NO322109B1

NO322109B1 - Vitronektinreseporantagonister

Info

Publication number: NO322109B1
Application number: NO20021113A
Authority: NO
Inventors: Irene Nijole Uzinskas; William H Miller; Peter J Manley
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1999-09-07
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2006-08-14
Also published as: CZ2002822A3; DE60016769T2; NZ517296A; EP1218005B1; CA2384671A1; CN1377269A; ZA200201780B; GC0000203A; MXPA02002455A; PE20010582A1; HK1049110A1; PL354176A1; PT1218005E; ES2234658T3; NO20021113L; HK1049110B; PL200404B1; KR100711170B1; AR025589A1; HUP0202710A3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår farmasøytisk aktive forbindelser som inhiberer vitronektinreseptoren og er brukbare for behandling av inflammasjon, cancer og kardiovaskulære lidelser, som aterosklerose og restenose, og sykdommer der beinresorpsjon er en faktor, for eksempel osteoporose.

Integriner er en superfamilie av celleadhesjonsreseptorer som er transmembrane glyko-proteiner uttrykt på et antall celler. Disse celleoverflateadhesjonsreseptorer inkluderer

gpIIb/HIa (fibrinogenreseptoren) og a VP3 (vitronektinreseptoren). Fibrinogenreseptoren gpHb/IIIa uttrykkes på plateoverflaten og medierer plateaggregering og dannelsen av en hemostatisk klump på setet for et blødende sår, se Philips et al., "Blood", 1988, 71, 831. Vitronektinreseptoren a VP3 uttrykkes på et antall celler, inkludert endoteliale

glattmuskel-, osteoklast- og tumorceller, og har således et antall funksjoner, a VP3-reseptoren uttrykt på membranen for osteoklastceller, medierer adhesjonen av osteoklaster til beinmatriksen, et nøkkeltrinn i beinresorpsjonsprosessen, se Ross et al., "J. Biol. Chem.", 1987,262, 7703. En sykdom som karakteriseres ved eksessiv beinresorpsjon, er osteoporose, a vP3-reseptoren uttrykt på humane, aortiske glattmuskel-celler, medierer deres migrering inn i neointima, en prosess som kan føre til restenose etter perkutan koronarangioplasti, se Brown et al., "Cardiovascular Res.", 1994,28, 1815.1 tillegg har Brooks et al., "Cell", 1994, 79,1157, vist at en a vp3-antagonist er i stand til å fremme tumorregresjon ved indusering av apoptose av angiogeniske blodkar. Således vil midler som blokkerer vitronektinreseptoren, være brukbar for behandling av sykdommer som osteoporose, restenose og cancer.

Vitronektinreseptoren er nå kjent å referere til tre forskjellige integriner, kalt a vPi,

a vp3 og a vp5, se Horton et al. i "Int. J. Exp. Pathol.", 1990, 71, 741. a vPi binder fibronektin og vitronektin. a VP3 binder et stort antall ligander inkludert fibrin, fibrino-gen, laminin, trombospondin, vitronektin, von Willebrands faktor, ostepontin og ben-sialoprotein I. a vPs binder vitronektin. Vitronektinreseptoren a vPs er påvist å være involvert i celleadhesjon av et antall celletyper inkludert mikrovaskulære endotelial-celler, se Davis et al. i "J. Cell. Biol.", 1993, 51,206, og dens rolle i angiogenese er bekreftet, se Brooks et al. i "Science", 1994,264, 569. Dette integrin uttrykkes på blodkar i human sårgranuleringsvev, men ikke i normal hud.

Vitronektinreseptoren er kjent å binde til beinmatriksproteiner som inneholder tri-peptidet Arg-Gly-Asp(eller RGD)-delen. Således beskriver Horton et al. i "Exp. Cell Res.", 1991, 195, 368, at RGD-inneholdende peptider og et anti-vitronektinreseptor-antistoff (23C6) inhiberer dentinresorpsjon og cellespredning ved osteoklaster. I tillegg beskriver Sato et al. i "J. Cell Biol.", 1990,111,1713, at echistatin, et slangegiftig peptid som inneholder RGD-sekvensen, er en potent inhibitor for beinresorpsjon i vevs-kultur, og inhiberer festing av osteoklaster til bein.

Det er nå funnet at visse forbindelser er potente inhibitorer for a VP3- og a vPs-reseptorene. Særlig er det funnet at slike forbindelser er mer potente inhibitorer av vitronektinreseptoren enn fibrinogenreseptoren.

Foreliggende oppfinnelse angår nye forbindelser som er mer potente inhibitorer av vitronektinreseptoren enn fibrinogenreseptoren. Oppfinnelsen angår forbindelser med den generelle formel (I):

der:

R<1> er

der R' er CM-alkyl og R" er fenyl, benzyl eller -CH2CF3; eller R' og R" sammen danner en morfolinylring;

R<2> er

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Også innenfor rammen av oppfinnelsen er farmasøytisk akseptable addisjonsalter og komplekser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. I tilfeller der forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan ha ett eller flere kirale sentra, omfatter oppfinnelsen, hvis ikke annet er sagt, hver unike ikke-racemiske forbindelser som kan syntetiseres og oppløses ved konvensjonelle teknikker. I henhold til foreliggende oppfinnelse er (S)-konfigurasjonen av formel (I)-forbindelser foretrukket.

I tilfeller der forbindelser har umettede karbon-karbon-dobbeltbindinger, er både cis(Z)-og trans(E)-isomerene innenfor oppfinnelsens ramme. I tilfeller der forbindelsene kan

eksistere i tautomere former som keto-enol-tautomerer, for eksempel

og

er hver tautomer form ansett for å ligge innenfor oppfinnelsens ramme

uansett om den foreligger i likevekt eller er låst i én form på grunn av egnet substitusjon med R'.

Forbindelsene med formel (I) inhiberer bindingen av vitronektin og andre RGD-holdige peptider til vitronektinreseptoren. Inhibering av vitronektinreseptoren på osteoklaster inhiberer osteoklastisk beinresorpsjon og er brukbar ved behandling av sykdommer der beinresorpsjon er forbundet med patologi, som osteoporose og osteoartritt.

Oppfinnelsen vedrører også stimulering av beindannelse. Økt beinproduksjon er en klar fordel i sykdomstilstander der det er en mangel på mineralisert beinmasse eller remodellering av bein er ønskelig, for eksempel ved bruddheling og prevensjon av beinbrudd. Sykdommer og metabolske lidelser som resulterer i tap av beinstruktur, vil også ha fordel av slik behandling. For eksempel kan hyperparatyroidisme, Pagets sykdom, hyperkalsemi av malignans, osteolytiske lesjoner dannet ved beinmetastaser, beintap på grunn av immobilisering eller sexhormonmangel, Behcets sykdom, osteomalaci, hyperostose og osteopetrose, kunne trekke fordel av administrering av forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Fordi forbindelsene ifølge oppfinnelsen inhiberer vitronektinreseptorer på et antall forskjellige typer celler, vil forbindelsene i tillegg være brukbare ved behandling av inflammatoriske lidelser, som reumatoid artritt og psoriasis, og kardiovaskulære sykdommer som aterosklerose og restenose. Berørte sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til, tromboemboliske lidelser, astma, allergier, adult-respiratorisk distressyndrom, poding-mot-vertssykdom, organtransplantatawisning, septisk sjokk, eksem, kontaktdermatitt, inflammatorisk tarmsykdom og andre autoimmune sykdommer. Et annet område er sårheling.

Oppfinnelsen vedrører også angiogeniske lidelser. Uttrykket angiogeniske lidelser slik det her benyttes, inkluderer tilstander som involverer unormal neovaskularisering. Når veksten av nye blodkar er årsaken til eller bidrar til patologien som forbindes med en sykdom, vil inhibering av angiogenesen redusere de skadelige virkninger av sykdommen. Et eksempel på et slikt sykdomsmål er diabetisk retinopati. Der veksten av nye blodkar er nødvendig for å understøtte vekst av et skadelig vev, vil inhiberingen av angiogenese redusere blodtilførselen til vevet og derved bidra til å redusere vevmasse basert på blodtilførselskrav. Eksempler er vekst av tumorer der neovaskularisering er et kontinuerlig krav for at tumoren skal vokse og opprettelse av fast tumormetastase. Oppfinnelsen vedrører således tumorvevangiogenese og derved forhindring av tumorvekst.

Et annet terapeutisk mål ifølge oppfinnelsen er øyesykdommer som karakteriseres ved neovaskularisering. Slike øyensykdommer inkluderer korneale, neovaskulære lidelser som korneal transplantasjon, herpetisk keratitt, luetisk keratitt, pterygium og neovaskulær pannus assosiert med kontaktlinsebruk. Ytterligere øyesykdommer er også aldersrelatert, makular degenerering, antatt okular histoplasmose, retinopati av prematuritet og neovaskulær glaukom.

Med henblikk på formel (I) er en egnet R<1>:

der

R<1> er Ci-4-alkyl, og

R" er fenyl, benzyl eller -CH2CF3; eller

R' og R" sammen danner en morfolinylring.

Egnet som R<2> er:

Representative for de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen, er: (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyirdin-2-ylH butansyre;

(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoks<y>]fen<y>l]-3-[4-[(N-rnetyl-N-fenyl-amino)karbonyl] -1,3 -oksazol-2-yl]butansyre;

(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[(morfolin-4-yl)-karbonyl] -1,3 -oksazol-2-yl]butansyre;

(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[[N-metyl-N-(2,2,2-trifluoretyl)amino]karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]butansyre;

(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-^ yl]butansyre;

(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-(3-metyltiazol-2-yl)-butansyre;

(S)-3-(3-lfuorfenyl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)etoksy]fenyl]-butansyre;

(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]etoksy]fenyl]-3-(pyridin-3-yl)butansyre;

(S)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]etoksy]fenyl]-3-(pyridin-3-yl)butansyre; og

(S)-3-(pyridin-3-yl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrabydro-l,8-naflyridin-2-yl)etoksyl]fenyl]-butansyre;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I tilfeller der forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan ha ett eller flere kirale sentra, omfatter oppfinnelsen, hvis ikke annet er sagt, hver unike, ikke-racemiske forbindelser som kan syntetiseres og oppløses ved konvensjonelle teknikker.

I de tilfeller der forbindelsene har umettede karbon-karbon-dobbeltbindinger, ligger både cis(Z)- og trans(E)-isomerene innenfor oppfinnelsens ramme. Betydningen av enhver substituent ved enhver opptreden er uavhengig av dens betydning eller enhver annen substituents betydning ved enhver annen opptreden.

Også inkludert innenfor oppfinnelsens ramme er prodrugs av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Prodrugs anses som enhver kovalent bundet bærer som frigir det aktive opp-havsmedikament i henhold til formel (I) in vivo. I et annet aspekt ved oppfinnelsen ligger således nye prodrugs som også er mellomprodukter ved fremstilling av forbindelse (Ia)-forbindelser, med formel (II).

Forkortelser og symboler som vanligvis benyttes i peptid- og kjemiteknikken, benyttes her for å beskrive forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Generelt følger aminosyreforkort-elsene IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, som beskrevet i "Eur. J. Biochem.", 158,9 (1984).

Ci-4-alkyl anvendes her i betydningen eventuelt substituert alkyl med 1 til 4 karbon-atomer, og inkluderer metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl og t-butyl. Enhver Ci-4.alkyl kan eventuelt være substituert med gruppen Rx, som kan være på et hvilket som helst karbonatom som resulterer i en stabil forbindelse og som er tilgjengelig ved konvensjonelle synteseteknikker. Egnede grupper for Rx er CM-alkyl, OR<*>, SR<*>, CM_alkylsulfonyl, CM-alkylsulfoksyl, -CN, N(R<*>)2, CH2N(R<*>)2, -N02, -CF3, -C02R<*>, -CON(R<*>)2, -COR<*>, -S02N(R<*>)2, -NR<*>C(0)R<*>, F, Cl, Br, I eller CF3S(0)r-, hvor r er 0,1 eller 2, og R<*> er H, Ci_4.alkyl, fenyl eller benzyl.

Halogen eller halo betyr F, Cl, Br og I.

Ar eller aryl betyr, slik uttrykket her benyttes, fenyl eller naftyl, eller fenyl eller naftyl som er substituert med én til tre substituenter, som de som er definert ovenfor for alkyl, særlig Ci-4-alkyl, CM.alkoksy, Ci.4.alkyltio, CF3, NH2, OH, F, Cl, Br eller I.

Het eller heterosykel antyder en eventuelt substituert fem- eller seksleddet, monosyklisk ring eller en ni- eller tileddet, bisyklisk ring inneholdende ett til tre heteroatomer valgt fra gruppen nitrogen, oksygen og svovel, som er stabile og tilgjengelige ved konven-sjonell kjemisk syntese. Illustrerende heterosykler er benzofuran, benzimidazol, benzo-pyran, benzotiofen, benzotiazol, furan, imidazol, indolin, morfolin, piperidin, piperazin, pyrrol, pyrrolidin, tefrahydropyridin, pyridin, tiazol, oksazol, tiofen, kinolin, isokinolin og terra- og perhydro-kinolin og isokinolin. Enhver tilgjengelig kombinasjon av opp til tre substituenter på Het-ringen som de som er definert ovenfor for alkyl og som er tilgjengelige ved kjemisk syntese og er stabile, ligger innenfor rammen av oppfinnelsen.

Visse radikale grupper angis ved forkortelser. t-Bu angir tert.-butylresten, Boe angir t-butyloksykarbonylresten, Fmoc angir fluorenylmetoksykarbonylresten, Ph angir fenyl-resten, Cbz angir benzyloksykarbonylresten, Bn angir benzylresten, Me angir metyl, Et angir etyl, Ac angir acetyl, Alk angir Ci-4-alkyl, Nph angir 1- eller 2-naftyl og cHex angir sykloheksyl. Tet betyr 5-tetrazolyl.

Visse midler angis forkortet. DCC angir disykloheksylkarbodiimid, DMAP angir dimetylaminopyridin, DIEA angir diisopropyletylamin, EDC angir l-(3-dimetylamino-propyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid, HOBt angir 1-hydroksybenzotriazol, THF angir tetrahydrofuran, DIEA angir diisopropyletylamin, DEAD angir dietylazodikarboksylat, PPh3 angir trifenylfosfin, DIAD angir diisopropylazodikarboksylat, DME angir di-metoksyetan, DMF angir dimetylformamid, NBS angir N-bromsuksinimid, Pd/C angir en palladium-på-karbonkatalysator, PPA angir polyfosforsyre, DPPA angir difenyl-fosforylazid, BOP angir benzotriazol-l-yloksy-tris(dimetylamino)fosfoniumheksafluor-fosfat, HF angir flussyre, TEA angir trietylamin, TFA angir trifluoreddiksyre, PCC angir pyridiniumklorkromat.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen fremstilles ved de generelle metoder som er beskrevet i reaksjonsskjemaene I til VI. (a) CH3NH(0CH3)HC1, EDC, HOBtH20, Et3N, DMF; (b) 4-brombenzotrifluorid, sek-BuLi, THF; (c) (EtO)2P(0)CH2C02Et, NaH, toluen; (d) H2,10 % Pd/C, EtOH; (e) BBr3, CH2C12; (f) 6-(metylamino)-2-pyridyletanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (g) 1,0 NNaOH, MeOH, så surgjøring.

En egnet alkylfenyleddiksyre, for eksempel 4-metoksyfenyleddiksyre (I-l), omdannes til deoksybenzoinderivatet 1-3 ved omsetning med det tilsvarende N-metoksy-N-metyl-amid (1-2) med et metallert aromatisk derivat i henhold til den generelle metode ifølge Weinreb ("Tetrahedron Lett.", 1981,22,3815). Forbindelse 1-3 omdannes til den a,p-umettede ester 1-4 via den velkjente Wittig-reaksjon. Optimalt gjennomføres reaksjonen ved bruk av trietylfosfonoacetat i nærvær av en egnet base, generelt natriumhydrid eller litium-bis(trimetylsilyl)amid, i et aprotisk oppløsningsmiddel som toluen, THF eller blandinger derav. Reduksjon av olefingruppen i 1-4 gjennomføres optimalt ved hydrogenering i nærvær av en palladiumkatalysator som palladium på aktivert trekull, i et egnet oppløsningsmiddel som EtOAc, MeOH, EtOH, i-PrOH eller blandinger derav. Metyleteren av 1-5 kan spaltes med bortribromid (BBr3) i et inert oppløsningsmiddel, fortrinnsvis CH2CI2 eller med etantiol (EtSH) og aluminiumtriklorid (AICI3) i et inert opp-løsningsmiddel som CH2CI2. Andre brukbare metoder for fjerning av metyleterbeskyttende grupper er beskrevet av Greene i "Protective Groups in Organic Synthesis", utgitt av Wiley-Interscience. Den resulterende fenol 1-6 omsettes med 6-(metylamino)-2-pyridyletanol i en Mitsunobu-type koblingsreaksjon ("Organic Reactions", 1992,42, 335-656; "Synthesis", 1981,1-28) for å gi 1-7. Denne reaksjon medieres av komplekset dannet mellom en azodikarboksylatdiester som dietylazodikarboksylat eller diisopropylazodikarboksylat og trifenylfosfin, og gjennomføres i et aprotisk oppløsningsmiddel som THF, CH2CI2 eller DMF. Etylesteren av 1-7 hydrolyseres ved bruk av vandig base som LiOH i vandig THF eller NaOH i vandig metanol eller etanol, og intermediatkarboksylatsaltet surgjøres med en egnet syre som TFA eller HC1, for å gi karboksylsyren 1-8. Alternativt kan intermediatkarboksylatsaltet isoleres hvis ønskelig, eller et karboksylatsalt av den frie karboksylsyre kan fremstilles ved i og for seg kjente metoder.

(a) Triisopropylsilylklorid, imidazol, DMF; (b) metyl-3-(benzyloksykarbonyl)-3-butenoat, Pd(OAc)2, P(tol)3, (i-Pr)2NEt, propionitril; (c) H2,10 % Pd/C, EtOAc; (d) serinbenzylester-hydroklorid, EDC, HOBt • H20, Et3N, DMF; (e) Burgess-reagens, THF; (f) Cl3CBr, DBU, CH2C12; (g) TBAF, THF; (h) (Boc)20, pyridin, THF; (i) H2, 10 % Pd/C, EtOH; (j) N-metylanilin, EDC, BPFFH, (i-Pr)2NEt, pyridin, DMF; (k) 4 N HCl/dioksan; (1) 6-(metylamino)-2-pyridyletanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (m) LiOH, THF, H20, så surgjøring.

Et halofenolderivat som 4-bromfenol (II-1), konverteres til et egnet beskyttet derivat, for eksempel 4-brom-l-(triisopropylsilyloksy)benzen (II-2). Den beskyttende gruppe for fenolen må være kompatibel med den etterfølgende kjemi og må også kunne fjernes selektivt når det er ønskelig. Metoder for beskyttelse av fenoler er beskrevet i standard-referansebind som Greene i "Protective Groups in Organic Synthesis" (publisert av Wiley-Interscience). Forbindelsen II-2 reagerer med metyl-3-(benzyloksykarbonyl)-3-butenoat i en Heck-typereaksjon (se Heck, "Org. Reactions", 1982,27, 345) for å gi II-3. Reaksjonen medieres av paliadium(0)-spesies og gjennomføres generelt i et inert oppløsningsmiddel som CH3CN, propionitril eller toluen, i nærvær av en egnet syrefanger som trietylamin (Et3N) eller diisopropyletylamin ((i-Pr)2NEt). Typiske kilder for palladium(0)spesies er palladium(H)acetat (Pd(OAc)2) og palladium(H)klorid (PdCl2) og ofte er fosfinligander som trifenylfosfin (PPI13) eller tri-orto-tolylfosfin (P(tol)3), inkludert. Den a,P-umettede ester II-3 reduseres til den mettede forbindelse II-4 ved omsetning med hydrogengass i nærvær av en egnet katalysator, fortrinnsvis palladium-metall på aktivert karbon (Pd/C) i et inert oppløsningsmiddel, generelt MeOH, EtOH, EtOAc eller blandinger derav. Karboksylsyren av II-4 omdannes til en aktivert form for eksempel ved bruk av EDC og HOBt, SOCl2 eller l,l'-karbonyldiimidazol (CDI) og den aktiverte form omsettes deretter med et egnet amin, for eksempel serinbenzylester, i et egnet oppløsningsmiddel som DMF, for å gi II-5. Avhengig av hvorvidt syrenøytraliser-ing er nødvendig, kan en tilsatt base, som trietylamin (Et3N), diisopropyletylamin ((i-Pr)2NEt) eller pyridin, anvendes. Mange ytterligere metoder for konvertering av en karboksylsyre til et amid er vel kjent og kan finnes i standardverk som "Compendium av Organic Synthetic Methods", vol. I-VI (publisert av Wiley-Interscience) eller Bodansky, "The Practice av Peptide Synthesis" (publisert av Springer-Verlag). II-5 konverteres så om til oksazolderivatet II-7. Flere metoder er kjent for omdanning av amidoalkoholer til oksazoler (Meyers, "Tetrahedron", 1994, 50,2297-2360; Wipf, "J. Org. Chem.", 1993, 58,3604-3606). For eksempel kan amidoalkoholen II-5 omdannes først til oksazolinet II-6. Denne transformering gjennomføres generelt under dehydratiserende betingelser, som omsetning med Burgess-reagens i THF. Oksazolin II-6 oksideres så til oksazol II-7 ved bruk for eksempel av bromtriklormetan og DBU i CH2C12 (Williams, "Tetrahedron Letters", 1997, 38, 331-334) eller CuBr2 og DBU i et egnet oppløsningsmiddel som EtOAc/CHCU eller CH2C12 (Barrish, "J. Org. Chem.", 1993, 58„ 4494-4496). Fjerning av den silylbeskyttende gruppe under standard fluoridbetingelser (se Greene ovenfor) gir fenolen II-8 som omdannes til tert.-butyloksykarbonatderivatet II-9 ved bruk av di-tert.-butyldikarbonat i nærvær av en base, generelt pyridin, i et polart, nøytralt oppløsningsmiddel som THF. Denne nye beskyttende gruppe velges som beskrevet ovenfor. Forbindelse II-9 konverteres til karboksylsyrederivatet 11-10 ved hydrogenering som beskrevet ovenfor, og 11-10 konverteres til amidet II-11 i henhold til den generelle prosedyre ifølge Carpino og Ayman i "J. Am. Chem. Soc", 1995,117, 5401-5402. Under disse betingelser omsettes karboksylsyren 11-10 med et egnet amin, for eksempel N-metylanilin, i nærvær av bis(tetrametylen)fluorformamidiniumheksafluorfosfat (BPFFH) og en egnet base, generelt Et3N, (i-Pr)2NEt, pyridin eller blandinger derav, i et polart, nøytralt oppløsningsmiddel som DMF. Den tert-butyloksykarbamatbeskyttende gruppe fjernes under standard sure betingelser, se Greene ovenfor, og den resulterende fenol 11-12 konverteres til U-l4 ved de metoder som er beksrevet under skjema I. (a) EtOH, refluks; (b) 4-(benzyloksy)benzaldehyd, NaOEt, EtOH; (c) A1203, NaOCl, CH3CN; (d) Et3SiH, BF3OEt2, CH2C12; (e) n-BujNF, THF; (f) (EtO)2P(=0)CH2C02Et, NaH, THF, refluks; (g) Mg, MeOH; (h) BF3-OEt2, EtSH; (i) 6-(metylamino)-2-pyridyl-etanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (j) LiOH, THF, H20, så surgjøring.

Tiazolderivatet ni-3 fremstilles ved kondensering av 2-cyanoacetamid (III-l) og 3-brom-l,l,l-tirfluoraceton (III-2) i tilbakeløpskokende etanol, ved egnet modifisering av prosedyrene ifølge Schaefer og Gewald i "J. Prakt. Chem.", 1974,316,684-692, for fremstilling av 4-fenyl-2-(cyanometyl)tiazol. Aldolkondensering av ni-3 med et egnet substituert benzaldehydderivat, for eksempel 4-(benzyloksy)benzaldehyd, gir III-4. Denne reaksjon katalyseres med en egnet base, fortrinnsvis natriumetoksid, og gjen-nomføres i et polart oppløsningsmiddel, generelt etanol. Epoksidering av III-4 for å gi ni-5, gjennomføres med natriumhypokloritt i nærvær av nøytralt aluminiumoksid i henhold til den generelle metode ifølge Foucaud i "Synthesis", 1987,9, 854-856. Andre velkjente epoksideringsbetingelser som mCPBA, basisk hydrogenperoksid eller basisk tert-butylhydroperoksid, kan også benyttes så lenge betingelsene er kompatible med substratets funksjonalitet. Ved eksponering til trietylsilan i nærvær av en egnet Lewissyre, som BF3-OEt2, eller en egnet protisk syre som TFA eller HC1, blir epoksidringen i III-5 reduktivt åpnet på en meget regioselektiv måte for å gi ketonet III-6 sammen med det tilsvarende trimetylsilylcyanohydrin av III-6. Dette cyanohydrin konverteres hensiktsmessig til keton IJI-6 ved eksponering til tetrabutylammoniumfluorid i et egnet oppløsningsmiddel som THF. Dette keton reagerer i en Wittig-type reaksjon med trietylfosfonoacetat i nærvær av en egnet base, for eksempel LiN(TMS)2 eller NaH i et polart, aprotisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis THF, for å gi den a,P-umettede ester ni-7 som en blanding av olefiniske isomerer. Ved omsetning med magnesiummetall i MeOH reduseres olefinet III-7 selektivt og gir det mettede derivat ni-8. Etylesteren konverteres til en metylester under disse betingelser. Fjerning av benzylgruppen gjen-nomføres med etantiol og BF3OEt2 for å gi fenolen IIT-9, som konverteres til JJI-10 i henhold til de metodene som er beskrevet i skjema I. (a) BnCl, K2C03, aceton; (b) 5-metyltiazol, n-BuLi, THF; (c) (EtO)2P(=0)CH2C02Et, NaH, THF; (d) Mg, MeOH; (e) BF3OEt2, EtSH; (f) 6-(metylamino)-2-pyridyletanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (g) LiOH, THF, H20, så surgjøring.

Fenolgruppen av kommersielt tilgjengelig metyl-4-hydroksyfenylacetat (V-l) er beskyttet med en egnet beskyttende gruppe, for eksempel metyleter, en benzyleter eller en triisopropylsilyleter. Beskyttelse av fenoler er vel kjente for fagmannen og representative beskyttende grupper er beskrevet i standard referansebind som Greene i "Protective Groups in Organic Synthesis", publisert av Wiley-Interscience. Den resulterende forbindelse (IV-2) reagerer med egnede Grignard- eller organolitiumreagenser og gir ketoner. For eksempel reagerer 2-litio-5-metyltiazol, fremstilt fra 5-metyltiazol og n-butyllitium, med IV-2 i et eterisk oppløsningsmiddel, som THF eller DME, og gir ketonderivåtet IV-3. Dette keton konverteres til IV-6 i henhold til de metoder som er beskrevet i skjema III. (a) TBDMSCI, KCN, Znl2, CH3CN; (b) LD A, THF, så 4-benzyloksybenzylklorid; (c) TBAF, THF; (d) (EtO)2P(=0)CH2C02Et, NaH, THF; (e) H2, Pd/C, EtOH; (f) 6-(metyl-amino)-2-pyirdyletanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (g) LiOH, THF, H20, så surgjøring.

Et valgt aromatisk aldehyd, for eksempel 3-pyridinkarboksaldehyd (V-l), konverteres til et silylbeskyttet cyanohydrin, som V-2, ved omsetning med cyanidion i nærvær av et egnet silylhalogenid som trimetylsilylklorid (TMSC1), triisopropylsilylklorid (TIPSCl) eller tert.-butyldimetylsilylklorid (TBDMSCI eller TBSC1). Typiske kilder for cyanid-ioner er kaliumcyanid (KCN), natriumcyanid (NaCN) og tetrabutylammoniumcyanid (BU4NCN). Reaksjonen gjennomføres hyppig i nærvær av en katalytisk mengde av en Lewissyre, generelt Znl2, og et polart, aprotisk oppløsningsmiddel som acetonitril (CH3CN), er foretrukket. Andre beskyttede cyanohydriner som et etoksyetylbeskyttet cyanohydrin, kan benyttes så lenge den beskyttende gruppe er kompatibel med den etterfølgende kjemi og selektivt kan fjernes etter ønske. En diskusjon av beskyttende grupper kan finnes i standardverk som Greene i "Protective Groups in Organic Synthesis", utgitt av Wiley-Interscience. Forbindelse V-2 C-alkyleres med et egnet benzylhalogenid, for eksempel 4-benzyloksybenzylklorid, for å gi V-3. Reaksjonen involverer en første deprotonering for å gi et intermediatanion som ikke isoleres, men omsettes in situ med alkyleringsmidlet. Typiske baser for denne type reaksjon er litium-diisopropylamid (LDA) og litiumheksametyldisilazid (LiN(TMS)2), og polare, aprotiske oppløsningsmidler, som THF og DME, er foretrukket. TBS-cyanohydrinet av V-3 konverteres hensiktsmessig til ketonet V-4 ved omsetning med tetrabutylammoniumfluorid (TBAF). En totrinnsprosedyre kan også benyttes for å gjennomføre denne transformering. For eksempel kan den silylbeskyttende gruppe på V-3 fjernes under sure betingelser, for eksempel omsetning med HF, for å gi et cyanohydrin som kan konverteres til ketonet V-4 ved omsetning med en egnet base. Forbindelsen V-4 konverteres til den cc,P-umettede ester V-5 via den vel kjente Wittig-reaksjon. Karakteristisk gjennomføres reaksjonen ved bruk av trietylfosfonoacetat i nærvær av en egnet base, generelt natriumhydrid (NaH) eller LiN(TMS)2, i et aprotisk oppløsningsmiddel som toluen, THF eller blandinger derav. Reduksjon av olefingruppen av V-5 gjennomføres optimalt ved hydrogenering i nærvær av en palladiumkatalysator, for eksempel palladium på aktivert trekull, i et egnet oppløsningsmiddel som EtOAc, MeOH, EtOH, iPrOH eller blandinger derav. Under disse betingelser fjernes også den benzylbeskyttende gruppe på fenolen. Den resulterende fenol V-6 omsettes med 6-(metylamino)-2-pyridyletanol i en Mitsunobutype koblingsreaksjon ("Organic Reactions", 1992,42, 335-656, "Synthesis", 1981,1-18) for å gi V-7. Reaksjonen medieres ved komplekset som dannes mellom azodikarboksylatdiesteren som dietylazodikarboksylat eller diisopropylazodikarboksylat og trifenylfosfin, og gjennomføres typisk i et aprotisk oppløsningsmiddel som THF, CH2CI2 eller DMF. Etylesteren av V-7 hydrolyseres ved bruk av vandig base som LiOH eller NaOH i vandig dioksan, THF, metanol eller etanol, og intermediatkarboksylatsaltet surgjøres med en egnet syre som TFA eller HC1, for å gi karboksylsyren V-8. Hvis ønskelig kan intermediatkarboksylatsaltet isoleres. I tillegg kan egnede salter av karboksylsyren eller aminet fremstilles ved metoder som er kjente for fagmannen.

(a) akryloylklorid, (i-Pr)2NEt, CuCl, CH2C12; (b) 3-brompyridin, Pd(OAc)2, P(tol)3, (i-Pr)2NEt, DMF; (c) 4-metoksybenzylmagnesiumklorid, Znl2, CuBrDMS, THF, toluen; (d) NaOEt, THF; (e) A1C13, EtSH, CH2C12; (f) 6-(metylamino)-2-pyridyletanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (g) NaOH, dioksan, H20, så surgjøring.

Kommersielt tilgjengelig (4S,5R)-l,5-dimetyl-4-fenyl-2-imidazolidinon (VI-1) reagerer med et egnet a,p-umettet syreklorid som akryloylklorid, for å gi imidet VI-2. Reaksjonen medieres av en egnet base, karakteristisk trietylamin (Et3N) eller diisopropyletylamin ((i-Pr)2NEt), og gjennomføres i nærvær av en katalytisk mengde kobber(I)halo-genid, for eksempel kobber(I)klorid. Et nøytralt oppløsningsmiddel som CH2C12, er foretrukket. Forbindelse VI-2 reagerer med et egnet arylhalogenid som 3-brompyridin i en Heck-type reaksjon (se Heck, "Org. Reactions", 1982,27, 345), for å gi VI-3. Reaksjonen medieres av palladium(0)spesies og gjennomføres generelt i et inert oppløsnings-middel som CH3CN, propionitril, toluen eller DMF, i nærvær av en egnet syrefanger som trietylamin (Et3N) eller diisopropyletylamin ((iPr^NEt). Typiske kilder for palladium(0)spesies er palladium(H)acetat (Pd(OAc)2) og palladium(II)klorid (PdCh), og ofte inkluderes fosfinligander som trifenylfosfin (PPli3) eller tri-orto-tolylfosfin (P(tol)3). Forbindelse VI-3 reagerer med en organokobberforbindelse i en 1,4-addisjons-reaksjon for å gi konjugataddisjonsproduktet VI-4 (se Melnyk, O.; Stephan, E.; Pourcelot, G.; Cresson, P., "Tetrahedron", 1992,48, 841-850; Bongini, A.; Cardillo, G.; Mingardi, A.; Tomasini, C, "Tetrahedron Asymmetry", 1996, 7,1457-1466; van Heerden, P. S.; Bezuidenhoudt, B. C. B.; Ferreira, D., "Tetrahedron Lett.", 1997, 38, 1821-1824. For gjennomgåelse av kobberorganiske reaksjoner se Posner, G., "Organic Reactions", 1972,19,1-113; Lipshutz, B., "Organic Reactions", 1992,41,135-631). Generering av den kobberorganiske forbindelse kan gjennomføres ved å sette en litium-organisk eller magnesiumorganisk forbindelse, for eksempel 4-metoksybenzylmagnesiumklorid, til en kobber(I)-kilde som CuCl, CuBr • DMS eller Cul, i et inert oppløsningsmiddel som Et20, THF, DME, toluen eller blandinger derav. Diastereo-selektiviteten for reaksjonen kan forbedres ved hjelp av visse Lewissyrer, som MgBr2, Bu2BOTf eller ZnL;. Den kirale variant av VI-4 fjernes hensiktsmessig ved etanolyse under basiske betingelser. For eksempel gir behandling av VJI-4 med natriumetoksid i THF, VI-5. Metyleteren av VI-5 kan spaltes med bortribromid (BBr3) i et inert oppløsn-ingsmiddel, helst CH2CI2, eller med etantiol (EtSH) og aluminiumtriklorid (AICI3) i et inert oppløsningsmiddel som CH2CI2, for å gi fenolen VI-6. Andre brukbare metoder for å fjerne metyleterbeskyttende grupper er beskrevet i standardreferansevolumer (se skjema V). Fenolen VI-6 konverteres til VI-8 som beskrevet i skjema V.

Amidkoblingsreagenser slik de her benyttes, angir reagenser som kan benyttes for å danne peptidbindinger. Typiske koblingsmetoder benytter karbodiimider, aktiverte anhydrider og estere og acylhalogenider. Reagenser som EDC, DCC, DPPA, BOP-reagensen, HOBt, N-hydroksysuksinimid og oksalylklorid, er typiske.

Koblingsmetoder for å danne peptidbindinger er generelt vel kjente. Koblingsmetodene for peptidsyntese som generelt inngitt av Bodansky et al., "THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS", Springer-Verlag, Berlin, 1984, Ali et al. i "J. Med. Chem.", 29, 984 (1986) og "J. Med. Chem.", 30,2291 (1987), er generelt illustrerende for teknologien.

Karakteristisk blir aminet eller anilin koblet via sin frie aminogruppe til et egnet karboksylsyresubstrat ved bruk av et egnet karbodiimidkoblingsmiddel, som N,N'-disykloheksylkarbodiimid (DCC), eventuelt i nærvær av katalysatorer som 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) og dimetylaminopyridin (DMAP). Andre metoder som dannelse av aktiverte estere, anhydrider eller syrehalogenider av den frie karboksyl av et egnet beskyttet syresubstrat og den etterfølgende omsetning med det frie amin eller et egnet beskyttet amin, eventuelt i nærvær av en base, kan også benyttes. For eksempel blir en beskyttet Boc-aminosyre eller Cbz-amidinobenzosyre behandlet i et vannfritt opp-løsningsmiddel som metylenklorid eller tetrahydrofuran (THF) i nærvær av en base, som N-metylmorfolin, DMAP eller et trialkylamin med isobutylklorformiat for å danne det "aktiverte anhydrid" som deretter omsettes med det frie amin eller en andre beskyttet aminosyre eller et anilin.

Brukbare mellomprodukter for fremstilling av formel (I)-forbindelser, der R er et benzimidazol, er beskrevet hos Nestor et al. i "J. Med. Chem.", 1984,27, 320. Representative metoder for fremstilling av benzimidazolforbindelser som kan benyttes som mellomprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse, er også vanlige i teknikken og kan for eksempel finnes i EP-A 0 381 033.

Syreaddisjonssalter av forbindelsene fremstilles på standard måte i et egnet opp-løsningsmiddel fra opphavsforbindelsen og et overskudd av en syre som salt-, hydro-brom-, hydrofluor-, svovel-, fosfor-, eddik-, trifluoreddik-, eple-, rav- eller metansulfon-syre. Visse av forbindelsene danner indre salter eller zwitterioner som kan være akseptable. Kationiske salter fremstilles ved å behandle opphavsforbindelsen med et overskudd av en alkalisk reagens som hydroksid, karbonat eller alkoksid, inneholdende det egnede kation; eller med et egnet organisk amin. Kationer som Li<+>, Na<+>, K<+>, Ca"<4-1->, Mg"<1-1>" og NH4<+> er spesifikke eksempler på kationer som er til stede i farmasøytisk akseptable salter.

Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske preparater som omfatter en forbindelse ifølge formel (I) og en farmasøytisk akseptabel bærer. I henhold til dette kan forbindelsene med formel (I) benyttes ved fremstilling av et medikament. Farmasøytiske preparater av forbindelsene med formel (I), fremstilt som beskrevet ovenfor, kan formuleres i oppløsninger eller lyofiliserte pulvere for parenteral administrering. Pulvere kan rekonstitueres ved tilsetning av egnede fortynnere eller andre farmasøytisk akseptable bærere før bruk. Flytende formuleringer kan være bufrede, isotoniske, vandige oppløsninger. Eksempler på egnede fortynnere er vanlig isotonisk saltoppløsning, standard 5 % dekstrose i vann eller bufret natrium- eller ammoniumacetatoppløsning. Slike formuleringer er spesielt egnet for parenteral administrering, men kan også benyttes for oral administrering eller inneholdes i en dosert doseringsinhalator eller forstøver for innblåsing. Det kan videre være ønskelig å tilsette drøyemidler som polyvinylpyrrolidon, gelatin, hydroksycellulose, akasie, polyetylenglykol, mannitol, natriumklorid eller natriumcitrat.

Alternativt kan disse forbindelser innkapsles, tabletteres eller fremstilles i en emulsjon eller en sirup for oral administrering. Farmasøytisk akseptable, faste eller flytende bærere kan tilsettes for å forbedre eller stabilisere forbindelsen eller for å lette fremstilling av preparatene. Faste bærere inkluderer stivelse, laktose, kalsiumsulfatdihydrat, terra alba, magnesiumstearat eller stearinsyre, talkum, pektin, akasie, agar eller gelatin. Flytende bærere inkluderer sirup, jordnøtt- eller olivenolje, saltoppløsning og vann. Bæreren kan også inkludere et materiale for opprettholdt frigivning som glyserylmono-stearat eller glyseryldistearat, alene eller med en voks. Mengden fast bærer varierer, men vil fortrinnsvis være mellom rundt 20 mg og rundt 1 g pr. doseringsenhet. De farmasøytiske preparater fremstilles ved å følge konvensjonelle teknikker innen farmasien som involverer oppmaling, blanding, granulering og komprimering, hvis dette er nødvendig for tablettformer; eller oppmaling, blanding og fylling for hard-gelatinkapselformer. Når en flytende bærer benyttes vil preparatet vare i form av en sirup, eliksir, emulsjon eller en vandig eller ikke-vandig suspensjon. En slik flytende formulering kan administreres direkte pr. oralt eller fylles i en myk gelatinkapsel.

For rektal administrering kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen kombineres med drøye-midler som kakaosmør, glyserol, gelatin eller polyetylenglykoler og formes til et suppositorium.

Forbindelsene som her er beskrevet, er antagonister av vitronektinreseptorer og er brukbare for behandling av sykdommer der den underliggende patologi skyldes en ligand eller celle som interagerer med vitronektinreseptoren. For eksempel er disse forbindelser brukbare for behandling av sykdommer der tap av beinmatriksen skaper patologi. Således er de her beskrevne forbindelser brukbare for behandling av osteoporose, hyperparatyroidisme, Pagets sykdom, hyperkalsemi av malignans, osteolytiske lesjoner dannet ved beinmetastase, beintap på grunn av immobilisering eller seks-hormonmangel. Forbindelsene antas også å være brukbare som antitumor-, antiangiogeniske, antiinflammatoriske eller antimetastatiske midler og kan være brukbare ved behandling av aterosklerose og restenose.

Forbindelsene administreres enten oralt eller parenteralt til en pasient, enten på en slik måte at konsentrasjonen av medikament er tilstrekkelig til å inhibere beinresorpsjon, eller en annen slik indikasjon. Det farmasøytiske preparat inneholdende forbindelsen, administreres i en oral dose på mellom 0,1 og rundt 50 mg/kg på en måte som er konsistent med pasientens tilstand. Fortrinnsvis er den orale dose rundt 0,5 til rundt 20 mg/kg. For akutt terapi er parenteral administrering foretrukket. En intravenøs infusjon av peptidet i 5 % dekstrose i vann eller normal saltoppløsning, eller en tilsvarende formulering med egnede drøyemidler, er mest effektiv, selv om en intramuskulær bolus-injeksjon også er brukbar. Karakteristisk vil den parenterale dose være rundt 0,01 til rundt 100 mg/kg og fortrinnsvis mellom 0,1 og 20 mg/kg. Forbindelsene administreres én til fire ganger daglig i et nivå for å gi en total daglig dose på rundt 0,4 til rundt 400 mg/kg/dag. Det nøyaktige nivå og metoden ved hvilken forbindelsene administreres, bestemmes lett av fagmannen ved å sammenligne blodnivået av middel med konsentrasjonen som er nødvendig for å ha en terapeutisk effekt.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen slik det er angitt i de selvstendige kravene 10-15 og krav 17.

Det farmasøytiske preparat kan formuleres med både forbindelsen med formel (I) og det antineoplastiske middel i samme beholder, men formulering i forskjellige beholdere er foretrukket. Når begge midler tilveiebringes i oppløsningsform kan de inneholdes i et infusjons/injeksjonssystem for samtidig administrering eller i et tandemarrangement.

For hensiktsmessig administrering av forbindelsen med formel (I) og det antineoplastiske middel på samme eller forskjellige tidspunkter, fremstilles det et sett som omfatter, i en enkelt beholder som en boks, kartong eller en annen beholder, individuelle flasker, poser, ampuller eller andre beholdere, hver med en effektiv mengde av forbindelsen med formel (I) for parenteral administrering som beskrevet ovenfor, og en effektiv mengde av det antineoplastiske middel for parenteral administrering som beskrevet ovenfor. Et slikt sett kan for eksempel omfatte begge farmasøytiske midler i separate beholdere eller i samme beholder, eventuelt som lyofiliserte plugger og beholdere for oppløsninger for rekonstituering. En variasjon av dette er å gjenarbeide oppløsningen for rekonstituering og den lyofiliserte plugg i to kammere av en enkelt beholder, som så kan bringes til blanding før bruk. Med et slikt arrangement kan det antineoplastiske middel og forbindelsen ifølge oppfinnelsen pakkes separat som i to beholdere eller lyofilisert sammen som et pulver og tilveiebrakt i en enkelt beholder.

Når begge midler tilveiebringes i oppløsningsform kan de inneholdes i et infusjons/- injeksjonssystem for samtidig administrering i et tandemarrangement. For eksempel kan forbindelsen med formel (I) foreligge i en intravenøs injiserbar form, eller en infusjonspose forbundet i serie via rørledninger til det antineoplastiske middel i en andre infusjonspose. Ved bruk av et slikt system kan en pasient motta en første bolustype-injeksjon eller infusjon av forbindelsen med formel (I), fulgt av en infusjon av det antineoplastiske middel.

Forbindelsene kan testes i én av et antall biologiske analyser for å bestemme konsentrasjonen av forbindelser som er nødvendige for en gitt farmakologisk effekt.

Inhibering av vitronektinbinding

Fastfase [<3>H]-SK&F-107260-binding til a v(33:

Human placenta- eller humanplate a vP3 (0,1-0,3 mg/ml) i buffer T (inneholdende

2 mM CaCl2 og 1 % oktylglukosid) ble fortynnet med buffer T inneholdende 1 mM CaCl2,1 mM MnCl2,1 mM MgCl2 (buffer A) og 0,05 % NaN3, og så umiddelbart satt til 96-brønners ELISA-plater (Corning, New York, NY) i en mengde av 0,1 ml pr. brønn, idet 0,1 til 0,2 ug a vP3 ble satt til pr. brønn. Platene ble inkubert over natten ved 4 °C. På forsøkstidspunktet ble brønnene vasket én gang med buffer A og inkubert med 0,1 ml 3,5 % bovinserumalbumin i samme buffer i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble brønnene aspirert fullstendig og vasket to ganger med 0,2 ml buffer A.

Forbindelser ble oppløst i 100 % DMSO for å gi en 2 mM forrådsoppløsning som ble fortynnet med bindende buffer [15 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2,1 mM MgCl2] til en endelig forbindelseskonsentrasjon på 100 uM. Denne oppløsning fortynnes så med den nødvendige forbindelsessluttkonsentrasjon. Forskjellige konsentrasjoner av ikke-merkede antagonister (0,001-100 uM) ble satt til brønnen i triplikater, fulgt av tilsetning av 5,0 nM [<3>H]-SK&F-107260

(65-86 Ci/mmol).

Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble brønnene aspirert fullstendig og vasket én gang med 0,2 ml iskald buffer A i en brønn-til-brønn-modus. Reseptorene ble oppløseliggjort med 0,1 ml 1 % SDS og bindingen [<3>H]-SK&F-107260 ble bestemt ved væskescintillasjonstelling ved tilsetning av 3 ml Ready Safe i en Beckman LS Liquid Scintillation Counter, med 40 %-ig effektivitet. Ikke-spesifikk binding av [<3>H]-SK&F-107260 ble bestemt i nærvær av 2 uM SK&F-107260 og var konsistent mindre enn 1 % av den totale radioligandinput. IC50 (konsentrasjonen av antagonisten som inhiberer 50 % binding av [<3>H]-SK&F-107260) ble bestemt ved en ikke-lineær minste kvadratskiirvetilpasningsrutine som var modifisert fra LUNDON-2-programmet. K; (dissosiasjonskonstanten for antagonisten) ble beregnet i henhold til ligningen: Kj = ICso/(l + L/Kd), der L og K<j var konsentrasjonen henholdsvis dissosiasjonskonstanten for [<3>H]-SK&F-107260.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen inhiberer vitronektinbinding til SK&F 107260 i konsentrasjonsområdet rundt 0,060 til rundt 0,0005 mikomolar.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen er også testet for in vitro og in vivo-beinresorpsjon i analyser som er standard i teknikken for evaluering av inhibering av beindannelse som den gropdannelsesanalyse som er beskrevet i EP 528 587 og som også kan gjennom-føres ved bruk av humanosteoklaster i stedet for rotteosteoklaster, og den ovarekto-miserte rottemodell som beskrives av Wronski et al., "Cells and Materials", 1991, sup. 1, 69-74.

Vaskulær glattmuskelcellemigreringsanalyse

Rotte- eller humanaortaglattmuskelceller ble benyttet. Cellemigreringen ble overvåket i et Transwell cellekulturkammer ved bruk av en polykarbonatmembran med porer på

8 um (Costar). Den nedre overflate av filteret var belagt med vitronektin. Cellene ble suspendert i DMEM supplert med 0,2 % bovint serumalbumin i en konsentrasjon av 2,5 til 5,0 x IO6 celler/ml, og ble forbehandlet med testforbindelsen i forskjellige konsentrasjoner i 20 min ved 20 °C. Oppløsningsmidlet alene ble benyttet som kontroll. 0,2 ml av cellesuspensjonen ble anbrakt i det øvre rom av kammeret. Det nedre rom inneholdt 0,6 ml DMEM supplert med 0,2 % bovint serumalbumin. Inkuberingen ble gjennomført ved 37 °C i en atmosfære av 95 % luft/5 % CO2 i 24 timer. Etter inkubering ble de ikke-migrerte celler på den øvre overflate av filteret fjernet ved mild skraping. Filteret ble så fiksert i metanol og farget med 20 % Giemsa-flekking. Migreringen ble målt enten ved a) å telle antallet celler som hadde migrert til den nedre overfalte av filteret eller ved b) å ekstrahere de fargede celler med 10 %-ig eddiksyre, fulgt av bestemmelse av absor-bansen ved 600 nM.

Tyroparatyroidektomisert rottemodell

Hver forsøksgruppe bestod av 5 til 6 voksne Sprague-Dawley-hannrotter med kropps-vekt 250-400 g. Rottene ble tyroparatyroidektomisert (av leverandøren, Taconic Farms) 7 dager før bruk. Alle dyr fikk en erstatningsdose av tyroksin hver 3. dag. Ved mottak av rottene ble nivåene av sirkulerende ionisert kalsium målt i fullblod umiddelbart etter tapping ved halevenipunktur til hepariniserte rør. Rotter tas med hvis det ioniserte Ca-nivå (målt med en Ciba-Corning modell 634 kalsium pH-analyser) er < 1,2 mM/1. Hver rotte tilpasses med et innlagt venøst og arterielt kateter for avlevering av testmaterialet og for blodprøving. Rottene settes så på en diett av kalsiumfri næring og deionisert vann. Basislinje Ca-nivåer måles og hver rotte gis enten kontrollbærer eller human-paratyroidhormon 1-34 peptid (hPTHl-34, dose 1,25 ug/kg/t i saltoppløsning/0,1 % bovint serumalbumin, Bachem, Ca) eller en blanding av hPTHl-34 og testmateriale, ved kontinuerlig intravenøs infusjon via venekateteret ved bruk av en ekstern sprøyte-pumpe. Den kalsemiske respons for hver rotte måles i totimers intervaller under infu-sjonsperioden på 6 til 8 timer.

Human osteoklastresorpsjons- og adhesjonsanalyser

Gropresorpsjon og adhesjonsanalyse er utviklet og standardisert ved bruk av ikke-humane osteoklaster avledet fra osteoklastomavev. Analyse 1 ble utviklet for måling av osteoklastgropvolumer ved laserkonfokalmikroskopi. Analyse 2 ble utviklet som en høyere gjennomgangsskjerm hvori kollagenfragmenter (frigitt under resorpsjon) måles ved kompetitiv ELISA.

Analyse 1 (ved bruk av laserkonfokal mikroskopi)

1. Aliquoter av humane osteoklastomaavledede cellesuspensjoner fjernes fra lagring under flytende nitrogen, oppvarmes hurtig til 37 °C og vaskes én gang i RPMI-1640 medium ved sentrifugering (1 000 omdr./min i 5 min ved 4 °C). 2. Mediet aspireres og erstattes med murin-anti-HLA-DR-antistoff og så fortynnet 1:3 i RPMI-1640 medium. Suspensjonen inkuberes i 30 min på is og blandes hyppig. 3. Cellene vaskes 2 ganger med kald RPMI-1640, fulgt av sentrifugering ved 1 000 omdrVmin i 5 min ved 4 °C, og cellene overføres så til et sterilt 15 ml sentrifugerar. Antallet mononukleære celler telles i et forbedret Neubauer tellekammer. 4. Tilstrekkelig mange magnetiske kuler (5 pr. mononukleaer celle), belagt med geite-anti-muse IgG (Dynal, Great Neck, NY), fjernes fra forrådsflaskene og anbringes i 5 ml friskt medium (dette vasker bort det toksiske azidpreservativ). Mediet fjernes ved immobilisering av kulene på en magnet og erstattes med frisk medium. 5. Kulene blandes med cellene og suspensjonen inkuberes i 30 min på is. Suspensjonen blandes hyppig. 6. De kulebelagte celler immobiliseres på en magnet og de gjenværende celler (osteoklastrik fraksjon) dekanteres til et sterilt 50 ml sentrifugerar. 7. Friskt medium settes til de kulebelagte celler for å fjerne fangede osteoklaster. Denne vaskeprosess gjentas ti ganger. De kulebelagte celler kasseres. 8. De funksjonelle osteoklaster telles i et tellekammer ved bruk av fluorescein-diacetat for å merke levende celler. En storborings plastikkengangspasteurpipette benyttes for å bringe prøven til kammeret. 9. Osteoklastene pelletiseres ved sentrifugering og densiteten justeres til det egnede antall i EMEM-medium (antallet osteoklaster er varierbar fra tumor til tumor), supplert med 10 % føtalt kalveserum og 1,7 g/liter natriumbikarbonat. 10. 3 ml aliquoter av cellesuspensjonen (pr. forbindelsesbehandling) dekanteres til

15 ml sentrifugerar. Celle pelletiseres ved sentrifugering.

11. Til hvert rør settes 3 ml av den egnede forbindelsesbehandling (fortynnet til

50 uM i EMEM-medium). Også inkludert er egnede bærerkontroller, en positiv kontroll (anti-virfonektimeseptormurinmonoklonal antistoff [87 MEM1] fortynnet til 100 ug/ml) og en isotypekontroll (IgG2a fortynnet til 100 ug/ml). Prøvene inkuberes ved 37 °C i 30 min. 12. 0,5 ml aliquoter av cellene ympes på sterile dentinskiver i en 48-brønners plate og inkuberes ved 37 °C i 2 timer. Hver behandling screenes i kvadruplikat. 13. Skivene vaskes i seks bytter av varm PBS (10 ml pr. brønn i en 6-brønners plate) og anbringes så i friskt medium inneholdende forbindelsen som testes eller kontrollprøver. Prøvene inkuberes ved 37 °C i 48 timer. Tartratresistent sur fosfatase(TRAP)prosedyre (selektiv farging for celler av osteo-klastlinjen) 1. Beinskivene inneholdende de tilfestede osteoklaster, vaskes i fosfatbufret salt-oppløsning og fikseres i 2 % glutaraldehyd (i 0,2 M natriumkakodylat) i 5 min. 2. De vaskes så i vann og inkuberes i 4 min i TRAP-buffer ved 37 °C (0,5 mg/ml naftol AS-BI-fosfat oppløst i N,N-dimetylformamid og blandet med 0,25 M sitratbuffer (pH 4,5), inneholdende 10 mM natriumtartrat. 3. Etter en vasking i kaldt vann nedsenkes skivene i kald acetatbuffer (0,1 M, pH 6,2) inneholdende 1 mg/ml fast granatrødt og inkuberes ved 4 °C i 4 min.

4. Overskytende buffer aspireres og skivene lufttørkes etter en vask i vann.

5. De TRAP-positive osteoklaster (mursteinsrødt/purpurfarget presipitat) telles ved lysfeltmikroskopi og fjernes så fra overflaten av dentinet ved sonikering. 6. Gropvolumene bestemmes ved bruk av et Nikon/Lasertec ILM21W konfokalt mikroskop.

Analyse 2 (ved bruk av en ELISA-utlesning)

Humanosteoklastene anrikes og repareres for forbindelsesscreening som beskrevet i de første 9 trinn i analyse 1. For klarhets skyld repeteres disse trinn nedenfor.

Aliquoter av humane osteoklastomaavledede cellesuspensjoner fjernes fra lagring under flytende nitrogen, oppvarmes hurtig til 37 °C og vaskes én gang i RPMI-1640 medium ved sentrifugering (1 000 omdr./min i 5 min ved 4 °C).

Mediet aspireres og erstattes med murin-anti-HLA-DR-antistoff og så fortynnet 1:3 i RPMI-1640 medium. Suspensjonen inkuberes i 30 min på is og blandes hyppig.

Cellene vaskes 2 ganger med kald RPMI-1640, fulgt av sentrifugering ved 1 000 omdr./min i 5 min ved 4 °C, og cellene overføres så til et sterilt 15 ml

sentrifugerør. Antallet mononukleære celler telles i et forbedret Neubauer tellekammer.

Tilstrekkelig mange magnetiske kuler (5 pr. mononukleær celle), belagt med geite-anti-muse IgG (Dynal, Great Neck, NY), fjernes fra forrådsflaskene og anbringes i 5 ml friskt medium (dette vasker bort det toksiske azidpreservativ). Mediet fjernes ved immobilisering av kulene på en magnet og erstattes med frisk medium.

Kulene blandes med cellene og suspensjonen inkuberes i 30 min på is. Suspensjonen blandes hyppig.

De kulebelagte celler immobiliseres på en magnet og de gjenværende celler

(osteoklastrik fraksjon) dekanteres til et sterilt 50 ml sentrifugerør.

Friskt medium settes til de kulebelagte celler for å fjerne fangede osteoklaster.

Denne vaskeprosess gjentas ti ganger. De kulebelagte celler kasseres.

De funksjonelle osteoklaster telles i et tellekammer ved bruk av fluorescein-diacetat for å merke levende celler. En storborings plastikkengangspasteurpipette benyttes for å bringe prøven til kammeret.

Osteoklastene pelletiseres ved sentrifugering og densiteten justeres til det egnede antall i EMEM-medium (antallet osteoklaster er varierbar fra tumor til tumor), supplert med 10 % føtalt kalveserum og 1,7 g/liter natriumbikarbonat.

I motsetning til metoden som beskrevet ovenfor i analyse 1, screenes forbindelsene ved 4 doser for å oppnå en IC50 som skissert nedenfor:

Osteoklastpreparatene preinkuberes i 30 min ved 37 °C med testforbindelsen

(4 doser) eller kontroller.

• De ympes så på bovinkortikalbeinskiver i brønner i en 48-brønners vevskultur-plate og inkuberes i ytterligere 2 timer ved 37 °C. • Beinskivene vaskes i seks skifter av varm fosfatbufret saltoppløsning (PBS) for å fjerne ikke-adherente celler og returneres så til brønner i en 48-brønners plate inneholdende frisk forbindelse eller kontroller.

• Vevskulturplatene inkuberes så i 48 timer ved 37 °C.

• Supernatantene fra hver brønn aspireres inn i individuelle rør og screenes i en kompetitiv ELISA som detekterer c-telopeptidet av type I-kollagen som frigis under resorpsjonsprosessen. Dette er en kommersielt tilgjengelig ELISA (Osteo-meter, Danmark) som inneholder et kaninantistoff som spesifikt reagerer med en 8-aminosyresekvens (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) som er til stede i det karboksyterminale telopeptid av al-kjeden av type I-kollagen. Resultatene uttrykkes som % inhibering av resorpsjon sammenlignet med en bærerkontroll.

Human osteoklastadhesjonsanalyse

Humanosteoklaster anrikes og prepareres for forbindelsesscreening som beskrevet ovenfor i de første 9 trinn i analyse 1. For klarhetens skyld repeteres disse trinnene nedenfor.

Cellene vaskes 2 ganger med kald RPMI-1640, fulgt av sentrifugering ved 1 000 omdrVmin i 5 min ved 4 °C, og cellene overføres så til et sterilt 15 ml

De kulebelagte celler immobiliseres på en magnet og de gjenværende celler

(osteoklastrik fraksjon) dekanteres til et sterilt 50 ml sentrifugerør.

Denne vaskeprosess gjentas ti ganger. De kulebelagte celler kasseres.

Osteoklastomaavledede osteoklaster preinkuberes med forbindelsen (4 doser)

eller kontroller ved 37 °C i 30 min.

Cellene ympes så på osteopontinbelagte skiver (human- eller rotteosteopontin,

2,5 ug/ml) og inkuberes i 2 timer ved 37 °C.

Ikke-adherente celler fjernes ved vasking av skivene heftig i fosfatbufret salt-oppløsning og cellene som forblir på skivene fikseres i aceton.

Osteoklastene farges for tartratresistent sur fosfatase (TRAP), en selektiv markør for celler av denne fenotype (se trinn 15-17), og telles ved lysmikroskopi. Resultatene uttrykkes som %-inhibering av adhesjonen sammenlignet med en bærerkontroll.

CELLEADHESJONSANALYSE

Celler og cellekultur

Humanembryoniske nyreceller (HEK293 celler) ble oppnådd fra ATCC (katalog nr. CRL 1573). Celler ble dyrket i Earls minimale, essensielle medium (EMEM), et medium inneholdende Earls salter, 10 % føtalt bovint serum, 1 % glutamin og 1 % Penicillin-Steptomycin.

Konstrukter og transfeksjoner

Et 3,2 kb EcoRI-Kpnl-fragment av a v-subenheten og et 2,4 kb Kbal-XhoI-fragment av P3-subenheten ble skutt inn i EcoRI-EcoRV-kloningssetene av pCDN-vektoren (Aiyar et al., 1994) inneholdende CMV-promoter og en G418-selekterbar markør ved stump-endeligering. For stabil ekspresjon ble 80 x IO<6> HEK 293-celler elektrotransformert med a v+P3-konstrukter (20 ug DNA av hver subenhet) ved bruk av en Gene Pulser (Hensley et al., 1994) og brakt på plater i 100 mm plater (5 x 10<5> celler pr. plate). Etter 48 timer ble vekstmediet supplert med 450 ug/ml Geneticin (G418 Sulfate, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Cellene ble holdt i seleksjonsmedium inntil koloniene var store nok til analyse.

Immunocytokjemisk analyse av transfekterte celler

For å bestemme hvorvidt HEK 293-transfektantene uttrykte vitronektinreseptoren, ble cellene immobilisert på glassmikroskopskiver ved sentrifugering, fiksert i aceton i 2 min ved romtemperatur og lufttørket. Spesifikk reaktivitet med 23 C6, med et mono-klonalt antistoff som var spesifikt for a vP3-komplekset, ble vist ved bruk av en standard indirekte imrnunofluorescensmetode.

Celleadhesj onsstudier

Corning 96-brønners ELISA-plater ble belagt over natten ved 4 °C med 0,1 ml human vitronektin (0,2 ug/ml i RPMI-medium). På tidspunktet for forsøket ble platene vasket én gang med RPMI-medium og blokkert med 3,5 % BSA i RPMI-medium i 1 time ved romtemperatur. Transfekterte 293-celler ble resuspendert i RPMI-medium, supplert med 20 mM Hepes, pH 7,4 og 0,1 % BSA ved en densitet på 0,5 x IO<6> celler/ml. 0,1 ml cellesuspensjon ble satt til hver brønn og inkubert i 1 time ved 37 °C i nærvær eller fravær av forskjellige a vP3-antagonister. Etter inkubering ble 0,025 ml av en 10 %-ig formaldehydoppløsning, pH 7,4, tilsatt og cellene fiksert ved romtemperatur i 10 min. Platene ble vasket 3 ganger med 0,2 ml RPMI-medium og de adherente celler ble farget ved 0,1 ml 0,5 % toluidinblått i 20 min ved romtemperatur. Overskytende farging ble fjernet ved ekstensiv vasking med deionisert vann. Toluidinblått som var inkorporert i cellene, ble eluert ved tilsetning av 0,1 ml 50 %-ig etanol inneholdende 50 mM HC1. Celleadhesjon ble kvantitert ved en optisk densitet på 600 nm på en mikro ti terplateleser (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).

Fastfase a vpVbindingsanalyse:

Vitronektinreseptoren a vPs ble renset fra human placenta. Reseptorpreparatet ble fortynnet med 50 mM Tris-HCl, pH 7,5,100 mM NaCl, 1 mM CaCl2,1 mM MnCl2,1 mM MgCl2 (buffer A) og ble umiddelbart satt til 96-brønners ELISA-plater ved 0,1 ml pr. brønn. 0,1-0,2 ug a vfc ble tilsatt pr. brønn. Platene ble inkubert over natten ved 4 °C. På tidspunktet for forsøket ble brønnene vasket én gang med buffer A og inkubert med 0,1 ml 3,5 % bovint serumalbumin i den samme buffer i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble cellene aspirert fullstendig og vasket to ganger med 0,2 ml buffer

A.

I en [<3>H]-SK&F-107260-kompetisjonsanalyse ble forskjellige konsentrasjoner ikke-merkede antagonister (0,001-100 uM) satt til brønnene, fulgt av tilsetning av 5,0 nM [<3>H]-SK&F-107260. Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble cellene aspirert fullstendig og vasket én gang med 0,2 ml iskald buffer A i en brønn-til-brønn-modus. Reseptorene ble oppløseliggjort med 0,1 ml 1 % SDS og det bundne [<3>H]-SK&F-107260 ble bestemt ved væskescintillasjonstelling ved tilsetning av 3 ml Ready Safe i en Beckman LS 6800 Liquid Scintillation Counter, med 40 % effektivitet. Dcke-spesifikk binding av [<3>H]-SK&F-107260 ble bestemt i nærvær av 2 uM SK&F-107260 og var konsistent mindre enn 1 % av den totale radioligandinput. IC50 (konsentrasjonen av antagonisten som inhiberer 50 % binding av [<3>H]-SK&F-107260) ble bestemt ved en ikke-lineær minste kvadYatsloirvetilpasriingsrutine som var modifisert fra LUNDON-2-programmet. Ki (dissosiasjonskonstanten for antagonisten) ble beregnet i henhold til Cheng og Prusoff-ligningen: K; = ICso/(l + L/Ka), der L og Kd var konsentrasjonen og dissosiasjonskonstanten for [<3>H]-SK&F-107260.

INHIBERING AV RGD-MEDIERT GPIIB-IIIA-BINDING

Rensing av GPIIb-IIIa

10 enheter av utdaterte, vaskede humanplater (oppnådd fra Røde Kors) ble lysert ved forsiktig omrøring i 3 % oktylglukosid, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4,140 mM NaCl, 2 mM CaCb ved 4 °C i 2 timer. Lysatet ble sentrifugert ved 100 000 gil time. Supernatanten som ble oppnådd, ble brakt på en 5 ml lentil lektinsefarose 4B-kolonne (E. Y. Labs) som var ekvilibrert på forhånd med 20 mM Tris-HCl, pH 7,4,100 mM NaCl, 2 mM CaCb, 1 % oktylglukosid (buffer A). Etter 2 timers inkubering ble kolonnen vasket med 50 ml kald buffer A. Den lektintilbakeholdte GPIIb-IIIa ble eluert med buffer A inneholdende 10 % dekstrose. Alle prosedyrer ble gjennomført ved 4 °C. Den oppnådde GPHb-IIIa var >95 % rent som vist ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese.

Inkorporering av GPIIb-IIIa i liposomer.

En blanding av fosfatidylserin (70%) og fosfatidylkolin (30%) (Avanti Polar Lipids) ble tørket på veggene til et glassrør under en nitrogenstrøm. Renset GPIIb-IIIa ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg/ml og blandet med fosfolipidene i et protein:fosfolipid forhold på 1:3 (vekt/vekt). Blandingen ble resuspendert og lydbehandlet i et bad-lydbehandlingsapparat i 5 minutter. Blandingen ble deretter dialysert over natten ved anvendelse av 12.000-14.000 molekylarvekt cutoff dialyserør mot et 1000-gangers overskudd av 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,100 mM NaCl, 2 mM CaCb (med 2 forandringer). GPIIb-IHa-inneholdende liposomer ble sentrifugert ved 12.000 g i 15 minutter og resuspendert i dialysebuffer ved en sluttproteinkonsentrasjon på ca. 1 mg/ml. Liposomene ble lagret ved -70°C til de ble brukt.

Konkurrerende binding til GPIIb-IIIa

Binding til fibrinogenreseptoren (GPIIb-IIIa) ble undersøkt ved en indirekte konkurrerende bindingsfremgangsmåte ved anvendelse av [<3>H]-SK&F-107260 som en RGD-type ligand. Bindingsundersøkelsen ble utført i et 96-brønns filtreringsplate-arrangement (Millipore Corporation, Bedford, MA) ved anvendelse av 0,22 um hydrofile durapore membraner. Brønnene ble forhåndsbelagt med 0,2 ml 10 ug/ml polylysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ved romtemperatur i 1 time for å blokkere ikke-spesifikk binding. Forskjellige konsentrasjoner av ikke-merkede benzazepiner ble tilsatt til brønnene i kvadruplikat. [<3>H]-SK&F-107260 ble tilført hver brønn i en sluttkonsentrasjon på 4,5 nM, fulgt av tilsetning av 1 ug rensede blodplate GPUb-IIIa-inneholdende liposomer. Blandingene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. GPIlb-IIIa-bundet [<3>H]-SK&F-107260 ble separert fra ikke-bundet ved filterering ved anvendelse av en Millipore filfreringsmanifold, fulgt av vasking med iskald buffer (2 ganger, hver 0,2 ml). Bundet radioaktivitet tilbake på filtrene ble talt i 1,5 ml Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA) i en Beckman flytende scintillasjonsteller (modell LS6800), med 40% effektivitet. Ikke-spesifikk binding ble bestemt under nærvær av 2 nm ikke-merket SK&F-107260 og var konsekvent mindre enn 0,14% av den totale radioaktiviteten tilsatt prøvene. Alle datapunkter er middelverdi av kvadruplikate bestemmelser.

Konkurrerende bindingsdata ble analysert med en ikke-lineær minstekvadrat kurve-tilpasningsprosedyre. Denne fremgangsmåten gir IC50-verdi til antagonistene (konsentrasjon av antagonist som inhiberer spesifikk binding av [<3>H]-SK&F-107260 med 50% ved likevekt). IC50-verdien er relatert til likevektsdissosiasjonskonstanten (Ki) til antagonisten basert på Cheng og Prusoff ligningen: Ki = IC50/(l+L/Kd), hvor L er konsentrasjonen av [ H]-SK&F-107260 anvendt i den konkurrerende bindingsundersøkelsen (4,5 nM), og Kd er dissosiasjonskonstanten til [<3>H]-SK&F-107260 som er 4,5 nM som bestemmes ved Scatchard-analysen.

Foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen har en affinitet for vitronektinreseptoren relativt fibrinogenreseptoren på større enn 10:1. De mest foretrukne forbindelser har et aktivitetsforhold større enn 10:1.

Effektiviteten for forbindelsene med formel (I) alene eller i kombinasjon med et antineoplastisk middel kan bestemmes ved bruk av forskjellige transplantable musetumor-modeller. Når det gjelder detaljer henvises det til US 5 004 758 og 5 633 016.

De følgende eksempler er ikke på noen måte ment å begrense rammen for oppfinnelsen, men skal illustrere hvordan forbindelsene skal fremstilles og benyttes ifølge oppfinnelsen. Andre utførelsesformer vil være åpenbare for fagmannen.

Protonnukleær magnetisk resonans(<1>H NMR)-spektra ble tatt opp ved enten 250, 300 eller 400 MHz. Kjemiske skift er angitt i deler pr. million, 8, nedstrøms den indre standard tetrametylsilan (TMS). Forkortelser for NMR-data er som følger: s = singlet, d = dublett, t = triplett, q = kvartett, m = multiplett, dd = dublett av dubletter, dt = dublett av tripletter, app = tilsynelatende, br = bred. J antyder NMR-koblingskonstanten målt i hertz. CDCI3 er deuteriokloroform, DMSO-d6 er heksadeuteriodimetylsulfoksid og CD3OD er tetradeuteirometanol. Infrarødt (IR) spektra ble tatt opp i transisjonsmodus og båndposisjonene er angitt i omvendt bølgetall (cm"<1>). Massespektra ble oppnådd ved bruk av elektrospray (ES) eller FAB-ioniseringsteknikker. Elementanalyser ble gjen-nomført enten in-house eller ved Quantitative Technologies Inc., Whitehouse, NJ. Smeltepunktene ble tatt på en Thomas-Hoover-smeltepunktsapparatur og er ukorrigerte. Alle temperaturer er angitt i grader celsius. Analtech Silica Gel GF og E. Merck Silica Gel 60 F-254-tynnplater ble benyttet for tynnsjiktskromatografi. Både flash- og gravitetskromatografi ble gjennomført på E. Merck Kieselgel 60 (230-400 mesh) silikagel. Analytisk og preparativ HPLC ble gjennomført på Rainin- eller Beckman-kromato-grafer. ODS henviser til en kromatografisk oktadecylsilylderivatisert silikagelbærer. En 5 u Apex-ODS antyder en kromatografisk oktadecylsilylderivatisert silikagelbærer som har en nominell partikkelstørrelse på 5 \ i, fremstilt av Jones Chromatography, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ® er en ODS-kromatografisk bærer og er et registrert varemerke for YMC Co. Ltd., Kyoto, Japan. PRP-1® er en polymer(styren-divinylbenzen)-kromatografisk bærer og er et registrert varemerke for Hamilton Co., Reno, Nevada. Celite® er et filterhjelpemiddel bestående av syrevasket diatomésilisiumdioksid og er et registrert varemerke for Manville Corp., Denver, Colorado.

Fremstilling 1

Fremstilling av 6-(metylamino)-2-pyridyletanol

a) 2-(tert-butoksykarbonylamino)-6-pikolin

En oppløsning av 2-amino-6-pikolin (21,63 g, 200 mmol) og di-tert-butyldikarbonat

(52,38 g, 240 mmol) i 200 ml CH2CI2, ble konsentrert ved en rotasjonsfordamper ved 50 °C, og den resulterende rest tillatt rotasjon på rotasjonsfordamperen ved 50 °C under vakuum. Etter 21,5 timer ble reaksjonen fortynnet med 400 ml heksaner og filtrert gjennom silikagel (heksaner, fulgt av 20 % EtOAc/heksaner). Konsentrasjon etterlot tittelforbindelsen (41,84 g, kvantitativ) som en lysegule olje som gradvis størknet ved henstand.

<*>H NMR (250 MHz, CDC13) 5 7,71 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,40-7,65 (m, 2 H), 6,80 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 2,43 (s, 3 H), 1,50 (s, 9 H);

MS (ES) m/e 153 (M + H - C4H8)<+.>

b) 2-[(tert-butoksykarbonyl)metylamino]-6-pikolin

NaH (60 % i mineralolje, 3,60 g, 90 mmol) ble i porsjoner og i løpet av flere minutter

satt til en oppløsning av 2-(tert-butoksykarbonylamino)-6-pikolin (15,62 g, 75 mmol) og jodmetan (9,3 ml, 150 mmol) i 75 ml vannfri DMSO ved 15 °C (kaldt vannbad). Den indre temperatur steg til 35 °C. Etter at gassutviklingen hadde gitt seg ble det kalde vannbad fjernet og reaksjonsblandingen omrørt ved romtemperatur. Etter 0,5 timer ble den mørkegule blanding helt på 300 ml is/H20 og ekstrahert med 3 x 300 ml Et20. De kombinerte, organiske sjikt ble vasket sekvensielt ved 2 x 75 ml H2O og 75 ml saltopp-løsning. Tørking over MgSCU og konsentrering, etterlot en gul olje som ble kromatografert på silikagel med 7 % EtOAc:heksaner. Tittelforbindelsen (13,01 g, 78 %) ble oppnådd som en blek, gul olje.

'H NMR (250 MHz, CDCI3) 8 7,51 (app t, 1 H), 7,37 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 6,86 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 3,38 (s, 3 H), 2,49 (s, 3 H), 1,50 (s, 9 H);

MS (ES) m/e 223 (M + H)<+>.

c) Etyl-6- [(tert-bu toksykarbonyl)metylamino] -2-py ridy lacetat

LDA ble fremstilt ved 0 °C under argon fra diisopropylamin (19,5 ml, 139,14 mmol) og

2,5 M n-BuLi i heksaner (46,4 ml, 115,95 mmol) i 350 ml tørr THF. Oppløsningen ble avkjølt til -78 °C og en oppløsning av 2-[(tert-butoksykarbonyl)metylamino]-6-pikolin (10,31 g, 46,38 mmol) i 46 ml tørr THF dråpevis tilsatt i løpet av 10 min. Ytterligere 2 ml THF ble benyttet i overføringen. Den orangefargede oppløsning ble omrørt ved -78 °C i 15 min, og deretter ble dietylkarbonat (6,2 ml, 51,02 mmol) tilsatt hurtig. Den røde oppløsning ble omrørt ved -78 °C i 15 min, og ble så quenchet med 175 ml halv-mettet NH4CI. Blandingen ble oppvarmet til +5 °C og ekstrahert med 175 ml EtOAc og så med 2 x 100 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske sjikt ble vasket med 100 ml salt-oppløsning, tørket over MgS04 og konsentrert. Den uklare, gule olje ble kromatografert på silikagel med 15 % EtOAc:heksaner og man oppnådde tittelforbindelsen (10,72 g, 79 %) som en gul olje.

<J>H NMR (250 MHz, CDC13) 8 7,51 - 7,63 (m, 2 H), 6,91-7,03 (m, 1 H), 4,19 (q, J =

7,1 Hz, 2 H), 3,77 (s, 2 H), 3,38 (s, 3 H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3 H), 1,51 (s, 9 H);

MS (ES) m/e 295(M + H)<+>.

d) 6- [(tert-butoksykarbonyl)metylamino]-2-pyridyletanol

En oppløsning av 2 N L1BH4 i THF (7 ml, 14 mmol) ble via en sprøyte satt til en omrørt

oppløsning av etyl-6-[(tert-butoksykarbonyl)metylamino]-2-pyridylacetat (6,97 g,

23,7 mmol) i 30 ml vannfri THF under argon. Reaksjonsblandingen ble så langsomt varmet opp til tilbakeløp (eksoterm til å begynne med). Etter 16 timer under tilbakeløp ble reaksjonsblandingen avkjølt til 0 °C og forsiktig quenchet med 50 ml vann. Blandingen ble ekstrahert med 150 ml EtOAc og det organiske sjikt vasket med saltopp-løsning, tørket over Na2SC>4 og konsentrert. Rensing ved flashkromatografi på silikagel med 35 % EtOAc:heksan ga tittelforbindelsen (5,26 g, 88 %) som en klar olje.

'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,57 (m, 2 H), 6,88 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 4,01 (t, 2 H), 3,39 (s, 3 H), 3,00 (t, 2 H), 1,53 (s, 9 H);

MS (ES) m/e 253,2 (M + H)<+>.

e) 6-(metylamino)-2-pyridyletanol

Til 6-[(tert-butoksykarbonyl)metylamino]-2-pyridyletanol (17,9 g, 71 mmol) ble det satt

200 ml oppløsning av 4 N HC1 i dioksan. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time (det ble observert en mild gassutvikling) og så ble det hele konsentrert til tørr tilstand. Produktet som hydrokloridsaltet, størknet under vakuum. Faststoffet ble oppløst i 75 ml NaCl-mettet 1,0 N NaOH-oppløsning, og oppløsningen ble ekstrahert med 2 x 200 ml Et20. De kombinerte, organiske sjikt ble vasket med saltoppløsning, tørket over Na2SC<4 og konsentrert for å gi tittelforbindelsen (9,12 g,

85 %) som et voksaktig faststoff.

'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,37 (t, 1 H), 6,42 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 6,27 (d, J =

8,3 Hz, 1 H), 4,62 (br s, 1 H), 3,96 (t, 2 H), 2,90 (d, J = 5,2 Hz, 3 H), 2,84 (t, 2 H);

MS(ES)m/el53(M + H)<+>.

Fremstilling 2

Fremstilling av2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol

a) 2-(pivaloylamino)pyridin

Til en oppløsning av 2-aminopyridin (94,12 g, 1 mol) og Et3N (167,3 ml, 1,2 mol) i

1 liter CH2C12 ble det dråpevis satt pivaloylklorid (135,5 ml, 1,1 mol) ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble blandingen filtrert. Filtratet ble vasket sekvensielt med 1,5 liter H2O og 2 x 1,5 liter mettet NaHCC>3, så tørket over MgS04 og konsentrert under redusert trykk for å gi tittelforbindelsen (183 g, 103 %) som et hvitaktig faststoff.

'H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 8,28 (m, 2 H), 8,00 (br s, 1 H), 7,70 (m, 1 H), 7,03 (m, lH),l,31(s,9H);

MS(ES)m/el79(M + H)<+>.

Note: <!>H NMR viste nærværet av en liten mengde tert-butylholdige urenheter, men materialet er rent nok for det neste trinn.

b) 2-(pivaloylamino)-3-pyridinkarboksaldehyd

Til en oppløsning av 2-(pivaloylamino)pyridin (17,8 g, 100 mmol) i 250 ml tørr THF

ble det ved -20 °C dråpevis satt n-BuLi (2,5 M oppløsning i heksaner, 100 ml,

250 mmol) over 30 min. Etter 2 timer ble DMF (21 ml, 275 mmol) dråpevis tilsatt i løpet av 30 min. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble blandingen quenchet med 300 ml mettet NH4CI og den resulterende blanding ble ekstrahert med 3 x 400 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgSC<4 og konsentrert for å gi tittelforbindelsen som en 2:1-blanding med 2-(pivaloylamino)pyridin (22 g).

<!>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 10,95 (br s, 1 H), 9,95 (s, 1 H), 8,69 (m, 1 H), 8,02 (m, 2 H), 7,20 (m, 1 H), 1,38 (s, 9 H);

MS (ES) m/e 207 (M + H)<+>.

Note: Prosedyren ovenfor ble gjentatt ved bruk av 1-formylpiperidin (30,5 ml,

275 mmol) i stedet for DMF for å gi tittelforbindelsen som en 4:1 blanding med 2-(pivaloylamino)pyridin (21 g).

c) 2-amino-3-pyridinkarboksaldehyd

Uren 2-(pivaloylamino)-3-pyridinkarboksaldehyd (fra trinn b, 43 g) ble oppløst i 500 ml 3 M HC1, og oppløsningen oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur og pH-verdien forsiktig justert til 7 ved bruk av fast K2CO3. Den vandige oppløsning ble ekstrahert med 3 x 500 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgSC«4 og konsentrert for å gi tittelforbindelsen (24,57 g,

101 %) som et rødaktig, brunt faststoff.

<]>H NMR (300 MHz, CDC13) 8 9,85 (s, 1 H), 8,24 (m, 1 H), 7,80 (m, 1 H), 6,90 (br s, 2 H), 6,74 (m, 2 H);

MS(ES)m/el23(M + H)<+>.

d) 2-metyl-l,8-naftyridin

Til en oppløsning av 2-amino-3-pyridinkarboksaldehyd (fra trinn c, 24,57 g) i 750 ml

aceton ble det satt prolin (2,3 g, 20 mmol), hvoretter blandingen ble oppvarmet til til-bakeløp. Etter 48 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur, filtrert og konsentrert. Flashkolonnekromatografi på silikagel med 35 % acetomheksaner, ga tittelforbindelsen (18,5 g, 64 % over 3 trinn) som et orangegult faststoff.

<*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8 9,07 (m, 1H), 8,10 (m, 2 H), 7,40 (m, 2 H), 2,80 (s, 3 H);

MS (ES) m/e 145 (M + H)<+>.

e) 2-metyl-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin

En blanding av 2-metyl-l,8-naftyridin (18,5 g, 128 mmol), 5 g 10 % Pd/C og 150 ml

absolutt EtOH ble ristet under et hydrogentrykk på 15 psi på en Parr-apparatur. Etter 24 timer ble blandingen filtrert gjennom Celite®, og filterputen ble vasket sekvensielt med absolutt EtOH og EtOAc. Filtratet ble konsentrert til tørr tilstand og man fikk tittelforbindelsen (18,85 g, 99 %) som et hvitaktig faststoff.

'H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,02 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 6,34 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 4,80 (br s, 1 H), 3,38 (m, 2 H), 2,74 (m, 2 H), 2,30 (s, 3 H), 1,88 (m, 2 H).

MS (ES) m/e 149 (M + H)<+>.

f) 2-metyl-8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin

Til en oppløsning av 2-metyl-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin (23,32 g, 157 mmol) og di-tert-butyldikarbonat (44,74 g, 205 mmol) i 750 ml tørr THF ble det ved 0 °C dråpevis satt LiHMDS (1,0 M oppløsning i THF, 205 ml, 205 mmol). 30 min etter at tilsettingen var ferdig, ble blandingen quenchet med 500 ml mettet NH4CI og ekstrahert med 3 x 500 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04 og konsentrert under redusert trykk. Flashkolonnekromatografi på silikagel med 40 % EtOAc:heksaner, ga tittelforbindelsen (32,3 g, 83 %) som en lysegul olje.

'H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 7,27 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,81 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 3,69-3,79 (m, 2 H), 2,65-2,75 (m, 2 H), 2,48 (s, 3 H), 1,83-1,98 (m, 2 H), 1,52 (s, 9 H);

MS (ES) m/e 249 (M + H)<+.>

g) Etyl-[8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyri(lin-2-yl]acetat

Til en oppløsning av diisopropylamin (47,7 ml, 364 mmol) i 250 ml tørr THF ble det

ved 0 °C dråpevis satt n-BuLi (2,5 M i heksaner, 145,6 ml, 364 mmol). Etter 15 min ble denne oppløsning dråpevis satt til en oppløsning av 2-metyl-8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin (32,3 g, 130 mmol) og dietylkarbonat (56,8 ml,

481 mmol) i 400 ml tørr THF ved -78 °C. Etter 30 min ble blandingen quenchet med 500 ml mettet NH4CI, oppvarmet til romtemperatur og ekstrahert med 3 x 500 ml EtOAc. De kombinerte, organiske ekstrakter ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk. Tørking under høyvakuum over natten ga tittelforbindelsen (42,52 g, 102 %) som en lysegul olje.

<l>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 6,96 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 4,18 (t, 2 H), 3,75 (m, 4 H), 2,72 (t, 2 H), 1,91 (m, 2 H), 1,52 (s, 9 H), 1,24 (m, 3 H);

MS (ES) m/e 321 (M + H)<+.>

Note: 'H-NMR viste en liten mengde dietylkarbonat til stede i produktet, men

materialet var rent nok for anvendelse i det neste trinn.

h) 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol

Til en oppløsning av etyl-[8-(tert-butoksykarbonyl)-5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yljacetat (42,52 g, 130 mmol) i 650 ml tørr THF ble det ved romtemperatur satt L1BH4 (2,0 M i THF, 65 ml, 130 mmol), og den resulterende blanding oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til 0 °C og forsiktig quenchet med 300 ml H2O. Etter 10 min ble blandingen ekstrahert med 3 x 500 ml EtOAc. De kombinerte, organiske ekstrakter ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk.

Resten ovenfor ble oppløst i 300 ml CH2CI2. Til denne oppløsning ble det langsomt satt 300 ml 4 N HC1 i dioksan ved romtemperatur. Etter 4 timer ble blandingen konsentrert under redusert trykk. Resten ble tatt opp i 300 ml av en 1:1 blanding av 1,0 N NaOH og mettet NaCl og ekstrahert med 3 x 300 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske ekstrakter ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk. Resten ble tatt opp i 250 ml Et20 og 130 mmol 96 %-ig maursyre ble tilsatt dråpevis. Det resulterende faststoff ble samlet ved filtrering og vasket med 2 x 50 ml Et20. Faststoffet ble oppløst i en 1:1 blanding av 1,0 N NaOH og mettet med 300 ml NaCl og oppløsningen ble ekstrahert med 3 x 300 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske ekstrakter ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk for å gi tittelforbindelsen (11,1 g, 48 % over 4 trinn) som et gult faststoff.

'H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,05 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,33 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 3,90 (t, 2H), 3,39 (m, 2 H), 2,75 (t, 2 H), 2,70 (t, 2 H), 1,90 (m, 2 H);

MS (ES) m/e 179(M + H)<+>.

Fremstilling 3

Fremstilling av etyl-(±)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]butanoat

a) N-metoksy-N-metyl-2-(4-metoksyfenyI)acetamid

Til en oppløsning av 4-metoksyfenyleddiksyre (3,3 g, 20 mmol) i 75 ml tørr DMF ble

det satt N-metoksy-N-metylamin-hydroklorid (1,95 g, 20 mmol), Et3N (3,1 ml,

22 mmol), HOBt • H20 (1,95 g, 22 mmol) og EDC (2,7 g, 22 mmol). Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur over natten og så konsentrert under vakuum. Resten ble tatt opp i 10 ml 5 % Na2C03-oppløsning og ekstrahert med 3 x 29 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert over silikagel med 3 % MeOH/CE^Ch for å gi tittelforbindelsen (1,54 g,

37 %) som et hvitt faststoff.

MS (ES)m/e210(M + H)<+>.

b) 2-(4-metoksyfenyl)-l-[4-(trifluormetyl)fenyl]etanon

Til en oppløsning av sek-BuLi (1,3 M i THF, 22,6 ml, 29,5 mmol) i 50 ml tørr THF ble

det dråpevis satt 4-brombenzotrifluorid (3,3 g, 14,7 mmol) i 20 ml tørr THF ved -78 °C. Etter 20 min ble N-metoksy-N-metyl-2-(4-metoksyfenyl)acetamid (1,5 g, 7,4 mmol) i

20 ml tørr THF tilsatt dråpevis. Etter 1 time ble blandingen quenchet med 10 ml mettet NH4CI, oppvarmet til romtemperatur og ekstrahert med 3 x 20 ml Et20. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 15 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (2,2 g, 100 %) som et lysegult faststoff.

TLC (1,5 % EtOAc:heksaner) Rf 0,81;

<X>R NMR (300 MHz, CDC13) 8 8,10, (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,72 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,18 (d, J = 8,7 Hz, 2 H), 6,88 (d, J = 8,7 Hz, 2 H), 4,25 (s, 2 H), 3,79 (s, 3 H).

c) Etyl-(±)-4-(4-metoksyfenyl)-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]krotonat

Til en suspensjon av 60 %-ig NaH (350 mg, 8,84 mmol) i 30 ml tørr toluen ble det ved

romtemperatur dråpevis satt trietylfosfonoacetat (2,0 g, 8,84 mmol) i 20 ml tørr toluen. Etter 15 min ble en oppløsning av 2-(4-metoksyfenyl)-l-[4-(trifluormetyl)fenyl]etanon (1,3 g, 4,42 mmol) i 15 ml tørr toluen tilsatt dråpevis, og oppløsningen oppvarmet til tilbakeløp. Etter 16 timer ble reaksjonsblandingen quenchet med 10 ml NH4CI og blandingen ekstrahert med 3 x 20 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Tittelforbindelsen (2,2 g, 56 %, en blanding av to kom-ponenter) ble oppnådd som en lysegul olje.

TLC (5 % EtOAc:heksaner) Rf 0,42,0,44.

Dette materialet ble benyttet uten ytterligere rensing.

d) Etyl-(±)-4-(4-metoksyfenyl)-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]butanoat

Til en suspensjon av 600 mg 10 % Pd:C i 50 ml absolutt EtOH ble det satt etyl-(±)-4-(4-metoksyfenyl)-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]krotonat (2,2 g, 6 mmol), og blandingen ble ristet på en Parr-apparatur ved romtemperatur under et hydrogentrykk på 50 psi. Etter 4 timer ble blandingen filtrert gjennom en pute av Celite®, og filtratet ble konsentrert. Reaksjonssekvensen ble gjentatt 3 ganger. Resten ble kromatografert på silikagel med

35 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (900 mg, 56 %) som en olje.

TLC (5 % EtOAciheksaner) Rf 0,46;

<*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,51 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,24 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 6,94 (d, J = 8,7 Hz, 2 H), 6,76 (d, J = 8,7 Hz, 2 H), 3,99 (q, J = 7,1 Hz, 2 H), 3,76 (s, 3 H),

3,35-3,50 (m, 1 H), 2,75-2,93 (m, 2 H), 2,69 (dd, J = 15,6, 6,4 Hz, 1 H), 2,60 (dd, J = 15,6, 8,9 Hz, 1 H), 1,11 (t, J = 7,1 Hz, 3 H).

e) Etyl-(±)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]butanoat

Til en oppløsning av etyl-(±)-4-(4-metoksyfenyl)-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]butanoat

(450 mg, 1,23 mmol) i 5 ml CH2C12 ble det satt BBr3 (1,5 ml, 1,48 mmol) ved -10 °C. Etter 3 timer ble blandingen forsiktig quenchet med 10 ml EtOH og oppløsningen tillatt oppvarming til romtemperatur. Blandingen ble konsentrert og resten kromatografert på silikagel med 20 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (270 mg, 63 %) som en gul olje.

TLC (20 % EtOAc:heksaner) Rf 0,22.

Fremstilling 4

Fremstilling av metyl-(±)-3-[4-karboksy-l ,3-oksazol-2-yl]-4-[4-[(tert-butyloksy-karbony l)oksy] fenyl] butanoat

a) 4-brom-l-(triisopropylsilyloksy)benzen

Til en oppløsning av 4-bromfenol (17,3 g, 100 mmol) i 100 ml tørr DMF ble det ved

romtemperatur satt imidazol (13,62 g, 200 mmol), fulgt av triisopropylsilylklorid (22,5 ml, 105 mmol). Etter 4 timer ble blandingen fortynnet med 50 ml H20 og ekstrahert med 3 x 75 ml heksaner. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi tittelforbindelsen (32,23 g, 100 %) som en klar olje som ble benyttet uten rensing.

<J>H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,29 (d, J = 6 Hz, 2 H), 6,71 (d, J = 6 Hz, 2 H), 1,12 (m, 3H), 1,09 (m, 18 H).

b) Metyl-3-(benzyloksykarbonyl)-3-butenoat

Diisopropylazodikarboksylat (32,8 ml, 166 mmol) ble satt til en oppløsning av metyl-3-karboksy-3-butenoat (20 g, 139 mmol), benzylalkohol (17,2 mg, 166 mmol) og trifenylfosfin (43,7 g, 166 mmol) i 500 ml vannfri THF ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming etter hvert som badet varmet seg opp til romtemperatur. Etter 3 timer ble blandingen konsentrert og resten kromatografert på silikagel med 10 %

EtOAc:heksaner. Tittelforbindelsen (29,46 g, 91 %) ble oppnådd som en fargeløs olje.

<!>H NMR (300 MHz, CDC13) 6 7,35 (m, 5 H), 6,48 (s, 1 H), 5,71 (s, 1 H), 5,20 (s, 2 H), 3,63 (s, 3 H), 3,37 (s, 2 H).

c) Metyl-(±)-4-(4-triisopropylsilyloksyfenyl)-3-karboksybutanoat

En oppløsning av 4-brom-l-(triisopropylsilyloksy)benzen (33,23 g, 100 mmol), metyl-3-(benzyloksykarbonyl)-3-butenoat (28,11 g, 120 mmol), Pd(OAc)2 (2,24 g, 10 mmol), P(o-tolyl)3 (6,09 g, 20 mmol) og (i-Pr)2NEt (34,8 ml, 200 mmol) i 350 ml propionitril ble deoksygenert (3 evakuerings/N2-spylings-sykler), så oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert og resten kromatografert på silikagel med 10 % EtOAc:heksaner for å gi en gul olje. Oljen ble tatt opp i 100 ml 5 % EtOAc:heksaner og oppløsningen ble satt hen ved romtemperatur. Etter 72 timer ble blandingen filtrert og filtratet konsentrert for å gi urent metyl-(±)-4-(4-triisopropylsilyloksyfenyl)-3-(benzyl-oksykarbonyl)-3-butenoat som en blanding av olefinisomerer. Denne ble benyttet umiddelbart i det neste trinn.

Olefinblandingen ovenfor ble delt i to deler. Hver del ble omsatt på følgende måte og så kombinert etter filtrering. Til en suspensjon av 7,4 g 10 % Pd:C i 100 ml EtOAc satte

man den ovenfor angitte olefinblanding. Blandingen ble deoksygenert (3 evakuerings/- N2-spylings-sykler) og så chargert med 50 psi H2. Etter 4 timer ble H2 fjernet og blandingen filtrert gjennom en pute av Celite®. Filtratet ble konsentrert for å gi tittelforbindelsen (24,64 g, 89 % fra 4-brom-l-(triisopropylsilyloksy)benzen) som en klar olje.

<*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,01 (d, J = 6 Hz, 2 H), 6,80 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3,62 (s, 3 H), 3,05 (m, 2 H), 2,65 (m, 1 H), 2,40 (m, 2 H), 1,21 (m, 3 H), 1,09 (m, 18 H).

d) (±)-N-[2-[4-(triisopropylsilyloksy)benzyl]-3-(karbometoksy)propionyI]serinbenzylester

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-karboksy-4-[4-(triisopropylsilyloksy)fenyl]butanoat (5,00 g, 12,67 mmol) i 60 ml tørr DMF ble det ved romtemperatur satt serinbenzylester-hydroklorid (3,52 g, 15,21 mmol), HOBt (2,06 g, 15,21 mmol), Et3N (5,3 ml,

38,01 mmol) og EDC (2,92 g, 15,21 mmol). Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 80 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (5,76 mg, 79 %) som en blekgul olje.

MS (ES) m/e 572 (M + H)<+>.

e) Metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l,3-oksazolin-2-yl]-4-[4-(triisopropyl-silyloksy)fenyl] butanoat

Til en oppløsning av (±)-N-[2-[4-(triisopropylsilyloksy)benzyl]-3-(karbometoksy)-propionyljseirnbenzylester (5,76 g, 10,07 mmol) i 50 ml tørr THF ble det satt Burgess-reagens (2,88 g, 12,08 mmol), hvoretter blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 2 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 35 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (4,45 g, 80 %) som en klar olje:

MS (ES) m/e 554 (M + H)<+>.

f) Metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l,3-oksazol-2-yl]-4-[4-(triisopropyl-silyloksy)fenyl] butanoat

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l,3-oksazolin-2-yl]-4-[4-(triisopropylsilyloksy)fenyl]butanoat (4,45 g, 8,03 mmol) i 40 ml CH2CI2 ble det ved 0 °C satt DBU (1,4 ml, 9,64 mmol), fulgt av bromtriklormetan (0,95 ml, 9,64 mmol). Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 20 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (2,23 g, 50 %) som en klar olje.

MS (ES) m/e 552 (M + H)<+>.

g) Metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l,3-oksazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)-butanoat

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l,3-oksazol-2-yl]-4-[4-(tri-isopropylsilyloksy)fenyl]butanoat (2,23 g, 4,04 mmol) i 20 ml tørr THF ble det ved 0 °C satt en oppløsning av TBAF i THF (1,0 M, 6,06 ml, 6,06 mmol). Etter 2 timer ble blandingen fortynnet med 10 ml mettet NH4CI og ekstrahert med 3 x 15 ml CH2C12. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 40 % EtOAc :heksaner for å gi tittelforbindelsen (1,4 g, 88 %) som et hvitaktig skum.

MS(ES)m/e396(M + H)<+>.

h) Metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l,3-oksa2ol-2-yl]-4-[4-[(tert-butyloksy-karbonyl)oksy] fenyl] butanoat

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l,3-oksazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat (700 mg, 1,77 mmol) og di-tert-butyldikarbonat (463 mg,

2,12 mmol) i 10 ml tørr THF ble det satt pyridin (0,17 ml, 2,12 mmol) ved romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble triturert med heksaner, filtrert og tørket under vakuum for å gi tittelforbindelsen (765 mg, 87 %) som et hvitt faststoff:

MS (ES) m/e 496 (M + H)<+>.

i) Metyl-(±)-3-[4-karboksy-l,3-oksazol-2-yl]-4-[4-[(tert-butyloksykarbonyl)-oksy] fenyl] butanoat

En blandingen metyl-(±)-3-[4-(benzyloksykarbonyl)-l ,3-oksazol-2-yl]-4-[4-[(tetr-butyl-oksykarbonyl)oksy]fenyl]butanoat (765 mg, 1,54 mmol) og 164 mg 10 % Pd:C i 20 ml EtOH ble deoksygenert (3 evakuerings/N2-spylings-sykler) og så chargert med 50 psi H2. Etter 4 timer ble H2 fjernet og blandingen filtrert gjennom en pute av Celite®. Filtratet ble konsentrert for å gi tittelforbindelsen (659 mg, 100 %) som et hvitt faststoff.

MS (ES) m/e 811 (2M + H)<+>.

Fremstilling 5

Fremstilling av metyl-(±)-3-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)-butanoat

a) 2-cyanometyl-4-(trifluormetyl)tiazol

2-cyanotioacetamid (1,00 g, 9,99 mmol) og 3-brom-i-trifluorpropan-2-on (1,04 ml,

9,99 mmol) ble kombinert i 50 ml absolutt EtOH og oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 15 % EtOAc :heksaner for å gi 1,24 g av tittelforbindelsen som en 2:1 blanding med etyl-2-cyanoacetat.

MS (ES) m/e 385 (2M + H)<+>.

b) 3-(4-benzyloksyfenyl)-2- [(4-trifluormetyl)tiazol-2-y 1] akrylonitril

NaH (516 mg, 60 % dispersjon i mineralolje, 12,9 mmol) ble omsatt med 10 ml absolutt

EtOH ved 0 °C. Etter at gassutviklingen hadde gitt seg ble blandingen oppvarmet til romtemperatur. 4-benzyloksybenzaldehyd (2,05 g, 9,68 mmol) ble tilsatt på én gang som et faststoff. Til denne blanding ble det dråpevis satt en oppløsning av 1,24 g 2-cyanometyl-4-(trifluormetyl)tiazol i 20 ml absolutt EtOH. Reaksjonsblandingen ble om-rørt i 4 timer, hvoretter faststoffet ble samlet ved filtrering og vasket med heksaner for å gi tittelforbindelsen (1,64 g, 42 % over 2 trinn) som et gult faststoff.

'H NMR (300 MHz, CDC13) 6 8,25 (s, 1 H), 8,00 (d, J = 6 Hz, 2 H), 7,79 (s, 1 H), 7,40 (m, 5 H), 7,10 (d, J = 6 Hz, 2 H), 5,18 (s, 2 H).

c) 3-(4-benzyloksyfenyl)-2-cyano-2-[(4-trifluormetyl)tiazol-2-yl]oksiran

Til en oppløsning av 3-(4-benzyloksyfenyl)-2-[(4-trifluormetyl)tiazol-2-yl]akrylonitril

(500 mg, 1,29 mmol) i 5 ml CH3CN ble det satt 1,3 g nøytral aluminiumoksid. 5 ml Klorox-blekemiddel ble dråpevis tilsatt ved romtemperatur. Etter 1 time ble blandingen filtrert. Filtratet ble fortynnet med 20 ml H20 og ekstrahert med 3 x 20 ml CH2C12. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi tittelforbindelsen (425 mg, 82 %) som en gul olje som var tilstrekkelig ren til bruk i det neste trinn.

<*>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 7,90 (s, 1 H), 7,40 (m, 7 H), 7,06 (d, J = 6 Hz, 2 H), 5,10 (s,2H),4,59(s,lH).

d) 2-(4-benzyloksyfenyl)-l-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]etanon

Til en oppløsning av 3-(4-benzyloksyfenyl)-2-cyano-2-[(4-trifluormetyl)tiazol-2-yl]-oksiran (425 mg, 1,06 mmol) i 7 ml CH2C12 ble det dråpevis ved 0 °C satt Et3SiH

(0,85 ml, 5,3 mmol) og så BF3 • OEt2 (0,39 ml, 3,17 mmol). Etter 2 timer ble blandingen helt i 20 ml H20 og ekstrahert med 3 x 20 ml CH2C12. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert.

Til resten ovenfor i 7 ml tørr THF ble det satt en oppløsning av TBAF i THF (1,0 M, 1,6 ml, 1,6 mmol) ved 0 °C. Etter 1 time ble blandingen helt i 20 ml mettet NH4CI

(20 ml) og ekstrahert med 3 x 20 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 5 % EtOAc :heksaner for å gi tittelforbindelsen (167 mg, 40 %) som et hvitt faststoff.

<]>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 8,05 (s, 1 H), 7,35 (m, 7 H), 6,92 (d, J = 6 Hz, 2 H), 5,05 (s,2H), 4,40 (s,lH).

e) Metyl-(±)-3-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat

Til en suspensjon av NaH (35 mg, 0,88 mmol) i 2 ml tørr THF ble det dråpevis satt trietylfosfonoacetat (0,17 ml, 0,88 mmol) ved romtemperatur. Etter 15 min ble en opp-løsning av 2-(4-benzyloksyfenyl)-l-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]etanon (167 mg,

0,44 mmol) i 2 ml tørr THF tilsatt dråpevis, og blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur, quenchet med 10 ml mettet NH4CI og ekstrahert med 3 x 20 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi uren etyl-(±)-3-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]-4-(4-benzyloksyfenyl)krotonat som en olje. Denne ble benyttet uten ytterligere rensing.

Etyl-(±)-3-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]-4-(4-benzyloksyfenyl)krotonat (0,44 mmol, uren) ble oppøst i 4 ml MeOH og magnesiumspon (53 mg, 2,20 mmol) ble tilsatt ved romtemperatur. Etter 72 timer ble blandingen helt i 75 ml 10 % HC1 og ekstrahert med 3 x 50 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi urent metyl-(±)-3[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]-4-(4-benzyloksyfenyl)-butanoat. Dette ble benyttet uten ytterligere rensing.

Til en oppløsning av metyl-(±)-3[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]-4-(4-benzyloksyfenyl)-butanoat (0,44 mmol, uren) i 5 ml EtSH ble det ved romtemperatur satt 0,3 ml BF3 • OEt2. Etter 18 timer ble ytterligere 0,3 ml BF3 • OEt2 tilsatt. Etter ytterligere 18 timer ble blandingen avkjølt til 0 °C og forsiktig quenchet med mettet NaHC03. Den resulterende blanding ble ekstrahert med 3 x 25 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert over silikagel med 30 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (123 mg, 81 % over 3 trinn) som en gul olje.

MS(ES)m/e346(M + H)<+>.

Fremstilling 6

Fremstilling av metyl-(±)-3-(5-metyltiazol-2-yl)-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat

a) Metyl-4-(benzyloksy)fenyIacetat

Til en suspensjon av K2CO3 (20,7 g, 150 mmol) i 50 ml aceton ble det satt metyl-4-hydroksyfenylacetat (5,0 g, 30 mmol) og benzylklorid (10,4 ml, 90 mmol), hvoretter blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 24 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 10 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen (7,7 g, 100 %) som et hvitt faststoff.

'H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 7,40 (m, 5 H), 7,21 (d, J = 6,6 Hz, 2 H), 6,95 (d, J =

6,6 Hz, 2 H), 5,05 (s, 2 H), 3,70 (s, 3 H), 3,59 (s, 2 H).

b) 2-(4-benzyloksyfenyl)-l-(5-metyltiazol-2-yl)etanon

Til en oppløsning av 5-metyltiazol (0,21 ml, 2,34 mmol) i 10 ml tørr THF ble det ved - 78 °C dråpevis satt n-BuLi (0,94 ml, 2,5 M oppløsning i heksaner, 2,34 mmol). Etter 15 min ble metyl-4-benzyloksyfenylacetat (0,5 g, 1,95 mmol) i 5 ml tørr THF tilsatt dråpevis. Etter 30 min ble blandingen quenchet med 10 ml mettet NH4CI, oppvarmet til romtemperatur og ekstrahert med 3 x 20 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert over silikagel med 15 % EtOAc:heksaner for å gi tittelforbindelsen som et hvitt faststoff (532 mg, 51 %):

MS (ES) m/e 324 (M + H)<+>.

c) Etyl-(±)-4-(4-benzyloksyfenyl)-3-(5-metyltiazol-2-yl)-krotonat

Til en suspensjon av NaH (79 mg, 1,98 mmol) i 2 ml tørr THF ble det ved romtemperatur dråpevis satt trietylfosfonoacetat (0,39 ml, 1,98 mmol). Etter 15 min ble en opp-løsning av 2-(4-benzyloksyfenyl)-l-(5-metyltiazol-2-yl)etanon (320 mg, 0,99 mmol) i 3 ml tørr THF tilsatt dråpevis og blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur, quenchet med 10 ml mettet NH4CI og ekstrahert med 3 x 20 ml EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Den resulterende gule olje ble benyttet i det neste trinn uten ytterligere rensing.

MS(ES)m/e394(M + H)<+>.

d) Metyl-(±)-3-(5-metyltiazol-2-yl)-4-(4-benzyloksyfenyl)butanoat

Etyl-(±)-3-(5-metyltiazol-2-yl)-4-(4-benzyloksyfenyl)krotonat (0,99 mmol, uren) ble

oppløst i 5 ml MeOH og magnesiumspon (120 mg, 4,95 mmol) ble tilsatt ved romtemperatur. Etter 72 timer ble blandingen helt i 75 ml 10 % HC1 og ekstrahert med 3 x 50 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi den urene tittelforbindelse. Denne ble benyttet uten rensing.

MS(ES)m/e382(M + H)<+>.

e) Metyl-(±)-3-(5-metyltiazol-2-yl)-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-(5-metyltiazol-2-yl)-4-(4-benzyloksyfenyl)butanoat

(0,99 mmol, uren) i 5 ml EtSH ble det ved romtemperatur satt 0,6 ml BF3 • OEt2. Etter 18 timer ble ytterligere 0,6 ml BF3 • OEt2 tilsatt. Etter ytterligere 18 timer ble blandingen avkjølt til 0 °C og forsiktig quenchet med mettet NaHCC"3. Den resulterende blanding ble ekstrahert med 3 x 25 ml CH2C12. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgSC«4, filtrert og konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 50 % EtOAcrheksaner for å gi tittelforbindelsen (249 mg, 86 % over 3 trinn) som et gult faststoff.

MS (ES) m/e 292 (M + H)<+>.

Fremstilling 7

Fremstilling av (4R,5S)-1 -akryloyl-3,4-dimetyl-5-fenylimidazolidin-2-on

Til en oppløsning av (4S,5R)-l,5-dimetyl-4-fenyl-2-imidazolidinon (45,0 g, 237 mmol) og (i-Pr)2NEt (62 ml, 355 mmol) i 1 200 ml CH2C12 ble det satt CuCl (50 mg,

0,51 mmol) og så akryloylklorid (29 ml, 355 mmol), og blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 2 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur, vasket med 3 x 400 ml H2O, tørket over MgS04 og konsentrert. Det resulterende faststoff ble triturert med 300 ml Et20 og samlet ved filtrering for å gi tittelforbindelsen (45,15 g, 78 %).

<!>H NMR (300 MHz, CDC13) 5 7,72 (dd, J = 17,0,10,5 Hz, 1 H), 7,20-7,38 (m, 3 H), 7,10-7,20 (m, 2 H), 6,40, (dd, J = 17,0, 2,1 Hz, 1 H), 5,77 (dd, J= 10,4,2,0 Hz, 1 H), 5,36 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,85-4,00 (m, 1 H), 2,85 (s, 3 H), 0,82 (d, J = 6,6 Hz, 3 H);

MS (ES) m/e 245 (M + H)<+>.

Fremstilling 8

Fremstilling av 4-metoksyfenylmagnesiumbromid

En oppløsning av 4-metoksybenzylklorid (120 g, 766 mmol) i 1,01 tørr THF ble dråpevis og i løpet av 1,5 timer satt til en oppløsning av magnesiumspon (74 g, 3,04 mol) og I2 (50 mg, 0,20 mmol) i 0,5 1 tørr THF ved romtemperatur. I løpet av de første 10 minut-tene av tilsetningen forsvant den brune farge og reaksjonen ble varm. Én time etter at tilsetningen var ferdig vendte reaksjonsblandingen tilbake til romtemperatur. Titrering ved bruk av 1,10-fenantrolin indikerte at oppløsningen var 0,36 M Grignard-reagens i

THF.

Fremstilling 9

Fremstilling av etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat

(a) (4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(E)-3-(3-lfuorfenyl)prop-2-enoyI]-5-fenyI-imidazolidin-2-on

En oppløsning av l-brom-3-fluorbenzen (525 mg, 3 mmol), (4R,5S)-l-akryloyl-3,4-di-metyl-5-fenylimidazolidin-2-on (500 mg, 2 mmol), Pd(OAc)2 (22 mg, 0,10 mmol), P(o-tolyl)3 (61 mg, 0,20 mmol) og (i-Pr)2NEt (0,73 ml, 4,2 mmol) i 10 ml tørr DMF ble avgasset (3 x vakuum/N2-spyling) og så oppvarmet til 110 °C. Etter 2 timer ble blandingen avkjølt og helt i EtOAc. Den resulterende blanding ble vasket 3 ganger med H20 og de kombinerte, vandige sjikt ble ekstrahert tilbake med EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert gjennom en plugg av silikagel og konsentrert. Resten ble tatt opp i 10 ml 1:1 Et20:heksaner og avkjølt til -20 °C over natten. Faststoffet ble samlet og tørket under vakuum for å gi tittelforbindelsen (514 mg, 76 %).

'H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 8,18 (d, J = 15,9 Hz, IH), 7,64 (d, J = 15,9 Hz, 1 H), 7,15-7,45 (m, 8 H), 6,98-7,10 (m, 1 H), 5,42 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,88-4,03 (m, 1 H), 2,88 (s, 3 H), 0,85 (d, J = 6,6 Hz, 3 H);

MS(ES)m/e339(M + H)<+>.

(b) (4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-(4-metoksyfenyl)butanoyl]-5-fenylimidazolidin-2-on

En oppløsning av 4-metoksyfenylmagnesiumbromid i THF (0,31 M, 14,7 ml,

4,56 mmol) ble dråpevis satt til en omrørt suspensjon av (4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(E)-3-(3-fluorfenyl)prop-2-enoyl]-5-fenylimidazolidin-2-on (514 mg, 1,52 mmol), CuBr • DMS-kompleks (229 mg, 1,06 mmol) og Znl2 (582 mg, 1,82 mmol) i 10 ml THF:toluen ved -15 °C. Etter 1,5 timer ble reaksjonsblandingen quenchet med mettet NH4CI og ekstrahert med 3 x EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04 og

konsentrert til tørr tilstand. Resten ble tatt opp i 1:1 Et20:heksaner og avkjølt til -20 °C i 18 timer. Faststoffet ble samlet, vasket med Et20:heksaner 1:1, og tørket under vakuum for å gi en første høst av tittelforbindelsen. Filtratet ble konsentrert og resten renset ved flashkromatografi på silikagel med 30 % EtOAc:heksaner for å gi ytterligere tittelforbindelse som en gul olje som størknet under vakuum. Det totale utbyttet av tittelforbindelsen var 0,62 g (91 %).

<J>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 6,75-7,37 (m, 13 H), 5,10 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,80 (s, 3 H), 3,65-3,85 (m, 1 H), 3,63 (dd, J = 16,7,9,6 Hz, 1 H), 3,36-3,41 (m, 1 H), 3,14 (dd, J = 16,7,4,9 Hz, 1 H), 2,72-2,88 (m, 2 H), 2,79 (s, 3 H), 0,74 (d, J = 6,6 Hz, 3 H).

(c) Etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-(4-metoksyfenyl)butanoat

En oppløsning av 21 % NaOEt i EtOH (0,6 ml, 1,8 mmol) ble satt til en oppløsning av (4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(S)-3-(3-fiuorfenyl)-4-(4-metoksyfenyl)butanoyl]-5-fenylimida-zolidin-2-on (620 mg, 1,38 mmol) i 10 ml THF. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time og så quenchet med mettet NH4CI. EtOAc-ekstrahering, tørking over MgS04 og konsentrering etterlot en rest som ble filtrert gjennom en plugg av silikagel (15 % EtOAc:heksaner. Filtratet ble konsentrert for å gi tittelforbindelsen (263 mg, 60 %) som en klar olje. 1 NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,13-7,35 (m, 1 H), 6,80-7,00 (m, 5 H), 6,70-6,80 (m, 2 H), 4,00 (q, J = 7,1 Hz, 2 H), 3,81 (s, 3 H), 3,28-3,45 (m, 1 H), 2,83 (d, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,65 (dd, J = 15,4,6,4 Hz, 1 H), 2,56 (dd, J = 15,4, 8,7 Hz, 1 H), 1,12 (t, J =

7,1 Hz, 3 H).

(d) Etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat

Til en oppløsning av etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-(4-metoksyfenyl)butanoat (263 mg, 0,83 mmol) i 5 ml CH2C12 ble det ved -15 °C satt etantiol (0,30 ml, 4,16 mmol), fulgt av AICI3 (555 mg, 4,16 mmol). Etter 30 min ble blandingen oppvarmet til romtemperatur, omrørt i ytterligere 30 min og så helt over is. Isen ble tillatt å smelte og blandingen ble ekstrahert 3 ganger med CH2CI2. Tørking over MgSC<4 og konsentrering etterlot en rest som ble filtrert gjennom en plugg av silikagel (30 % EtOAc:heksaner). Konsentrasjon av filtratet ga tittelforbindelsen (250 mg, kvantitativ).

'H NMR (300 MHz, CDCI3) 6 7,10-7,35 (m, 1 H), 6,78-7,00 (m, 5 H), 6,58-6,78 (m, 2 H), 5,00 (s, 1 H), 4,00 (q, 2 H), 3,28-3,45 (m, 1 H), 2,83 (d, 2 H), 2,50-2,75 (m, 2 H), 1,17 (t, 3 H).

Fremstilling 10

Fremstilling av etyl-(±)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat

(a) 2-(tert-butyldimetylsilyloksy)-2-(pyridin-3-yl)acetonitril

Til en oppløsning av 3-pyridinkarboksaldehyd (1,0 g, 9,34 mmol) i 45 ml CH3CN ble det satt KCN (6,0 g, 93 mmol), TBDMSCI (1,7 g, 11,21 mmol) og Znl2 (50 mg,

0,16 mmol). Etter 4 timer ved romtemperatur ble blandingen filtrert gjennom Celite® og filtratet konsentrert. Flashkromatografi på silikagel med 25 % EtOAc :heksaner, ga tittelforbindelsen (2,17 g, 94 %) som en klar olje.

'H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 8,63-8,73 (m, 2 H), 7,80-7,87 (m, 1 H), 7,33-7,41 (m, 1 H), 5,57 (s, 1 H), 0,97 (s, 9 H), 0,27 (s, 3 H), 0,19 (s, 3 H).

(b) (±)-3-(4-benzyloksyfenyl)-2-(tert-butyldimetylsilyloksy)-2-(pyridin-3-yl)-propionitril

LD A ble fremstilt ved tilsetning av n-BuLi (2,5 M i heksaner, 1,93 ml, 4,83 mmol) til en oppløsning av diisopropylamin (0,63 ml, 4,83 mmol) i 5 ml tørr THF ved 0 °C. LDA-oppløsningen ble dråpevis satt til en oppløsning av 2-(tert-butyldimetylsilyloksy)-2-(pyridin-3-yl)acetonitril (1,0 g, 4,03 mmol) i 15 ml tørr THF ved -78 °C. Opp-løsningen ble omrørt i 15 min og deretter ble 4-benzyloksybenzylklorid (1,41 g, 6,05 mmol) tilsatt som et faststoff, alt på én gang. Reaksjonsblandingen ble holdt ved -78 °C i 15 min og så varmet opp til romtemperatur. Etter 30 min ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen quenchet med mettet, vandig NH4CI og omrørt i 20 min. Ekstrahering 3 ganger med EtOAc, tørking over MgS04, konsentrering og flashkromatografi over silikagel med 20 % EtOAc:heksaner, ga tittelforbindelsen (769 mg, 43 %) som en gul olje.

<!>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 8,80 (snever m, 1 H), 8,67-8,70 (m, 1 H), 7,75-7,80 (m, 1 H), 7,33-7,53 (m, 6 H), 7,08 (d, 2 H), 6,93 (d, 2 H), 5,10 (s, 2 H), 3,30 (1/2 Abq, 1 H), 3,18 (1/2 Abq, 1 H), 0,99 (s, 9 H), 0,12 (s, 3 H), 0,08 (s, 3 H).

(c) 2-(4-benzyIoksyfenyl)-l -(pyridin-3-yl)etanon

En oppløsning av TBAF i THF (1,0 M, 2,2 ml, 2,2 mmol) ble dråpevis satt til en opp-løsning av (±)-3-(4-benzyloksyfenyl)-2-(tert-butyldimetylsilyloksy)-2-(pyridin-3-yl)-propionitril (769 mg, 1,73 mmol) i 10 ml tørr THF ved -15 °C. Etter 30 min ble reaksjonsblandingen fordelt mellom EtOAc og H2O. Sjiktene ble separert og det organiske sjikt vasket med H2O, tørket over MgS04, filtrert gjennom en plugg av silikagel og konsentrert for å gi en uren tittelforbindelse (492 mg, 94 %) som et gult faststoff.

MS(ES)m/e304(M + H)<+>.

Dette materialet ble benyttet uten ytterligere rensing.

(d) Etyl-4-(4-benzyloksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)but-2-enoat

Trietylfosfonoacetat (0,70 ml, 3,46 mmol) ble dråpevis satt til en suspensjon av NaH (60 % dispersjon i mineralolje, 138 mg, 3,46 mmol) i 5 ml tørr THF ved romtemperatur. Etter at gassutviklingen ga seg ble en oppløsning av 2-(4-benzyloksyfenyl)-l-(pyridin-3-yl)etanon [ca. 1,73 mmol, urent materiale fra fremstilling 10 (c)] i 5 ml tørr THF tilsatt og blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur, quenchet med mettet, vandig NH4CI og ekstrahert med 3 x EtOAc. De kombinerte, organiske væsker ble tørket over MgS04 og så konsentrert for å gi en uren tittelforbindelse.

MS (ES) m/e 374 (M + H)<+>.

Dette materiale ble benyttet uten ytterligere rensing.

(e) Etyl-(±)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat

En blanding av etyl-4-(4-benzyloksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)but-2-enoat (1,73 mmol) og 200 mg 10 % Pd:C i 10 ml EtOH ble ristet under et hydrogentrykk på 50 psi på en Parr-apparatur. Etter 4 timer ble blandingen filtrert gjennom Celite® og filtratet konsentrert. Flashkromatografi på silikagel med 50 % EtOAc:heksaner ga den urene tittelforbindelse (327 mg, 66 % over tre trinn) som en gul olje.

MS (ES) m/e 286 (M + H)<+>.

Dette materiale ble benyttet uten ytterligere rensing.

Fremstilling 11

Fremstilling av etyl-(S)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat

(a) (4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(E)-3-(pyridin-3-yl)prop-2-enoyl]-5-fenylimida-zoIidin-2-on

En oppløsning av 3-brompyridin (8,6 ml, 88,5 mmol), (4R,5S)-l-akryloyl-3,4-dimetyl-5-fenylimidazolidin-2-on (14,4 g, 59 mmol), Pd(OAc)2 (662 mg, 2,95 mmol), P(o-tolyl)3 (1,80 g, 5,9 mmol) og (i-Pr)2NEt (22 ml, 124 mmol) i 300 ml tørr DMF ble avgasset (3 x vakuum/N2-spyling) og så oppvarmet til 110 °C. Etter 2 timer ble blandingen avkjølt og helt i EtOAc. Den resulterende blanding ble vasket med 3 x H20 og de kombinerte, vandige sjikt ekstrahert tilbake 2 ganger med EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert gjennom en plugg av silikagel og konsentrert. Resten ble tatt opp i EtOAc :heksaner 1:1 og faststoffet samlet, vasket med 1:1 EtOAc:heksaner og tørket under vakuum for å gi en første høst av tittelforbindelsen. Filtratet ble konsentrert og krystalliseringsprosessen gjentatt for å oppnå en andre høst. Det totale utbyttet av tittelforbindelsen var 17,53 g (92 %).

<*>H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,48-8,85 (m, 2 H), 8,25 (d, J = 15,9 Hz, 1 H), 7,89-7,97 (m, 1 H), 7,68 (d, J = 15,9 Hz, 1 H), 7,15-7,38 (m, 6 H), 5,43 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,90-4,02 (m, 1 H), 2,88 (s, 3 H), 0,85 (d, J = 6,6 Hz, 3 H).

MS (ES) m/e 322 (M + H)<+>.

(b) (4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(S)-4-(4-metoksyfenyl)-3-(pyridin-3-yI)butanoyl]-5-fenylimidazolidin-2-on

En oppløsning av 4-metoksyfenylmagnesiumbromid i THF (0,33 M, 495 ml,

163,5 mmol) ble dråpevis satt til en omrørt suspensjon av (4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(E)-3-(pyridin-3-yl)prop-2-enoyl]-5-fenylimidazolidin-2-on (17,53 g, 54,5 mmol), CuBr • DMS-kompleks (14,1 g, 65,4 mmol) og Znl2 (20,9 g, 65,4 mmol) i 270 ml THF:toluen ved -15 °C. Etter 1 time ble reaksjonsblandingen quenchet med mettet NH4Cl:konsentrert NH4OH 9:1 og blandingen omrørt åpen til luft i 30 min. Blandingen ble fortynnet med H20 og ekstrahert 3 ganger med EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04 og konsentrert. Resten ble tatt opp i 200 ml metyl-tert-butyleter (MTBE) og lagret ved -20 °C over natten. Faststoffet ble samlet, vasket med MTBE og tørket under vakuum. Dette materialet ble omkrystallisert fra heksaner:EtOAc 3:1 for å gi tittelforbindelsen (19,408 g, 80 %).

'H NMR (400 MHz, CDCI3) 8 8,72 (br s, 2 H), 7,50 (snever m, 1 H), 7,12-7,35 (m,

4 H), 6,97-7,03 (m, 2 H), 6,94 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,72 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 5,11 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 3,70-3,90 (m, 2 H), 3,70 (s, 3 H), 3,43-3,58 (m, 1 H), 3,03-3,18 (m, 1 H), 2,75-2,95 (m, 2 H), 2,71 (s, 3 H), 0,66 (d, J = 6,5 Hz, 3 H);

MS (ES) m/e 444 (M + H)<+>.

(c) Etyl-(S)-4-(4-metoksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat

En oppløsning av 21 % NaOEt i EtOH (18,4 ml, 56,88 mmol) ble satt til en oppløsning av(4R,5S)-3,4-dimetyl-l-[(S)-4-(4-metoksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoyl]-5-fenyl-imidazolidin-2-on (19,408 g, 43,8 mmol) i 200 ml THF ved 0 °C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time og så quenchet med mettet NH4CI og ekstrahert 3 ganger med EtOAc. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04 og konsentrert. Resten ble tatt opp i 1:1 EtOAc:heksaner og filtrert, og filtratet ble filtrert gjennom en plugg av silikagel (1:1 EtOAc:heksaner). Filtratet ble konsentrert for å gi tittelforbindelsen (9,25 g, 71 %) som en orangefarget olje.

lK NMR (400 MHz, CDCI3) 8 8,57 (br s, 2 H), 7,44 (snever m, 1 H), 7,17-7,25 (m,

1 H), 6,95 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,76 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 4,01 (q, J = 7,1 Hz, 2 H), 3,75 (s, 3 H), 3,33-3,48 (m, 1 H), 2,91 (dd, J = 13,7, 7,3 Hz, 1 H), 2,85 (dd, J = 13,7,7,8 Hz, 1 H), 2,71 (dd, J = 15,6, 6,5 Hz, 1 H), 2,61 (dd, J = 15,6, 8,7 Hz, 1 H), 1,13 (t, J =

7,1 Hz, 3 H);

MS (ES) m/e 300 (M + H)<+>.

(d) Etyl-(S)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat

En oppløsning av etyl-(S)-4-(4-metoksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat (9,25 g,

31 mmol) i 150 ml CH2C12 ble avkjølt til 0 °C. Etantiol (11,5 ml, 155 mmol) ble tilsatt og deretter ble AICI3 (20,7 g, 155 mmol) tilsatt porsjonsvis. Etter 2 timer ble blandingen helt over is, tillatt oppvarming til romtemperatur og nøytralisert med NaHC03. Den resulterende suspensjon ble filtrert gjennom Celite® og filterputen vasket med CH2C12. Sjiktene ble separert og det vandige sjikt ekstrahert med CH2C12. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgSCM og konsentrert. Flashkromatografi over silikagel med EtOAc:heksaner 1:1 ga tittelforbindelsen (6,435 g, 73 %).

<!>H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,72, 8,41 (dd, J = 4,9,1,5 Hz, 1 H), 8,24 (snever m,

1 H), 7,26 (dd, J = 7,8, 4,9 Hz, 1 H), 6,78 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 6,64 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 4,03 (q, J = 7,1 Hz, 2 H), 3,34-3,48 (m, 1 H), 2,92 (dd, J = 13,7, 6,1 Hz, 1 H), 2,69-2,81 (m, 2 H), 2,64 (dd, J = 15,6, 8,7 Hz, 1 H), 1,13 (t, J = 7,1 Hz, 3 H);

MS (ES) m/e 286 (M + H)<+>.

Eksempel 1

Fremstilling av (±)-4- [4- [2- [6-(metylamino)pyridin-2-yl]-1 -etoksy] feny 1]-3- [4-(tri-fluormetyl)fenyl] butansyre

a) Etyl-(±)-4-[4-[2-[6-(met>lamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluor-metyl)fenyl]butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,15 ml, 0,767 mmol) ble i løpet av 2 min satt til en opp-løsning av etyl-(±)-4-(4-hy(koksyfenyl)-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]butanoat (270 mg, 0,767 mmol), 6-(metylamino)-2-pyridyletanol (130 mg, 0,92 mmol) og trifenylfosfin (200 mg, 0,767 mmol) i 5 ml vannfri THF ved 0 °C under N2. Den gule oppløsning ble holdt ved 0 °C i 10 min og så oppvarmet til romtemperatur. Etter 24 timer ble reaksjonsblandingen konsentrert og resten kromatografert på silikagel med 20 % EtOAc:heksaner. Tittelforbindelsen (200 mg, 54 %) ble oppnådd som en fargeløs olje.

MS (ES) m/e 487 (M + H)<+>.

b) (±)-4-[4-[2-[6-(mer>'lamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluor-metyl)fenyl] butansy re

1,0 N NaOH (8,2 ml, 0,823 mmol) ble dråpevis satt til en 15 °C avkjølt oppløsning av etyl-(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluormetyl)-fenyljbutanoat (200 mg, 0,41 mmol) i 3 ml MeOH og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 24 timer. Den resulterende oppløsning ble konsentrert under vakuum og resten oppløst i 5 ml H2O. pH-verdien ble justert til 5 med 1,0 N HC1 og presipitatet ble samlet, vasket med en liten mengde vann og tørket under vakuum ved 60 °C. Tittelforbindelsen (120 mg, 64 %) ble oppnådd som et hvitt, skumaktig faststoff.

MS(ES)m/e459(M + H)<+>.

Elementanalyse for C25H25FN2O3 • 0,85 H20

Beregnet: C 63,38, H5,68, N5,91,

Funnet: C 63,23, H5.41, N5.73.

Eksempel 2

Fremstilling av (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[(N-metyI-N-fenylamino)karbonyl] -1,3-oksazol-2-yl] -butansyre

a) Metyl-(±)-3-[4-[(N-metyl-N-fenylamino)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-karboksy-l,3-oksazol-2-yl]-4-[4-[(tert-butyloksy-karbonyl)oksy]fenyl]butanoat (150 mg, 0,37 mmol), (i-Pr)2NEt (0,1 ml, 0,56 mmol), pyridin (0,09 ml, 1,11 mmol) og N-metylanilin (0,06 ml, 0,56 mmol) i 2 ml tørr DMF ble det satt BPFFH (382 mg, 1,11 mmol) ved romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble tatt opp i 20 ml 10 % HC1 og ekstrahert med 3 x 20 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgSC>4, filtrert og konsentrert.

Resten ovenfor ble oppløst i 10 ml 4 N HC1 i dioksan ved romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble kromatografert over silikagel med 75 %

EtOAc:heksaner for å gi 146 mg av tittelforbindelsen som et orangefarget skum som var forurenset med bis(pentametylen)urea.

MS(ES)m/e417(M + H)<+>.

b) Metyl-(±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[(N-metyl-N-fenylamino)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl)]butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,15 ml, 0,74 mmol) ble satt til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-[(N-metyl-N-fenylamino)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)-butanoat (146 mg, 0,37 mmol), 6-(metylamino)-2-pyridyletanol (113 mg, 0,74 mmol) og trifenylfosfin (194 mg, 0,74 mmol) i 2 ml CH2C12 ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert og resten kromatografert på silikagel med 50 % THF:heksaner. Fraksjoner inneholdende produktet, ble konsentrert for å gi tittelforbindelsen (322 mg), forurenset med trifenylfosfinoksid.

MS (ES) m/e 529(M + H)<+>.

c) (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[(N-fenyl-N-metylamino)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-butansyre

Til en oppløsning av 322 mg metyl-(±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]-fenyl]-3-[4-[(N-metyl-N-fenylamino)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl)]butanoat i 2 ml THF:H20 1:1 ble det ved romtemperatur satt 1,0 N LiOH (0,35 ml, 0,35 mmol). Etter 18 timer ble blandingen surgjort til pH 6 ved bruk av 10 % HC1 og det hele så konsentrert til tørr tilstand. Resten ble renset ved reversfase-HPLC med en gradient 10 -> 80 % CH3CN:H20 inneholdende 0,1 % TF A. Fraksjonene inneholdende produktet ble kombinert og konsentrert for å fjerne CH3CN. Den resulterende, vandige oppløsning ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen (33 mg, 29 % over 3 trinn) som et hvitt faststoff.

MS(ES)m/e515(M + H)<+>.

Elementanalyse for CMH30N4O5 • 1,85 TFA:

Beregnet: C 54,13, H4,42, N7.72,

Funnet: C 54,17, H4,50, N7,52.

Eksempel 3

Fremstilling av (±)-4-[4-[2-[6-(metyIamino)pyridin-2-ylJ-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(morfolin-4-yl)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-butansyre

a) Metyl-(±)-3-[4-(morfolin-4-yl)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-4-(4-hydroksy-fenyl)butanoat

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-karboksy-l,3-oksazol-2-yl]-4-[4-[(tert-butyloksy-karbonyl)oksy]fenyl]butanoat (150 mg, 0,37 mmol), (i-Pr^NEt (0,1 ml, 0,56 mmol), pyridin (0,09 ml, 1,11 mmol) og morfolin (0,05 ml, 0,56 mmol) i 2 ml tørr DMF ble det satt BPFFH (382 mg, 1,11 mmol) ved romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble tatt opp i 20 ml 10 %-ig HC1 og ekstrahert med 3 x 20 ml CH2CI2. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgSC>4, filtrert og konsentrert.

Resten ovenfor ble oppløst i 10 ml 4 N HC1 i dioksan ved romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble kromatografert over silikagel med 100 % EtOAc for å gi tittelforbindelsen (122 mg, 88 %) som en klar olje.

lU NMR (300 MHz, CDC13) 8 8,05 (s, 1 H), 7,88 (d, J = 6,6 Hz, 2 H), 6,70 (d, J =

6,6 Hz, 2 H), 5,9 (s, 1 H), 3,73 (bs, 8 H), 3,62 (s, 3 H), 2,85 (m, 5 H).

b) Mety l-(±)-4- [4- [2-(6-metyIaminopy ridin-2-y 1)-1 -etoksy ] fenyl] -3- [4-(morfo!in-4-yl)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl)]butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,13 ml, 0,66 mmol) ble satt til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-(morfolin-4-yl)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat (122 mg, 0,37 mmol), 6-(metylamino)-2-pyridyletanol (100 mg, 0,66 mmol) og trifenylfosfin (173 mg, 0,66 mmol) i 2 ml CH2CI2 ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert og resten kromatografert over silikagel med 100 % EtOAc. Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert for å gi 94 mg av tittelforbindelsen, forurenset med trifenylfosfinoksid.

MS (ES) m/e 509 (M + H)<+>.

c) (±)-4- [4-[2- [6-(metylamino)pyridin-2-yl] -1 -etoksy] fenyl] -3- [4-(morfolin-4-yl)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-butansyre

Til en oppløsning av metyl-(±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(morfolin-4-yl)karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl)]butanoat (94 mg, 0,18 mmol) i 2 ml THF/H20 1:1 ble det ved romtemperatur satt 1,0 N LiOH (0,25 ml, 0,25 mmol). Etter 18 timer ble blandingen surgjort til pH 6 ved bruk av 10 % HC1 og så konsentrert til tørr tilstand. Resten ble renset ved reversfase HPLC med gradient 15 -> 35 % CH3CN:H20 inneholdende 0,1 % TF A. Fraksjonene inneholdende produktet ble kombinert og konsentrert for å fjerne CH3CN. Den resulterende, vandige oppløsning ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen (23 mg, 26 % over 2 trinn) som et hvitt faststoff.

MS (ES) m/e 495 (M + H)<+>.

Elementanalyse for C26H30N4O6 • 1,75 TFA:

Beregnet: C 49,76, H4,78, N7.87,

Funnet: C 49,93, H4,97, N7,84.

Eksempel 4

Fremstilling av (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksylfenyl]-3-[4-[[N-metyl-N-(2,2,2-trifluoretyl)amino]karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-butansyre

a) Metyl-(±)-3-[4-[[N-metyl-N-(2,2,2-trifluoretyl)amino]karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat

Til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-karboksy-l,3-oksazol-2-yl]-4-[4-[(tert-butyloksy-karbonyl)oksy]fenyl]butanoat (150 mg, 0,37 mmol), (i-Pr)2NEt (0,1 ml, 0,56 mmol), pyridin (0,09 ml, 1,11 mmol) og N-metyl-N-(2,2,2-trifluoretyl)arnin-hydroklorid (84 mg, 0,56 mmol) i 2 ml tørr DMF ble det satt BPFFH (382 mg, 1,11 mmol) ved romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble tatt opp i 20 ml 10 % HC1 og ekstrahert med 3 x 20 ml CH2Cl2. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert.

Resten ovenfor ble oppløst i 10 ml 4 N HC1 i dioksan ved romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert. Resten ble kromatografert på silikagel med 60 % EtOAc:-heksaner for å gi 298 mg av tittelforbindelsen som en klar olje forurenset med bis-(pentametylen)urea. Oljen ble benyttet i det neste trinn uten ytterligere rensing.

b) Metyl-(±)-4-[4-[2-(6-met\laminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[[N-metyl-N-(2,2,2-trifluoretyl)amino] karbonyl]-l ,3-oksazol-2-yl)] butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,15 ml, 0,74 mmol) ble satt til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-[[>I-metyl-N-(2,2,2-triflu^ hydroksyfenyl)butanoat (298 mg, 0,37 mmol), 6-(metylamino)-2-pyridyletanol (113 mg, 0,74 mmol) og trifenylfosfin (194 mg, 0,74 mmol) i 2 ml CH2C12 ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert og resten kromatografert over silikagel med 40 % EtOAc:heksaner. Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert for å gi 115 mg av tittelforbindelsen forurenset med trifenylfosfinoksid.

MS (ES) m/e 535 (M + H)<+>.

c) (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenylJ-3-[4-[[N-metyl-N-(2,2,2-trifluoretyl)amino]karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]-butansyre

Til en oppløsning av metyl-(±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[|^-metyl-N-(2,2,2-trifluoretyl)amino]karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl)]butanoat (115 mg, 0,22 mmol) i 2 ml THF:H20 1:1 ble det ved romtemperatur satt 1,0 N LiOH (0,32 ml, 0,32 mmol). Etter 18 timer ble blandingen surgjort til pH 6 ved bruk av 10 % HC1 og så konsentrert til tørr tilstand. Resten ble renset ved reversfase HPLC med en gradient 10 -> 80 % CH3CN:H20 inneholdende 0,1 % TFA. Fraksjonene inneholdende produktet ble kombinert og konsentrert for å fjerne CH3CN. Den resulterende, vandige oppløsning ble lyofilisert for å gi tittelforbindelsen (42 mg, 37 % over 3 trinn) som et hvitt faststoff.

MS (ES) m/e 522 (M + H)<+>.

Elementanalyse for CÆ7F3N4O5 • 1,4 TFA:

Beregnet: C 49,09, H4,21, N8,24,

Funnet: C 49,18, H4,18, N8,22.

Eksempel 5

Fremstilling av (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]butansyre

a) Metyl-(±)-4- [4- [2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l -etoksy] fenyl]-3- [4-(trifluor-metyl)tiazol-2-yl] butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,14 ml, 0,71 mmol) ble satt til en oppløsning av metyl-(±)-3-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]-4-hydroksyfenyl)butanoat (123 mg, 0,37 mmol), 6-(metylamino)-2-pyridyletanol (108 mg, 0,71 mmol) og trifenylfosfin (186 mg,

0,71 mmol) i 2 ml CH2CI2 ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble blandingen konsentrert og resten kromatografert på silikagel med 40 % EtOAc i toluen:heksaner 1:1. Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert for å gi tittelforbindelsen i en mengde av 114 mg, forurenset med redusert DIAD.

MS (ES) m/e 480 (M + H)<+>.

b) (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluor-metyl)tiazol-2-yl]-butansyre

Til en oppløsning av metyl-(±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluormetyl)tiazol-2-yl]butanoat (114 mg, 0,24 mmol) i 2 ml THF:H20 1:1 ble det ved romtemperatur satt 1,0 N LiOH (0,36 ml, 0,36 mmol). Etter 18 timer ble blandingen surgjort til pH 6 ved bruk av 10 % HC1. Den resulterende faststoff ble samlet ved filtrering og tørket under vakuum ved 50 °C for å gi tittelforbindelsen (43 mg, 42 %) som et hvitt faststoff.

MS (ES) m/e 466 (M + H)<+>.

Elementanalyse for C22H22F3N3O3S ■ 0,2 H20:

Beregnet: C 56,33, H4.81, N8,96,

Funnet: C 56,34, H4,69, N8,88.

Eksempel 6

Fremstilling av (±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-(5-metyltiazol-2-yl)butansyre

a) Metyl-(±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-(5-metyltiazol-2-yl)butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,25 ml, 1,28 mmol) ble satt til en suspensjon av metyl-(±)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(5-metyltiazol-2-yl)butanoat (249 mg, 0,85 mmol), 6-(metyl-amino)-2-pyridyletanol (194 mg, 1,28 mmol) og trifenylfosfin (336 mg, 1,28 mmol) i 5 ml TBME ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 72 timer ble blandingen konsentrert og resten kromatografert på silikagel med 30 % EtOAc:CHCi3. Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert for å gi 385 mg av tittelforbindelsen, forurenset med trifenylfosfinoksid.

MS (ES) m/e 426 (M + H)<+>.

b) (±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-(5-metyltiazol-2-yl)butansyre

Til en oppløsning av metyl-(±)-4-[4-[2-(6-metylaminopyridin-2-yl)-l-etoksy]fenyl]-3-(5-metyltiazol-2-yl)butanoat (0,85 mmol) i 5 ml THF:H20 1:1 ble det satt 1,0 N NaOH (1,28 ml, 1,28 mmol). Etter 18 timer ble blandingen surgjort til pH 6 ved bruk av 10 % HC1 og så konsentrert til tørr tilstand. Resten ble kromatografert på silikagel med EtOH for å gi tittelforbindelsen som et gult faststoff (217 mg, 62 % over 2 trinn).

MS (ES)m/e412(M + H)<+>.

Elementanalyse for C22H25N3O3S • 1,2 H20:

Beregnet: C 61,01, H6,38, N9.70,

Funnet: C 61,25, H6,06, N9,32.

Eksempel 7

Fremstilling av (S)-3-(3-nuorfenyl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)etoksy] fenyl] butansy re

(a) Etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-etoksy] fenyl] butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,20 ml, 1,0 mmol) ble dråpevis satt til en oppløsning av etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat (250 mg, 0,83 mmol), 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol (178 mg, 1,0 mmol) og trifenylfosfin (262 mg, 1,0 mmol) i 5 ml vannfri THF ved romtemperatur. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen konsentrert og resten flashkromatografert på silikagel med Et20:heksaner 5:1 for å oppnå en uren tittelforbindelse (236 mg, 61 %).

MS(ES)m/e463(M + H)<+>.

Denne ble benyttet uten ytterligere rensing.

(b) (S)-3-(3-lfuorfenyl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)etoksy]-fenyl]butansyre

1,0 N LiOH (0,76 ml, 0,76 mmol) ble satt til en oppløsning av etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-natfyridin-2-yl)etoksy]fenyl]butanoat (236 mg,

0,51 mmol) i 3 ml THF:H20 og blandingen ble oppvarmet til 50 °C. Etter 18 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur og surgjort til pH 6 med 10 % vandig HC1. 5 ml EtOAc ble tilsatt og blandingen omrørt heftig. Faststoffet ble samlet ved sugefiltrering, vasket 2 ganger med H20 og 2 ganger med Et20 og tørket under vakuum ved 50 °C for å gi tittelforbindelsen.

MS (ES)m/e435 (M + H)<+>.

Elementanalyse for C26H27FN203 • 2,25 HC1:

Beregnet: C 60,46, H5,71, N5.42,

Funnet: C 60,44, H5,34, N5,45.

Eksempel 8

Fremstilling av (±)-4- [4- [2- [6-(metylamino)pyridin-2-yl] etoksy] fenyl]-3-(py ridin-3-yl)butansyre

(a) Etyl-(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]etoksy]fenyl]-3-(pyridin-3-yl)-butanoat

Man arbeidet i henhold til prosedyren i eksempel 7(a) bortsett fra at man benyttet etyl-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat (327 mg urent, 1,15 mmol) i stedet for etyl-(S)-3-(3-fluorfenyl)-4-(4-hydroksyfenyl)butanoat og benyttet 6-(metylamino)-2-pyridyl-etanol (210 mg, 1,38 mmol) i stedet for 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-l-etanol, og tittelforbindelsen ble fremstilt som et urent, lyst orangefarget faststoff etter flashkromatografi på silikagel med 100 % EtOAc.

MS (ES) m/e 420 (M + H)<+>.

Dette materialet ble benyttet uten ytterligere rensing.

(b) (±)-4- [4-[2- [6-(metylamino)py ridin-2-y 1] etoksy] fenyl] -3-(py ridin-3-yl)-butansyre

1,0 N LiOH (3,45 ml, 3,45 mmol) ble satt til en oppløsning av etyl-(±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl] etoksy] fenyl] -3 -(pyridin-3-yl)butanoat (1,15 mmol) i 5 ml THF:H20 og blandingen ble oppvarmet til 50 °C. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og surgjort til pH 6 med 10 % vandig HC1. Blandingen ble ekstrahert 3 ganger med CHCI3 og de kombinerte, organiske sjikt tørket over MgS04 og konsentrert. Resten ble kromatografert på en C-18 Bond-Elute-kolonne med 20 % CH3CN:H20. Fraksjonene inneholdende produktet ble slått sammen og ekstrahert

3 ganger med CHC13 og de kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04 og konsentrert. Det resulterende faststoff ble tatt opp i 2 M NaOH og vasket 2 ganger med EtOAc. EtOAc-ekstraktene ble kassert. Det vandige sjikt ble surgjort til pH 6 og ekstrahert 3 ganger med CHCI3. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgS04 og konsentrert for å gi tittelforbindelsen (51 mg, 11%) som et hvitt faststoff. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) 8 8,32 (m, 2 H), 7,54 (dd, J = 8,7, 7,2 Hz, 1 H), 7,38-7,46 (m, 1 H), 7,12 (dd, J = 7,8, 4,9 Hz, 1 H), 6,86 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,68 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,52 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 6,37 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 4,15-4,30 (m, 2 H), 3,39-3,52 (m, 1 H), 2,98-3,20 (m, 3 H), 2,85 (s, 3 H), 2,80 (dd, J = 13,7, 8,9 Hz, 1 H), 2,68 (dd,

J = 15,1, 8,3 Hz, 1 H), 2,59 (dd, J = 15,1,6,7 Hz, 1 H);

MS (ES) m/e 392(M + H)<+>;

Elementanalyse for C23H25N3O3 • 1,3 HC1:

Beregnet: C 62,95, H6.04, N9.57,

Funnet: C 62,84, H5,87, N9,20.

Eksempel 9

Fremstilling av (S)-4- [4- [2- [6-(metylamino)pyridin-2-yl] etoksy] fenyl] -3-(pyridin-3-yl)butansyre

(a) Etyl-(S)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]etoksylfenyl]-3-(pyridin-3-yl)butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (7,8 ml, 39,8 mmol) ble dråpevis satt til en oppløsning av etyl-(S)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat (9,455 g, 33,1 mmol), 6-(metyl-amino)-2-pyridyletanol (6,06 g, 39,8 mmol) og trifenylfosfin (10,44 g, 39,8 mmol) i

150 ml vannfri THF ved 0 °C. Blandingen ble tillatt oppvarming til romtemperatur etter hvert som badet varmet seg opp. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen konsentrert og resten flashkromatografert på silikagel med 3 % MeOH i EtOAc:CHCl31:1 for å gi tittelforbindelsen (9,2 g, 66 %) som en viskøs, gul olje.

<!>H NMR (400 MHz, CDCI3) 6 8,43 (dd, J = 4,8,1,6 Hz, 1 H), 8,39 (d, J = 1,9 Hz, 1 H), 7,31-7,45 (m, 2 H), 7,13-7,21 (m, 1 H), 6,91 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,77 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,53 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 6,24 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 4,43-4,58 (m, 1 H), 4,26 (t, J = 7,0 Hz, 2 H), 3,92-4,05 (m, 2 H), 3,32-3,45 (m, 1 H), 3,04 (t, J = 7,0 Hz, 2 H), 2,89 (d, J = 5,3 Hz, 3 H), 2,88 (dd, J = 13,7, 7,2 Hz, 1 H), 2,82 (dd, J = 13,7, 7,8 Hz, 1 H), 2,70 (dd, J = 15,6, 6,3 Hz, 1 H), 2,59 (dd, J = 15,6,9,0 Hz, 1 H), 1,11 (t, J = 7,1 Hz, 3 H);

MS (ES) m/e 420 (M + H)<+>.

(b) (S)-4- [4- [2- [6-(metylamino)py ridin-2-yl] etoksy] fenyl] -3-(pyridin-3-yl)butansyre

2,0 M NaOH (15 ml, 30 mmol) ble satt til en oppløsning av etyl-(S)-4-[4-[2-[6-(metyl-amino)pyridin-2-yl]etoksy]fenyl]-3-(pyridin-3-yl)butanoat (9,2 g, 22 mmol) i 100 ml dioksan:H20 og blandingen ble oppvarmet til 50 °C. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og surgjort med 25 ml 10 % HC1 og konsentrert til 1/3 volum for å presipitere en gummi. Supernatanten ble dekantert og gummien fordelt mellom H2O og CHCI3. Sjiktene ble separert og det vandige sjikt ekstrahert 3 ganger med CHCI3. De kombinerte, organiske sjikt ble tørket over MgSC«4 og konsentrert, og resten tatt opp i H2O og 30 ml 2 M NaOH. Oppløsningen ble vasket 3 ganger med Et20 og Et20-ekstraktene ble kassert. Den vandige oppløsning ble surgjort med 50 ml 10 % HC1, konsentrert til 1/3 volum og ekstrahert 3 ganger med CHC13. De organiske sjikt ble kombinert, tørket over MgS04 og konsentrert for å etterlate et skum. Dette skum ble tatt opp i CH2CI2 og oppløsningen fortynnet med heksaner og konsentrert. Denne prosess ble gjentatt tre ganger. Det resulterende faststoff ble tørket under vakuum ved 65 °C for å gi tittelforbindelsen (7,96 g, 92 %).

<*>H NMR (400 MHz, MeOH-dj) 8 8,28 (snever m, 1 H), 8,21 (d, J = 1,7 Hz, 1 H), 7,68 (snever m, 1 H), 7,48 (dd, J = 8,5, 7,3 Hz, 1 H), 7,30 (dd, J = 7,9,4,9 Hz, 1 H), 6,91 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,72 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,56 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 6,44 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 4,20 (t, J = 6,6 Hz, 2 H), 3,31-3,42 (m, 1 H), 3,02 (t, J = 6,6 Hz, 2 H), 2,97 (dd, J = 13,6, 6,5 Hz, 1 H), 2,87 (s, 3 H), 2,77 (dd, J = 13,6, 8,9 Hz, 1 H), 2,71 (dd, J = 15,6,

6,4 Hz, 1 H), 2,62 (dd, J = 15,6, 8,9 Hz, 1 H);

MS (ES) m/e 392 (M + H)<+>;

Elementanalyse for C23H25N3O3 • 0,1 H2O:

Beregnet: C 70,25, H6,46, N 10,68,

Funnet: C 70,32, H6,50, N 10,32.

Eksempel 10

Fremstilling av (S)-3-(pyridin-3-yl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridiii-2-yl)-etoksy] fenyl] butansyre

(a) Etyl-(S)-3-(pyridin-3-yl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)-etoksy ] fenyl] butanoat

Diisopropylazodikarboksylat (0,41 ml, 2,1 mmol) ble dråpevis satt til en oppløsning av etyl-(S)-4-(4-hydroksyfenyl)-3-(pyridin-3-yl)butanoat (500 mg, 1,75 mmol), 2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyirdin-2-yl)-l-etanol (374 mg, 2,1 mmol) og trifenylfosfin (551 mg, 2,1 mmol) i 8 ml vannfri THF ved romtemperatur. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen konsentrert og resten flashkromatografert på silikagel med 90 % EtOAc:heksaner og så 5 % EtOH:EtOAc for å gi tittelforbindelsen (572 mg, 73 %) som en olje. •H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,43 (dd, J = 4,8,1,6 Hz, 1 H), 8,39 (d, J = 1,9 Hz, 1 H), 7,41 (snever m, 1 H), 7,17 (dd, J = 7,8,4,8 Hz, 1 H), 7,07 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,76 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,44 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 4,75 (br s, 1 H), 4,21 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,93-4,08 (m, 2 H), 3,31-3,45 (m, 3 H), 2,99 (t, J = 7,0 Hz, 2 H), 2,88 (dd, J = 13,7,7,2 Hz, 1 H), 2,82 (dd, J = 13,7,7,8 Hz, 1 H), 2,65-2,75 (m, 3 H), 2,59 (dd, J = 15,6, 9,0 Hz, 1 H), 1,85-1,95 (m, 2 H), 1,12 (t, J = 7,1 Hz, 3 H);

MS (ES) m/e 446 (M + H)<+>.

(b) (S)-3-(pyirdin-3-yl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naftyridin-2-yl)etoksy]-fenyl]butansyre

1,0 M LiOH (2,6 ml, 2,6 mmol) ble satt til en oppløsning av etyl-(S)-3-(pyridin-3-yl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-natfyridin-2-yl)etoksy]fenyl]butanoat (572 mg,

1,28 mmol) i 8 ml THF:H20 og blandingen ble oppvarmet til 50 °C. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og surgjort til pH 6,0 med 10 % HC1. Det presipiterte faststoff ble samlet ved sugefiltrering, vasket med H2O og tørket under vakuum for å gi tittelforbindelsen (414 mg, 77 %).

'H NMR (400 MHz, MeOH-dj) 8 8,28 (dd, J = 4,9,1,4 Hz, 1 H), 8,21 (d, J = 1,8 Hz,

1 H), 7,68 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,25-7,27 (m, 2 H), 6,91 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,71 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 6,53 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 4,08-4,22 (m, 2 H), 3,30-3,45 (m, 3 H), 2,90-3,05 (m, 3 H), 2,70-2,85 (m, 3 H), 2,68 (dd, J = 15,2,6,7 Hz, 1 H), 2,58 (dd, J = 15,2, 8,5 Hz, 1 H), 1,80-1,97 (m, 2 H);

MS(ES)m/e418(M + H)<+>.

Elementanalyse for C23H25N3O3 • 0,25 H20:

Beregnet: C 71,15, H6,57, N9,96,

Funnet: C 71,11, H6,66, N9,82.

Eksempel 11

Parenteralt enhetsdosepreparat

Et preparat inneholdende 20 mg av forbindelsen fra eksempel 1 som sterilt tørrpulver, fremstilles som følger: 20 mg av forbindelsen oppløses i 15 ml destillert vann. Opp-løsningen filtreres under sterile betingelser til en 25 ml multidoseampulle og lyofili-seres. Pulveret rekonstitueres ved tilsetning av 20 ml 5 % dekstrose i vann (D5W) for intravenøs eller intramuskulær injeksjon. Doseringen bestemmes derved ved injeksjons-volumet. Etterfølgende fortynning kan skje ved tilsetning av et tildosert volum av denne doseringsenhet til et annet volum D5W for injeksjon, eller en tilmålt dose kan settes til en annen mekanisme for utlevering av medikamentet, for eksempel en flaske eller pose for IV-dryppinfusjon eller et annet injeksjons-infusjonssystem.

Eksempel 12

Oralt enhetsdosepreparat

En kapsel for oral administrering fremstilles ved å blande og oppmale 50 mg av forbindelsen fra eksempel 1 med 75 mg laktose og 5 mg magnesiumstearat. Det resulterende pulver siktes og fylles i en hardgelatinkapsel.

Eksempel 13

Oralt enhetsdosepreparat

En tablett for oral administrering fremstilles ved å blande og granulere 20 mg sukrose, 150 mg kalsiumsulfatdihydrat og 50 mg av forbindelsen fra eksempel 1 med en 10 % gelatinoppløsning. De våte granuler siktes, tørkes, blandes med 10 mg stivelse, 5 mg talkum og 3 mg stearinsyre, og komprimeres til en tablett.

Beskrivelsen ovenfor angir fullt ut hvordan oppfinnelsen skal utføres og brukes. Imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset til de spesielle utførelsesformer som er beskrevet, men inkluderer alle modifikasjoner innenfor rammen av de følgende krav. Det henvises til de forskjellige referanser som journaler, patenter og andre publikasjoner, når det gjelder detaljer.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved formel (I): der: R<1> er der R' er Ci_4-alkyl og R" er fenyl, benzyl eller -CH2CF3; eller R' og R" sammen danner en morfolinylring; R<2> er eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R<2> er:

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R2 er:

4. Forbindelse ifølge krav 1 til 3, karakterisert ved at den er: (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluormetyl)fenyl]-butansyre; (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[(N-metyl-N-fenyl-amino)karbonyl]-1,3-oksazol-2-yl]butansyre; (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-[(morfolm-4-karbonyl]-1,3-oksazol-2-yl]butansyre; (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-eto^^ trifluoretyl)amino]karbonyl]-l,3-oksazol-2-yl]butansyre; (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-[4-(trifluorm yl]butansyre; (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyirdin-2-yl]-l-etoksy]fenyl]-3-(3-metyltiazol-2-yl)-butansyre; (S)-3-(3-fluorfenyl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-l,8-naflyridin-^ butansyre; (±)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyridin-2-yl]etoksy]fenyl^ (S)-4-[4-[2-[6-(metylamino)pyirdin-2-yl]etoksy]fenyl]-3-(pyridin-3-yl)butansyre; eller (S)-3-(pyirdin-3-yl)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tefr^ butansyre; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

6. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1, et antineoplastisk middel og en farmasøytisk akseptabel bærer.

7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 5, karakterisert ved at det antineoplastiske middel er topotekan eller cisplatin.

8. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1, en inhibitor for beinresorpsjon og en farmasøytisk akseptabel bærer.

9. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 for anvendelse som et medikament.

10. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) som angitt i krav 1 ved fremstilling av et medikament for behandling av sykdommer der antagonisme av a vP3-reseptoren er indikert.

11. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament for behandling av sykdommer der antagonisme av a vpVreseptoren er indikert.

12. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) som angitt i krav 1 ved fremstilling av et medikament for behandling av osteoporose.

13. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) som angitt i krav 1 ved fremstilling av et medikament for inhibering av angiogenese, tumorvekst eller tumormetastase.

14. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) som angitt i krav 1 ved fremstilling av et medikament for behandling av aterosklerose, restenose eller reumatoid artritt.

15. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) som angitt i krav 1, og et antineoplastisk middel ved fremstilling av et medikament for inhibering av tumorvekst i fysisk kombinasjon eller for trinnvis administrering.

16. Anvendelse ifølge krav 15 av topotekan eller cisplatin som antineoplastisk middel.

17. Anvendelse av en forbindelse med formel (I) som angitt i krav 1, og en inhibitor for beinresorpsjon ved fremstilling av et medikament for behandling av osteoporose, i fysisk kombinasjon eller for trinnvis administrering.