podmínek: kolona Diacel Chiralpak AS^R (21,2 x 250 mm), pohyblivá fáze CH₃CN, rychlost průtoku 15 ml/min, UV detekce při 254 nm, injekce 500 mg; t pro methylester kyseliny (R) -(±)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-acetát = 10,2 min; t_R pro methylester kyseliny (S)-( + )-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové =

19,0 min.

Příprava 4

Demethylace methylesteru kyseliny (S)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

a) Methylester kyseliny (S)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

Roztok 15,0 g (0,057 mmol) methylesteru kyseliny (S) -8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4octové ve 160 ml trichlormethanu se v průběhu 30 minut přidá pod argonem po kapkách k 20,53 ml (0,217 mmol) roztoku bromidu boritého ve 160 ml trichlormethanu o teplotě

-8 °C, za stálého udržování teploty mezi -5 °C a 0 °C. Reakční směs se míchá 30 min při teplotě asi -8 °C a poté se přidá, zpočátku po kapkách, 200 ml methanolu, za stálého udržování teploty asi na 0 ^OC. Reakční směs se odpaří, čímž se získá viskózní olej ovitá látka, která se znovu odpaří ze 100 ml methanolu. Olejovitá látka se rozpustí ve směsi methanolu a vody a malé množství pevné příměsi tmavé barvy se odstraní filtrací. Filtrát se zneutralizuje (na pH = 7) 50% roztokem hydroxidu sodného, čímž vznikne bílá pevná látka. pH suspenze se upraví přidáním malého množství

ΦΦ 11 11 ΦΦ

ΦΦ φ φφφφ ΦΦΦΦ φφ 1 ι 9 11 9 11» φ ΦΦ 9 1 11 9 11 ΦΦ Φ

ΦΦΦ φφφφ ΦΦΦΦ φφ Φ φφ 11 11 11 kyseliny octové na hodnotu 4,5 a pevná látka se oddělí a suší ve vakuu, čímž se získá 9,7 g (68 %) sloučeniny uvedé v nadpise. Pomocí HPLC se u produktu stanoví chirální čistota: kolona Chiralpak AS^R (4,6 x 50 mm), pohyblivá fáze 100% methanol, rychlost průtoku 0,5 ml/min, UV detekce při 215 nm; t =7,5 min pro (S) enantiomer (99 %) ; t

4,4 min pro (R) enantiomer (1 %) .

Příprava 5

Příprava methylesteru kyseliny (S)-8-hydroxy-3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)-benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové alkylací methylesteru kyseliny (S) -8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

a) Methylester kyseliny (S)-3-oxo-8-[4-(trifluoromethyl)benzyloxy] -2- [4- (trifluoromethyl)benzyl] -2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové

K roztoku 0,31 g (1,24 mmol) methylesteru kyseliny (S) -8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové a 0,89 g (3,72 mmol) 4-(trifluoromethy)benzylbromidu v 10 ml DMF se přidá 0,11 g (2,75 mmol, 60% suspenze v oleji) NaH. Vše se 4 hodiny míchá za teploty místnosti a poté se DMF odpaří ve vakuu. Odparek se rozdělí mezi nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného a EtOAc. Vodná fáze se extrahuje EtOAc a spojené organické extrakty se promyjí nasyceným roztokem chloridu sodného, suší síranem sodným a odpaří, čímž se získá 0,90 g čiré olejovité látky. Radiální chromatografií (5% aceton v dichlormethanu, silikagel, 6 m deska) se získá 0,53 g sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bílé pěny.

« · ·

4 4 9 9

4 4 4

4 4 9 4 4 4 4 4 4 4 4 4

9 4 4 4 4 9 9 9 4 9

4 « 49 4 4 44 4 4

MS .(ES) m/e 566,1 (Μ + H) *.

b) Methylester kyseliny (S)-8-hydroxy-3-oxo-2-[4-(trifluormethyl) benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové

Parrova hydrogenační baňka se naplní 0,78 g (1,38 mmol) methyleteru kyseliny (S)-3-oxo-8-[4-(trifluoromethyl)benzyloxy]-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové a 20 mg Perlmanova katalyzátoru ve 20 ml methanolu. Po hydrogenací, která probíhá za tlaku 351,5 kPa po dobu 24 hodin, se reakční nádoba odvětrá a katalyzátor se odstraní filtrací. Odstraněním rozpouštědla se získá 0,60 g bílé pěny. Radiální chromatografií (5% aceton v dichlormethanu, silikagel, 6 m deska) se získá 0,42 g sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bílé pěny.

^XH NMR (250 MHz, CDC1J δ 7,50 (d, J = 8,5 Hz, 2H) , 7,23 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,90 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 6,67 (dd, J = 7,5, 3,4 Hz, 1H) , 6,39 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 5,05 (m,

Η), 4,35 (d, J = 15,4 Hz, 1 Η), 3,85 (m, 1H), 3,70 (s,

Η), 3,60 (m, 1H), 2,95 (m, 4 Η), 2,45 (dd, J = 17,1,

5,1 Hz, 1 H).

Příprava 6

Příprava methylesteru kyseliny (S)-8-hydroxy-3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu enantioselektivní syntézou

a) 4-Brom-3-brommethylanisol

K roztoku 100 g (497 mmol) 4-brom-3-methylanisolu v ·· 00

0 0 0

0 0 ·

500 ml suchého dichlormethanu se za stálého mícháni přidá 97 g (545 mmol) N-bromsukcinimidu a poté 6 g (25 mmol) benzoylperoxidu. Reakční směs se lehce zahřívá pod zpětným chladičem 150 wattovou lampou s reflektorem umístěným přibližně 30 cm od reakční baňky. Po 24 hodinách se reakční směs odpaří rotačním odpařováním na polovinu svého objemu a nechá se 4 hodiny stát. Vytvoří se bílá sraženina, která se odfiltruje a propláchne malým objemem dichlormethanu. Filtrát se odpaří dosucha a odparek se trituruje s hexany a filtruje. Sušením ve vakuu se získá 100,25 g (72 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bílých jehliček: GCt_R = 6,56 min (methylisilikonová kolona HP 530 μτη x 20 m, průtok helia jako nosiče 20 ml/min, počáteční teplota 100 °C, počáteční čas 1 min, změna 10 °C/min, konečná teplota 200 °C, konečný čas 1 min).

^XH NMR (400 MHz, CDC1J 5 7,44 (d, J = 10 Hz, 1H) , 6,99 (d, J = 3 Hz, 1H), 6,73 (dd, 1H), 4,55 (s, 2H), 3,80 (S,

H) .

b) 3- [N- (4-Trifluormethylbenzyl) aminomethyl] -4-bromanisol

K roztoku 35 g (125 mmol) 4-brom-3-brommethylanisolu v 50 ml bezvodého DMSO a 50 ml suchého THF se za stálého míchání přidá 30 g (171 mmol) 4-trifluormethylbenzylaminu a pak 18 ml (129 mol) triethylaminu. Reakční směs se 18 hodin míchá za teploty místnosti, poté se odpaří, naředí 250 ml IN vodného roztoku hydroxidu sodného a extrahuje dvakrát 250 ml diethyletheru. Spojené organické extrakty se promyjí roztokem chloridu sodného, suší síranem sodným a odpaří se dosucha. Zbylý odparek se čistí velmi rychlou chromatografii na silikagelu (10% až 20% EtOAc v trichlormethanu), čímž se získá 34,17 g (73 %) sloučeniny uvedé »t fefefefe • fe • fe fefe fefe • fe · fefefefe fefefefe • fe · fefe fefe fefefefe fe fefe fefe fefe fefefe fefe · • fefe fefefefe fefefefe fefe · fefe fefe fefe fefe v nadpise: TLC (20% EtOAc v trichlormethanu) R_ř 0,63;

¹H NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,59 (d, J = 8,2 Hz, 2H) , 7,49 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,43 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,96 (d,

J = 3,1 HZ, 1H), 6,70 (dd, 1H) , 3,86 (s, 2H), 3,84 (s,

Η) , 3,79 (s, 3H) , 1,75 (široký s, 1H) .

c) 3- [N- (terč. -Butoxykarbonyl) -N- (4-trifluormethylbenzyl) aminomethyl]-4-bromanisol

K roztoku 34,17 g (91 mmol) 3-[N-(4-trifluormethylbenzyl) aminomethyl]-4-bromanisolu ve 100 ml suchého THF se za stálého míchání přidá 22 g (101 mmol) di-terc.-butyldikarbonátu. Reakční směs se 18 hodin míchá pod argonem (je pozorován mohutný vývoj plynu). Odpařením a chromatografií na silikagelu (5% až 10% EtOAc v hexanu) se získá 41,09 g (95 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě čiré olejovité látky: TLC (silikagel 20% EtOAc v hexanu) R_s 0,44;

¹H NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,57 (d, J = 8,3 Hz, 2H) , 7,40 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,39 - 7,33 (m, 2H) , 6,83 a 6,72 (2s,

1H), 6,71 (dd, 1H), 4,54 a 4,50 (2s, 2H) , 4,43 (s, 2H) , 3,75 (S, 3H), 1,47 (s, 9H).

d) Methylester kyseliny 2-[N-(terč.-butoxykarbonyl) -N- (4-trifluormethylbenzyl)aminomethyl]-4-methoxyskořicové

K roztoku 37,08 g (78 mmol) 3-[N-(terč.-butoxykarbonyl) -N- (4-trifluormethylbenzyl) aminomethyl] -4-bromanisolu, 35 ml (390 mmol) methylakrylátu, 0,88 g (3,9 mmol) octanu palladnatého, 2,38 g (7,8 mol) tri-o-tolyfosfinu a 31 ml (178 mmol) diisopropylethylaminu ve 200 ml acetnitrilu se deoxygenuje (3 evakuace/cykly propláchnutí argonem), • «I * · · · » · • · • · · · ♦ · · · • · · · · ·· · , _ ··« ·····

- 45 - .. · ·· ·· poté se v argonové atmosféře zahřívá pod zpětným chladičem (v olejové lázni nastavené na. 80 °C). Po 6 hodinách se přidá dodatečných 0,88 g (3,9 mmol) octanu palladnatého a 2,38 g (7,8 mmol) tri-o-tolylfosfinu a reakční směs se za míchání zahřívá pod zpětným chladičem dalších 18 hodin. Reakční směs se odpaří dosucha a odparek se vyjme do 300 ml směsi diethyletheru a petroletheru v poměru l : 1 a nechá 4 hodiny stát. Šedě zbarvená sraženina se odfiltruje a promyje malým objemem (100 ml) směsi diethyletheru a petroleumetheru v poměru 1:1. Červený filtrát s odstínem do pomerančové barvy se odpaří a čistí velmi rychlou chromatografií na silikagelu (15% ethylacetát v hexanech). Výsledný zbytek se vyjme hexanem a směs se nechá několik hodin stát, poté se filtruje, aby se odstranila žlutá sraženina. Zahuštěním filtrátu se získá 34,52 g (92 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě sytě žluté olejovité látky: TLC (silikagel 20% EtOAc v hexanech) R_£ 0,45;

^XH NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,80 (široký s, IH) , 7,57 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,53 (d, J = 8,6 Hz, IH), 7,29 (široký s, 2 Η), 6,83 (dd, IH), 6,72 (široký s, IH), 6,23 (d, J = 15,7 Hz, IH), 4,58 a 4,53 (2 široké S, 2H), 4,46 a 4,37 (2 Široké S, 2Hj, 3,80 (s, 3H), 3,77 (s, 3H), 1,49 (s, 9H) .

e) Methylester kyseliny 2-[N-(terc.-butoxykarbonyl)-N-(4-trifluormethylbenzyl)aminomethyl]-4-methoxydihydroskořicové

K 5 g 10% Pd/C předmáčeného v DMF se přidá roztok 34,52 g (72 mmol) methylesteru kyseliny 2-[N-(terč.-butoxykarbonyl) -N- (4-trifluormethylbenzyl) aminomethyl] -4-methoxyskořicové ve 100 ml methanolu. Směs se 7 hodin protřepává ve vodíkové atmosféře o tlaku 351,5 kPa v Parrově aparátu, poté se filtruje přes destičku Celíte^<R> za účelem odstranění

IV 00»· • · • 0 00 • 0 0 0 ·0 0 0 0 0 · ·« • 0 0 0 0 0 00 0 *· 00 katalyzátoru. Filtrát se odpaří, čímž se získá 34,15 g (98 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bezbarvé olej ovité látky.

^XH NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,58 (d, J = 8,1 Hz, 2H) , 7,31 (široký s, 2H), 7,09 (d, J = 8,4 Hz, 1H) 6,76 (dd, 1H),

6,66 (S, 1H), 4,47 (široké S, 2H), 4,40 (široké S, 2H),

3,76 (S, 3H), 3,63 (s, 3H), 2,79 (široké s, 2H), 2,47 (t,

2H), 1,48 (s, 9H).

f) Kyselina 2-[N-(terč.-butoxykarbonyl)-N-(4-trifluormethylbenzyl)aminomethyl]-4-methoxydihydroskořicová

K roztoku 34,15 g (71 mmol) kyseliny 2-[N-(terč.-butoxykarbonyl)-N-(4-trifluorbenzyl)aminomethyl]-4-methoxydihydroskořicové ve 150 ml dioxanu se za stálého míchání přidá 85 ml (85 mmol) IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Zakalená reakce se 4 hodiny míchá za teploty místnosti. Výsledný homogenní roztok se neutralizuje 85 ml (85 mmol) vodného IN roztoku kyseliny chlorovodíkové a extrahuje se dvakrát 250 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se promyjí 250 ml roztoku chloridu sodného, suší síranem hořečnatým a odpaří, čímž se získá 34,60 g (100 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě husté čiré olej ovité látky.

TLC (směs trichlormethanu, methylalkoholu a HOAc v poměru 95 : 4 : 1) R_£ 0,49;

^XH NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,58 (d, J = 8,1 Hz, 2H) , 7,30 (široký s, 2H), 7,09 (d, J = 8,4 Hz, 1H) 6,78 (dd, 1H),

6, 65 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 4,47 (široké S, 2H) , 4,42 (široké S, 2H), 3,76 (s, 3H), 2,81 (Široké s, 2H), 2,53 (t, 2H), toto toto»· • * • · to • to · • · · • t · •e et • · » to to ·· to <to · toto *· tor ·» « to· · • to· 3 • to* to ·· · ·· ··

1,47 (S, 9H).

g) (R)-4-Benzyl-2-oxazolidinonyl-2-[N-(terč.-butoxykarbonyl) -N-(4-trifluormethylbenzyl)aminomethyl]-4-methoxydihydrocinnamid

K míchanému roztoku 34,60 g (71 mmol) kyseliny 2-[N-(terč.-butoxykarbonyl)-N-(4-trifluormethylbenzyl)aminomethyl]-4-methoxydihydroskořicové a 6,9 ml (85 mmol) pyridinu ve 200 ml suchého dichlormethanu se přidá stříkačkou pod argonem 4,4 ml (48 mmol) kyanfluoridu.

Reakční směs se 4 hodiny míchá za teploty místnosti.

Výsledná hustá suspenze se filtruje přes destičku Celíte^<R·⁵ a propláchne malým objemem (50 ml) suchého dichlormethanu. Čirý filtrát se nalije do dělící nálevky a promyje 500 ml ledově chladné vody. Sušení síranem hořečnatým a odpaření skýtáá 34,70 g (100 %) surového fluoridu kyseliny, který se použije bez dalšího čištění.

K míchanému roztoku 13,8 g (78 mmol) (R)-4-benzyl-2-oxazolidinonu ve 300 ml suchého THF se přidá při teplotě -78 °C pod argonem stříkačkou 25 ml 2,5M roztoku 75 mmol) n-BuLi v hexanech. Reakční směs se při teplotě -78 °C míchá po dobu 15 min, poté se stříkačkou přidá roztok výše uvedených 34,70 g (71 mmol) fluoridu kyseliny ve 100 ml suchého THF. Reakční směs se míchá 1 hodinu při teplotě -78 °C pak se reakce zastaví nasyceným roztokem chloridu amonného a dvakrát extrahuje 200 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se promyjí 400 ml roztoku chloridů sodného, suší síranem hořečnatým a odpaří dosucha. Čištěním pomocí velmi rychlé chromatografie na silikagelu (20% ethylacetát v hexanu) se získá 40,34 g (90 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě husté čiré olejovité látky.

tt ·

TLC {20% ethylacetát v hexanu) R_fi 0,21;

^XH NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,58 (d, J = 8,1 Hz, 2H) ,

7,33 - 7,26 (m, 5H), 7,16 (m, 3H), 6,77 (dd, 1H), 6,67 (d, J = 2,5 Hz, 1H) , 4,62 (m, 1H), 4,60 - 4,40 (m, 4H) ,

4,16 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,27 (dd, 1H), 3,21 - 3,10 (m, 2H), 2,88 (Široké s, 2H) , 2,72 (dd, 1H), 1,48 (s, 9H) .

h) (R)-4-Benzyl-2-oxazolidinonyl-3-[2-/N-(terč.-butoxykarbonyl) -N- (4-trifluormethylbenzyl)aminomethyl/-4-methoxyfenyl] -2- (S) -methoxykarbonylmethylpropionamid

K míchanému roztoku 40,30 g (64 mmol) (R)-4-benzyl-2oxazolidinonyl-2-[N-(terč.-butoxykarbonyl)-N-(4-trifluormethylbenzyl) aminomethyl] -4-methoxydihydrocinnamidu ve 300 ml suchého THF o teplotě -78 °C se přidá stříkačkou 70 ml 1M roztoku (70 mmol) bis(trimethylsilyl)amidu lithia. Po 30 min se se stříkačkou přidá 30 ml roztoku (317 mmol) methylbromacetátu. Po dalších 30 min při teplotě -78 °C se reakční směs nechá ohřát na -20 °C a míchá se dalších 6 h. Reakce se zastaví 400 ml nasyceného roztoku chloridu amonného a dvakrát extrahuje 200 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se promyjí 300 ml roztoku chloridu sodného, suší síranem hořečnatým a odpaří do sucha. Čištěním pomocí velmi rychlé chromatografie na silikagelu (20% ethylacetát v hexanech) se získá 38,62 g (86 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bílé pevné látky: HPLC (Altex Ulrasphere™-Si 5u, 20% ethylacetát v hexanech) ukazuje stálou přítomnost přibližně 20 % nealkylováného výchozího materiálu. HPLC surové reakční směsi vykazuje u reakce de z 90%;

fl · • · • fc · · fcfc • · · · fc ·· · fcfc fcfc·

¹H NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,57 (d, J = 8,1 Hz, 2H) ,

7,40 - 7,11 (m, 8H), 6,71 (dd, 1H), 6,63 (d, J = 2,7 Hz,

1H), 4,57 - 4,34 (m, 6H), 4,03 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,85 (t, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,61 (s, 3H) , 3,28 (dd, 1H), 2,90 (dd,

1H), 2,86 - 2,71 (m, 2H), 2,70 (dd, 1H), 2,44 (m, 1H),

1,48 a 1,46 (2s, 9H).

i) Methylester kyseliny (S)-8-methoxy-3-oxo-2-(4-trifluormethylbenzyl)-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

K míchanému roztoku 38,0 g (54 mmol) (R)-4-benzyl-2-oxazolidinonyl-3- [2-/N- (terč.-butoxykarbonyl) -N- (4-trifluormethylbenzyl) aminomethyl/-4-methoxyfenyl] -2- (S) -methoxykarbonylmethyl-propionamidu ve 300 ml THF a 100 ml vody se přidá po kapkách v průběhu 30 min za teploty 0 °C 18,9 ml 30% peroxidu vodíku a roztok 2,3 g (55 mmol) monohydrátu hydroxidu lithného v 62 ml vody. Zakalený roztok se míchá další 1 h za teploty 0 °C. Do výsledného homogenního roztoku se za teploty 0 °C pomalu přidá roztok 34,3 g (272 mmol) siřičitanu sodného ve 175 ml vody, poté se okyselí ledově chladným roztokem 35 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové ve 150 ml vody. Reakční směs se dvakrát extrahuje 200 ml ethylacetátu, spojené organické vrstvy se promyjí 400 ml roztoku chloridu sodného, suší síranem hořečnatým a odpaří dosucha. K výslednému odparku se přidá 4,0M kyselina chlorovodíková ve 400 ml dioxanu a míchá se za teploty místnosti (je pozorován pomalý vývoj plynu). Po 1 h se reakční směs odpaří a dvakrát opětovně odpaří za stálého míchání se směsí trichlořmethanu a toluenu v poměru 1:1, poté se 37,65 g odparku vyjme do 400 ml suchého DMF.

K roztoku se pod argonem v Dewarově baňce při teplotě 0 °C přidá 15,3 ml (109 mmol) triethylaminu a 22,9 g (273 mmol) hydrogenuhličitanu sodného a následně 13 ml (60 mmol)

00 * 0 0

0 0 0 • 0 • 0 0 · ·

0« difenylfosforylazidu. Poté co se reakční směs míchá 24 h za teploty 0 °C, odpaří se do sucha. Odparek se vyjme do 400 ml ethylacetátu, následně propláchne 300 ml vody a 300 ml roztoku chloridu sodného. Sušením síranem hořečnatým, odpařením a velmi rychlou chromatografii na silikagelu (35% ethylacetát v hexanu) se získá 16,87 g (74 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě husté čiré olejovité látky.

TLC (40% ethylacetát v hexanu) R_£ 0,50;

MS (ES) m/e 422,3 (Μ + H)*.

^ΧΗ NMR (400 MHz, CDC1J δ 7,52 (d, J = 8,1 Hz, 2H) , 7,29 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,02 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,75 (dd, 1H),

6,36 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 16,5 Hz, 1H), 4,96 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 3,87 (m, 1H) , 3,74 (d, J = 16,5 Hz, 1H) , 3,73 (s, 3H) , 3,71 (s,

3H), 3,08 (dd, 1H), 3,02 (dd, 1H), 2,95 (dd, 1H), 2,48 (dd, 1H) .

j) Methylester kyseliny (S)-8-hydroxy-3-oxo-2-(4-trifluormethylbenzyl)-2,3,4,5-tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové

160 ml 1M roztoku (160 mmol) boridu bromitého v dichlormethanu se po kapkách přidá pod argonem v průběhu 30 min k roztoku 16,67 g (39,6 mmol) methylesteru kyseliny (S)-8-methoxy-3-oxo-2-(4-trifluormethylbenzyl)-2,3,4,5tetrahydro-lH-benzazepin-4-octové ve 150 ml bezvodého dichlormethanu o teplotě -20 °C. Po dalších 1,5 h na teplotě -15 až -20 °C se reakční směs znovu ochladí na -20 °C a reakce se zastaví pečlivým přidáním 160 ml methanolu po kapkách. Reakční směs se 1 h míchá při teplotě -10 °C až • · · · • · • · * ♦ · · · · · · · • · fe fefefefe fefefe fe • fefe ·· fefe fefefe fefe · • · · fefefefe fefefefe •fe · ·· fefe fefe fefe

O °C, pak se odpaří na rotační odparce. Odparek se dvakrát opětovně odpaří z methanolu. Čištěním pomocí velmi rychlé chromatografie na silikagelu (50% až 100% ethylacetát v hexanech) se získá 14,87 g (92 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bílé pevné látky.

[a]- 81,8° (c, 1,0, methanol);

TLC (silikagel, 50% ethylacetát v hexanu) R_£ 0,50;

MS (ES) m/e 408,2 (Μ + H)*;

^XH NMR (400 MHz, CDC1₃ + 2% DMSO-dJ δ 7,53 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 8,4 Hz, 1H),

6,70 (dd, 1H), 6,41 (d, J = 2,3 Hz, 1H) , 5,16 (d, J =

16,4 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 15,6 Hz, 1H) , 4,39 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 3,84 (m, 1H), 3,73 (d, J = 16,4 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H) , 3,01 (dd, 1H), 2,98 (m, 1H), 2,90 (dd, 1H) , 2,47 (dd, 1H) .

Příprava 7

Příprava 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxidu

a) 2-[(3-Hydroxy-1-propyl)amino]-4-methylpyridin-N-oxid

Směs 12,1 g (0,068 mol) 2-chlor-4-methylpyridin-N-oxidu (E.V. Brown, J. Amer. Chem. Soc, Tjg., 3565 (1957)), 10,33 ml (0,14 mol) 3-amino-l-propanolu, 28 g (0,34 mol) hydrogenuhličitanu sodného a 70 ml terč.-amylalkoholu se zahřívá pod zpětným chladičem. Po 16 h se reakční směs zchladí, zředí 300 ml dichlormethanu a za podtlaku se filtruje za účelem • · · · • · · · • · · · odstranění nerozpustných materiálů. Filtrát se odpaří a opětovně odpaří z toluenu, čímž se získá žlutá olej ovitá látka. Rekrystalizací ze směsi dichlormethanu a diethyletheru se získá 10,87 g (88 %) sloučeniny uvedené v nadpise v podobě žluté pevné látky.

TLC (15% methanol v dichlormethanu) R_£ 0,44;

MS (ES) m/e 183 (Μ + Η)¹.

’-Η NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 7,92 (d, J = 6,7 Hz, 1H) , 7,28 (široký t, 1H), 6,43 (s, 1H), 6,33 (dd, J = 6,6, 2,1 Hz,

1H) , 3,73 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,47 (q, H = 6,3 Hz, 2H),

2,29 (S, 3H), 1,82 - 1,88 (m, 2H).

Příprava 8

Příprava kyseliny (S)-8-[3-(4-methylpyridin-2-ylamino)-1-propoxy]-3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl] -2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové

a) Methylester kyseliny (S)-8-[3-(4-methyl-l-oxopyridin-2-ylamino) -1-propoxy] -3-oxo-2- [4- (trifluoromethyl)benzyl] -2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové

K roztoku 0,42 g (1,03 mmol) methylesteru kyseliny (S) -8-hydroxy-3-oxo-2- [4- (trifluoromethyl)benzyl] -2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové a 0,41 g (1,56 mmol) Ph₃P v 6 ml dichlormethanu o teplotě 0 °C se po kapkách přidá roztok 0,28 g 2-[ (3-hydroxy-l-propyl)amino] -4-methylpyridin-N-oxidu a 0,24 ml (1,52 ml) diethylesteru kyseliny azodikarboxylové. Po ukončení přidávání se odstraní ledová lázeň, a reakční směs se míchá za teploty místnosti. Po 20 h • ·· se rozpouštědlo odpaří a produkt se izoluje pomocí velmi rychlé chromatografie (10.0% trichlormethan až 10% methanol v trichlormethanu, silikagel), čímž se získá 0,57 g sloučeniny uvedené v nadpise v podobě čiré olejovité látky.

MS (ES) m/e 572,2 (Μ + H) *.

b) Methylester kyseliny (S)-8-[3-(4-methylpyridin-2-ylamino)-1-propoxy]-3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové.

K roztoku 0,57 g (1,00 mmol) methylesteru kyseliny (S)-8- [3-(4-methyl-l-oxopyridin-2-ylamino)-1-propoxy] -3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-2,3,4,5 -tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové a 1,00 ml (9,87 mmol) cyklohexenu v 10 ml methanolu se přidá 0,11 g 10% Pd/C. Reakční směs se 20 h zahřívá pod zpětným chladičem. Po ochlazení reakční směsi na teplotu místnosti se katalyzátor odstraní filtrací a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, čímž se získá 0,49 g bílé pěny. Pomocí radiální chromatografie (5% methanol v trichlormethanu, silikagel, 6mm plotna) se získá 0,42 g sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bílé pevně látky.

MS (ES) m/e 556,1 (M+H)*.

c) Kyselina (S)-8-[3-(4-methylpyridin-2-ylamino)-1-propoxy]-3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2-benzazepin-4-octová

K 0,42 g (0,75 mmol) methylesteru kyseliny (S)-8-[3-(4-methylpyridin-2-ylamino)-1-propoxy]-3-oxo-2-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2benzazepin-4-octové ve 2 ml ethanolu se přidá 1,50 ml • ··

IN roztoku (1,50 mmol) hydroxidu sodného. Míchá se 3 h za teploty místnosti a poté se objem.rozpouštědla odstraní ve vakuu. Odparek se okyselí na pH = 3 IN kyselinou chlorovodíkovou, zmrazí se a lyofilizuje dosucha. K odparku se přidá voda a nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného se zneutralizuje na pH = 7. Vodná vrstva se extrahuje trichlormethanem, spojené organické extrakty se suší síranem sodným a odpaří se, čímž se získá 0,47 g bílé pěny. Pomocí radiální chromatografie (10% methanol v trichlormethanu, silikagel, 6mm plotna) se získá 0,30 g sloučeniny uvedené v nadpise v podobě bílé pevné látky.

MS (ES) m/e 542,2 (Μ + H)*.

Analýza vypočteno pro ^C29^H3O^F3^N3°4 · C 57,61; ,

H 6,17; N 6,95. Nalezeno: C 57,6; H 5,30; N 6,38.

Příklad 2

Dávková jednotka parenterálního prostředku

Přípravek obsahující 20 mg sloučeniny podle příkladu 1 ve formě sterilního suchého prášku se připraví takto: 20 mg sloučeniny se rozpustí v 15 ml destilované vody. Roztok se za sterilních podmínek filtruje do 25ml ampule obsahující více dávek a nechá se lyofilizovat. Prášek se rekonstituuje přidáním 20 ml 5% roztoku glukózy ve vodě (D5W) pro intravenózní nebo intramuskulární injekci. Dávkování je takto určeno objemem injekce. Následné ředění může být provedeno přidáním odměřeného objemu této dávkové jednotky do jiného objemu D5W pro injekci, nebo může být odměřená dávka přidána do jiného mechanismu uvolňujícího lék, jako je láhev nebo vak pro intravenózní kapací infuzi nebo jiný ·· ·· • · · · • · · · • 9 9 9 • ·· injekčně infúzní systém.

Příklad 3

Dávková jednotka orálního prostředku

Kapsle k orálnímu podání se připraví míšením a mletím 50 mg sloučeniny z příkladu 1 se 75 mg laktózy a s 5 mg stearatu hořečnatého. Výsledný prášek se proseje a plní do tvrdé želatinové kapsle.

Příklad 4

Dávková jednotka orálního prostředku

Tableta pro orální podání se připraví míšením a granulací 20 mg sacharózy, 150 mg dihydrátu síranu vápenatého a 50 mg sloučeniny z příkladu 1 s 10% roztokem želatiny. Vlhké granule se prosejí, usuší, smíchají s 10 mg škrobu, 5 mg mastku a 3 mg kyseliny stearové; a slisují se do tablety.

Výše uvedený popis plně uvádí jak provést a použít tohoto vynálezu. Tento vynález však není omezen výše popsanými určitými provedeními, nýbrž zahrnuje všechny jeho modifikace v rozsahu následujících patentových nároků. Různé odkazy na časopisy, patenty a jiné publikace, které jsou zde citovány, obsahují stav oboru a jsou zde zařazeny jako celek formou odkazů.

Claims (26)

1. Sloučenina vzorce (I) ;n nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

2. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

3. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1, protinádorově působící látku a farmaceuticky přijatelný nosič.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že protinádorově působící látkou je topotekan.

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že protinádorově působící látkou je cisplatina.

6. Způsob léčby chorobného stavu, ve kterém je indikován antagonismus vůči receptorů vyznačující se t i m, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.

to · ·· · ·

7. Způsob léčby chorobného stavu, ve kterém je indikován antagonismus vůči receptoru ce_vS₅ vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.

8. Způsob léčby osteoporózy vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.

9. Způsob inhibice angiogeneze vyznačující se t i m, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.

10. Způsob inhibice nádorového růstu nebo nádorových metastáz vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuj e.

11. Způsob léčby aterosklerózy nebo restenózy vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.

12. Způsob léčby zánětu vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 subjektu, který to potřebuje.

13. Způsob inhibice nádorového růstu vyznačuj ίο i se t i m, že zahrnuje podávání sloučeniny podle nároku 1 a protinádorové působící látky, postupně nebo ve fyzické kombinaci.

14. Způsob podle nároku 13 vyznačuj ící se ·· ··· · ·· ·· ·· ·· • · · · to to to · to · to • · · ···· · · « · to ·· · · · · ··· ·· to ··· ···· *··· ·· to to· ·· ·· ·· tím, že protinádorově působící látkou je topotekan.

15. Způsob podle nároku 13 vyznačuj ící se tím, že protinádorově působící látkou je cisplatina.

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

(III) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

18. Sloučenina vzorce (I) k použití jako lék.

19. Použití sloučeniny podle nároku 1 při výrobě léku k léčbě onemocnění, u kterých je indikován antagonismus vůči receptoru qHŠ₃·

20. Použití sloučeniny podle nároku 1 při výrobě léku k léčbě onemocnění, u kterých je indikován antagonismus vůči

- 59 00 ···· • 0 00 00 00 0 0000 0000 00 0 00 00 0000 0 00 00 00 000 00 0 • 00 ···· 0000 00 0 00 00 ·· 00 při výrobě léku k při výrobě léku k při výrobě léku k receptoru cM3_s21. Použití sloučeniny podle nároku 1 léčbě osteoporózy.

22. Použití sloučeniny podle nároku 1 inhibici angiogeneze.

23. Použití sloučeniny podle nároku 1 inhibici nádorového růstu nebo nádorových metastáz.

24. Použití sloučeniny podle nároku 1 při výrobě léku k léčbě aterosklerózy nebo restenózy.

25. Použití sloučeniny podle nároku 1 při výrobě léku k léčbě zánětu.

26. Použití sloučeniny podle nároku 1 a protinádorové působící látky pří výrobě léku k inhibici nádorového růstu, ve fyzické kombinaci nebo při postupném podávání.

27. Použití podle nároku 26, kde protinádorové působící látkou je topotekan.

28. Použití podle nároku 26, kde protinádorové působící látkou je cisplatina.

29. Použití sloučeniny podle nároku 1 a inhibitoru resorbce kosti při výrobě léku k léčbě osteoporózy, ve fyzické kombinaci nebo při postupném podávání.