CZ20001061A3 - Antagonista receptoru pro vitronektin - Google Patents

Abstract

Sloučenina obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, kteráje antagonistou receptoru pro vitronektin a je užitečná při léčbě osteoporózy.

Description

ANTAGONISTA RECEPTORU PRO VITRONEKTIN

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceuticky účinné sloučeniny, která inhibuje receptor pro vitronektin a je užitečná při léčbě zánětu, rakoviny a kardiovaskulárních onemocnění, jako například aterosklerózy a restenozy, a onemocnění, kde je faktorem resorpce kosti, jako například osteoporózy.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou skupinou adhezních receptorů buněk, které jsou transmembránovými glykoproteiny exprimované na různými typech buněk. Tyto adhezní receptory povrchu buněk zahrnují glykoprotein Ilb/IIIa (receptor pro fibrinogen) a α_νβ₃ (receptor pro vitronektin). Receptor pro fibrinogen glykoprotein Ilb/IIIa se exprimuje na povrchu . krevních destiček a ovládá agregaci destiček a tvorbu hemostatické sraženiny v místě krvácejícího poranění /Philips a kol., Blood. 71, 831 (1988)/. Receptor pro vitronektin α_νβ₃ se exprimuje na velkém počtu buněk, které zahrnují endoteliální buňky, buňky hladkého svalstva, osteoklasty a nádorové buňky, a má tudíž mnoho funkcí. Receptor α_νβ₃ exprimovaný na membráně osteoklastů ovládá adhezi osteoklastů ke kostní matrix, klíčový krok procesu resorpce kosti /Ross a kol., J. Biol. Chem. 262, 7703 (1987)/. Osteoporóza je onemocnění vyznačující se nadměrnou kostní resorpci. Receptor α_νβ3 exprimovaný na lidských buňkách hladké svaloviny aorty ovlládá jejich migraci do neointimy, proces, který po • · • · · · · · • ···· · « · • ·· · · · · · • · · · · · · • · · · · · perkutánní koronární angioplastice vede k restenóze /Brown a kol., Cardiovascular Res. 18, 1815 (1994)/. Dodatečně Brooks a kol., Cell 7 9, 1157 (1994) ukázal, že antagonista α_νβ₃ je schopen podpořit regresi nádoru indukcí apoptózy angiogenních cév. Tudíž by léčiva, která blokují receptor pro vitronektin, byla užitečná při léčbě onemocnění, jako například osteoporozy, restenozy a rakoviny.

Nyní je známo, že receptor pro vitronektin α_νβ₃ má vztah ke třem odlišným intergrinům označovaným α_νβι, α_νβ3 a α_νβδ (Horton a kol., Int. J. Exp. Pathol. 71, 741 (1990)/. α_νβχ váže fibronektin a vitronektin, α_νβ₃ váže širokou škálu ligandů, které zahrnují fibrin, fibrinogen, laminin, trombospondin, vitronektin, von Willebrandův faktor, osteopontin a kostní sialoprotein I, α_νβ5 váže vitronektin. Ukázalo se, že receptor pro vitronektin α_νβ₅ je zapojený v buněčné adhezi mnoha typů buněk včetně mikrovaskulárních endoteliálních buněk /Davis a kol., J. Cell. Biol. 51, 206 (1993)/ a potvrdila se jeho úloha při angiogenezi /Brooks a kol., Science 264, 569 (1994)/. Tento integrin se exprimuje na cévách poraněné granulační tkáně člověka, avšak ne na normální kůži.

Je známo, že receptor pro vitronektin je vázán k proteinům kostní matrix, které obsahují pohyblivý tripeptid Arg-Gly-Asp (nebo RGD) . Horton a kol., Exp. Cell. Res. 195, 368 (1991) tedy popisuje, že peptidy obsahující RGD a protilátka proti receptorů pro vitronektin (23C6) inhibují resorpci dentinu a rozvolnění buněk osteoklastů. Kromě toho Sáto a kol., J. Cell. Biol. 111, 1713 (1990) popisuje, že echistatin, peptid hadího jedu, který obsahuje sekvenci RGD, je potenciálním inhibitorem kostní resorpce ve tkáňové kultuře a inhibuje uchycení osteoklastů ke kosti.

Nyní bylo nalezeno, že účinným inhibitorem receptorů α_νβ₃ a α_νβ₅ je konkrétní sloučenina. Především bylo nalezeno,

4 4 4 • · • ·

4 4

že taková sloučenina je účinnějším inhibitorem receptoru pro vitronektin, než receptoru pro fibrinogen.

Souhrnný popis vynálezu

Tento vynález zahrnuje sloučeninu obecného vzorce I, jak se popisuje dále, která má farmakologicky účinek inhibice receptoru pro vitronektin a je užitečná při léčbě zánětu, rakoviny a kardiovaskulárních poruch, jako například aterosklerózy a restenózy, a onemocnění, kde je faktorem resorpce kosti, jako například osteoporózy.

Tento vynález je také farmaceutický prostředek zahrnující sloučeninu podle obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.

Tento vynález je také způsob léčby onemocnění, které jsou ovládány receptorem pro vitronektin. Ve zvláštním aspektu je sloučenina podle tohoto vynálezu užitečná k léčbě aterosklerózy, restenózy, zánětu, rakoviny a onemocnění, kde je faktorem resorpce kosti, jako například osteoporózy.

Detailní popis vynálezu

Tento vynález zahrnuje novou sloučeninu, která je účinnějším inhibitorem receptoru pro vitronektin než receptoru pro fibrinogen. Tato nová sloučenina obsahuje benzazepinové jádro, kde na aromatickém cyklickém kruhu se šesti atomy uhlíku bezazepinu je přítomný substituent obsahující dusík a na cyklickém kruhu se sedmi atomy uhlíku benzazepinu je přítomen alifatický substituent obsahující kyselou část. Míní se, že cyklický kruh benzazepinu příznivě interaguje s receptorem pro vitronektin orientuj e • ·

• · ··· · · ··· • · · · · · · · • · · · · · · ·· ··· ·· ·· postranní řetězce substituentů na cyklických kruzích se šesti a sedmi atomy uhlíku tak, že také mohou příznivě interagovat s receptorem. Upřednostňuje se, že mezi kyselou skupinou na alifatickém substituentu cyklického kruhu se sedmi atomy uhlíku benzazepinu a atomem dusíku subsituentu obsahujícího atom dusíku na aromatickém cyklickém kruhu se šesti atomy uhlíku benzazepinu bude nej kratším intramolekulárním spojením přítomno přibližně dvanáct až čtrnáct spojujících kovalentních vazeb.

Tento vynález zahrnuje sloučeninu obecného vzorce I

nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl. Touto sloučeninou je kyselina (S)-8-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-3-oxo-2(2,3,4-trifluorbenzyl)-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4octová.

Sloučenina obecného vzorce I inhibuje vazbu vitronektinu a jiných peptidů obsahujících RGD k receptorů pro vitronektin. Inhibice receptorů pro vitronektin na osteoklastech inhibuje osteoklastickou resorpci kosti a je užitečná při léčbě onemocnění, kde se s patologií spojuje resorpce kosti, jako například osteoporózy a osteoartritidy.

V dalším aspektu je tento vynález způsob stimulace tvorby kosti, který zahrnuje podání sloučeniny obecného vzorce I, která způsobí zvýšené uvolňování osteokalcinu. Zvýšená produkce kosti je jasným přínosem u chorobných stavů, kde je deficience mineralizované kostní hmoty nebo je žádoucí remodelace kosti, jako například hojení zlomenin a metastázou, deficiencí prevence zlomenin kostí. Z takové léčby by mohly mít prospěch také onemocnění a metabolické poruchy, které mají za následek ztrátu struktury kosti. Podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu by mohlo mít prospěch například při hyperparathyreoidismu, Pagetově chorobě, hyperkalcémii u malignity, osteolytických lézích vytvořených kostní úbytku kosti způsobeném imobilizací nebo pohlavních hormonů, Behcetově chorobě, osteomalácii, hyperostóze a osteopetróze.

Dodatečně, protože sloučenina podle tohoto vynálezu inhibuje receptory pro vitronektin na mnoha odlišných typech buněk, bude řečená sloučenina užitečná při léčbě zánětlivých onemocnění, jako například revmatoidní artritidy a psoriázy, a kardiovaskulárních onemocnění, jako například aterosklerózy a restenózy. Sloučenina obecného vzorce I podle tohoto vynálezu může být užitečná pro léčbu nebo prevenci jiných onemocnění, která zahrnují, ale neomezují se pouze na tromboembolická onemocnění, astma, alergie, syndrom respirační úzkosti dospělých, reakce štěpu proti hostiteli, odhojení orgánového transplantátu, septický šok, ekzém, kontaktní dermatitis, zánětlivé onemocnění střev a jiná autoimunitní onemocnění. Sloučenina podle tohoto vynálezu může být také užitečná při hojení ran.

Sloučenina podle tohoto vynálezu je také užitečná při léčbě angiogenních poruch, včetně prevence. Výraz angiogenní poruchy, jak se zde používá, zahrnuje stavy zahrnující abnormální neovaskularizaci. Inhibice angiogeneze bude snižovat škodlivý účinek onemocnění tam, kde je růst nových cév ' příčinou nebo přispívá k patologii spojené s onemocněním. Příkladem takového cílového onemocnění je diabetická retinopatie. Inhibice angiogeneze bude snižovat krevní zásobení do tkání, a tím přispívat k redukci tkáně založené na požadavcích krevního zásobení tam, kde je růst ·· ··· · • · · ·· · • · · · · nových cév potřebný k podpoře růstu zhoubné tkáně. Příklady zahrnují růst nádorů, kde je neovaskularizace trvalým požadavkem, aby nádor rostl a vytvořil pevné nádorové metastázy. Sloučenina podle tohoto vynálezu tedy inhibuje angiogenezi nádorové tkáně, čímž předchází nádorovým metastázám a nádorovému růstu.

Podle způsobů tohoto vynálezu tedy může inhibice angiogeneze použitím sloučeniny podle tohoto vynálezu zlepšit příznaky onemocnění, a v některých případech může vyléčit onemocnění.

Dalším terapeutickým cílem pro sloučeninu podle tohoto vynálezu jsou oční onemocnění vyznačující se oční onemocnění zahrnují rohovky, jako například herpetickou keratitidu, luetickou a neovaskulární pannus spojený neovaskularizací. Taková neovaskulární onemocnění transplantaci rohovky, keratitidu, pterygium používáním kontaktních čoček. Další onemocnění očí také zahrnují makulární degeneraci spojenou s věkem, předpokládanou okulární histoplasmózu, retinopatii při předčané zralosti a neovaskulární glaukom.

Tento vynález dále poskytuje způsob inhibice růstu nádoru, který zahrnuje podání, postupně nebo ve fyzické kombinaci, sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastika, jako například topotekanu a cisplatiny.

V tomto vynálezu jsou také zahrnuta proléčiva sloučenin podle vynálezu. Proléčiva se považují za kterékoliv kovalentně vázané nosné látky, které in vivo uvolňují původní léčivo obecného vzorce I. Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou tedy nová proléčiva obecného vzorce II, která jsou také meziprodukty při přípravě sloučeniny obecného vzorce I, ·· ···· • · • « ·· (II)

999

99

9 9 4 • 9 9 4 • 9 4 9

4 4 4

nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.

Ještě dalším aspektem podle tohoto vynálezu jsou nové meziprodukty obecného vzorce III

nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.

K popisu sloučenin podle tohoto vynálezu se zde používá zkratek a symbolů běžně používaných v oboru peptidu a chemie. Obvykle se zkratky aminokyselin řídí názvoslovím IUPAC-IUB společné komise pro biochemickou nomenklaturu, jak se popisuje v Eur. J. Biochem. 158, 9 (1984).

Alkylová skupina s jedním až šesti atomy uhlíku, jak se zde používá, znamená popřípadě substituovanou alkylovou skupinu s jedním až šesti atomy uhlíku, a zahrnuje methylovou skupinu, ethylovou skupinu, norm. propylovou skupinu, izopropylovou skupinu, norm. butylovou skupinu, izobutylovou skupinu, terč. butylovou skupinu, norm. pentylovou skupinu, izopentylovou skupinu, neopentylovou skupinu a hexylovou skupinu a jejich jednoduché alifatické izomery.

Používá se zde zkratek konkrétních reagenčních činidel. DCC se týká dicyklohexylkarbodimidu, DMAP se týká • · ··· · ·· ·4 » · · 4 • · 4 • · 4 • · · · · « β ·· ·· ·· <· dimethylaminopyridinu, DIEA se týká diizopropylethylaminu,

EDC se týká ethylkarbodimidhydrochloridu.

1-(3-dimethylaminopropyl)-3HOBt se týká 1hydroxybenzotriazolu, THF se týká tetrahydrofuranu, DIEA se týká diizopropylethylaminu,

DEAD se týká diethylazodikarboxylátu, PPh₃ se týká trifenylfosfinu, DIAD se týká diizopropylazodikarboxylátu, DME se týká dimethoxyethanu, DMF se týká dimethylformamidu, NBS se týká N-bromsukcinimidu, Pd/C se týká katalyzátoru paladia na aktivním uhlí, PPA se týká kyseliny polyfosforečné, DPPA se týká difenylfosforylazidu, BOP se týká 1-benzotriazolyltris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorofosfátu, HF se týká kyseliny fluorovodíkové, TEA se týká triethylaminu, TFA se

PCC se týká se obvykle připravují a kol., mezinárodní týká kyseliny trifluoroctové, pyridiniumchlorochromátu.

Sloučeniny obecného vzorce I způsoby, které popsal Bondinell patentová přihláška WO 93/00095 publikovaná 7.ledna 1993 a Bondinell a kol., mezinárodní patentová přihláška

WO 94/14776, jejichž úplná zveřejnění jsou zde zahrnuta odkazem.

Dodatečně se sloučenina obecného vzorce I připravuje způsoby podrobně posanými v dále uvedeném schématu.

• to ··· · • · • ···

Schéma 1 toto · ·· · toto ··· ·· ·· • ·· • ···· • ·· · · • · · · ·· ·· • to- ·· • ·· · • toto to

·.·· · • ·· · • · ··

I10

• · fe • · • · • ··· * fe • fefe • · •fe- fe· • · fe fefe » • · fe ♦ · ♦

a) 2-[N-(3-hydroxy-l-propyl)-N-(terč. butoxykarbonyl)amino]pyridin-N-oxid diethylazodikarboxylát trifenylfosfin, dimethylformamid

b) LiHMDS, 2,3,4-trifluorbenzylbromid, dimethylfomamid

c) kyselina chlorovodíková/dioxan

d) cyklohexen, 10% katalyzátor paladia na aktivním uhlí, methanol

e) l,0N roztok hydroxidu sodného, methanol

f) kyselina trifluoroctové

Sloučenina 1 ze schématu 1 připravená obecnými způsoby, které popsal Bondinell a kol., mezinárodní patentová přihláška WO 93/00095 publikovaná 7.ledna 1993 a Bondinell a kol·., mezinárodní patentová přihláška WO 94/14776 se podrobí reakci s 2-[N-)3-hydroxy-l-propyl)-N-(terč.butoxykarbonyl)amino]pyridin-N-oxidem ve slučovací reakci podle Mitsunobu /Organic Reactions 42, 335 - 656 (1992) ; Synthesis, 1 28 (1981)/, aby se obdržela sloučenina 2 ze schématu 1. Reakce je ovládána komplexem vytvořeným mezi diethylazodikarboxylátem a trifenylfosfinem a provádí se v aprotickém rozpouštědle, například tetrahydrofuranu, dichlormethanu nebo dimethylformamidu. Výsledný produkt, sloučenina 2 ze schématu 1, může být alkylován v poloze 2 (číslování benzazepinu) za standardních podmínek alkylace dobře známých odborníkovi v oboru. K provedení deprotonace amidu N-H se může sloučenina 2 ze schématu 1 například podrobit reakci s bází, jako například hydridem sodným, LDA nebo hexamethyldisilazidem lithným v příslušném rozpouštědle, obvykle tetrahydrofuranu, dimethylformamidu, dimethoxyethanu nebo jejich směsích. Zpracování výsledného aniontu s příslušným elektrofilním činidlem, například s 2,3,4-trifluorobenzylbromidem má za následek N-alkylaci, • · · · ·· »·· » · · < ·· ·· groups in Interscience) aby se obdržel produkt 3 ze schématu 1. Odstranění skupiny terč. butoxykarbamátu z produktu 3 ze schématu 1, aby se obdržel produkt 4 ze schématu 1, se může uskutečnit za standardních podmínek kyselého prostředí. Takové podmínky jsou odborníkovi v oboru dobře známy, a jsou popsány v příslušných svazcích, například v Greene, Protective organic synthesis (publikováno WileySkupina pyridin-N-oxidu produktu 4 ze schématu 1 se redukuje na odpovídající pyridin 5 ze schématu 1 za podmínek přenosné hydrogenace použitím katalyzátoru paladia, výhodně paladia na aktivním uhlí, v inertním rozpouštědle, například methanolu, ethanolu, nebo 2propanolu. V tomto typu reakce se běžně používají jako reakční činidla přenášející atom vodíku cyklohexen, 1,4cyklohexadien, kyselina mravenčí a soli kyseliny mravenčí, jako například formiát draselný nebo formiát amonný. Methylester produktu 5, schéma 1, se hydrolyzuje použitím vodného roztoku báze, jako například hydroxidu litného ve vodném roztoku tetrahydrofuranu nebo hydroxidu sodného ve vodném roztoku methanolu nebo ethanolu, a meziprodukt sůl karboxylátu se okyselí vhodnou kyselinou, například kyselinou trifluoroctovou nebo kyselinou chlorovodíkovou, aby se obdržela karboxylová kyselina 6, schéma 1. Alternativně se může meziprodukt sůl karboxylátu izolovat, je-li to žádoucí, nebo se může sůl karboxylátu volné karboxylové kyseliny připravit způsoby dobře známými odborníkovi v oboru.

Adiční soli sloučeniny s kyselinami se připravují standardním způsobem ve vhodném rozpouštědle z původní sloučeniny a nadbytku kyseliny, jako například kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, fluorovodíkové, sírové, fosforečné, octové, trifluoroctové, maleinové, jantarové nebo methansulfonové. Kationtové soli se připravují • · · · zpracováním původní sloučeniny s nadbytkem alkalického reagenčního činidla, jako například hydroxidu, uhličitanu nebo alkoxidu, obsahujícího příslušný kationt, nebo s příslušným organickým aminem. Konkrétními příklady kationtů přítomných ve farmaceuticky přijatelných solích jsou kationty, jako například Li⁺, Na⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ a NH₄ ⁺.

Tento vynález také poskytuje farmaceutický prostředek, který zahrnuje sloučeninu podle obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku. Podle toho se může sloučenina obecného vzorce I použít při výrobě léku. Farmaceutické prostředky obsahující sloučeninu obecného vzorce I připravené způsobem popsaným dále se mohou připravit jako roztoky nebo lyofilizované prášky k parenterálnímu podání. Prášky se mohou rekonstituovat před použitím přidáním vhodného ředidla nebo jiné farmaceuticky přijatelné nosné látky. Kapalný přípravek může být pufrovaný isotonický vodný roztok. Příklady vhodných ředidel jsou normální isotonický roztok chloridu sodného, standardní 5% roztok dextrózy ve vodě nebo pufrovaný roztok octanu sodného nebo octanu amonného. Takový přípravek je zvláště vhodný k parenterálnímu podání, ale může se také použít k perorálnímu podání nebo může být zahrnut v odměřené dávce inhaléru nebo nebulizéru k insuflaci. Může být žádoucí přidání excipientů, jako například polyvínílpyrrolidonu, želatiny, hydroxycelulózy, akácie, polyethylenglykolu, manitolu, chloridu sodného nebo citrátu sodného.

Alternativně se může sloučenina enkapsulovat, tabletovat nebo připravit jako emulze nebo sirup k perorálnímu podání. Ke zlepšení nebo stabilizaci prostředku nebo k usnadnění přípravy prostředku se mohou přidat farmaceuticky přijatelné pevné nebo kapalné nosné látky. Pevné nosné látky zahrnují škrob, laktózu, dihydrát síranu vápenatého, bílou hlinku, stearát hořečnatý nebo • · • · • · • ·

kyselinu stearovou, mastek, pektin, akácii, agar nebo želatinu. Kapalné nosné látky zahrnují sirup, podzemnicový olej, olivový olej, roztok chloridu sodného a vodu. Nosná látka může také zahrnovat látku s prodlouženým uvolňováním, jako například glycerylmonostearát a glyceryldistearát, samostatně nebo s voskem. Množství pevné nosné látky se liší, ale výhodně bude v rozmezí od přibližně 20 mg do přibližně 1 g v dávkové jednotce. Farmaceutické prostředky se vyrábí těmito způsoby obvyklými v oboru farmacie, které zahrnují pro formy tablet rozdrobňování, míšení, granulování a lisování, je-li to nutné, nebo pro formy želatinových tobolek rozdrobňování, míšení, a plnění. Použije-li se kapalná nosná látka, bude prostředek ve formě sirupu, elixíru, emulze nebo vodné či nevodné suspenze. Takový kapalný přípravek se může podat přímo perorálně, nebo naplnit do měkké želatinové tobolky.

K rektálnímu podání se může sloučenina podle tohoto vynálezu také kombinovat s excipienty, jako například kakaovým olejem, glycerinem, želatinou nebo polyethylenglykoly, a vytvarovat do podoby čípku.

Zde popsaná sloučenina je antagonistou receptoru pro vitronektin a je užitečná k léčbě onemocnění, kde je možné základní patologii přičítat ligandu nebo buňce, která interaguje s receptorem pro vitronektin. Například je tato sloučenina užitečná k léčbě onemocnění, kde patologii vytváří úbytek kostní matrix. Tudíž tato sloučenina je užitečná k léčbě osteoporózy, hyperparathyreoidismu, Pagetovy nemoci, hyperkalcémie u malignity, osteolytických lézí vytvořených kostní metastázou, úbytku kosti způsobeném imobilizací nebo deficiencí pohlavních hormonů. Míní se, že sloučenina podle tohoto vynálezu je také použitelná jako protinádorové léčivo, antiangiogenní léčivo, protizánětlivé léčivo a léčivo zabraňující tvorbě metastáz, a může být • · • · · · • · • * • · ·· 4 • · · ♦ · · » ♦ · · užitečné při léčbě aterosklerózy a restenozy.

Sloučenina se pacientovi podává buďto perorálně nebo parenterálně takovým způsobem, že koncetrace léčiva je dostačující k inhibici resorpce kosti nebo jiné takové indikaci. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu se podává v perorální dávce od přibližně 0,1 do přibližně 50 mg/kg způsobem, který je v souladu se stavem pacienta. Výhodně bude perorální dávka v rozmezí od přibližně 0,5 do přibližně 20 mg/kg. K akutní léčbě se upřednostňuje parenterální podání. Nejúčinnější je intravenózní infúze peptidu v 5% roztoku dextrózy ve vodě nebo normálním rozoku chloridu sodného, nebo obdobný přípravek s vhodnými excipienty, i když intramuskulární injekce bolusu je také užitečná. Obvykle bude parenterálně podaná dávka od přibližně 0,01 do přibližně 100 mg/kg, výhodně od 0,1 do 20 mg/kg. Sloučenina se podává jednou až čtyřikrát denně v množství k dosažení celkové denní dávky od přibližně 0,4 do přibližně 400 mg/kg/den. Přesné množství a způsob, jakým se sloučenina podává, snadno určí běžný odborník v oboru srovnáním hladiny léčiva v krvi s koncentrací požadovanou k terapeutickému účinku.

Tento vynález dále poskytuje způsob léčby osteoporózy nebo inhibice úbytku kosti, který zahrnuje podání, postupně nebo v kombinaci, sloučeniny obecného vzorce I a jiných inhibitorů resorpce kosti, jako například bisfosfonátů (tj.

(hormone replacement therapy, léčba antiestrogenů nebo kalcitoninu. Navíc alendronátu), HRT náhradou hormonů), tento vynález poskytuje způsob léčby použitím sloučeniny a anabolika, jako kosti, iproflavonu, k prevenci úbytku kosti a/nebo ke zvýšení kostní hmoty.

Dodatečně tento vynález poskytuje způsob inhibice nádorového růstu, který zahrnuje podání, postupně nebo podle tohoto morfogenního vynálezu proteinu například užitečného • ·

004 758, č, 4 342 776, č.

v kombinaci, sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastika. Dobře známými skupinami antineoplastik jsou sloučeniny třídy analog kamptotecinu, jako například topotekan, irinotekan a 9-aminokamptotecin a koordinační komplexy platiny, jako například cisplatina, ornaplatina a tetraplatina. Sloučeniny třídy analog kamptotecinu jsou popsány v US patentu č.

604 463, č. 4 473 692, č. 4 545 880, č. 4 513 138, č. 4 399 276, evropské patentové přihlášce č. 0 418 099 a č. 0 088 642, Wani a kol., J. Med. Chem. 29, 2358 (1986), Wani a kol., J. Med. Chem. 23, 554 (1980), Wani a kol., J. Med. Chem. 30, 1774 (1987) a

Nitta a kol., Proč. 14th International Congr. Chemotherapy, Anticancer section 1, 28 (1985), úplné zveřejnění každého z nich je zde začleněno odkazem. Koordinační komplex platiny, cisplatina, je obchodně dostupná od společnosti Bristol Myers-Squibb pod názvem Platinol®. Užitečné prostředky s cisplatinou jsou popsány v US patentu č. 5 562 925 a č. 4 310 515, úplné zveřejnění každého z nich je zde začleněno odkazem.

Ve způsobu inhibice nádorového růstu, který zahrnuje podání, postupně nebo v kombinaci, sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastika, mohou být koordinační sloučeniny platiny, například cisplatiny, podány použitím pomalé intravenózní infúze. Upřednostňovanou nosnou látkou je roztok dextrózy/chloridu sodného obsahující manitol. Dávkovači schéma koordinační sloučeniny platiny může být v základě od přibližně 1 do přibližně 500 mg na čtvereční metr (mg/m²) plochy povrchu těla v průběhu léčby. Infúze koordinační sloučeniny platiny se mohou podávat jednou nebo dvakrát týdně, a tyto týdenní léčby se mohou několikrát opakovat. Při použití sloučeniny třídy analog kamptotecinu parenterálním podáním se obvykle v průběhu léčby použije od přibližně 0,1 do přibližně 300,0 mg/m² plochy povrchu těla denně, po dobu přibližně pěti po sobě následujících dní. Nej výhodněji se v průběhu léčby použije množství topotekanu od přibližně 1,0 do přibližně 2,0 mg/m² plochy povrchu těla denně po dobu přibližně pěti po sobě následujících dní. Výhodně se průběh léčby opakuje nejméně jednou v intervalu od přibližně sedmi do přibližně dvaceti osmi dní.

Farmaceutický prostředek se může zformulovat se sloučeninou obecného vzorce lis antineoplastikem do stejného obalu, ale upřednostňuje se formulace do odlišných obalů. Jsou-li obě léčiva poskytnuta ve formě roztoku, mohou se uzavřít do systému infúze/injekce k simultánnímu podání nebo v tandemovém uspořádání.

Ke vhodnému podání sloučeniny obecného vzorce I a antineoplastika ve stejnou nebo rozdílnou dobu se připravuje kit, který obsahuje v samostatném obalu, jako například kazetě, krabicí nebo jiném obalu, jednotlivé lahvičky, sáčky, ampulky nebo jiné obaly, z nichž každý obsahuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce I k parenterálnímu podání, jak je popsáno výše, a účinné množství antineoplastika k parenterálnímu podání, jak je popsáno výše. Takový kit může zahrnovat obě farmaceutická léčiva například v oddělených obalech nebo v jednom obalu, popřípadě jako lyofilizované částice, a obaly s roztoky k rekonstituci. Obměnou toho je zahrnutí roztoku k rekonstituci a lyofilizované náplně do dvou komor jednoho obalu, které se dají před použitím smísit. V takové úpravě mohou být antineoplastikum a sloučenina podle tohoto vynálezu baleny jak odděleně, tak i ve dvou obalech, nebo společně lyofilizovány jako prášek a poskytnuty v jednom obalu.

Jsou-li obě léčiva poskytnuta v podobě roztoku, mohou být uzavřeny do systému infúze/injekce k simultánnímu podání nebo v tandemovém uspořádání. Sloučenina obecného vzorce I • · • φ

• · « • · · · « φ φ e • · · ··

Φ· · · • ♦ · * • · Φ · • · ♦ · » ♦ · · Φ • * Φ · může být například v injekční formě k intravenóznímu podání, nebo v infúzním vaku propojeném za sebou hadičkou ke druhému infúznímu vaku s antineoplastikem. Použitím takového systému může pacient obdržet injekci nebo infúzi typu počátečního bolusu sloučeniny obecného vzorce I, a následně infúzi antineoplastika.

Sloučenina se může zkoušet jednou nebo několika biologickými zkouškami ke stanovení koncentrace sloučeniny, která se požaduje k danému terapeutickému účinku.

INHIBICE VAZBY VITRONEKTINU

Vazba pevné fáze [³H]-SK&F-107260 na α_νβ₃:

α_νβ₃ lidské placenty nebo lidských destiček v množství 0,1 až 0,3 mg/ml v pufru T (obsahujícím 2 mM CaCl₂ a 1 % oktylglukosidu) se zředilo pufrem T obsahujícím 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (pufr A) a 0,05 % NaN₃, a potom se ihned přidalo na plotny ELISA s 96 jamkami (Corning, New York, NY) v množství 0,1 ml na jamku. Přidal se α_νβ₃ v množství 0,1 až 0,2 pg na jamku. Plotny se inkubovaly přes noc při teplotě 4 °C. V době experimentu se jamky jedenkrát promyly pufrem A a inkubovaly se 1 h při teplotě místnosti 0,1 ml 3,5% roztoku bovinního sérového albuminu ve stejném pufru. Po inkubaci se jamky úplně odsály a dvakrát promyly vždy 0,2 ml pufru A.

Sloučeniny se rozpustily ve 100% DMSO, aby se dostal 2mM zásobní roztok, který se zředil vazebným pufrem (15 mM Tris-HCl s hodnotou pH = 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂) , aby konečná koncentrace sloučeniny byla 100μΜ. Tento roztok se potom zředí na požadovanou konečnou koncentraci sloučeniny. Do jamek se přidaly vždy ve třech provedeních různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 • · 9 0 · » • · · • 9 9 99 • · 0 • · 9 « * 0·0 •0 00 9 9· f e 00 · • 00 9 • 0 0 · • » 0 0 až 100 μΜ) , a následně se přidalo 5,0 nM [³H] -SK&F-107260 (65 až 86 Ci/mmol).

Plotny se inkubovaly 1 h při teplotě místnosti. Po inkubaci se jamky úplně odsály a jedenkrát promyly 0,2 ml chladného pufru A způsobem od jamky k jamce. Receptory se solubilizovaly 0,1 ml 1% SDS a vazba [³H]-SK&F-107260 se stanovila kapalinovou scintilaci za přidání 3 ml Ready Safe v Beckmanově LS kapalinovém scintilačním detektoru s účinností 40 %. Nespecifická vazba [³H]-SK&F-107260 se stanovila v přítomnosti 2 μΜ SK&F-107260 a konzistentně byla menší než 1 % celkového vstupu radioligandu. IC50 (koncentrace antagonisty k inhibici 50% vazby [³H]-SK&F107260) se stanovila nelineárně, metodou nejmenších čtverců, která se modifikovala programem LUNDON-2. Ki (disociační konstanta antagonisty) se vypočítala podle vztahu: Ki = IC50/ (1 + L/Kd), kde L je koncentrace a K_d je dissociační konstanta [³H]-SK&F-107260.

Sloučenina podle tohoto vynálezu inhibuje vazbu vitronektinu na SK&F-107260 v koncentraci přibližně 0,033 μΜ.

Sloučenina podle tohoto vynálezu se také zkouší na resorpci kosti in vitro a in vivo standardními zkouškami v oboru ke stanovení inhibice tvorby kosti, jako například zkoušením tvorby mezer popsaným v evropském patentu č. 528 587, které se může také provést za použití lidských osteoklastů místo krysích osteoklastů, a na ovarektomizovaném modelu krysy, jak popsal Wironski a kol., Cells and Materials, Sup. 1, 69 - 74 (1991).

ZKOUŠKA MIGRACE BUNĚK HLADKÉ SVALOVINY CÉV • · • · • ··· * i · ♦ • · ♦ e » · ♦ · *» »· kultivace Transwell za s póry 8 μιη (Costar) .

Použily se buňky hladké svaloviny aorty krys nebo člověka. Migrace buněk se monitorovala v komoře buněčné použití polykarbonátové membrány Spodní povrch filtru se pokryl vitronektinem. Buňky se suspendovaly v koncentraci 2,5 až 5,0 x 10⁶ buněk/ml v DMEM obohaceném o 0,2% bovinní sérový albumin a po dobu 20 min se při teplotě 20 °C předem zpracovaly s testovanou sloučeninou v různých koncentracích. Samotné rozpouštědlo se použilo jako kontrola. Do horního oddílu komory se umístilo 0,2 ml suspenze buněk. Spodní oddíl obsahoval 0,6 ml DMEM obohaceného 0,2% bovinního sérového albuminu. Provedla se inkubace po dobu 24 h při teplotě 37 °C v atmosféře směsi 95 % vzduchu a 5 % CO₂. Po inkubaci se nemigrující buňky na vrchní části filtru odstranily opatrným setřením. Potom se filtr umístil do methanolu a obarvil 10% barvivém Giemsa. Migrace se měřila buďto a) počítáním počtu buněk, které migrovaly do nižší části filtru nebo b) extrakcí obarvených buněk 10% kyselinou octovou a následným stanovením absorbance při 600 nm.

MODEL THYREOIDEKTOMIZOVANÉ KRYSY

Každá experimentální skupina se skládá z 5 až 6 dospělých samců krys kmene Sprague-Dawley (tělesná hmotnost 250 až 400 g) . Krysám se 7 dní před použitím odstraní parathyreoidea (prodejcem, Taconic Farms). Všechny krysy obdrží každé tři dny substituční dávku thyroxinu. Po jejím obdržení se měří hladiny cirkulujícího ionizovaného vápníku v celé krvi ihned po jejím odběru venepunkcí jehlou do heparinizovaných hadiček. Krysy se použijí, jestliže hladina ionizovaného vápníku (měřená pH analyzátorem vápníku, model Ciba-Corning 634) bude <1,2 mM/Ι. Každá krysa se opatří • ·· · • · · · • · ·· to ·· • ♦ « · • » · • * « • · e • · · · vnitřně zavedeným venózním katetrem k dopravení zkoušené látky a arteriálním katetrem k odběru krevního vzorku. Krysám se potom podává dietní strava bez vápníku a deionizovaná voda. Měří se bazální hladiny vápníku a každé kryse se podá kontinuální infúzí pomocí žilního katetru za použití externí injekční pumpy buďto kontrolní vehikulum nebo peptid 1-34 lidského parathyreiodálního hormonu (hPTH 1-34, dávka 1,25 pg/kg/h ve směsi fyziologického roztoku a 0,1% bovinního sérového albuminu, Bachem, Ca) nebo směs hPTH 1 - 34 a zkoušené látky. Odpověď kalcémie se u každé krysy měří během infúzní periody 6 až 8 hodin ve dvouhodinových intervalech.

ZKOUŠKY RESORPCE A ADHEZE OSTEOKLASTŮ U ČLOVĚKA

Zkoušky mezerové resorpce a adheze se vyvinuly a standartizovaly s použitím lidských osteoklastů získaných z tkáně osteoklastomu. Zkouška 1 se vyvinula pro měření velikostí mezer osteoklastů laserovou konfokální mikroskopií. Zkouška 2 se vyvinula jako screening s vyšší výkonností, ve které se měří fragmenty kolagenu (uvolněné během resorpce) kompetitivním testem ELISA.

ZKOUŠKA 1 (použití laserové konfokální mikroskopie)

V prostředí tekutého dusíku uložené alikvóty suspenze lidských buněk pocházejících z osteoklastomu se odstraní, rychle zahřejí na teplotu 37 °C a při teplotě 4 °C se jedenkrát promyjí mediem RPMI-1640 odstředěním při frekvenci 1000 otáček za minutu.

Medium se odsaje a nahradí myší protilátkou anti-HLA0 0

0 • · • « · ·

DR, potom se zředí mediem RPMI-1640 v poměru 1:3. Suspenze se 30 min inkubuje v ledové tříšti a často se mísí.

Buňky se dvakrát promyjí chladným RPMI-1640, následné se při teplotě 4 °C odstředí při frekvenci 1000 otáček za minutu a buňky se potom přemístí do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 15 ml. V upravené Neubauerově sčítací komoře se počítají mononukleární buňky.

Ze zásobní lahve se odebere dostatečný počet magnetických kuliček (5/mononukleární buňka) pokrytých kozím antimyším IgG (Dynal, Great Neck, New York) a umístí do 5 ml čerstvého media (to odplaví toxické azidové konzervans). Medium se odstraní imobilizací kuliček na magnet a nahradí se čerstvým mediem.

Kuličky se smísí s buňkami a suspenze se 30 min inkubuje v ledové tříšti. Suspenze se často mísí.

Kuličkami obalené buňky se imobilizují na magnet a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se dekantují do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml.

Ke kuličkami obaleným buňkám se přidá čerstvé medium k odstranění některých zachycených osteoklastů. Tento postup promývání se opakuje desetkrát. Kuličkami obalené buňky se odloží.

Životaschopné osteoklasty se sečtou v počítací komoře s použitím fluoresceindiacetátu ke značení živých buněk. K přidání vzorku do komory se použije jednorázová velkoobjemová plastická pasteurova pipeta.

Osteoklasty se obalují odstřeďováním a hustota se upraví na příslušnou hodnotu (počet osteoklastů se liší od nádoru k nádoru) v mediu EMEM obohaceném 10% fetálním telecím sérem a roztokem uhličitanu sodného 1,7 g/1.

Alikvoty 3 ml suspenze buněk (ke zpracování se sloučeninou) se dekantují do centrifugačních zkumavek o objemu 15 ml. Buňky se obalují odstřeďováním.

·· ··* · ·· · a ♦ » · 9 * *· ·· »· ’ · ί ί *; : *: · · · ·· .......

Do každé zkumavky se přidají 3 ml příslušné sloučeniny ke zpracování (žředěné na 50 μΜ v mediu EMEM) . Také se zahrnou příslušné kontroly s vehikulem, pozitivní kontrola (myší monoklonální protilátka proti receptoru pro vitronektin [87MEM1] zředěná na 100 pg/ml) a izotypová kontrola (IgG zředěný na 100 pg/ml). Vzorky se 30 min inkubují při teplotě 37 °C.

Alikvoty 0,5 ml buněk se naočkují na sterilní řezy dentinu na plotnu se 4 8 jamkami a inkubují se 2 h při teplotě 37 °C. Každé zpracování se screenuje ve čtyřech provedeních.

Řezy se promyjí v šesti výměnách horkým PBS (10 ml/jamka na plotně se šesti jamkami), a potom se umístí do čerstvého media obsahujícího vzorky zpracované se sloučeninou nebo kontrolní vzorky. Vzorky se inkubují 48 h při teplotě 37 °C.

Postup kyselé fosfatázy resistentní k tartrátu (TRAP) (selektivní barvivo pro buňky linie osteoklastů)

Řezy kostí obsahující uchycené osteoklasty se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a na 5 min se umístí do 2% roztoku glutaraldehydu v 0,2M kakodylátu sodném.

Potom se promyjí vodou a 4 min inkubují při teplotě 37 °C v TRAP pufru (0,5 mg/ml naftolu AS-BI fosfátu rozpuštěného v N,N-dimethylformamidu a smíšeného s 0,25M citrátovým pufrem s hodnotou pH = 4,5, obsahující 10 mM tartrátu sodného).

Po promytí studenou vodou se řezy ponoří do chladného acetátového pufru (0,lM, pH = 6,2) obsahujícího 1 mg/ml rychlé granátové červeně a 4 min se inkubují při teplotě 4 °C.

• ·· ·

Nadbytek pufru se odsaje a řezy se po promytí ve vodě vysuší vzduchem.

TRAP pozitivní osteoklasty (cihlově červená/pupurová sraženina) se sečtou mikroskopií na světlém poli a potom se z povrchu dentinu odstraní ultrazvukem.

Velikosti mezer se stanoví konfokální mikroskopií na přístroji Nikon/Lasertec ILM21W.

ZKOUŠKA 2 (použití výstupu ELISA)

Lidské osteoklasty se upraví a připraví na screening sloučenin, jak se popisuje v prvních 9 bodech zkoušky 1. K ujasnění se tyto body dále opakují.

V prostředí tekutého dusíku uložené alikvoty suspenze lidských buněk pocházejících z osteoklastomu se odstraní, rychle zahřejí na teplotu 37 °C a při teplotě 4 °C se jedenkrát promyjí mediem RPMI-1640 odstředěním při frekvenci 1000 otáček za minutu.

Medium se odsaje a nahradí myší protilátkou anti-HLADR, potom se zředí mediem RPMI-1640 v poměru 1:3. Suspenze se 30 min inkubuje v ledové tříšti a často se mísí.

Buňky se dvakrát promyjí chladným RPMI-1640, a následně se při teplotě 4 °C odstředí při frekvenci 1000 otáček za minutu a buňky se potom přemístí do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 15 ml. V upravené Neubauerově sčítací komoře se počítají mononukleární buňky.

Ze zásobní lahve se odebere dostatečný počet magnetických kuliček (5/mononukleární buňka) pokrytých kozím antimyším IgG (Dynal, Great Neck, New York) a umístí do 5 ml čerstvého media (to odplaví toxické azidové konzervans). Medium se odstraní imobilizací kuliček na magnet a nahradí • · 1 • · • · * · • fcfcfc fc · • · • · • fc se čerstvým mediem.

Kuličky se smísí s buňkami a suspenze se 30 min inkubuje v ledové tříšti. Suspenze se často mísí.

Kuličkami obalené buňky se imobilizují na magnet a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se dekantují do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml.

Ke kuličkami obaleným buňkám se přidá čerstvé medium k odstranění některých zachycených osteoklastů. Tento postup promývání se opakuje desetkrát. Kuličkami obalené buňky se odloží.

Životaschopné osteoklasty se sečtou v počítací komoře s použitím fluoresceindiacetátu ke značení živých buněk. K přidání vzorku do komory se použije jednorázová velkoobjemová plastická pasteurova pipeta.

Osteoklasty se obalují odstřeďováním a hustota se upraví na příslušnou hodnotu (počet osteoklastů se liší od nádoru k nádoru) v mediu EMEM obohaceném 10% fetálním telecím sérem a roztokem uhličitanu sodného 1,7 g/1.

Na rozdíl od způsobu popsaného výše ve zkoušce 1 se sloučeniny screenují ve 4 dávkách způsobem popsaným níže, aby se dostala IC50:

Preparáty osteoklastů se předem inkubují s testovanou sloučeninou (4 dávky) nebo s kontrolami 30 min při teplotě °C.

Potom se naočkují na řezy kortikální částí bovinní kosti do jamek plotny ke tkáňové kultivaci se 48 jamkami a inkubují se další 2 h při teplotě 37 °C.

Řezy kostí se promyjí šestkrát po sobě horkým fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), aby se odstranily neadherované buňky, a potom se opět vrátí do jamek plotny se 48 jamkami, obsahujících testovanou sloučeninu nebo kontroly.

Plotna ke tkáňové kultivaci se potom 48 h inkubuje při • · · · teplotě 37 °C.

Supernatanty z každé jamky se odsají do jednotlivých zkumavek a screenují se kompetitivním testem ELISA, který detekuje c-telopeptid kolagenu typu I, který se uvolňuje během procesu resorpce. Je to obchodně dostupný test ELISA (Osteometer, Dánsko), který obsahuje králičí protilátku, která specificky reaguje se sekvencí 8 aminokyselin (GluLys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg), která je na karboxylovém konci telopeptidu řetězce al kolagenu typu I. Výsledky jsou vyjádřeny jako % inhibice resorpce ve srovnání s kontrolním vehikulem.

Zkouška adheze lidských osteoklastů

Lidské osteoklasty se upraví a připraví ke screenování sloučenin, jak se popisuje výše v prvních 9 bodech zkoušky 1. K ujasnění se tyto body dále opakují.

V prostředí tekutého dusíku uložené alikvoty suspenze lidských buněk pocházejících z osteoklastomu se odstraní, rychle zahřejí na teplotu 37 °C a při teplotě 4 °C se jedenkrát promyjí mediem RPMI-1640 odstředěním při frekvenci 1000 otáček za minutu.

Medium se odsaje a nahradí myší protilátkou anti-HLADR, potom se zředí mediem RPMI-1640 v poměru 1:3. Suspenze se 30 min inkubuje v ledové tříšti a často se mísí.

Buňky se dvakrát promyjí chladným RPMI-1640, a následně se při teplotě 4 °C odstředí při frekvenci 1000 otáček za minutu a buňky se potom přemístí do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 15 ml. V upravené Neubauerově sčítací komoře se počítají mononukleární buňky.

Ze zásobní lahve se odebere dostatečný počet magnetických kuliček (5/mononukleární buňka) pokrytých kozím ♦

99· • 9

• · · • 9 • ·

antimyším IgG (Dynal, Great Neck, New York) a umístí do 5 ml čerstvého media (to odplaví toxické azidové konzervans). Medium se odstraní imobilizací kuliček na magnet a nahradí se čerstvým mediem.

Kuličky se smísí s buňkami a suspenze se 30 min inkubuje v ledové tříšti. Suspenze se často mísí.

Kuličkami obalené buňky se imobilizují na magnet a zbývající buňky (frakce bohatá na osteoklasty) se dekantují do sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml.

Ke kuličkami obaleným buňkám se přidá čerstvé medium k odstranění některých zachycených osteoklastů. Tento postup promývání se opakuje desetkrát. Kuličkami obalené buňky se odloží.

Životaschopné osteoklasty se sečtou v počítací komoře s použitím fluoresceindiacetátu ke značení živých buněk. K přidání vzorku do komory se použije jednorázová velkoobjemová plastická pasteurova pipeta.

Osteoklasty se obalují odstřeďováním a hustota se upraví na příslušnou hodnotu (počet osteoklastů se liší od nádoru k nádoru) v mediu EMEM obohaceném 10% fetálním telecím sérem a roztokem uhličitanu sodného 1,7 g/1.

Osteoklasty pocházející z osteoklastomu se předem inkubuj i 30 min při teplotě 37 °C se sloučeninou (4 dávky) nebo kontrolami.

Potom se buňky naočkují na vrstvy potažené osteopontinem (lidský nebo krysí osteopontin, 2,5 pg/ml) a inkubují se 2 h při teplotě 37 °C.

Neadherované buňky se odstraní rázným promytím vrstev fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a zbývající buňky na vrstvách se fixují v acetonu.

Osteoklasty se obarví kyselou fosfatázou resistentní k tartrátu (TRAP), selektivním markérem pro buňky tohoto fenotypu (viz kroky 15 - 17), a spočítají se světelnou inhibice adheze • fefefefe fe · • fefefe • · • fe • fefe • fe • fefefe • · fe fefe · • · • fe • · mikroskopií. Výsledky jsou vyjádřeny jako % ve srovnání s kontrolním vehikulem.

ZKOUŠKA ADHEZE BUNĚK

Buňky a buněčné kultury

Lidské získaly od kultivovaly embryonální buňky ledviny (buňky HEK 293) se

ATCC (katalogové číslo v mediu EMEM (Earlovo medium) mediu obsahujícím Earlovy

CRL 1573) minimální soli, 10

Buňky se esenciální fetálního bovinního séra, 1 % glutaminu a 1 % penicilin-streptomycinu.

Konstrukty a transfekce

Fragment EcoRI-KpnI o velikosti 3,2 kb podjednotky a_v a fragment Xbal-Xhol o velikosti 2,4 kb podjednotky β₃ se inzerovaly otevřením a ligací do klonovacích míst EcoRI EcoRV vektoru pCDN (Aiyar a kol., 1994), který obsahuje promotor CMV a volitelný markér G418. K trvalé expresi se 80 x 10⁶ buněk HEK 293 elektrotransformovalo konstrukty a_v a β₃ (20 gg DNA každé podjednotky) použitím Gene Pulser (Hensley a kol.,1994) a nanesly na lOOmm plotny (5 x 10⁵ buněk/plotna). Po 48 h se růstové medium obohatilo 450 gg/ml geneticinu (G418 sulfát, GIBCO-BRL, Bethesda, MD) . Buňky se udržovaly v selekčním mediu do té doby, kdy se kolonie rozšířily dostatečně k provedení zkoušky.

Imunocytochemická zkouška přenesených buněk

K určení, zda transfekty HEK 293 exprimovaly receptor pro vitronektin se buňky odstředěním imobilizovaly na « · «

• · to • · tototo • · to • · · • to to·· mikroskopická skla, na 2 min umístily do acetonu při teplotě místnosti a na vzduchu vysušily. Specifická reaktivita s monoklonálni protilátkou 23C6 specifickou pro komplex α_νβ₃ se ukázala použitím standardní nepřímé imunofluorescenční metody.

Zkoušky adheze buněk

Granulační plotny ELISA s 96 jamkami se přes noc při teplotě 4 °C předem potáhly 0,1 ml lidského vitronektinu (0,2 pg/ml media RPMI). V čase experimentu se plotny jedenkrát promyly mediem RPMI a na 1 h při teplotě místností zablokovaly 3,5% roztokem BSA v mediu RPMI. Transfektované buňky 293 se resuspendovaly v mediu RPMI obohaceném 20 mM HEPES s hodnotou pH = 7,4 a 0,1% BSA v hustotě 0,5 x 10⁶ buněk/ml. Do každé jamky se přidalo 0,1 ml suspenze buněk a v přítomnosti nebo absenci různých antagonistů α_νβ₃ se 1 h inkubovala při teplotě 37 °C. Po inkubaci se přidalo 0,025 ml 10% roztoku formaldehydu s hodnotou pH = 7,4 a buňky se 10 min fixovaly při teplotě místnosti. Plotny se třikrát promyly vždy 0,2 ml media RPMI a adherované buňky se na 20 min při teplotě místnosti obarvily 0,1 ml 0,5% toluidinové modři. Nadbytek barviva se odstranil mohutným promytím deionizovanou vodou. Toluidinová modř inkorporovaná do buněk se eluovala přidáním 0,1 ml 50% ethanolu obsahujícího 50 mM HCI. Adheze buněk se kvantitativně vyhodnotila při optické hustotě 600 nm detekčním přístrojem pro mikroplotnu (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).

Zkouška vazby pevné fáze α_νβ5

Receptor pro vitronektin α_νβ3 se očistil od Lidské fc · ) • fc 1 • fc fcfc fc* ··· · l · · • · ·· • fc • fc • · · · · • fc fcfc placenty. Receptorový preparát se zředil 50 mM Tris-HCl s hodnotou pH = 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂ , 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ (pufr A) a ihned se přidal do ploten ELISA s 96 jamkami v množství 0,1 ml na jamku, do každé jamky se přidalo 0,1 - 0,2 pg α_νβ3. Plotny se přes noc inkubovaly při teplotě 4 °C. V čase experimentu se jamky jedenkrát promyly pufrem A a inkubovaly 1 h při teplotě místnosti 0,1 ml 3,5% bovinního sérového albuminu ve stejném pufru. Po inkubaci se jamky úplně odsály a dvakrát promyly 0,2 ml pufru A.

Ve zkoušce kompetice [³H]-SK&F-107260 se do jamek přidaly různé koncentrace neznačených antagonistů (0,001 100 μΜ) a následně se přidalo 5,0 nM [³H]-SK&F-107260. Plotny se inkubovaly 1 h při teplotě místnosti. Po inkubaci se jamky úplně odsály a jedenkrát promyly 0,2 ml chladného pufru A způsobem od jamky k jamce. Receptory se solubilizovaly 0,1 ml 1% SDS a vazba [³H]-SK&F-107260 se stanovila kapalinovou scintilací za přidání 3 ml Ready Safe v Beckmanově LS kapalinovém scintilačním detektoru s účinností 40 %. Nespecifická vazba [³H]-SK&F-107260 se stanovila v přítomnosti 2 μΜ SK&F-107260 a konzistentně byla menší než 1 % celkového vstupu radioligandu. IC₅₀ (koncentrace antagonisty k inhibici 50% vazby [³H]-SK&F107260) se stanovila nelineárně, metodou nejmenších čtverců, která se modifikovala programem LUNDON-2. Ki (disociační konstanta antagonisty) se vypočítala podle vztahu Chenga a Prustoffa: K± = IC₅o/(l + L/K_d) , kde L je koncentrace a K_d je disociační konstanta [³H]-SK&F-107260.

INHIBICE VAZBY GPIIb-IIIa OVLÁDANÁ RGD

Čištění GPIIb-IIIa ·· ·««· ► · 0

0··

Deset jednotek starších, promytých lidských destiček (získaných od Red Cross) se lyžovalo opatrným míšením 2 h při teplotě 4 °C ve směsi 3% oktylglukozidu, 20 mM Tris-HCl s hodnotou pH = 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2· Lyzát se 1 h odstřeďoval při frekvenci otáček 100 000 x g. Získaný supernatant se nanesl na 5 ml kolony s čočkami lektinu 4B (E.Y. Labs), která se předem uvedla do rovnováhy směsí 20 mM Tris-HCl s hodnotou pH - 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2 a 1% oktylglukozidem (pufr A) . Po 2h inkubaci se kolona promyla 50 ml chladného pufru A. GPIIb-IIIa zachycený lektinem se eluoval pufrem A obsahujícím 10 % dextrózy. Všechny postupy se uskutečnily při teplotě 4 °C. Jak ukázala SDS elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, měl získaný GPIIbIIIa čistotu >95 %.

Inkorporace GPIIb-IIIa do liposomů

Do jamek se pod dusíkovou atmosférou přidala ze skleněné zkumavky směs fosfatidylserinu (70 %) a fosfatidylcholinu (30 %) (Avanti Polar Lipids). Čištěný GPIIb-IIIa se zředil na konečnou koncentraci 0,5 mg/ml a smísil s fosfolipidy v hmotnostním poměru proteinů a fosfolipidů 1:3. Směs se resuspendovala a na 5 min vystavila působení ultrazvuku v ultrazvukové lázni. Směs se potom přes noc dialyzovala použitím dialyzační hadičky s molekulovou hmotností membrány 12 000 - 14 000 oproti lOOOnásobnému nadbytku směsi 50 mM Tris-HCl s hodnotou pH = 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (se dvěma obměnami). Liposomy obsahující GPIIb-IIIa se 15 min odstřeďovaly při frekvenci otáček 12 000 x g a resuspendovaly v dialyzačním pufru na konečnou koncentraci proteinu přibližně 1 mg/1 ml. Liposomy se skladovaly až do doby potřeby při teplotě -70 °C.

31.

,··. ........

, ϊ · · · · •··· · · ·*« ί :·!··«

Kompetitivní vazba na GPIIb-IIIa jamkami (společnost 0,22pm hydrofilních

Vazba na receptor fibrinogenu (GPIIb-IIIa) se zkoušela způsobem nepřímé kompetitivní vazby použitím [³H]-SK&F107260 jako ligandu typu RGD. Zkouška vazby se uskutečnila v soustavě filtrační plotny s 96

Milipore, Bedford, MA) s použitím membrán durapore. Jamky se na 1 h při teplotě místnosti předem potáhly 0,2 ml 10 pg/ml polylysinu (společnost Sigma Chemical, St. Louis, MO) k zablokování nespecifické vazby. K jamkám se vždy ve čtyřech vyhotoveních přidaly různé koncentrace neznačených benzazepinů. Do každé jamky se přidal [³H]-SK&F-107260 v konečné koncentraci 4,5 nM, a následně se přidal 1 pg čištěných liposomů obsahujících GPIIb-IIIa destiček. Směsi se 1 h inkubovaly při teplotě místnosti. Navázaný GPIIb-IIIa k [³H]-SK&F-107260 se od nenavázaného oddělil filtrací použitím různých filtrů Millipore, s následným promytím dvakrát vždy 0,2 ml ledově pufru. Radioaktivita vázaná na v 1,5 ml Ready Solve (Beckman CA) v Beckmanově kapalinovém (model LS6800) s účinností 40 %.

filtrech se Instruments, scintilačním Nespecifická chladného stanovila

Fullerton, detektoru vazba se stanovila v přítomnosti 2 μΜ neznačeného SK&F107260 a konzistentně byla menší než 0,14 % celkové radioaktivity přidané ke vzorkům. Všechny údaje jsou střední hodnotou ze čtyřech stanovení.

Údaje kompetitivní vazby se analyzovaly nelineární metodou nejmenších čtverců. Tento způsob poskytuje IC₅₀ antagonisty (koncentrace antagonisty, která v rovnováze inhibuje specifickou vazbu [³H]-SK&F-107260 z 50 %). IC50 se vztahuje k rovnovážné dissociační konstantě (Ki) antagonisty podle vztahu Chenga a Prustoffa: : Ki = ICso/(l + L/Kd), kde ·« 9999 • · 9 • 9 9 99 • · · • · · • to ··· ♦ to

L je koncentrace [³H]-SK&F-107260 použitá ve zkoušce kompetitivní vazby (4,5 nM) a K_d je disociační konstanta [³H]-SK&F-107260 , která má hodnotu 4,5 nM, jak še stanovilo analýzou podle Scatcharda.

Sloučenina podle tohoto vynálezu má afinitu k receptorů pro vitronektin vzhledem k receptorů pro fibrinogen větší než 10:1. Tato sloučenina má poměr účinku větší než 100:1.

Účinnost sloučeniny obecného vzorce I samotné nebo v kombinaci s antineoplastikem se může stanovit použitím několika myších modelů transplantace tumorů. Podrobnosti o těchto modelech viz US patent č. 5 004 758 a č. 5 633 016.

Následující příklady nejsou žádným způsobem zamýšleny k vymezení rozsahu tohoto vynálezu, ale poskytují se k ilustrování, jak vyrábět a používat sloučeninu podle tohoto vynálezu. Odborníkovi v oboru bude ihned známo mnoho jiných ztělesnění.

Příklady provedení vynálezu

Obecně

Spektra ¹H nukleární magnetické rezonance se zaznamanávala buďto při 250 nebo při 400 MHz. Chemické posuny jsou zaznamenány v ΙΟ^-6 (δ) v poli z vnitřního standardu tetramethylsilanu (TMS). Zkratky údajů NMR mají tento význam: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet, dd = dublet dubletu, dt = dublet tripletů, app =zdánlivý, br = široký signál. J ukazuje slučovací konstantu NMR měřenou v Hz.

CDCI3 je deuteriochloroform, DMSO-d6 je • · • φ ·· «»·· • · • φ ·· • · · ·· φφ »* • · * • · φφφ • · »

• · ·· hexadeuteriodimethy1sulfoxid

CD₃OD tetradeuteriomethanol. Infračervená spektra se zaznamenávala v přenosu a polohy čar se zaznamenávají v inverzních vlnových délkách (cm^-1) . Hmotnostní spektra se získala použitím způsobů ionizace elektrosprejem (ES). Elementární analýzy se uskutečnily způsobem podle Quantitative Technologies lne., Whitehouse, NJ. Teploty tání se stanovily na přístroji ke stanovení teploty tání podle Thomase a Hoovera a jsou neopravené. Všechny teploty jsou zaznamenány ve stupních Celsia, ke chromatografii na tenké vrstvě se použily desky s tenkou vrstvou silikagelu Analtech GF a E. Merck silikagelu 60 F - 254. Jak velmi rychlá, tak i gravitační chromatografie se uskutečnily na křemičitém silikagelu E. Merck Kieselgel 60 (částice 230 až 400 mesh, tj. přibližně 0,0662 až 0,038 mm). Analytická a preparativní HPLC chromatografie se uskutečnila na chromatogramech Rainin nebo Beckman. ODS se podpory chromatografie silikagelem nahrazeným oktadecylsilylem. 5 μ Apex-ODS udává podporu chromatografie silikagelem nahrazeným oktadecylsilylem s normální velikostí částic 5 μ, vyrobeno Jones Chromatography, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ® je podpora chromatografie ODS a je registrovanou obchodní známkou společnosti YMC Ltd., Kyoto, Japan. PRP-1® je polymerní (styren-divinylbenzen) podpora chromatografie a je registrovanou obchodní známkou společnosti Hamilton , Reno, Nevada. Celíte® je filtr a skládá se z dvoj atomového křemíku promytého kyselinou a je registrovanou obchodní známkou společnosti Manville, Denver, Colorado.

PŘÍKLAD 1

Příprava přípravku s kyselinou (S)-3-oxo-8-[3-(2pyridylamino)-1-propyloxy]-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-2,3,4,5tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octovou «4 • « • 0 • ·

0 ·* «··· • 0 0 • 0 ··· • » · ·· ·« * ··· « · • » <9 «· •

Příprava 1

Příprava methyl (±)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu

a) 4-Brom-3-brommethylanizol

Směs 20 g (0,10 mol) 2-brom-5-methoxytoluenu, 19,6 g (0,11 mol) N-bromsukcinimidu, 1 g (4 mmol) benzoylperoxidu a 200 ml methylenchloridu se 18 h ozařovalo lampou za účelem opatrného refluxování. Směs se potom ochladila na několik hodin na teplotu -10 °C a roztok se slil z vysráženého sukcinimídu. Roztok se odpařil a zbytek se nechal krystalizovat ze směsi chloroformu a hexanu, aby se dostalo

19,7 g (70 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako světle žlutých hranolků:

^ΧΗ NMR (CDC1₃):5 7,45 (d, J = 8,9 Hz, 1H) ; 6,99 (d, J = 3 Hz, 1H) ; 6,74 (dd, J = 8,9, 3 Hz, 1H) ; 4,55 (s, 2H) ; 3,80 (s, 3H) .

b) 3-Bis(terc.butoxykarbonyl)aminomethyl-4-bromanizol

Směs 24 g (86 mmol) 4-brom-3-brommethylanizolu a 24 g (94 mmol) diterc.butyliminodikarboxylátu draselného ve 200 ml dimethylformamidu se mísila 18 h pod argonovou atmosférou při teplotě místnosti. Reakce se potom za vakua odpařila a zbytek se rozdělil mezi ethylacetát a vodu. Organická fáze se promyla vodou a roztokem chloridu sodného vysušila síranem hořečnatým a odpařila,. Zbytek se rekrystalizoval z hexanu, aby se dostalo 15 g (42 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako bílé pevné látky.

^ΧΗ NMR (CDC1₃):6 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 1H) ;

4,81 (s, 2H); 3,74 (s, 3H); 1,44 (s, 18H).

6,68 (m, 2H) ;

c) Methyl (±)-3-karbomethoxy-4-[2-bis(terč.butoxykarbonyl) aminomethyl-4-methoxyfenyl]-3-butenoát

Baňka o objemu 500 ml se naplnila 15 g (36 mmol) 3bis(terč.butoxykarbonyl)aminomethyl-4-bromanizolu, 7,5 g (47 mmol) dimethylitakonátu, 1 g (3 mol) tri-o-tolylfosfinu, 0,4 g (2 mmoly) paladiumacetátu, 12,8 ml (72 mmol) diizopropylethylamínu a 150 ml propionitrilu. Směs se promyla argonem (několik cyklů vyprázdnění/proudu argonu), potom se 1 h zahřívala pod argonovou atmosférou k refluxování. Reakce se nechala ochladit na teplotu místnosti, ethyletheru

500 ml ledově chladného potom se vlila do

Výsledná sraženina se odstranila filtrací a filtrát se odpařil. Zbytek se čistil chromatografii na silikagelu (10% až 20% ethylacetát v hexanu), aby se dostalo

11,8 g (66 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako světle žluté olejovité látky:

^ΧΗ NMR (CDC1₃) :5 7,94 (s, 1H) ; 7,15 (d,

6,77 (d, J = 8,1 Hz, 1H) ; 6,76 (s, 1

3,81 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,71 (s,

1, 44 (s, 18H) .

J	= 8,1	Hz,	1H) ;
r	4,73	(s,	2H) ;
) '	3,38	(S,	2H) ;

d) Methyl (±)-3-karbomethoxy-4-[2-bis(terč.butoxykarbonyl) -aminomethyl-4-methoxyfenyl]butanoát

Tlaková nádoba naplněná 11,8 g methyl (±)-3karbomethoxy-4-[2-bis(terč.butoxykarbonyl)aminomethyl-4methoxyfenyl]-3-butenoátu, 120 ml ethylacetátu a 1 g 10% paladia na aktivním uhlíku se mísila 18 h pod tlakem vodíku 45 psi. Směs se potom zfiltrovala a filtrát se odpařil, aby se dostalo 12 g (100 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako bezbarvé olejovité látky:

• · • · · · » · · · · • · • · ·· ^JH NMR (CDC1₃):5 7,00 (d, J = 8,2 Hz, 1H) ; 6,71 (m, 2H) ;

4,81 (s, 2H); 3,75 (s, 3H); 3,66 (s, 3H); 3,63 (s, 3H); 3,05 (m, 2H); 2,73 (m, 2H); 2,42 (dd, J = 16,0; 4,8 Hz, 1H); 1,44 (s, 18H).

e) Methyl (±)-3-karbomethoxy-4-[2-aminomethyl-4-methoxyfenyl]butanoát

Roztok 12 g methyl (±)-3-karbomethoxy-4-[2bis(terc.butoxykarbonyl)aminomethyl-4-methoxyfenyl]butanoátu ve 100 ml chloroformu a 50 ml kyseliny trifluoroctové se 4 h mísil při teplotě místnosti pod argonovou atmosférou. Roztok se potom za vakua odpařil, aby se dostalo 10 g (100 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako viskózní olejovité látky: MS (ES) m/e 296,2 (M + H)⁺.

f) Methyl (±)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát

Roztok 10 g (24 mmol) methyl (±)-3-karbomethoxy-4-[2bis(terc.butoxykarbonyl)aminomethyl-4-methoxyfenyl]butanoátu a 17 ml (120 mmol) triethylaminu ve 100 ml toluenu se 18 h zahříval pod refluxem. Reakce se potom odpařila a zbytek se rozdělil ethylacetátem a vodou. Vodná vrstva se dvakrát extrahovala ethylacetátem a spojené organické výtažky se promyly roztokem chloridu sodného, vysušily síranem hořečnatým a odpařily, aby se dostalo 4,8 g (76 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako žlutohnědé pevné látky: MS (ES) m/e 264,2 (M + H)⁺.

f) Methyl (±)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát •· ···· ·· ·· ·· ·· • · · «·· 0«·· • · ··· « · ··· « · · · • · · « « β · «··· ·· ··« · · « · · · · ·

Κ míšenému roztoku 3 g (11 mmol) methyl-(±)-8-methoxy3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu a 4,2 ml (57 mmol) ethanthiolu ve 100 ml (120 mmol) dichlormethanu se pod argonovou atmosférou při teplotě 0 °C po částech přidalo

7,6 g (57 mmol) bezvodého chloridu hlinitého. Výsledná směs se nechala ohřát na teplotu místnosti a mísila přes noc, potom se odpařila. Zbytek se trituroval ledovou vodou a výsledná pevná látka se shromáždila filtrací a vysušila, aby se dostalo 2,64 g (91 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako bělavé pevné látky: MS (ES) m/e 250,2 (M + H)⁺.

Příprava 2

HPLC separace enantiomerů methyl (±)-8-hydroxy-3-oxo2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu

a) Methyl (R)-(+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát a methyl (S)-(-)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát

Methyl (±)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2benzazepin-4-acetát se rozštěpil na své enantiomery chirální HPLC s použitím těchto podmínek: kolona Diacel Chiralpak AS® (21,2 x 250 mm), mobilní fáze ethanol, rychlost proudění 7 ml/min, UV detekce při 254 nm, injekce 70 mg, t_R pro methyl (P)-(+)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2benzazepin-4-acetát = 21,5 min; t_R pro methyl (5)-(-)-8hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4acetát = 39,1 min.

Příprava 3

HPLC separace enantiomerů methyl (±)-8-methoxy-3-oxo38 • to to to • toto • · · · · · to «to·· ·· tototo toto to· «· «·

2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu

a) Methyl (R)-(+)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát a methyl (S)-(-)-8-methoxy-3-oxo2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát

Methyl (±)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát se rozštěpil na své enantiomery chirální HPLC s použitím těchto podmínek: kolona Diacel Chiralpak AS® (21,2 x 250 mm), mobilní fáze CH₃CN, rychlost proudění 15 ml/min, UV detekce při 254 nm, injekce 500 mg, t_R pro methyl (R)-(+)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH2-benzazepin-4-acetát = 10,2 min; t_R pro methyl (S)-(-)-8methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4acetát = 19,0 min.

Příprava 4

Demethylace methyl (S)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu

a) Methyl (S)-8-hydroxy~3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro~lH-2benzazepin-4-acetát

K roztoku 20,53 ml (0,217 mol) borontribromidu ve 160 ml CHC1₃ se při teplotě -8 °C pod argonovou atmosférou po kapkách během 30 min přidal roztok 15,0 g (0,057 mol) methyl (S)-8-methoxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4acetátu ve 160 ml CHC1₃, přičemž se teplota udržovala v rozmezí -5 °C až 0 °C. Reakční směs se 30 min mísila při teplotě přibližně -8 °C, a potom se přidalo, zpočátku po kapkách, 200 ml methanolu, přičemž se teplota udržovala na přibližně 0 °C. Reakční směs se odpařila, aby se dostala • · fefe· fefe ·· ·· fefe viskózní olejovitá látka, ze které se znovu odpařilo 100 ml methanolu. Olejovitá látka se rozpustila ve směsi vody a methanolu a malé množství tmavé pevné látky se odstranilo filtrací. Filtrát se neutralizoval 50% roztokem hydroxidu sodného na hodnotu pH = 7 za vysrážení bílé látky. pH suspenze se upravilo na hodnotu 4,5 přidáním malého množství kyseliny octové a pevná látka se shromáždila a za vakua vysušila, aby se dostalo 9,7 g (68 %) sloučeniny pojmenované v nadpise. Zkoušela se chirální čistota produktu pomocí HPLC: kolona Chiralpak AS® (4,6 x 50 mm), mobilní fáze 100% ethanol, rychlost proudění 0,5 ml/min, UV detekce při 215 nm, t_R = 7,5 min (S-enantiomer, 99 %) ; t_R = 4,4 min (Renantiomer, 1 %).

Příprava 5

Příprava 2-[N-(3-hydroxy-l-propyl)—N-(terč.butoxykarbonyl)amino]pyridin-N-oxidu

a) 2-[(3-hydroxy-l-propyl)amino]pyridin-N-oxid

Směs 16,6 g (0,1 mol) 2-chlorpyridin-N-oxidu, 15,3 ml (0,2 mol) 3-amino-l-propanolu, 42 g (0,5 mol) NaHCO₃ a 100 ml terč.amylalkoholu se zahřívala pod refluxem. Po 21 h se reakce ochladila, zředila 200 ml dichlormethanu a za podtlaku zfiltrovala k odstranění nerozpustných látek. Z filtrátu se odpařil toluen a znovu odpařil toluen k obdržení žluté olejovité látky. Chromatografie na silikagelu (20% směs methanolu a CHCI3) poskytla 15,62 g (93 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako žluté pevné látky: TLC (20% směs methanolu a CHCI3) : Rf 0,48;

^XH NMR (250, CDC1₃):5 8,07 (dd, J = 6,6; 1,2 Hz, 1H) ;

• · · ·

7,34 (široký t, 1H); 7,10 - 7,30 (m, 1H); 6,64 (dd, J = 8,5; 1,4 Hz, 1H); 6,40 - 6,60 (m, 1H); 4,49 (široký s, 1H) ; 3, 65 - 3, 90 (m, 2H) ; 3,35 - 3, 60 (m, 2H) ; 1,75 - 2,00’ (m, 2H). MS (ES) m/e 169 (M + H)⁺.

b) 2-[N-(3-hydroxy-l-propyl)-N-(terč.butoxykarbonyl)amino]pyridin-N-oxid

Roztok 8,0 g (47,6 mmol) 2-[(3-hydroxy-lpropyl) amino]pyridin-N-oxidu v 80 ml terč.butanolu se zpracoval s 11,4 g (55,3 mmol) diterc. butyldikarbonátu. Po 18 h se roztok odpařil a zbytek se trituroval hexanem. Výsledná pevná látka se vysušila ve vakuu, aby se dostalo 12,5 g (98 %) sloučeniny pojmenované v nadpise jako bělavé pevné látky: MS (ES) m/e 269,3 (M + H)⁺.

Příprava 6

Příprava kyseliny (S)-3-oxo-8-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octové

a) Methyl (S)-8-/3-[N-(l-oxo-2-pyridylamino)-N-(terč. butoxykarbonyl)amino]-l-propyloxy/-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát

K roztoku 0,65 g (2,75 mmol) (S)-8-hydroxy-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu a 1,94 g (7,4 mmol) trifenylfosfinu ve 13,5 ml bezvodého dimethylformamidu se při teplotě místnosti přidal po kapkách během 10 min roztok 1,8 g (6,84 mmol) 2-[N-(3-hydroxy-l-propyl)—N-(terč.butoxykarbonyl)amino]pyridin-N-oxidu a

1,19 g (6,84 mmol) diethylazodikarboxylátu ve 22,5 ml

		• · to to to to to ·· 41 ! ; ···_ . • « · · ·	• to ·· · · ·· • · · * · · · • ·«·· · ·· · to · ·· to· ··
bezvodého dimethylformamidu. Po 16 h se roztok odpařil na hnědou olejovitou látku, která se rozdělila 500 ml ethylacetátu a 100 ml vody. Organická vrstva se promyla dvakrát vždy 100 ml vody a 100 ml roztoku chloridu sodného,

vysušila síranem sodným a odpařila, aby se dostala světle hnědá olejovitá látka. Čištění chromatografií na silikagelu (5% směs methanolu a dichlormethanu) poskytlo 0,85 g (60 %) sloučeniny pojmenované v nadpise.

MS (ES) m/e 500,3 (M + H)⁺.

b) Methyl (S)-8-/3-[N-(l-oxo-2-pyridyl)-N-(terč. butoxykarbonyl)amino]-l-propyloxy/-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetát

K roztoku 0,470 g (0,94 mmol) (S) 8-/3-[N-(l-oxo-2-pyridyl)-N-(2-terc.butoxykarbonyl)amino]-l-propyloxy/-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu v 10,0 ml bezvodého dimethylformamidu se při teplotě -15 °C pod argonovou atmosférou po kapkách přidal 1,0 ml (1,0 mmol) 1,OM roztoku bis (trimethylsilyl)amidu líthného. Po 10 min se přidal po kapkách roztok 0,22 g (0,96 mmol) 2,3,4trifluorbenzylbromidu v 5,0 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Roztok se nechal během 2 h ohřát na teplotu místnosti. Po 18 h se roztok odpařil a zbytek se rozdělil 200 ml ethylacetátu a 30 ml vody. Organická vrstva se promyla dvakrát vždy 25 ml vody a 30 ml roztoku chloridu' sodného, vysušila síranem sodným a odpařila, aby se dostala světle žlutá pevná látka. Čištění chromatografií na silikagelu (5% směs methanolu a dichlormethanu) poskytlo 0,45 g (75 %) sloučeniny pojmenované v nadpise.

MS (ES) m/e 644,1 (Μ + H)⁺.

·· ··· · • · • ···

c) Methyl (S)-8-/3-[N-(l-oxo-2-pyridyl)amino]-1-propyloxy/-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2-benzazepin-4-acetát

Ve 4,0M roztoku kyseliny chlorovodíkové ve 20 ml 1,4dioxanu se rozpustilo 0,39 g (0,61 mmol) (S)-8-/3-[N-(1-oxo2-pyridyl)-N-(terč.butoxykarbonyl)amino]-l-propyloxy/-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu a reakce se 16 h udržovala při teplotě místnosti. Odstranění rozpouštědla zanechalo olejovitou látku, která po triturování etherem vykrystalizovala. Tato látka se rozpustila v 80 ml dichlormethanu a promyla 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuličitanu sodného. Organická vrstva se vysušila síranem sodným a odpařila se, aby se dostalo 0,33 g (98 %) sloučeniny pojmenované v nadpise. MS (ES) m/e 544,1 (M + H)⁺.

d) Methyl (S)-3-oxo-8-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2-benzazepin-4-acetát

Roztok 0,28 g (0,52 mmol) methyl (S)-8-/3-[N-(l-oxo-2-pyridyl)amino]-l-propyloxy/-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu a 0,28 g (3,35 mmol) cyklohexenu v 15 ml methanolu obsahující 0,270 g 10% paladia na aktivním uhlí se 16 h zahříval pod reluxem, ochladil a zfiltroval přes celit®. Filtrát se odpařil, aby se dostalo 0,27 g (99 %) sloučeniny pojmenované v nadpise. MS (ES) m/e 528,1 (Μ + H)⁺.

e) Kyselina (S)-3-oxo-8-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-octová • · • · · · · · • · • ···

Roztok 0,27 g (0,52 mmol) methyl (S)-3-oxo-8-[3-(2-pyridylamino-l-propyloxy]-2-(2,3,4-trifluorbenzyl)-3-oxo-2,3,4,5-tetrahydro-lH-2-benzazepin-4-acetátu ve směsi 15 ml methanolu a 3,0 ml 0,5N hydroxidu sodného se zahříval při teplotě 50 °C. Po 2 h se reakce ochladila na teplotu místnosti, zpracovala s 0,50 ml kyseliny trifluoroctové a odpařila, aby se dostala světle žlutá pevná látka. Čištění semipreparativní chromatografií HPLC (YMC ODS-AQ, 10 pm, 120 A, 50 mm x 250 mm, 40% směs CH3CN a vody obsahující 0,1 % kyseliny trifluoroctové) poskytlo 0,210 g (67 %) sloučeniny pojmenované v nadpise.

MS (ES) m/e 514,4 (M + H)⁺.

Analýza C27H26F3N3O4 . 1,3 CF₃CO₂H: Vypočteno: C, 53,73; H, 4,16; N, 6,35. Nalezeno: C, 53,64; H, 4,11; N, 6,14.

PŘÍKLAD 2

Přípravek k parenterálnímu dávkování

Přípravek, který obsahuje 20 mg sloučeniny z příkladu 1, se jako sterilní suchý prášek připraví takto: 20 mg sloučeniny se rozpustí v 15 ml destilované vody. Roztok se za sterilních podmínek zfiltruje do vícedávkové ampulky o objemu 25 ml a lyofilizuje se. K intravenózní nebo intramuskulární injekci se prášek rekonstituuje přídavkem 20 ml 5% roztoku dextrózy ve vodě (D5W) . Dávkování je tudíž určeno objemem injekce. Postupné zředění se může provést přidáním odměřeného objemu této jednotkové dávky k dalšímu objemu D5W pro injekci, nebo se mohou odměřené dávky přidávat do jiného systému k podávání léčiva, jako například do lahve nebo vaku k intravenózní infúzi kapačkou nebo k jinému systému injekce-infúze.

• 4» fefefefe • fe fe* ·· fefe fefefe ««· «fefe· • fefefefe · fefefefe · fefe fe • fe · fefefefe fe · · fe • fe fefefe fefe · · fefe fefe

PŘÍKLAD 3

Přípravek k perorálnímu dávkování

Tobolka k perorálnímu podání se připraví smísením a rozdrobněním 50 mg sloučeniny z příkladu 1 se 75 mg laktózy a 5 mg stearátu hořečnatého. Výsledný prášek se zkouší a plní do tvrdých želatinových tobolek.

PŘÍKLAD 4

Přípravek k perorálnímu dávkování

Tableta k perorálnímu podání se připraví smísením a granulováním 20 mg sacharózy, 150 mg dihydrátu síranu vápenatého a 50 mg sloučeniny z příkladu 1 s 10% roztokem želatiny. Vlhký granulát se zkouší, vysuší, smísí s 10 mg škrobu, 5 mg mastku a 3 mg kyseliny stearové a slisuje do tablety.

Výše uvedený popis plně ukazuje, jak vyrábět a používat tento vynález. Avšak tento vynález se neomezuje pouze na jednotlivá ztělesnění popsaná výše, ale zahrnuje všechny jeho modifikace poskytované rámcem následujících nároků. Různé odkazy na časopisy, patenty a jiné publikace, které se zde citují, obsahují stav techniky, a jsou zde začleněny odkazem, jako by byly plně zveřejněny.

Claims (28)

1. Sloučenina obecného vzorce I farmaceuticky přijatelná sůl.

(I) nebo její

2. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku I a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.

3. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku I, antineoplastikum a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3 vyznačující se tím, že antineoplastikem je topotekan.

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 3 vyznačující se tím, že antineoplastikem je • Φ φ·· φ • φ cisplatina.

6. Způsob léčby chorobného stavu, ve kterém se projevuje antagonismus receptorů α_νβ3, vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1 člověku, který to pořebuje.

7. Způsob léčby chorobného stavu, ve kterém se projevuje antagonismus receptorů α_νβδ, vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1 člověku, který to potřebuje.

8. Způsob léčby osteoporozy vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1 člověku, který to potřebuje.

9. Způsob inhibice angiogeneze vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1 člověku, který to potřebuje.

10. Způsob inhibice nádorového růstu nebo nádorových metastáz vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1 člověku, který to potřebuje.

11. Způsob léčby aterosklerózy nebo restenozy vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1 člověku, který to potřebuje.

» 0

0 0 0 0

0 0 0 ·

0 ·· · • 0 0 · ·· 0004 • 0 0 0 0 0

00 000 • 0 0 0 00 00

12. Způsob léčby zánětu vyznačující se tím, že zahrnuje podání sloučeniny podle nároku 1 člověku, který to potřebuj e.

13. Způsob inhibice nádorového růstu vyznačující se tím, že zahrnuje podání, postupně nebo ve fyzické kombinaci, sloučeniny podle nároku 1 a antineoplastika.

14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že antineoplastikem je topotekan.

15.

tím, že

Způsob podle nároku 13 vyznačující antineoplastikem je cisplatina.

16. Sloučenina obecného vzorce II (II) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

17. Sloučenina obecného vzorce III o- • fe fefefefe • fe

COjC^alkyl nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

18. Sloučenina podle nároku 1 k použití jako léku.

19. Použití sloučeniny podle nároku I při výrobě léku k léčbě onemocnění, ve kterém se projevuje antagonismus receptorů oí_vp>320. Použití sloučeniny podle nároku I při výrobě léku k léčbě onemocnění, ve kterém se projevuje antagonismus receptorů α_νβ5·

21. Použití sloučeniny podle nároku I při výrobě léku k léčbě osteoporózy.

22. Použití sloučeniny podle nároku I při výrobě léku k inhibicí angiogeneze.

23. Použití sloučeniny podle nároku I při výrobě léku k inhibicí nádorového růstu nebo nádorových metastáz.

• 9 999 9

9 ·

0 999

99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9

9 9 999 9 9 9 · • · 9 9 9 9 9 0 0 0 9 · 0 • 0 0 0000 0 000

00 999 99 99 99 9·

24. Použití sloučeniny podle nároku I při výrobě léku k léčbě aterosklerózy nebo restenózy.

25. Použití sloučeniny podle nároku I při výrobě léku k léčbě zánětu.

26. Použití sloučeniny podle nároku I a antineoplastika při výrobě léku 'k inhibici nádorového růstu, k podání ve fyzické kombinaci nebo k postupnému podání.

27. Použití podle nároku 26, kde antineoplastikem je topotekan.

28. Použití podle nároku 26, kde antineoplastikem je cisplatina.

29. Použití sloučeniny podle nároku 1 a inhibitoru kostní resorpce při výrobě léku k léčbě osteoporózy, k podání ve fyzické kombinaci nebo k postupnému podání.