DE60118025T2

DE60118025T2 - Dibenzoxazepin-alpha-v-integrin-rezeptorantagonist

Info

Publication number: DE60118025T2
Application number: DE60118025T
Authority: DE
Inventors: A. Michael Rahway PATANE
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2021-10-20
Also published as: EP1331937B1; EP1331937A2; AU2002239435B2; EP1331937A4; CA2425117A1; ATE320258T1; WO2002040505A2; JP2004513953A; ES2259047T3; DE60118025D1; WO2002040505A3; US6943156B2; US20040019035A1; AU3943502A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Dibenzoxazepinderivat, dessen Synthese und dessen Verwendung als αv-Integrinrezeptorantagonist. Speziell ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung ein Antagonist der Integrinrezeptoren αvβ3, αvβ5 und von αv-Integrinrezeptoren, die mit anderen β-Untereinheiten assoziiert sind, und sie eignet sich zur Inhibierung von Knochenresorption, zur Behandlung und/oder Prävention von Osteoporose und zur Inhibierung von vaskulärer Restenose, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, Angiogenese, Atherosklerose, entzündlicher Arthritis, Krebs und metastatischem Tumorwachstum.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Man nimmt an, daß viele verschiedene Erkrankungsstadien und -zustände durch die Wirkung auf Integrinrezeptoren vermittelt werden können und daß Integrinrezeptorantagonisten eine geeignete Klasse von Arzneistoffen darstellen. Integrinrezeptoren sind heterodimere Transmembranrezeptoren, durch die sich Zellen an extrazelluläre Matrizen und andere Zellen binden und damit kommunizieren. (Siehe S.B. Rodan und G.A. Rodan, "Integrin Function In Osteoclasts", Journal of Endocrinology, 154, S47–S56 (1997), das hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen ist).
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eignet sich die Verbindung hierin zur Inhibierung von Knochenresorption. Die Knochenresorption wird durch die Wirkung von als Osteoklasten bekannten Zellen vermittelt. Osteoklasten sind große multinukleäre Zellen mit einem Durchmesser von bis zu etwa 400 μm, die mineralisiertes Gewebe, hauptsächlich Calciumcarbonat und Calciumphosphat, in Wirbeltieren resorbieren. Osteoklasten sind aktiv bewegliche Zellen, die entlang der Knochenoberfläche wandern und sich an Knochen binden können, notwendige Säuren und Proteasen absondern und dadurch die wirkliche Resorption von mineralisiertem Gewebe aus dem Knochen herbeiführen. Insbesondere nimmt man an, daß Osteoklasten in wenigstens zwei physiologischen Zuständen existieren, nämlich im sekretorischen Zustand und im wandernden oder beweglichen Zustand. Im sekretorischen Zustand sind Osteoklasten flach, sie binden sich über eine feste Bindungszone (Verschmelzungszone) an die Knochenmatrix, werden stark polarisiert, bilden einen gekräuselten Rand und sondern Lysosomalenzyme und Protonen ab, um Knochen zu resorbieren. Die Haftung von Osteoklasten an Knochenoberflächen ist ein wichtiger erster Schritt bei der Knochenresorption. Im wandernden oder beweglichen Zustand wandern die Osteoklasten über die Knochenmatrix und nehmen an der Resorption solange nicht teil, bis sie sich wieder an den Knochen binden.
Integrine sind bei der Osteoklastenbindung, -aktivierung und -wanderung beteiligt. Das häufigste Integrin auf Osteoklasten, z.B. auf Osteoklasten von Ratten, Hühnern, Mäusen und Menschen, ist ein als αvβ3 bekannter Integrinrezeptor, von dem angenommen wird, daß er im Knochen mit Matrixproteinen wechselwirkt, welche die RGD-Sequenz enthalten. αvβ3-Antikörper blockieren die Knochenresorption in vitro, was zeigt, daß dieses Integrin eine Schlüsselrolle bei dem Resorptionsverfahren spielt. Es gibt immer mehr Gründe, anzunehmen, daß αvβ3-Liganden wirksam zur Inhibierung von osteoklastenvermittelter Knochenresorption in vivo bei Säugern verwendet werden können.
Die Knochenerkrankungen, die derzeit am meisten im öffentlichen Interesse stehen, sind Osteoporose, Hyperkalzämie durch Malignität, Osteopenie aufgrund von Knochenmetastasen, periodontale Erkrankung, Hyperparathyreoidismus, periartikuläre Erosionen bei rheumatoider Arthritis, Paget-Krankheit, durch Immobilisierung hervorgerufene Osteopenie und durch Glukokortikoid induzierte Osteoporose. Alle diese Zustände sind durch Knochenschwund gekennzeichnet, welcher von einem Ungleichgewicht zwischen Knochenresorption, d.h. Knochenabbau, und Knochenbildung herrührt, das sich im Verlauf des Lebens mit einer Rate von durchschnittlich etwa 14% pro Jahr fortsetzt. Die Knochen-Turnover-Rate unterscheidet sich jedoch von Ort zu Ort; zum Beispiel ist sie im Trabekelknochen der Wirbel und im Alveolarknochen im Kiefer höher als in den Kortizes der Langknochen. Das Potential für Knochenschwund steht in direkter Beziehung mit dem Turnover und kann sich in den Wirbeln unmittelbar nach der Menopause auf über 5% pro Jahr summieren, ein Zustand, der zu erhöhtem Bruchrisiko führt.
Es gibt in den Vereinigten Staaten derzeit etwa 20 Millionen Personen mit nachweisbaren Wirbelfrakturen aufgrund von Osteoporose. Zusätzlich gibt es etwa 250000 Hüftfrakturen pro Jahr, die der Osteoporose zuzuschreiben sind. Diese klinische Situation ist verbunden mit einer 12%igen Sterberate innerhalb der ersten zwei Jahre, wobei 30% der Patienten nach der Fraktur eine Pflegeheimbetreuung benötigen.
Personen, die an allen oben aufgeführten Zuständen leiden, würden von der Behandlung mit Mitteln, welche die Knochenresorption inhibieren, einen Nutzen ziehen.
Ferner erwiesen sich αvβ3-Liganden bei der Behandlung und/oder Inhibierung von Restenose (d.h. dem erneuten Auftreten von Stenose nach einer Korrekturoperation an der Herzklappe), Atherosklerose, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration und Angiogenese (d.h. der Bildung neuer Blutgefäße) und bei der Inhibierung einer Viruserkrankung als geeignet. Darüber hinaus wurde postuliert, daß das Tumorwachstum von einer ausreichenden Blutzufuhr abhängig ist, die wiederum vom Wachstum neuer Gefäße in den Tumor abhängt; daher kann die Inhibierung der Angiogenese in Tiermodellen eine Tumorregression bewirken. (Siehe Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. Aufl., 1991, das in seiner Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist). αvβ3-Antagonisten, die die Angiogenese inhibieren, können daher bei der Behandlung von Krebs durch Inhibierung von Tumorwachstum geeignet sein. (Siehe z.B. Brooks et al, Cell, 79: 1157–1164 (1994), das in seiner Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist).
Es wurden auch Beweise vorgelegt, die darauf schließen lassen, daß die Angiogenese ein zentraler Faktor bei der Initiierung und Persistenz einer arthritischen Erkrankung ist und daß das Gefäßintegrin αvβ3 ein bevorzugtes Ziel bei der entzündlichen Arthritis ist. Daher können αvβ3-Antagonisten, die die Angiogenese inhibieren, einen neuen therapeutischen Weg zur Behandlung einer arthritischen Erkrankung, wie z.B. rheumatoider Arthritis, darstellen (siehe C.M. Storgard et al., "Decreased angiogenesis and arthritic disease in rabbits treated with an αvβ3 antagonist", J. Clin. Invest., 103:47–54 (1999), das hierin in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist).
Darüber hinaus kann die Verbindung dieser Erfindung durch Wirkung als Antagonist des Integrinrezeptors αvβ5 auch die Neovaskularisierung inhibieren. Es wurde gezeigt, daß ein monoklonaler Antikörper für αvβ5 die VEGF-induzierte Angiogenese in der Kaninchen-Kornea und dem Hühner-Chorioallontorismembran-Modell induziert (siehe M.C. Friedlander et al., Science 270, 1500–1502 (1995), das in seiner Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist). Daher eignen sich Verbindungen, welche αvβ5 antagonisieren, zur Behandlung und Prävention von Makuladegeneration, diabetischer Retinopathie, Krebs und metastatischem Tumorwachstum.
Zusätzlich kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung die Angiogenese und Entzündung inhibieren, indem sie als Antagonist von αv-Integrinrezeptoren, die mit anderen β-Untereinheiten assoziiert sind, wie z.B. αvβ6 und αvβ8, wirkt (siehe zum Beispiel Melpo Christofidou-Solomidou et al., "Expression and Function of Endothelial Cell αv Integrin Receptors in Wound-Induced Human Angiogenesis in Human Skin/ SCID Mice Chimeras", American Journal of Pathology, 151: 975–983 (1997), und Xiao-Zhu Huang et al., "Inactivation of the Integrin β6 Subunit Gene Reveals a Role of Epithelial Integrins in Regulating Inflammation in the Lungs and Skin, "Journal of Cell Biology, 133: 921–928, die in ihrer Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind).
Zusätzlich kann die Verbindung dieser Erfindung sowohl die αvβ3- als auch die αvβ5-Rezeptoren antagonisieren und eignet sich daher zur Inhibierung von Knochenresorption, zur Behandlung und Prävention von Osteoporose und zur Inhibierung von vaskulärer Restenose, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, Angiogenese, Atherosklerose, entzündlicher Arthritis, Krebs und metastatischem Tumorwachstum.
Peptidyl- sowie peptidomimetische Antagonisten des αvβ3-Integrinrezeptors wurden sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur beschrieben. Zum Beispiel wird verwiesen auf W.J. Hoekstra und B.L. Poulter, Curr. Med. Chem. 5: 195–204 (1998) und die darin zitierte Literatur; WO 95/32710; WO 95/37655; WO 97/01540; WO 97/37655; WO 98/08840; WO 98/18460; WO 98/18461; WO 98/25892; WO 98/31359; WO 98/30542; WO 99/15506; WO 99/15507; WO 00/03973; EP 853084 ; EP 854140 ; EP 854145 ; US-Patente Nr. 5 204 350; 5 217 994; 5 639 754; 5 741 796; 5 780 426; 5 929 120; 5 952 341; 6 017 925 und 6 048 861. Einen Hinweis auf die Fähigkeit von αvβ3-Integrinrezeptorantagonisten zur Prävention von Knochenresorption in vitro und in vivo wurde vorgelegt (siehe V.W. Engleman et al., "A Peptidomimetic Antagonist of the αvβ3 Integrin Inhibits Bone Resorption In Vitro and Prevents Osteoporosis In Vivo," J. Clin. Invest. 99: 2284–2292 (1997); S.B. Rodan et al., "A High Affinity Non-Peptide αvβ3 Ligand Inhibits Osteoclast Activity in Vitro and in Vivo," J. Bone Miner. Res. 11: S289 (1996); J.F. Gourvest et al., "Prevention of OVX-Induced Bone Loss With a Non-peptidic Ligand of the αvβ3 Vitronectin Receptor," Bone 23: S612 (1998); M.W. Lark et al., "An Orally Active Vitronectin Receptor αvβ3 Antagonist Prevents Bone Resorption In Vitro and In Vivo in the Ovariectomized Rat," Bone 23: S219 (1998)).
Der αvβ3-Integrinrezeptor erkennt die Arg-Gly-Asp-(RGD)-Tripeptidsequenz in seiner zugehörigen Matrix und in seinen zugehörigen Zelloberflächenglycoproteinen (siehe J. Samanen et al., "Vascular Indications for Integrin αv Antagonists," Curr. Pharmaceut. Design 3: 545–584 (1997)). Ein Benzazepinkern wurde neben anderen von Genentech und SmithKline Beecham als in der Konformation eingeschränktes Gly-Asp-Mimetikum zur Elaborierung von nichtpeptidischen αvβ3-Integrinrezeptorantagonisten, die am N-Terminus mit heterocyclischen Arginin-Mimetika substituiert sind, eingesetzt (siehe R.M. Keenan et al., "Discovery of Potent Nonpeptide Vitronectin Receptor (αvβ3) Antagonists," J. Med. Chem. 40: 2289–2292 (1997); R.M. Keenan et al., "Benzimidazole Derivatives As Arginine Mimetics in 1,4-Benzodiazepine Nonpeptide Vitronectin Receptor (αvβ3) Antagonists," Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 3165–3170 (1998); und R.M. Keenan et al., "Discovery of an Imidazopyridine-Containing 1,4-Benzodiazepine Nonpeptide Vitronectin Receptor (αvβ3) Antagonist With Efficacy in a Restenosis Model," Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 3171–3176 (1998). An SmithKline Beecham übertragene Patente, die solche Benzazepin- sowie verwandte Benzodiazepin- und Benzocyclohepten-αvβ3-Integrinrezeptorantagonisten offenbaren, sind u.a. WO 96/00574, WO 96/00730, WO 96/06087, WO 96/26190, WO 97/24119, WO 97/24122, WO 97/24124, WO 98/14192, WO 98/15278, WO 99/05107, WO 99/06049, WO 99/15170, WO 99/15178 und WO 99/15506, und an Genetech übertragene Patente sind u.a. WO 97/34865. Die Dibenzocyclohepten-, Dibenzocycloheptan- und Dibenzoxazipin-Gerüste wurden auch als Gly-Asp-Mimetika eingesetzt, um αvβ3-Antagonisten zu ergeben (siehe WO 97/01540, WO 98/30542, WO 99/11626, WO 99/15508, WO 00/33838, US-Patente Nr. 6 008 213 und 6 069 158, alle übertragen an SmithKline Beecham).
Andere Integrinrezeptorantagonisten, die in der Hauptkette Ring-Konformationseinschränkungen enthalten, wurden in der Patentliteratur beschrieben. Veröffentlichte Patentanmeldungen oder erteilte Patente, die Antagonisten mit einer Phenyl-Einschränkung offenbaren, sind u.a. WO 98/00395, WO 99/32457, WO 99/37621, WO 99/44994, WO 99/45927,WO 99/52872, WO 99/52879, WO 99/52896, WO 00/06169, EP 0 820 988 , EP 0 820 991 , US-Patente Nr. 5 741 796; 5 773 644; 5 773 646; 5 843 906; 5 852 210; 5 929 120; 5 952 381; 6 028 223 und 6 040 311. Veröffentlichte Patentanmeldungen oder erteilte Patente, die Antagonisten mit einer Einschränkung im monocyclischen Ring offenbaren, sind u.a. WO 99/26945, WO 99/30709, WO 99/30713, WO 99/31099, WO 99/59992, WO 00/00486, WO 00/09503, EP 0 796 855 , EP 0 928 790 , EP 0 928 793 , US-Patente Nr. 5 710 159; 5 723 480; 5 981 546; 6 017 926 und 6 066 648. Veröffentlichte Patentanmeldungen oder erteilte Patente, die Antagonisten mit einer Einschränkung im bicyclischen Ring offenbaren, sind u.a. WO 98/23608, WO 98/35949, WO 99/33798, EP 0 853 084 , US-Patente Nr. 5 760 028; 5 919 792 und 5 925 655.
Es bleibt jedoch noch immer ein Bedarf an kleinmolekularen nichtpeptidischen selektiven αv-Integrinrezeptorantagonisten, die eine verbesserte Wirksamkeit, eine bessere Pharmakodynamik und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen, wie z.B. orale Bioverfügbarkeit und Wirkungsdauer, verglichen mit bereits beschriebenen Verbindungen. Solche Verbindungen würden eine Verbesserung bei der Behandlung, Prävention oder Unterdrückung von verschiedenen Pathologien ergeben, die oben aufgezählt wurden und die durch αv-Integrinrezeptorbindung- und -zelladhäsion und -aktivierung vermittelt werden.
In der U.S.S.N 09/505 38726 (25. Januar 2000) offenbarten wir eine Reihe von Dibenzazepinderivaten, die αv-Integrinrezeptorantagonisten sind. In der vorliegenden Erfindung beschreiben wird ein neues Dibenzoxazepinderivat mit Eigenschaften als wirksamer αv-Integrinrezeptorantagonist.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Dibenzoxazepinderivat zur Verfügung zu stellen, das sich als αv-Integrinrezeptorantagonist eignet.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Dibenzoxazepinderivat zur Verfügung zu stellen, das als αvβ3-Rezeptorantagonist geeignet ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Dibenzoxazepinderivat zur Verfügung zu stellen, das als αvβ5-Rezeptorantagonist geeignet ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Dibenzoxazepinderivat zur Verfügung zu stellen, das als dualer αvβ3/αvβ5-Rezeptorantagonist geeignet ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die den αv-Integrinrezeptorantagonisten enthalten.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Herbeiführung einer αv-integrinrezeptorantagonisierenden Wirkung bei einem Säuger, der diese benötigt, durch Verabreichung der Verbindung der vorliegenden Erfindung und der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten, zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindung enthalten, zur Verfügung zu stellen, die sich zur Inhibierung von Knochenresorption, Restenose, Atherosklerose, entzündlicher Arthritis, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, Angiogenese, Krebs und metastatischem Tumorwachstum eignen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung und pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung enthalten, zur Verfügung zu stellen, die zur Behandlung von Osteoporose geeignet sind.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Knochenresorption, Restenose, Atherosklerose, entzündlicher Arthritis, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, Angiogenese, Krebs und metastatischem Tumorwachstum zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Osteoporose zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Ziele werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung leicht ersichtlich sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung der Strukturformel (I):
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Ester davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten.
Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Herbeiführung einer αv-integrinrezeptorantagonisierenden Wirkung bei einem Säuger, der diese benötigt, durch Verabreichung der Verbindung und von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten.
Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Inhibierung von Knochenresorption, Restenose, Atherosklerose, entzündlicher Arthritis, diabetischer Retinopathie, Makula degeneration, Angiogenese, Krebs und metastatischem Tumorwachstum durch Verabreichung der Verbindungen und von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten.
Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Behandlung von Osteoporose durch Verabreichung der Verbindung und von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Verbindung der Strukturformel (I)
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Ester davon.
Zur medizinischen Verwendung sind die Salze der Verbindung dieser Erfindung nichttoxische "pharmazeutisch annehmbare Salze". Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung oder ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze können jedoch auch andere Salze geeignet sein. Salze, die von der Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbare Salze" umfaßt sind, sind nichttoxische Salze der Verbindung dieser Erfindung, die im allgemeinen durch Umsetzung der freien Base mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Repräsentative Salze von basischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die folgenden: Acetat, Benzolsulfonat, Benzoat, Hydrogencarbonat, Hydrogensulfat, Hydrogentartrat, Borat, Bromid, Camsylat, Carbonat, Chlorid, Clavulanat, Citrat, Dihydrochlorid, Edetat, Edisylat, Estolat, Esylat, Fumarat, Gluceptat, Gluconat, Glutamat, Glycolylarsanilat, Hexylresorcinat, Hydrabamin, Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydroxynaphthoat, Iodid, Isothionat, Lactat, Lactobionat, Laurat, Malat, Maleat, Mandelat, Mesylat, Methylbromid, Methylnitrat, Methylsulfat, Mucat, Napsylat, Nitrat, N-Methylglucaminammoniumsalz, Oleat, Oxalat, Pamoat (Embonat), Palmitat, Pantothenat, Phosphat/Diphosphat, Polygalacturonat, Salicylat, Stearat, Sulfat, Subacetat, Succinat, Tannat, Tartrat, Teoclat, Tosylat, Triethiodid und Valerat. Wenn die Verbindung der Erfindung einen sauren Rest trägt, können darüber hinaus ge eignete pharmazeutisch annehmbare Salze davon u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Salze sein, die von anorganischen Basen hergeleitet sind, einschließlich Aluminium-, Ammonium-, Calcium-, Kupfer-, Eisen(II)-, Eisen(III)-, Lithium-, Magnesium-, Mangan(III)-, Mangan(II)-, Kalium-, Natrium-, Zinksalze und dergleichen. Besonders bevorzugt sind die Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Kalium- und Natriumsalze. Salze, die von pharmazeutisch annehmbaren organischen nichttoxischen Basen hergeleitet sind, sind u.a. Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, cyclischen Aminen und basischen Ionenaustauschharzen, wie z.B. Arginin, Betain, Koffein, Cholin, N,N-Dibenzylethylendiamin, Diethylamin, 2-Diethylaminoethanol, 2-Dimethylaminoethanol, 2-Methyl-2-amino-1-propanol, Ethanolamin, Ethylendiamin, N-Ethylmorpholin, N-Ethylpipendin, Glucamin, Glucosamin, Histidin, Hydrabamin, Isopropylamin, Lysin, Methylglucamin, Morpholin, Piperazin, Piperidin, Polyaminharze, Procain, Purine, Theobromin, Triethylamin, Trimethylamin, Tripropylamin, Tromethamin und dergleichen.
Ebenfalls vom Umfang der Erfindung umfaßt sind Solvate der Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge" soll die Menge eines Arzneistoffs oder eines pharmazeutischen Mittels bedeuten, welche die biologische oder medizinische Reaktion eines Gewebes, Systems, Tieres oder Menschen, die von einem Forscher oder Kliniker erwünscht wird, hervorruft.
Die Bezeichnung "αv-Integrinrezeptorantagonist", wie sie hier verwendet wird, bedeutet eine Verbindung, die sich entweder an den αvβ3-Rezeptor oder den αvβ5-Rezeptor bindet oder diesen antagonisiert, oder eine Verbindung, die sich an Kombinationen aus diesen Rezeptoren bindet und diese antagonisiert (zum Beispiel einen dualen αvβ3/αvβ5-Rezeptorantagonist).
Die Bezeichnung "Knochenresorption", wie sie hier verwendet wird, bedeutet das Verfahren, durch das Osteoklasten Knochen abbauen.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung weist eine submikromolare Affinität für die αv-Integrinrezeptoren, insbesondere die αvβ3- und αvβ5-Rezeptoren, auf. Die Verbindung dieser Erfindung eignet sich daher zur Behandlung von Säugern, die an einem Knochenzustand leiden, der durch erhöhte Knochenresorption verursacht oder vermittelt wird, und die eine solche Behandlung benötigen. Pharmakologisch wirksame Mengen der Verbindung, einschließlich pharmazeutisch annehmbare Salze davon, werden dem Säuger verabreicht, um die Wirkung von Säuger-Osteoklasten zu inhibieren.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung wird in Dosen verabreicht, welche die Antagonisierung des αvβ3-Rezeptors bewirken, wenn eine solche Behandlung benötigt wird, zum Beispiel zur Prävention oder Behandlung von Osteoporose.
Die Erfindung wird durch das Verfahren veranschaulicht, bei dem die αv-Integrinrezeptorantagonisierungswirkung eine αvβ3-Antagonisierungswirkung ist. Insbesondere ist die αvβ3-Antagonisierungswirkung ausgewählt aus der Inhibierung von: Knochenresorption, Restenose, Angiogenese, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, entzündlicher Arthritis, Krebs und metastatischem Tumorwachstum. Bei einer Ausführungsform des Verfahrens ist die αvβ3-Antagonisierungswirkung die Inhibierung von Knochenresorption.
Ein weiteres Beispiel der Erfindung ist das Verfahren, bei dem die αv-Integrinrezeptorantagonisierungswirkung eine αvβ5-Antagonisierungswirkung ist. Speziell ist die αvβ5-Antagonisierungswirkung ausgewählt aus der Inhibierung von Restenose, Angiogenese, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, entzündlicher Arthritis, Krebs und metastatischem Tumorwachstum.
Die Erfindung weiter veranschaulichend ist das Verfahren, bei dem die αv-Integrinrezeptorantagonisierungswirkung eine duale αvβ3/αvβ5-Antagonisierungswirkung ist. Speziell ist die duale αvβ3/αvβ5-Antagonisierungswirkung ausgewählt aus der Inhibierung von: Knochenresorption, Restenose, Angiogenese, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, entzündlicher Arthritis, Krebs und metastatischem Tumorwachstum.
Die Erfindung speziell veranschaulichend ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Ein weiteres Beispiel für die Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die durch Kombination der oben beschriebenen Verbindung und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers hergestellt wird. Eine weitere Veranschaulichung der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, das die Kombination der oben beschriebenen Verbindung und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers umfaßt.
Die Erfindung weiter veranschaulichend ist die Verwendung des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention eines Zustandes, der durch den Antagonismus eines αv-Integrinrezeptors vermittelt wird, bei einem Säuger, der diese benötigt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen Verbindung an einen Säuger. Vorzugsweise ist der Zustand ausgewählt aus Knochenresorption, Osteoporose, Restenose, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, Angiogenese, Atherosklerose, entzündlicher Arthritis, Krebs, Tumorwachstum und Metastase. Besonders bevorzugt ist der Zustand ausgewählt aus Osteoporose und Krebs. Ganz besonders bevorzugt ist der Zustand Osteoporose.
Ein spezielleres Beispiel für die Erfindung ist die Verwendung des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Herbeiführung einer αv-Integrinantagonisierungswirkung bei einem Säuger, der diese benötigt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung oder irgendwelchen der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die oben beschrieben wurden, an einen Säuger. Vorzugsweise ist die αv-Integrinantagonisierungswirkung eine αvβ3-Antagonisierungswirkung; speziell ist die αvβ3-Antagonisierungswirkung ausgewählt aus der Inhibierung von Knochenresorption, Inhibierung von Restenose, Inhibierung von Atherosklerose, Inhibierung von Angiogenese, Inhibierung von diabetischer Retinopathie, Inhibierung von Makuladegeneration, Inhibierung von entzündlicher Arthritis und Inhibierung von Krebs oder metastatischem Tumorwachstum. Besonders bevorzugt ist die αvβ3-Antagonisierungswirkung die Inhibierung von Knochenresorption. Alternativ ist die αv-Integrinantagonisierungswirkung eine αvβ5-Antagonisierungswirkung oder eine duale αvβ3/αvβ5-Antagonisierungswirkung. Beispiele für αvβ5-Antagonisierungswirkungen sind die Inhibierung von Restenose, Atherosklerose, Angiogenese, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, entzündlicher Arthritis, Krebs und metastatischem Tumorwachstum.
Zusätzliche Beispiele für die Erfindung sind die Verwendung des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Knochenresorption und zur Behandlung und/oder Prävention von Osteoporose bei einem Säuger, der diese benötigt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung oder irgendwelcher der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die oben beschrieben wurden, an einen Säuger.
Zusätzliche Veranschaulichungen der Erfindung sind die Verwendung des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hyperkalzämie durch Malignizität, Osteopenie aufgrund von Knochenmetastasen, periodontaler Erkrankung, Hyperparathyreoidismus, periartikulären Erosionen bei rheumatoider Arthritis, Paget-Krankheit, durch Immobilisierung hervorgerufener Osteopenie und Glucocorticoidbehandlung bei einem Säuger, der diese benötigt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung oder irgendwelcher der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die oben beschrieben wurden, an einen Säuger.
Ein spezielleres Beispiel für die Erfindung ist die Verwendung von der oben beschriebenen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von Osteoporose bei einem Säuger, der diese benötigt. Noch ein weiteres Beispiel für die Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von Knochenresorption, metastatischem Tumorwachstum, Krebs, Restenose, Atherosklerose, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, entzündlicher Arthritis und/oder Angiogenese.
Ebenfalls beispielhaft für die Erfindung sind Zusammensetzungen, die ferner einen Wirkstoff enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

a) einem organischen Bisphosphonat oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Ester davon,
b) einem Östrogenrezeptormodulator,
c) einem Androgenrezeptormodulator,
d) einem zytotoxischen/antiproliferativen Mittel,
e) einem Matrixmetalloproteinaseinhibitor,
f) einem Inhibitor der epidermalen, Fibroblasten- oder Thrombozyten-Wachstumsfaktoren,
g) einem VEGF-Inhibitor,
h) einem Antikörper zu einem Wachstumsfaktor oder einem Wachstumsfaktorrezeptor,
i) einem Flk-1/KDR-, Flt-1-, Tck/Tie-2- oder Tie-1-Inhibitor,
j) einem Kathepsin-K-Inhibitor,
k) einem Wachstumshormonsekretagogum,
l) einem Osteoklasten-Protonen-ATPase-Inhibitor,
m) einem Urokinaseplasminogenaktiviator (u-PA),
n) einem tumorspezifischen Antikörper-Interleukin2-Fusionsprotein,
o) einem HMG-CoA-Reduktaseinhibitor und
p) einem Farnesyltransferaseinhibitor oder einem Geranylgeranyltransferaseinhibitor oder einem doppelten Farnesyl/Geranylgeranyl-Transferaseinhibitor und Mischungen davon.

Vorzugsweise ist der Wirkstoff ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einem organischen Bisphosphonat oder einem pharmazeutisch annehm baren Salz oder Ester davon,
b) einem Östrogenrezeptormodulator,
c) einem Androgenrezeptormodulator,
d) einem Osteoklasten-Protonen-ATPase-Inhibitor,
e) einem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor und
f) einem Kathepsin-K-Inhibitor und Mischungen davon.

Nichtlimitierende Beispiele für solche Bisphosphonate sind u.a. Alendronat, Cimadronat, Clodronat, Etidronat, Ibandronat, Pamidronat, Piridronat, Risedronat, Tildronat und Zolendronat und pharmazeutisch annehmbare Salze und Ester davon. Ein besonders bevorzugtes Bisphosphonat ist Alendronat, insbesondere Alendronat-Mononatriumtrihydrat.
Nichtlimitierende Beispiele für Östrogenrezeptormodulatoren sind u.a. Östrogen, Progesterin, Östradiol, Droloxifen, Raloxifen und Tamoxifen.
Nichtlimitierende Beispiele für zytotoxische/antiproliferative Mittel sind Taxol, Vincristin, Vinblastin und Doxorubicin.
Kathepsin K, früher als Kathepsin O2 bekannt, ist eine Cysteinprotease und ist in der Internationalen PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 96/13523, veröffentlicht am 9. Mai 1996; dem US-Patent Nr. 5 501 969, ausgegeben am 3. März 1996; und dem US-Patent Nr. 5 736 357, ausgegeben am 7. April 1998, die alle in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind, beschrieben. Cysteinproteasen, insbesondere Kathepsine, sind mit einer Reihe von Erkrankungszuständen verbunden, wie z.B. Tumormetastasen, Entzündung, Arthritis und Knochenneubildung. Bei sauren pH-Werten können Kathepsine Typ-1-Kollagen abbauen. Kathepsinproteaseinhibitoren können die osteoklastische Knochenresorption durch Inhibierung des Kollagenfaserabbaus inhibieren und eignen sich daher zur Behandlung von Knochenresorptionserkrankungen, wie z.B. Osteoporose.
Es wurde festgestellt, daß Elemente aus der Klasse von HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren, die als "Statine" bekannt sind, das Wachstum neuer Knochen auslösen, wobei als Folge von Osteoporose verlorene Knochenmasse ersetzt wird (siehe The Wall Street Journal, Freitag, 3. Dezember 1999, Seite B1). Daher sind die Statine zur Behandlung von Knochenresorption vielversprechend. Nichtlimitierende Beispiele für Statine sind Lovastatin, Simvastatin, Atorvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Cerivastatin und Rosuvastatin.
Ein Beweis für die äußerst wichtige Rolle des Urokinase-Urokinase-Rezeptors (u-PA-u-PAR) bei Angiogenese, Tumorinvasion, Entzündung und Matrix Remodeling während der Wundheilung und Entwicklung wurde vorgelegt [siehe Y. Koshelnick et al., "Mechaisms of signaling through Urokinase Receptor and the Cellular Response," Thrombosis and Haemostatsis 82: 305–311 (1999) und F. Blasi, "Proteolysis, Cell Adhesion, Chemotaxis, and Invasiveness Are Regulated by the u.PA-u-PAR-PAI-1 System," Thrombosis and Haemostatis 82: 298–304 (1999)]. Somit inhibieren spezifische Antagonisten für die Bindung von u-PA an u-PAR die Zelloberflächenplasminogenaktivierung, das Tumorwachstum und die Angiogenese sowohl bei In-vitro als auch bei In-vivo-Modellen.
H.N. Lode und Mitarbeiter beobachteten in PNAS USA 96: 1591–1596 (1999) synergistische Effekte zwischen einem antiangiogenen αv-Integrinantagonisten und einem tumorspezifischen Antikörper-Cytokin(Interleukin 2)-Fusionsprotein bei der Beseitigung spontaner Tumormetastasen. Ihre Ergebnisse legen nahe, daß diese Kombination ein Potential zur Behandlung von Krebs und metastatischem Tumorwachstum besitzt.
Es wurde berichtet, daß die Protonen-ATPase, die auf der apikalen Membran des Osteoklasten vorkommt, eine bedeutende Rolle beim Knochenresorptionsverfahren spielt. Daher stellt diese Protonenpumpe ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Knochenresorptionsinhibitoren dar, welche zur Behandlung und Prävention von Osteoporose und verwandten metabolischen Erkrankungen potentiell geeignet sind (siehe C. Farina et al., "Selective inhibitors of the osteoclast vacuolar proton ATPase as novel bone antiresorptive agents, "DDT, 4: 163–172 (1999)).
Es wurde ein Beweis dafür erbracht, daß androgene Steroide eine physiologische Rolle bei der Entwicklung von Knochenmasse bei Männern und Frauen spielen und daß Androgene direkt auf den Knochen wirken. Androgenrezeptoren wurden in menschlichen osteoblastenartigen Zell-Linien nachgewiesen, und es wurde gezeigt, daß Androgene direkt die Knochenzellenproliferation und -differenzierung stimulieren. Für eine Diskussion darüber siehe S.R. Davis, "The therapeutic use of androgens in women, " J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 69: 177–184 (1999) und K.A. Hansen und S.P.T. Tho, "Androgens and Bone Health," Seminars in Regroductive Endocrinology," 16: 129–134 (1998). Daher werden Androgenrezeptormodulatoren bei der Behandlung und Prävention von Knochenschwund bei Frauen von Nutzen sein.
Es wurde gezeigt, daß der angiogene Faktor VEGF die Knochenresorbieraktivität von isolierten reifen Kaninchenosteoklasten durch Bindung an die Rezeptoren auf den Osteoklasten stimuliert (siehe M. Nakagawa et al., "Vascular endothelial growth factor (VEGF) directly enhances osteoclastic bone resorption and survival of mature osteoclasts," FEBS Letters, 473: 161–164 (2000)). Daher kann die Entwicklung von Antagonisten der VEGF-Bindung an Osteoklastenrezeptoren, wie z.B. KDR/Flk-1 und Flt-1 noch einen weiteren Weg zur Behandlung oder Prävention von Knochenresorption bilden.
Aktivatoren des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptors γ (PPARγ), wie z.B. die Thiazolidindione (TZD's), inhibieren die Bildung von osteoklastenartigen Zellen und die Knochenresorption in vitro. Die von R. Okazaki et al. in Endocrinology, 140, S. 5060–5065 (1999), berichteten Ergebnisse weisen auf einen lokalen Mechanismus auf Knochenmarkszellen sowie auf einen systemischen Mechanismus auf den Glucosemetabolismus hin. Nichtlimitierende Beispiele für PPARγ-Aktivatoren sind u.a. Troglitazon, Pioglitazon, Rosiglitazon und BRL 49653.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kombinationen der Verbindung der vorliegenden Erfindung mit ein oder mehreren Mitteln, die sich zur Prävention oder Behandlung von Osteoporose eignen. Zum Beispiel kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung wirkungsvoll in Kombination mit wirksamen Mengen anderer Mittel, wie z.B. einem organischen Bisphosphonat, einem Östrogenrezeptormodulator, einem Androgenrezeptormodulator, einem Kathepsin-K-Inhibitor, einem HMG-CoA-Reduktaseinhibitor, einem PPARγ-Aktivator, einem VEGF-Rezeptorantagonisten oder einem Inhibitor der Osteoklastenprotonen-ATPase, verabreicht werden.
Weitere Veranschaulichungen der Erfindung sind Verwendungen des neuen Dibenzoxazepinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder metastatischem Tumorwachstum bei einem Säuger, der diese benötigt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer oben beschriebenen Verbindung und eines oder mehrerer Mittel, von denen man weiß, daß sie zytotoxisch/antiproliferativ sind, an einen Säuger. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch in Kombination mit einer Strahlungstherapie zur Behandlung von Krebs und metastatischem Tumorwachstum verabreicht werden.
Zusätzlich kann der Integrin-αvβ3-Antagonist der vorliegenden Erfindung wirksam in Kombination mit einem Wachstumshormonsekretagogum bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung von Störungen im Calcium- oder Phosphat-Stoffwechsel und bei damit verbundenen Erkrankungen verabreicht werden. Diese Erkrankungen umfassen u.a. Zustände, die von einer Verringerung der Knochenresorption profitieren können. Eine Verringerung der Knochenresorption sollte das Gleichgewicht zwischen Resorption und Bildung verbessern, den Knochenschwund verringern oder zu einer Knochenzunahme führen. Eine Verringerung der Knochenresorption kann den mit osteolytischen Läsionen verbundenen Schmerz lindern und das Auftreten und/oder das Wachstum dieser Läsionen verringern. Diese Erkrankungen sind u.a.: Osteoporose (einschließlich Östrogenmangel, Immobilisation, durch Glukokortikoid induziert und senil), Osteodystrophie, Paget-Krankheit, Myositis ossificans, Bechterew-Krankheit, maligne Hyperkalzämie, metastatische Knochenerkrankung, periodontale Erkrankung, Cholelithiasis, Nephrolithiasis, Urolithiasis, Blasenstein, Arterienverhärtung (Sklerose), Arthritis, Bursitis, Neuritis und Tetanie. Eine erhöhte Knochenresorption kann durch pathologisch hohe Calcium- und Phosphatkonzentrationen im Plasma begleitet sein, die durch diese Behandlung verringert werden würden. Ähnlich würde die vorliegende Erfindung bei der Erhöhung der Knochenmasse bei Patienten mit Wachstumshormonmangel geeignet sein. Daher sind bevorzugte Kombinationen gleichzeitige oder abwechselnde Behandlungen mit einem αvβ3-Rezeptorantagonisten der vorliegenden Erfindung und einem Wachstumshormonsekretagogum, gegebenenfalls mit einer dritten Komponente, die ein organisches Bisphosphonat enthält, vorzugsweise Alendronat-Mononatriumtrihydrat.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können die einzelnen Komponenten der Kombination getrennt zu verschiedenen Zeiten während des Verlaufs der Therapie oder gleichzeitig in geteilten oder einzelnen Kombinationenformen verabreicht werden. Die vorliegende Erfindung soll daher so verstanden werden, daß sie alle solchen Regime mit gleichzeitiger oder abwechselnder Behandlung umfaßt, und die Bezeichnung "Verabreichen" soll dementsprechend interpretiert werden. Es ist selbstverständlich, daß der Umfang der Kombinationen der Verbindungen dieser Erfindung mit anderen Mitteln, die zur Behandlung von integrinvermittelten Zuständen geeignet sind, im Prinzip jede beliebige Kombination mit einer beliebigen, zur Behandlung von Osteoporose geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung umfaßt.
So wie hier verwendet, soll die Bezeichnung "Zusammensetzung" ein Produkt umfassen, das die angegebenen Bestandteile in den angegebenen Mengen enthält, sowie ein beliebiges Produkt, das direkt oder indirekt aus der Kombination der angegebenen Bestandteile in den angegebenen Mengen entsteht.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann in oralen Dosisformen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen mit verzögerter oder zeitlich festgelegter Freisetzung), Pillen, Pulver, Körnchen, Elixiere, Tinkturen, Suspensionen, Sirupe und Emulsionen verabreicht werden. Genauso können sie auch in intravenöser (Bolus oder Infusion), intraperitonealer, topischer (z.B. Augentropfen), subkutaner, intramuskulärer oder transdermaler (z.B. Pflaster) Form verabreicht werden, wobei alle Anwendungsformen den Durchschnittsfachleuten auf den pharmazeutischen Gebieten gut bekannt sind. Eine wirksame, jedoch nichttoxische Menge der erwünschten Verbindung kann als ein αvβ3-Antagonist eingesetzt werden.
Das Dosisregime, das die Verbindung der vorliegenden Erfindung einsetzt, wird gemäß einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, der Schwere des zu behandelnden Zustandes, des Verabreichungsweges, der Nieren- und Leberfunktion des Patienten und der verwendeten speziellen Verbindung oder des verwendeten speziellen Salzes davon. Ein Arzt, Tierarzt oder Kliniker mit durchschnittlichen fachlichen Fähigkeiten kann leicht die wirksame Menge des Arzneistoffes, die benötigt wird, um das Fortschreiten des Zustandes zu verhindern, zu bekämpfen oder aufzuhalten, ermitteln und verschreiben.
Orale Dosen der vorliegenden Erfindung werden, wenn sie für die angegebenen Wirkungen verwendet werden, zwischen etwa 0,01 mg pro kg Körpergewicht pro Tag (mg/kg/Tag) bis etwa 100 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,01 bis 10 mg/kg/Tag und besonders bevorzugt 0,1 bis 5,0 mg/kg/Tag liegen. Zur oralen Verabreichung werden die Zusammensetzungen vorzugsweise in der Form von Tabletten mit 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100 und 500 Milligramm des Wirkstoffs zur symptomatischen Einstellung der Dosis auf den zu behandelnden Patienten bereitgestellt. Ein Medikament enthält typischerweise etwa 0,01 mg bis etwa 500 mg des Wirkstoffs, vorzugsweise etwa 1 mg bis etwa 100 mg Wirkstoff. Intravenös werden die bevorzugtesten Dosen von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg/Minute während einer Infusion mit konstanter Rate reichen. Vorteilhafterweise kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung in einer einzelnen Tagesdosis verabreicht werden, oder die gesamte Tagesdosis kann in geteilten Dosen zwei-, drei- oder viermal am Tag verabreicht werden. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann ferner in intranasaler Form durch topische Verwendung geeigneter Intranasalvehikel oder auf transdermalen Wegen verabreicht werden, wobei jene Formen transdermaler Hautpflaster verwendet werden, die den Durchschnittsfachleuten gut bekannt sind. Zur Verabreichung in der Form eines transdermalen Abgabesystems wird die Dosisverabreichung während des Dosisregimes natürlich kontinuierlich anstatt intermittierend sein.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die hier im Detail beschriebene Verbindung den Wirkstoff bilden und wird typischerweise mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen oder Trägern (hierin gemeinsam als "Träger"-Materialen bezeichnet) vermischt verabreicht, welche im Hinblick auf die vorgesehene Verabreichungsform, d.h. Oraltabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dergleichen, und in Übereinstimmung mit herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken geeignet ausgewählt werden.
Zum Beispiel kann zur oralen Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die wirksame Arzneistoffkomponente mit einem oralen, nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z.B. Lactose, Stärke, Saccharose, Glucose, Methylcellulose, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Mannit, Sorbit und dergleichen, kombiniert werden; zur oralen Verabreichung in flüssiger Form können die oralen Arzneistoffkomponenten mit einem beliebigen oralen nichttoxischen pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z.B. Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen, kombiniert werden. Darüber hinaus können, falls erwünscht oder notwendig, auch geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Sprengmittel und Farbmittel in die Mischung eingebracht werden. Geeignete Bindemittel sind u.a. Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie z.B. Glukose oder beta-Lactose, Maissüßmittel, natürliche und synthetische Gummen, wie z.B. Akazien-, Tragantgummi oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und dergleichen. Gleitmittel, die in diesen Dosisformen verwendet werden, sind u.a. Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dergleichen. Sprengmittel sind u.a., ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dergleichen.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch in Form von Liposomabgabesystemen, wie z.B. kleinen einlamellaren Vesikeln, großen einlamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln, verabreicht werden. Liposome können aus einer Vielzahl von Phospholipiden, wie z.B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch durch die Verwendung monoklonaler Antikörper als einzelne Träger, an die die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind, zugeführt werden. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch mit löslichen Polymeren als auf ein Ziel ausrichtbare Arzneistoffträger gekoppelt sein. Solche Polymere können u.a. Polyvinylpyrrolidon, Pyrancopolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder mit Palmitoylresten substituiertes Polyethylenoxidpolylysin sein. Darüber hinaus kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung an eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt sein, die geeignet sind, eine gesteuerte Arzneistoffabgabe zu erzielen, zum Beispiel Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymere aus Polymilch- und Polyglycolsäure, Poly-epsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipatische Blockcopolymere von Hydrogelen.
Die Verbindung der Strukturformel (I) kann durch die in Schema 1 und in dem nachstehenden Beispiel detailliert beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Fachleute werden sofort erkennen, daß bekannte Variationen der Bedingungen und Verfahren der folgenden präparativen Verfahren angewandt werden können, um die Verbindung herzustellen. Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden alle Schritte bei Raum- oder Umgebungstemperatur durchgeführt, und alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
SCHEMA 1
BEISPIEL
{3-[21-(5,6,7,8-Tetrahydro-[1,8]naphthyridin-2-yl)-ethoxy]-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-yl}essigsäure (1-8)
4-Methoxy-2-(2-nitrophenoxy)benzoesäuremethylester (1-1)
Eine Lösung von 2-Fluornitrobenzol (3,978 g, 28,19 mmol), Methyl-4-methoxysalicylat (5,131 g, 28,15 mmol) und Kaliumcarbonat (7,800 g, 56,43 mmol) in DMF (30 ml) wurde über Nacht auf 50°C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand zwischen Dichlormethan und Wasser aufgetrennt. Das Wasser wurde zwei weitere Male mit Dichlormethan extrahiert, und die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung 1-1 als ein hellgelbes Öl zu ergeben.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8,01 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,97 (dd, 1H, J = 1,6, 8,1 Hz), 7,44 (dt, 1H, J = 1,6, 7,8 Hz), 7,14 (dt, 1H, J = 1,1, 7,8 Hz), 6,82 (dt, 2H, J = 2,6, 8,8 Hz), 6,63 (d, 1H, J = 2,6 Hz), 3,84 (s, 3H), 3,70 (s, 3H);
Niedrigauflösendes Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum (FABLRMS). Beobachtet m/e 304 (M⁺ + H).
2-(2-Aminophenoxy)-4-methoxybenzoesäuremethylester (1-2)
Eine Lösung von 11-1 (7,360 g, 21,87 mmol) in Methanol (200 ml) wurde zu einer Suspension von 10% Palladium auf Kohle in Ethanol (100 ml) zugegeben. Die Mischung wurde unter Wasserstoffgasdruck bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Celite filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft, um die Titelverbindung 1-2 als ein Öl zu ergeben.
FABLRMS: Beobachtet m/e 273 (M⁺).
3-Methoxy-10H-dibenzo[1,4]oxazepin-11-on (1-3)
Eine Lösung von 11-2 (47,80 g, 174,9 mmol) in THF (1 l) wurde mit Natriumhydrid (7,430 g einer 60%igen Dispersion in Öl, 185,7 mmol) portionsweise behandelt und 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit wäßrigem Ammoniumchlorid gequencht und dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um das Rohprodukt 11-3 zu ergeben. Die Umkristallisation aus Ethylacetat ergab 11-3 als weiße Kristalle.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8,10 (s, 1H), 7,90 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,24 (dd, 1H, J = 2,3, 7,0 Hz), 7,12 (m, 2H), 7,02 (dd, 1H, J = 2,6, 7,0 Hz), 6,78 (dd, 1H, J = 2,6, 8,8 Hz), 6,74 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 3,86 (s, 3H);
FABLRMS: Beobachtet m/e 242 (M⁺ + H).
3-Methoxy-10,11-dihydrodibenzo[1,4]oxazepin (1-4)
Eine Lösung von 11-3 (1,16 g, 4,80 mmol) in THF (50 ml) wurde mit einer Lösung von 1M LiAIH₄ in THF (10,0 ml, 10,0 mmol) behandelt und 2 Stunden auf 55°C erwärmt. Die Reaktion wurde mit wäßrigem Ammoniumchlorid gequencht und mit Diethylether extrahiert. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, um 1-4 zu ergeben.
FABLRMS: Beobachtet m/e 228 (M⁺ + H).
(3-Methoxy-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-yl)essigsäureethylester (1-5)
Eine Lösung von 11-4 (2,04 g, 8,97 mmol) in DMSO (10 ml) wurde auf 0°C abge kühlt und mit Natriumhydrid (450 mg einer 60%igen Dispersion in Öl, 11,2 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten auf Raumtemperatur erwärmt, gefolgt von der Zugabe von Ethylbromacetat (1,67 g, 10,0 mmol) und dem Erwärmen auf 50°C über Nacht. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Wasser verdünnt und mit drei Portionen Dichlormethan extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Die präparative Zentrifugalchromatographie (SiO₂, 6 mm, 50% EtOAc, 50% Hexan) ergab 1-5.
FABLRMS: Beobachtet m/e 314 (M⁺ + H).
(3-Hydroxy-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-yl)essigsäureethylester (1-6)
Eine Lösung von 11-5 (400 mg, 1,27 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde auf –5°C abgekühlt und mit Ethanthiol (419 mg, 6,75 mmol) und Aluminiumchlorid (815 mg, 6,11 mmol) behandelt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion mit wäßriger Ammoniumchloridlösung gequencht. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in 1M HCl gelöst. Die wäßrige Schicht wurde mit drei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Die präparative Zentrifugalchromatographie (SiO₂, 4 mm, 10% EtOH, 90% CH₂Cl₂) ergab 1-6.
FABLRMS: Beobachtet m/e 300 (M⁺ + H).
{3-[21-(5,6,7,8-Tetrahydro-[1,8]naphthyridin-2-yl)-ethoxy]-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-yl}essigsäureethylester (1-7)
Eine Lösung von 11-6 (363 mg, 1,21 mmol), 2-(5,6,7,8-Tetrahydro[1,8]naphthyridin-2-yl)ethanol (für die Herstellung siehe WO 00/33838) (340 mg, 1,91 mmol) und Triphenylphosphin (500 mg, 1,91 mmol) in THF (7 ml) wurde auf 0°C abgekühlt, mit Diethylazodicarboxylat (332 mg, 1,91 mmol) behandelt und über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand durch präparative Zentrifugalchromatographie (SiO₂, 4 mm, Ether/Hexan-Gradient) gereinigt, um 11-7 zu ergeben.
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 7,09–7,07 (m, 2H), 7,03 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 6,93–6,90 (m, 1H), 6,78–6,75 (m, 2H), 6,69 (1H, J = 1,5, 8,1 Hz), 6,61 (dd, 1H, J = 2,4, 8,3 Hz), 6,44 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 4,76 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 4,26–4,19 (m, 4H), 3,92 (s, 2H), 3,41–3,38 (m, 2H), 3,00 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 1,93–1,88 (m, 2H), 1,27 (t, 3H, J 7,2 Hz).
{3-[21-(5,6,7,8-Tetrahydro-[1,8]naghthyridin-2-yl)ethoxy]-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-yl}essigsäure (1-8)
Eine Lösung von 11-7 (235 mg, 0,511 mmol) in THF (2 ml) und 1,4-Dioxan (2 ml) wurde mit 1M wäßrigem NaOH (1,54 ml) bei Raumtemperatur über Nacht behandelt. Die Reaktion wurde mit 1M wäßrigem HCl (1,54 ml) neutralisiert und die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die präparative Zentrifugalchromatographie (SiO₂, 2 mm, 10% MeOH, 90% CH₂Cl₂) ergab 11-8.
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 10,74 (s, 1H), 7,59 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 7,02 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 6,91–6,87 (m, 3H), 6,69–6,66 (m, 2H), 6,54 (dd, 1H, J = 2,5, 8,1 Hz), 6,36 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 4,44 (s, 2H), 4,16 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 3,86 (s, 2H), 3,47 (t, 2H, J = 5,5 Hz), 2,98 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,71 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 1,93–1,88 (m, 2H). Niedrigauflösendes Elektronenspray-Massenspektrum: Beobachtet m/e 432 (M⁺ + H).
SCHEMA A Synthese des Radioliganden für den SPAV3-Test
SCHEMA A, Forts.
SCHEMA A, Forts.
N-(4-Iodphenylsulfonylamino)-L-asparagin (A-2)
Zu einer gerührten Lösung von Säure A-1 (4,39 g, 33,2 mmol), NaOH (1,49 g, 37,2 mmol), Dioxan (30 ml) und H₂O (30 ml) bei 0°C wurde Pipsylchlorid (10,34 g, 34,2 mmol) zugegeben. Nach ~5 Minuten wurde in 15 ml H₂O gelöstes NaOH (1,49 g, 37,2 mmol) zugegeben, gefolgt von der Entfernung des Kühlbades. Nach 2,0 Stunden wurde die Reaktionsmischung eingeengt. Der Rückstand wurde in H₂O (300 ml) gelöst und anschließend mit EtOAc gewaschen. Der wäßrige Teil wurde auf 0°C abgekühlt und dann mit konzentrierter HCl angesäuert. Der Feststoff wurde gesammelt und anschließend mit Et₂O gewaschen, um die Säure A-2 als einen weißen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (300 MHz, D₂O) δ 7,86 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,48 (d, 2H, J = 8 Hz), 3,70 (m, 1H), 2,39 (m, 2H).
2(S)-(4-Iodphenylsulfonylamino)-β-alanin (A-3)
Zu einer gerührten Lösung von NaOH (7,14 g, 181,8 mmol) und H₂O (40 ml) bei 0°C wurde Br₂ (1,30 ml, 24,9 mmol) tropfenweise innerhalb eines Zeitraums von zehn Minuten zugegeben. Nach ~5 Minuten wurden Säure A-2 (9,9 g, 24,9 mmol), NaOH (2,00 g, 49,8 mmol) und H₂O (35 ml) vereint, auf 0°C abgekühlt und anschließend in einer einzigen Portion zu der Reaktion hinzugegeben. Nach 20minütigem Rühren bei 0°C wurde die Reaktion 30 Minuten lang auf 90°C erwärmt und dann wieder auf 0°C abgekühlt. Der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von konzentrierter HCl auf ~7 eingestellt. Der Feststoff wurde gesammelt, mit EtOAc gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, um die Säure A-3 als einen weißen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (300 MHz, D₂O) δ 8,02 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 4,36 (m, 1H), 3,51 (dd, 1H, J = 5 Hz, 13 Hz), 3,21 (m, 1H).
Ethyl-2(S)-(4-iodphenylsulfonylamino)-β-alanin-Hydrochlorid (A-4)
HCl-Gas wurde 10 Minuten lang schnell durch eine Suspension aus Säure A-3 (4,0 g, 10,81 mmol) in EtOH (50 ml) bei 0°C geleitet. Das Kühlbad wurde entfernt und die Reaktion auf 60°C erwärmt. Nach 18 Stunden wurde die Reaktion eingeengt, um Ester A-4 als einen weißen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 7,98 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 4,25 (q, 1H, J = 5 Hz), 3,92 (m, 2H), 3,33 (m, 1H), 3,06 (m, 1H), 1,01 (t, 3H, J = 7 Hz).
Ethyl-4-[2-(2-aminopyridin-6-yl)ethyl]benzoat (A-5a)
Eine Mischung aus Ester A-5 (700 mg, 2,63 mmol) (für die Herstellung siehe: Schema 29 (Zwischenprodukt 29-3) von US-Patent Nr. 5 741 796 (21. April 1998)), 10% Pd/C (350 mg) und EtOH wurde unter 1 atm H₂ gerührt. Nach 20 Stunden wurde die Reaktion durch ein Celitekissen filtriert und anschließend eingeengt, um Ester A-5a als ein braunes Öl zu ergeben.
DC R_f = 0,23 (Silica, 40% EtOAc/Hexane)
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7,95 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,26 (m, 3H), 6,43 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,35 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,37 (m, 4H), 3,05 (m, 2H), 2,91 (m, 2H), 1,39 (t, 3H, J = 7 Hz).
4-[2-(2-Aminopyridin-6-yl)ethyl]benzoesäure-Hydrochlorid (A-6)
Eine Suspension von Ester A-5a (625 mg, 2,31 mmol) in 6N HCl (12 ml) wurde auf 60°C erwärmt. Nach ~20 Stunden wurde die Reaktion eingeengt, um Säure A-6 als einen gelbbraunen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 7,96 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,80 (m, 1H), 7,33 (d, 2H, J = 8 Hz), 6,84 (d, 1H, J = 9 Hz), 6,69 (d, 1H, J = 7 Hz), 3,09 (m, 4H).
Ethyl-4-[2-(2-aminopyridin-6-yl)ethyl]benzoyl-2(S)-(4-iodphenylsulfonylamino)-β-alanin (A-7)
Eine Lösung von Säure 15-6 (400 mg, 1,43 mmol), Amin A-4 (686 mg, 1,57 mmol), EDC (358 mg, 1,86 mmol), HOBT (252 mg, 1,86 mmol), NMM (632 μl, 5,72 mmol) in DMF (10 ml) wurde ~20 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit EtOAc verdünnt und anschließend mit gesätt. NaHCO₃, Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingeengt. Die Flashchromatographie (Silica, EtOAc, dann 5% Isopropanol/EtOAc) ergab das Amid A-7 als einen weißen Feststoff.
DC R_f = 0,4 (Silica, 10% Isopropanol/EtOAc).
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 7,79 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,61 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,52 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,29 (m, 1H), 7,27 (d, 2H, J = 8 Hz), 4,20 (m, 1H), 3,95 (q, 2H, J = 7 Hz), 3,66 (dd, 1H, J = 6 Hz, 14 Hz), 3,49 (dd, 1H, J = 8 Hz, 13 Hz), 3,01 (m, 2H), 2,86 (m, 2H), 1,08 (t, 3H, J = 7 Hz).
4-[2-(2-Aminopyridin-6-yl)ethyl]benzoyl-2(S)-(4-iodphenylsulfonylamino)-β-alanin (A-8)
Eine Lösung von Ester A-7 (200 mg, 0,3213 mmol) und 6N HCl (30 ml) wurde auf 60°C erwärmt. Nach ~20 Stunden wurde die Reaktionsmischung eingeengt. Die Flashchromatographie (Silica, 20:20:1:1 EtOAc/EtOH/NH₄OH/H₂O) ergab Säure A-8 als einen weißen Feststoff.
DC R_f = 0,45 (Silica, 20:20:1:1 EtOAc/EtOH/NH₄OH/H₂O).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8,40 (m, 1H), 8,14 (br. s, 1H), 7,81 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,62 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,48 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,27 (m, 3H), 6,34 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,25 (d, 1H, J = 8 Hz), 5,85 (br. s, 2H), 3,89 (br. s, 1H), 3,35 (m, 2H), 2,97 (m, 2H), 2,79 (m, 2H).
4-[2-(2-Aminopyridin-6-yl)ethyl)benzoyl-2(S)-(4-trimethylstannylphenylsulfonylamino-β-alanin (A-9)
Eine Lösung von Iodid A-8 (70 mg, 0,1178 mmol), [(CH₃)₃Sn]₂ (49 μl, 0,2356 mmol), Pd(PPh₃)₄ (5 mg) und Dioxan (7 ml) wurde auf 90°C erwärmt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion eingeengt und anschließend durch präparative HPLC (Delta-Pak C₁₈ 15 μM 100A°, 40 × 100 mm; 95:5, dann 5:95 H₂O/CH₃CN) gereinigt, um das Trifluoracetatsalz zu ergeben. Das Salz wurde in H₂O (10 ml) suspendiert, mit NH₄OH (5 Tropfen) behandelt und anschließend gefriergetrocknet, um das Amid A-9 als einen weißen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8,40 (m, 1H), 8,18 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,67 (m, 5H), 7,56 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,29 (d, 2H, J = 8 Hz), 6,95–7,52 (m, 2H), 6,45 (br. s, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 2,97 (m, 2H), 2,86 (m, 2H).
4-[2-(2-Aminopyridin-6-yl)ethyl]benzoyl-2(S)-4-¹²⁵iodphenylsulfonylamino-β-alanin (A-10)
Ein Iodobead (Pierce) wurde zu einer im Handel verwendeten Ampulle mit 5 mCi Na¹²⁵I (Amersham, IMS30) zugegeben und fünf Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von 0,1 mg A-9 in 0,05 ml 10% H₂SO₄/MeOH wurde hergestellt und sofort zu der Na¹²⁵I/Iodobead-Ampulle gegeben. Nach dreiminütigem Rühren bei Raumtemperatur wurden etwa 0,04–0,05 ml NH₄OH zugegeben, so daß die Reaktionsmischung einen pH-Wert von 6–7 hatte. Die gesamte Reaktionsmischung wurde zur Reinigung auf die HPLC-Vorrichtung [Vydac-Peptid-Protein-C-18-Säule, 4,6 × 250 mm, linearer Gradient von 10% Acetonitril (0,1% (TFA):H₂O (0,1% TFA) bis 90% Acetonitril (0,1% TFA):H₂O (0,1% TFA) innerhalb von 30 Minuten, 1 ml/min] gespritzt. Die Retentionszeit von A-10 beträgt unter diesen Bedingungen 17 Minuten. Die Fraktionen, die den Großteil der Radioaktivität enthielten, wurden gesammelt, gefriergetrocknet und mit Ethanol verdünnt, um etwa 1 mCi A-10 zu ergeben, welches bei der HPLC-Analyse mit einer authentischen Probe von A-8 gemeinsam eluierte.
SCHEMA B Synthese des Radioliganden für den SPAV5-Test
2(S)-(4-Iodbenzolsulfonylamino)-3-{4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-[1,8]naphthyridin-2-yl)ethyl]benzoylamino}propionsäureethylester (B-2)
Eine Mischung aus B-1 (0,23 g, 0,72 mmol; zur Herstellung siehe US-Patent Nr. 5 741 796), A-4 (0,343 g, 0,792 mmol), EDC (0,179 g, 0,93 mmol), HOBT (0,126 g, 0,93 mmol), NMM (0,316 ml, 2,86 mmol) in Acetonitril (3 ml) und DMF (3 ml) wurde 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser, gesättigtem wäßrigem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde auf Kieselgel (70:25:5 CHCl₃/EtOAc/MeOH) chromatographiert, um B-2 als einen weißen Feststoff zu ergeben.
DC R_f = 0,22 (Silica, 70:25:5 CHCl₃/EtOAc/MeOH).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7,79 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,54 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,27 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,04 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,60 (m, 1H), 6,29 (d, 1H, J = 7 Hz), 4,83 (br. s, 1H), 4,09 (m, 3H), 3,84 (m, 1H), 3,68 (m, 1H), 3,42 (m, 2H), 3,01 (m, 4H), 2,86 (m, 4H), 2,69 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,88 (m, 2H).
2(S)-(4-Iodbenzolsulfonylamino)-3-{4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-[1,8]naphthyridin-2-yl)ethyl]benzoylamino}propionsäure (B-3)
Eine Mischung aus B-2 (0,38 g, 0,573 mmol) und 6N HCl (50 ml) wurde 14 Stunden bei 60°C gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Mischung eingeengt und der Rückstand auf Kieselgel chromatographiert (25:10:1:1 bis 15:15:1:1 EtOAc/EtOH/NH₄OH/H₂O), um B-3 als einen weißen Feststoff zu ergeben.
DC R_f = 0,43 (Silica, 10:10:1:1 EtOAc/EtOH/NH₄OH/H₂O).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,42 (m, 1H), 7,79 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,44 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,27 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,10 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,58 (br. s, 1H), 6,32 (d, 1H, J = 7 Hz), 3,96 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,30 (m, 5H), 2,96 (m, 2H), 2,78 (m, 2H), 2,62 (m, 2H), 1,77 (m, 2H).
HRMS: Für C₂₆H₂₇IN₄O₅S, erwartet 635,0818, gefunden 635,0831.
3-{4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-[1,8]naphthyridin-2-yl)ethyl]benzoylamino}-2(S)-(4-trimethylstannanylbenzolsulfonylamino)propionsäure (B-4)
Eine Mischung aus B-3 (0,10 g, 0,16 mmol), Hexamethyldistannan (0,065 ml, 0,32 mmol), Pd(PPh₃)₄ und Dioxan (10 ml) wurde eine Stunde bei 90°C gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Mischung eingeengt und der Rückstand auf Kieselgel chromatographiert (50:10:1:1 bis 25:10:1:1 EtOAc/EtOH/NH₄OH/H₂O), um B-4 als einen weißen Feststoff zu ergeben.
DC R_f = 0,48 (Silica, 15:10:1:1 EtOAc/EtOH/NH₄OH/H₂O).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,38 (m, 1H), 8,14 (m, 1H), 7,63 (m, 4H), 7,28 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,50 (br. s, 1H), 6,28 (d, 1H, J = 7 Hz), 3,96 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 3,31 (m, 5H), 2,96 (m, 2H), 2,78 (m, 2H), 2,62 (m, 2H), 1,77 (m, 2H), 0,28 (s, 9H).
Hochauflösendes Massenspektrum: Für C₂₉H₃₆N₄O₅SSn, erwartet 665,1533 (¹¹²Sn) und 673,1507 (¹²⁰Sn), gefunden 665,1510 und 673,1505.
2(S)-(4-¹²⁵Iodbenzolsulfonylamino)-3-{4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-[1,8]naphthyridin-2-yl)ethyl]benzoylamino}propionsäure (B-5)
Ein Rührstab, Methanol (0,05 ml) und ein Iodobead (Pierce) wurden zu einer im Handel verwendeten Ampulle mit Na¹²⁵I (10 mCi, Amersham, IMS300) zugegeben und fünf Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von B-4 (~0,1 mg) in Methanol (0,04 ml) wurde hergestellt, und ein Teil davon (0,02 ml) wurde zu einer Mischung aus H₂SO₄ (0,005 ml) in Methanol (0,025 ml) gegeben und diese Lösung sofort zu der Na¹²⁵I/Iodobead-Ampulle zugegeben. Nach zweiminütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit NH₄OH (0,04–0,05 ml) gequencht und die gesamte Reaktionsmischung zur Reinigung auf die HPLC-Vorrichtung [Vydac-Peptid-Protein-C-18-Säule, 4,6 × 250 mm, linearer Gradient von 10% Acetonitril:H₂O (0,1% TFA) bis 90% Acetonitril:H₂O (0,1% TFA) innerhalb von 20 Minuten, 1 ml/min] gespritzt. Die Retentionszeit von B-5 beträgt unter diesen Bedingungen 16 Minuten. Die Fraktionen, die den Großteil der Radioaktivität enthielten, wurden gesammelt, gefriergetrocknet und mit Ethanol verdünnt, um etwa 1 mCi B-5 zu ergeben, welches bei der HPLC-Analyse mit einer authentischen Probe von B-3 gemeinsam eluierte.
Geräte: Die analytische und präparative HPLC wurde mit einem Waters 600E Powerline Multi Solvent Delivery System mit 0,1-ml-Köpfen mit einem Rheodyne-7125-Injektor und einem Waters 990 Photodiode Array Detector mit einem Gilson-FC203-Microfraction-Sammler durchgeführt. Für die analytische und präparative HPLC wurde eine Vydac-Peptid-Protein-C-18-Säule, 4,6 × 250 mm, mit einer C-18-Brownlee-Modular-Guard-Säule verwendet. Das für die HPLC-Analysen verwendete Acetonitril hatte Fisher-Optima-Qualität. Der verwendete HPLC-Radiodetektor war ein Beckmann-170-Radioisotope-Detektor. Eine Vydac-C-18-Protein-und-Peptid-Säule, 3,9 × 250 mm, wurde für die analytische und präparative HPLC verwendet. Radioaktivitätslösungen wurden unter Verwendung einer Speedvac-Vakuumzentrifuge konzentriert. Die Eichkurven und die chemischen Konzentrationen wurden mit einem Hewlett Packard Model 8452A UV/Vis Diode Array Spectrophotometer ermittelt. Die Radioaktivitäten der Proben wurden in einem Packard-A5530-Gammazähler ermittelt.
Die zur Messung der αvβ3- und αvβ5-Bindung und der Knochenresorptionsinhibierungswirkung der Verbindung der vorliegenden Erfindung verwendeten Testverfahren sind nachstehend beschrieben.
KNOCHENRESORPTIONSGRUBENTEST
Wenn Osteoklasten Knochenresorption betreiben, können sie die Bildung von Gruben in der Knochenoberfläche, auf die sie einwirken, bewirken. Daher ist es nützlich, beim Test der Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Osteoklasteninhibierung die Fähigkeit von Osteoklasten, diese Resorptionsgruben auszuheben, wenn die inhibierende Verbindung vorhanden ist, zu messen.
Fortlaufende 200 Mikron dicke Querschnitte aus einem 6-mm-Zylinder boviner Femur-Diaphyse werden mit einer langsamlaufenden Diamantsäge (Isomet, Beuler, Ltd., Lake Bluff, II) geschnitten. Die Knochenschnitte werden gesammelt, in eine 10%ige Ethanollösung gegeben und bis zur Weiterverwendung im Kühlschrank aufbewahrt.
Vor dem Experiment werden die Knochenschnitte zweimal jeweils 20 Minuten in H₂O mit Ultraschall behandelt. Die gereinigten Schnitte werden in Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, so daß zwei Kontrollbahnen und eine Bahn für jede Arzneistoffdosis zur Verfügung stehen. Jede Bahn stellt entweder dreifache oder vierfache Kulturen dar. Die Knochenschnitte in den Platten mit den 96 Vertiefungen werden durch UV-Bestrahlung sterilisiert. Vor der Inkubation mit Osteoklasten werden die Knochenschnitte durch die Zugabe von 0,1 ml αMEM, pH 6,9, das 5% fötales Rinderserum und 1% Penicillin/Streptomycin enthält, hydratisiert.
Langknochen von 7 bis 14 Tage alten Kaninchen (New Zealand White Hare) werden seziert, von Weichgebe befreit und in αMEM, das 20 mM HEPES enthält, gelegt. Die Knochen werden mit Scheren zerkleinert, bis die Stücke < 1 mm groß sind, und in ein 50-ml-Röhrchen in ein Volumen von 25 ml überführt. Das Röhrchen wird 60 mal leicht mit der Hand geschüttelt, das Gewebe läßt man 1 Minute absitzen, und der Überstand wird entfernt. Weitere 25 ml Medium werden zu dem Gewebe hinzugegeben, und man schüttelt erneut. Der zweite Überstand wird mit dem ersten Überstand vereint. Die Anzahl der Zellen wird gezählt, wobei Erythrozyten ausgeschlossen werden (typischerweise ~2 × 10⁷ Zellen/ml). Eine Zellsuspension, bestehend aus 5 × 10⁶/ml in αMEM, das 5% fötales Rinderserum, 10 nM 1,25(OH)₂D₃ und Penicillin-Streptomycin enthält, wird hergestellt. 200-ml-Aliquote werden zu den Rinderknochenschnitten (200 mm × 6 mm) gegeben und 2 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten 5%-CO₂ Atmosphäre inkubiert. Das Medium wird mit einer Mikropipettiervorrichtung entfernt, und frisches Medium, das Testverbindungen enthält, wird zugegeben. Die Kulturen werden 48 Stunden inkubiert und auf c-Telopeptid (Fragmente der a1-Kette von Kollagen vom Typ I) mittels Crosslaps für Kulturmedium (Herlev, Dänemark) untersucht.
Knochenschnitte werden 20–24 Stunden lang Osteoklasten ausgesetzt und zum Färben aufbereitet. Von jedem Knochenschnitt wird das Gewebekulturmedium entfernt. Jede Vertiefung wird mit 200 ml H₂O gewaschen, und die Knochenschnitte werden anschließend 20 Minuten in 2,5%igem Glutaraldehyd, 0,1M Cacodylat, pH 7,4, fixiert. Nach der Fixierung werden sämtliche verbliebenen Zelltrümmer durch 2minütige Ultraschallbehandlung in Gegenwart von 0,25M NH₄OH, gefolgt von 2 × 15minütiger Ultraschallbehandlung in H₂O, entfernt. Die Knochenschnitte werden sofort 6–8 Minuten mit filtriertem 1%igem Toluidin-Blau und 1 %igem Borax gefärbt.
Nachdem die Knochenschnitte getrocknet sind, werden die Resorptionsgruben in den Test- und Kontrollschnitten gezählt. Die Resorptionsgruben werden in einem Microphot-Fx(Nikon)-Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines polarisierenden Nikon-IGS-Filterkubus betrachtet. Die Testdosierungsergebnisse werden mit den Kontrollen verglichen und die resultierenden IC₅₀-Werte für jede getestete Verbindung ermittelt.
Die Eignung der Extrapolierung von Daten aus diesem Test für Erkrankungszustände von Säugern (einschließlich Menschen) wird von der bei Sato, M., et al., Journal of Bone and Mineral Research, Band 5, Nr. 1, S. 31–40, 1990, zu findenden Lehre gestützt, welche hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Dieser Artikel lehrt, daß bestimmte Bisphosphonate klinisch verwendet wurden und bei der Behandlung von Paget-Krankheit, Hyperkalzämie durch Malignität, durch Knochenmetastasen erzeugten osteolytischen Läsionen und Knochenschwund aufgrund von Immobilisierung oder Sexualhormonmangel wirksam zu sein scheinen. Die gleichen Bisphosphonate werden dann in dem oben beschriebenen Resorptionsgrubentest getestet, um eine Korrelation zwischen ihrem bekannten Nutzen und einer positiven Leistung in dem Test zu bestätigen.
EIB-TEST
Duong et al., J. Bone Miner. Res., 8:S378, beschreiben ein System für die Expression des menschlichen Integrins αvβ3. Es wurde vermutet, daß das Integrin die Bindung von Osteoklasten an die Knochenmatrix stimuliert, da Antikörper gegen das Integrin oder RGD-haltige Moleküle, wie z.B. Echistatin (Europäische Veröffentlichung 382 451), die Knochenresorption wirksam blockieren können.
Reaktionsmischung:

1. 175 μl TBS-Puffer (50 mM Tris·HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% BSA, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂).
2. 25 ml Zellextrakt (verdünnt mit 100 mM Octylglucosid-Puffer, um 2000 cpm/25 μl zu ergeben).
3. ¹²⁵I-Echistatin (25 μl/50000 cpm) (siehe EP 382 451 ).
4. 25 μl Puffer (Gesamtbindung) oder unmarkiertes Echistatin (unspezifische Bindung).

Die Reaktionsmischung wurde anschießend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das ungebundene und das gebundene αvβ3 wurden durch Filtration mit einem Skatron-Zellernter getrennt. Die Filter (10 Minuten lang vorbenetzt in 1,5%igem Polyethylenimin) wurden anschließend mit dem Waschpuffer (50 mM Tris HCl, 1 mM CaCl₂/MgCl₂, pH 7,2) gewaschen. Das Filter wurde anschließend in einem Gammazähler gezählt.
SPAV3-TEST
MATERIALIEN:

1. Weizenkeim-Agglutinin-Szintillation-Proximity-Beads (SPA): Amersham
2. Octylglucopyranosid: Calbiochem
3. HEPES: Calbiochem
4. NaCl: Fisher
5. CaCl₂: Fisher
6. MgCl₂: SIGMA
7. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF): SIGMA
8. Optiplate: PACKARD
9. Verbindung A-10 (spezifische Aktivität 500–1000 Ci/mmol)
10. Testverbindung
11. Gereinigter Integrin-Rezeptor: αvβ3 wurde aus 293-Zellen, die αvβ3 überexprimieren (Duong et al., J. Bone Min. Res., 8:S378, 1993) gemäß Pytela (Methods in Enzymology, 144:475, 1987) gereinigt.
12. Bindungspuffer: 50 mM HEPES, pH 7,8, 100 mM NaCl, 1 mM Ca²⁺/Mg²⁺, 0,5 mM PMSF
13. 50 mM Octylglucosid in Bindungspuffer: 50-OG-Puffer

VERFAHREN:

1. Vorbehandlung der SPA-Beads: 500 mg gefriergetrocknete SPA-Beads wurden zunächst viermal mit 200 ml 50-OG-Puffer und einmal mit 100 ml Bindungspuffer gewaschen und anschließend in 12,5 ml Bindungspuffer erneut suspendiert.
2. Herstellung der Mischung aus SPA-Beads und Rezeptor In jedes Teströhrchen wurden 2,5 μl (40 mg/ml) vorbehandelte Beads in 97,5 μl Bindungspuffer und 20 ml 50-OG-Puffer suspendiert. 5 ml (~30 ng/μl) gereinigter Rezeptor wurde zu den Beads in der Suspension hinzugegeben, wobei 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die Mischung wurde anschließend bei 2500 U/Minute in einer Beckman-GPR-Benchtop-Zentrifuge 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Pellets wurden anschließend in 50 μl Bindungspuffer und 25 μl 50-OG-Puffer erneut suspendiert.
3. Reaktion Folgendes wurde der Reihe nach zu Optiplate in den entsprechenden Vertiefungen hinzugegeben:
(i) Rezeptor/Beads-Mischung (75 μl)
(ii) jeweils 25 μl der folgenden Stoffe: zu testende Verbindung, Bindungspuffer zur vollständigen Bindung oder A-8 zur nichtspezifischen Bindung (Endkonzentration 1 μM)
(iii) A-10 in Bindungspuffer (25 μl, Endkonzentration 40 pM)
(iv) Bindungspuffer (125 μl)
(v) Jede Platte wurde mit Plattenversiegelung von PACKARD versiegelt und über Nacht unter Schütteln bei 4°C inkubiert.
4. Die Platten wurden mit PACKARD TOPCOUNT gezählt
5. Die %-Inhibierung wurde wie folgt berechnet: A = Zählungen insgesamt B = nichtspezifische Zählungen C = Proben-Zählungen %-Inhibierung = [{(A – B) – (C – B)}/(A – B)]/(A – B) × 100

OCFORM-TEST
Osteoblastenartige Zellen (1.8-Zellen), die ursprünglich von Mäuseschädeldecken stammten, wurden in CORNING-Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen in einem αMEM-Medium, das Ribo- und Desoxyribonukleoside, 10%iges fötales Rinderserum und Penicillin-Streptomycin enthielt, plattiert. Die Zellen wurden am Morgen mit 40000/Vertiefung angesetzt. Am Nachmittag wurden Knochenmarkszellen aus sechs Wochen alten männlichen Balb/C-Mäusen wie folgt hergestellt:
Die Mäuse wurden getötet, die Tibiae wurden entfernt und in das obige Medium gelegt. Die Enden wurden abgeschnitten und das Mark mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27,5-Gauge-Nadel aus dem Hohlraum in ein Röhrchen gespült. Das Mark wurde durch Auf- und Abpipettieren suspendiert. Die Suspension wurde durch ein > 100 μm Nylon-Zellfilter geleitet. Die resultierende Suspension wurde sieben Minuten bei 350 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut suspendiert, und eine Probe wurde in 2%iger Essigsäure verdünnt, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Die restlichen Zellen wurden in einem Hämozytometer gezählt. Die Zellen wurden pelletisiert und mit 1 × 10⁶ Zellen/ml erneut suspendiert. 50 μl wurden zu jeder Vertiefung mit 1.8-Zellen zugegeben, um 50000 Zellen/Vertiefung zu ergeben, und 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (D₃) wurde zu jeder Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von 10 nM hinzugegeben. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten 5%-CO₂ Atmosphäre inkubiert. Nach 48 Stunden wurde das Medium gewechselt. 72 Stunden nach der Zugabe von Knochenmark wurden die Testverbindungen mit frischem Medium, das D₃ enthielt, zu vierfachen Vertiefungen zugegeben. Nach 48 Stunden wurden die Verbindungen erneut mit D₃ haltigem frischem Medium versetzt. Nach weiteren 48 Stunden wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden mit 10%igem Formaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, gefolgt von einer 1–2minütigen Behandlung mit Ethanol:Aceton (1:1), und luftgetrocknet. Die Zellen wurden dann wie folgt für tartratresistente saure Phosphatase gefärbt:
Die Zellen wurden 10–15 Minuten mit 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0, der 30 mM Natriumtartrat, 0,3 mg/ml Fast Red Violet LB Salz und 0,1 mg/ml Naphthol AS -MX Phosphat enthielt, gefärbt. Nach dem Färben wurden die Platten ausgiebig mit entionisiertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Die Anzahl an multinukleierten positiv-färbenden Zellen wurde in jeder Vertiefung gezählt.
SPAV5-TEST
MATERIALIEN:

1. Weizenkeim-Agglutinin-Szintillation-Proximity-Beads (SPA): Amersham
2. Octylglucopyranosid und Phorbo-12-myristat-13-acetat (PMA): Calbiochem
3. Tris-HCl, NaCl und CaCl₂: Fisher
4. Minimum Essential Media (MEM): Gibco/BRL
5. Fötales Rinderserum (FBS): Hyclone
6. MgCl₂, MnCl₂ und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF): SIGMA
7. Proteaseinhibitorcocktailtabletten: Boehringer Mannheim
8. Optiplate-96-Well-Platten: PACKARD
9. B-5 wurde als radiomarkierter Ligand (spezifische Aktivität 500–1000 Ci/mmol) verwendet, und B-3 (2,5 μM) wurde verwendet, um eine 100%ige Inhibierung zu erzielen.
10. Testverbindung
11. HEK293-Zellen, die α_vβ₅ Integrine überexprimieren (Simon et al., J. Biol. Chem. 272, 29380–29389, 1997), werden in 150-mm-Schalen in 10% FBS/MEM-Medium (Gibco/BRL) kultiviert.
12. Lysepuffer: 100 mM Octylglucopyranosid, 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM PMSF und Proteaseinhibitoren (1 Tablette/50 ml Puffer).
13. Bindungspuffer: 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ und 1 mM MnCl₂.
14. 50 mM Octylglucopyranosid in Bindungspuffer: 50-OG-Puffer

VERFAHREN:

1. α_vβ₅-Zell-Lysate: HEK-293-Zellen, die α_vβ₅-Integrine exprimieren, wurden bis zur Konfluenz kultiviert. Anschließend ließ man die Zellen über Nacht in Medium, das 0,5% FBS enthält, hungern, gefolgt von der 20minütigen Behandlung mit 100 nM PMA. Die Zellen wurden 2mal mit kaltem Phosphatpuffer (4°C) gewaschen und in Lysepuffer 30 Minuten auf Eis löslich gemacht. Die Lysate wurden unter Verwendung einer Beckman JA-20 bei 20000 × g geklärt. Die Proteinkonzentration der geklärten Lysate wurde durch Verwendung eines Mikro-BCA-Kits (Pierce) ermittelt, und diese wurden in Aliquoten bei 80°C aufbewahrt.
2. Vorbehandlung der SPA-Beads: 500 mg gefriergetrocknete SPA-Beads wurden zunächst viermal mit 200 ml 50-OG-Puffer und einmal mit 100 ml Bindungspuffer gewaschen und anschließend in 12,5 ml Bindungspuffer erneut suspendiert.
3. Herstellung der SPAVS-Bindungsreaktion Zu jeder Testvertiefung wurden der Reihe nach folgende Stoffe in Optiplate-Platten zugegeben:
(i) Bindungspuffer, um ein Endvolumen von 125 μl pro Vertiefung zu ergeben,
(ii) 3 μl (120 μl/Vertiefung) vorbehandelte Beads, verdünnt mit 22 μl 50-OG-Puffer,
(iii) 15 μg α_vβ₅-Zell-Lysat-Proteine,
(iv) B-5 mit 50000 cpm,
(v) 25 μl abgestufte Konzentrationen der Testverbindung,
(vi) Jede Platte wurde mit Plattenversiegelung von PACKARD versiegelt und über Nacht unter Schütteln bei 4°C inkubiert.
4. Die Platten wurden mit einem PACKARD TOPCOUNT-Mikroplattenszintillationszähler gezählt.
5. Die %-Inhibierung wurde wie folgt berechnet: A = Zählungen insgesamt (Bindung von Rezeptor an B-5) B = nichtspezifische Zählungen (Bindung von Rezeptor an B-5 in Gegenwart von 2,5 μM kaltem Liganden) C = Zählungen von Rezeptorbindung an Testverbindung %-Inhibierung = [{(A – B) – (C – B)}/(A – B)]/(A – B) × 100

Der IC₅₀-Wert der Testverbindung wurde als 50%ige Inhibierung berechnet.
BEISPIEL FÜR EINE PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNG
Als eine spezielle Ausführungsform einer oralen Zusammensetzung werden 100 mg der Verbindung der vorliegenden Erfindung mit ausreichend feinteiliger Lactose formuliert, um eine Gesamtmenge von 580 bis 590 mg zu ergeben, die in eine Hartgelatinekapsel der Größe 0 gefüllt wird.
Obwohl die Erfindung in bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben und veranschaulicht wurde, werden die Fachleute erkennen, daß verschiedene Änderungen, Modifizierungen und Substitutionen daran vorgenommen werden können. Zum Beispiel können wirksame Dosen, die anders sind als die oben genannten bevorzugten Dosen, als Folge von Variationen beim Ansprechverhalten des Säugers, der gegen schwere, durch Resorption hervorgerufene Knochenstörungen oder gegen andere Indikationen behandelt wird, auf die oben angegebenen Verbindungen der Erfindung, zur Anwendung gelangen. Ähnlich können die beobachteten speziellen pharmakologischen Reaktionen variieren, gemäß und abhängig von der speziell ausgewählten Wirkverbindung oder dem Vorliegen pharmazeutischer Träger sowie der Art der Formulierung und des eingesetzten Verabreichungsmodus, und solche erwarteten Variationen oder Unterschiede bei den Ergebnissen sind von den Zielen und Praktiken der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Claims

Eine Verbindung der Strukturformel (I):
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein pharmazeutisch annehmbarer Ester davon.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 2, die ferner einen Wirkstoff enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) einem organischen Bisphosphonat oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Ester davon, b) einem Östrogenrezeptormodulator, c) einem zytotoxischen/antiproliferativen Mittel, d) einem Matrixmetalloproteinaseinhibitor, e) einem Inhibitor der epidermalen, Fibroblasten- oder Thrombozyten-Wachstumsfaktoren, f) einem VEGF-Inhibitor, g) einem Flk-1/KDR-, Flt-1-, Tck/Tie-2- oder Tie-1-Inhibitor, h) einem Kathepsin-K-Inhibitor und i) einem Prenylierungsinhibitor, wie z.B. einem Farnesyltransferaseinhibitor oder einem Geranylgeranyltransferaseinhibitor oder einem doppelten Farnesyl/Geranylgeranyl-Transferaseinhibitor, und Mischungen davon.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus a) einem organischen Bisphosphonat oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Ester davon, b) einem Östrogenrezeptormodulator und c) einem Kathepsin-K-Inhibitor und Mischungen davon.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das organische Bisphosphonat oder das pharmazeutisch annehmbare Salz oder der pharmazeutisch annehmbare Ester davon Alendronat-Mononatrium-Trihydrat ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus a) einem zytotoxischen/antiproliferativen Mittel, b) einem Matrixmetalloproteinaseinhibitor, c) einem Inhibitor der epidermalen, Fibroblasten- oder Thrombozyten-Wachstumsfaktoren, d) einem VEGF-Inhibitor und e) einem Flk-1/KDR-, Flt-1-, Tck/Tie-2- oder Tie-1-Inhibitor und Mischungen davon.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung eines Zustandes, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Knochenresorption, Restenose, Angiogenese, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, entzündlicher Arthritis und Tumorwachstum.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei der zu inhibierende Zustand Knochenresorption ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Osteoporose bei einem Säuger.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Medikament zusätzlich ein organisches Bisphosphonat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Ester davon enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei das organische Bisphosphonat oder das pharmazeutisch annehmbare Salz oder der pharmazeutisch annehmbare Ester davon Alendronat-Mononatrium-Trihydrat ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorwachstum bei einem Säuger, der sich einer Strahlentherapie unterzieht.