ES2259047T3

ES2259047T3 - Antagonista de receptor de integrina de la dibenzoxazepina.

Info

Publication number: ES2259047T3
Application number: ES01987196T
Authority: ES
Inventors: Michael A. Patane
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2006-09-16
Anticipated expiration: 2021-10-19
Also published as: DE60118025D1; US20040019035A1; AU2002239435B2; AU3943502A; DE60118025T2; WO2002040505A2; CA2425117A1; JP2004513953A; WO2002040505A3; ATE320258T1; EP1331937A2; EP1331937B1; EP1331937A4; US6943156B2

Abstract

Un compuesto de la **fórmula** estructural o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, que comprende adicionalmente un ingrediente activo seleccionado entre el grupo constituido por: a) un bifosfonato orgánico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, b) un modulador de receptor de estrógeno, c) un agente citotóxico/antiproliferativo, d) un inhibidor de la metaloproteinasa de matriz, e) un inhibidor de factores de crecimiento derivados de epidermis, derivado de fibroblastos, o derivado de plaquetas, f) un antagonista del receptor VEGF, g) un inhibidor de Flk-1/KDR, Plt-1, Tck/Tie-2, o Tie-1, h) un inhibidor de la catepsina K, i) un inhibidor de prenilación, tal como un inhibidor de la farnesiltransferasa o un inhibidor de la geranilgeraniltransferasa o un inhibidor dual de la farnesil/geranilgeranil transferasa.

Description

Antagonista de receptor de integrina de la dibenzoxazepina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un derivado de dibenzoxazepina, su síntesis, y su uso como un antagonista del receptor de las integrinas \alphav. Más particularmente, el compuesto de la presente invención es un antagonista de los receptores \alphav\beta3, \alphav\beta5, y receptores de las integrinas \alphav asociados a otras subunidades \beta, y es útil para inhibir la resorción ósea, tratando y/o previniendo la osteoporosis, e inhibiendo reestenosis vascular, retinopatía diabética, degeneración macular, angiogénesis, aterosclerosis, artritis inflamatoria, cáncer, y desarrollo tumoral metastá-
tico.

Antecedentes de la invención

Se cree que una amplia diversidad de estados y afecciones patológicos pueden estar mediados mediante la actuación sobre los receptores de integrina y esos antagonistas de receptores de integrina representan una clase útil de fármacos. Los receptores de integrina son receptores heterodímeros de transmembrana mediante los que las células se unen y comunican con matrices extracelulares y otras células. (Véase S. B. Rodan y G. A. Rodan, "Integrin Function In Osteoclasts," Journal of Endocrinology, 154: S47 - S56 (1997), que se incorpora por referencia en su
totalidad).

En un aspecto de la presente invención, el compuesto descrito en esta memoria descriptiva es útil para inhibir la resorción ósea. Los osteoclastos son grandes células multinucleadas de hasta aproximadamente 400 mm de diámetro que resorben el tejido el tejido mineralizado, principalmente carbonato de calcio y fosfato de calcio, en vertebrados. Los osteoblastos son células motrices activamente que migran a lo largo de la superficie del hueso, y se pueden unir al hueso, secretan los ácidos y proteasas necesarios, provocando por lo tanto la resorción real de tejido mineralizado a partir del hueso. Más específicamente, se cree que los osteoclastos existen en al menos dos estados fisiológicos, a saber, el estado secretor y el estado migratorio o motriz. En el estado secretor, los osteoclastos son planos, se unen ala matriz ósea mediante una zona de unión ajustada (zona de sellado), llegan a estar altamente polarizadas, forman un borde encrespado, y secretan enzimas lisosomales y protones para resorber el hueso. La adhesión de osteoclastos a superficies óseas es una etapa inicial importante en la resorción ósea. En el estado migratorio o motriz, los osteoclastos migran a través de la matriz ósea y no toman parte en la resorción hasta que de nuevo se unen al
hueso.

Las integrinas están implicadas en la unión, activación y migración de osteoclastos. La integrina más abundante en los osteoclastos, por ejemplo, en osteoclastos de rata, pollo, ratón y ser humano, es un receptor de integrina conocido como \alphav\beta3, que se creían que interactúan en el hueso con las proteínas de matriz que contienen la secuencia RGD. Los anticuerpos para \alphav\beta3 bloquean la resorción ósea in vitro que indican que esta integrina juega un papel clave en el proceso de resorción. Existe una evidencia creciente que sugiere que los ligandos \alphav\beta3 se pueden usar de manera eficaz para inhibir la resorción ósea mediada por osteoclastos in vivo en mamíferos.

Las enfermedades óseas principales actuales de interés público son osteoporosis, hipercalcemia maligna, osteopenia debida a metástasis ósea, enfermedad periodontal, hiperparatiroidismo, erosiones particulares y artritis reumatoide, enfermedad de Paget, osteopenia inducida por inmovilización, y osteoporosis inducida por glucocorticoides. Todas estas afecciones se caracterizan por pérdida ósea, que de producen por desequilibrio entre resorción ósea, es decir, descomposición y formación ósea, que continúa a lo largo de toda la vida a una velocidad de aproximadamente 14% por año de promedio. Sin embargo, la velocidad de recambio óseo difiere de sitio s sitio; por ejemplo, es mayor en el hueso trabecular del vertebrado en el hueso alveolar en las mandíbulas que en las cortezas de los huesos largos. El potencial de la pérdida ósea está directamente relacionada con el recambio y puede sumar hasta sobre 5% al año en vertebrados inmediatamente después de la menopausia, una afección que conduce a un aumento en el riesgo de fractura.

En los Estados Unidos, existen actualmente aproximadamente 20 millones de personas con fracturas detectables de las vértebras debido a osteoporosis. Además, existen aproximadamente 250.000 fracturas de cadera por año atribuidas a osteoporosis. Esta situación clínica está asociada a un 12% de tasa de mortalidad dentro de los dos primeros años, mientras que el 30% de los pacientes requieren asistencia de cuidado en casa después de la fractura.

Los individuos que sufren todas las afecciones enumeradas anteriormente se beneficiarían del tratamiento con agentes que inhiben la resorción ósea.

De manera adicional, los ligandos \alphav\beta3 se ha encontrado que son útiles en el tratamiento y/o inhibición de la reestenosis (es decir, la recurrencia de estenosis después de cirugía correctora en la válvula cardíaca), aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular, y angiogénesis (es decir, formación de nuevos vasos sanguíneos), e inhibición de la enfermedad viral. Además, se ha postulado que el crecimiento de tumores depende de un adecuado suministro de sangre, que a su vez depende del crecimiento de nuevos vasos en el tumor, de este modo, la inhibición de angiogénesis puede provocar regresión tumoral en modelos animales (Véase Harrison’s Principles of Internal Medicine, edición 12ª, 1991, que se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad). Por lo tanto, los antagonistas de \alphav\beta3 que inhiben la angiogénesis pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer mediante la inhibición de desarrollo tumoral (véase, por ejemplo, Brooks y col., Cell, 79: 1157 - 1164 (1994), que se incorpora por referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad).

También se ha presentado evidencia que sugiere que la angiogénesis es un factor central en la inhibición y persistencia de enfermedad artrítica, y que la integrina vascular \alphav\beta3 puede ser una diana preferida en la artritis inflamatoria. Por lo tanto, los antagonistas de v que inhiben la angiogénesis pueden representar un planteamiento terapéutico novedoso para el tratamiento de la enfermedad artrítica, tal como artritis reumatoide (véase, por ejemplo, C. M. Storgard, y col., "Decreased angiogénesis and arthritic disease in rabbits treated with an \alphav\beta3 antagonist," J. Clin. Invest., 103: 47 - 54 (1999), que se incorpora por referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad).

Además, el compuesto de esta invención también puede inhibir la neovascularización actuando como un antagonista del receptor de la integrina \alphav\beta5. un anticuerpo monoclonal para \alphav\beta5 se ha mostrado que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF en córnea de conejo y el modelo de membrana corioalantoica de pollo (véase M. C. Friedlander, y col., Science 270: 1500 - 1502 (1995), que se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad). De este modo, los compuestos que antagonizan \alphav\beta5 son útiles para tratar y prevenir la degeneración macular, retinopatía diabética, cáncer, y desarrollo tumoral metastático.

De manera adicional, el compuesto de la presente invención puede inhibir la angiogénesis e inflamación actuando como antagonistas de los receptores de las integrinas \alphav asociados a otras subunidades \beta, tales como \alphav\beta6 y \alphav\beta8 (véase, por ejemplo, Melpo Christofidou - Solomidou, y col., "Expression and Function of Endothelial Cell \alphav Integrin Receptors in Wound - Induced Human Angiogenesis in Human Skin(SCDI Mice Chimeras," American Journal of Pathology, 151: 975 - 83 (1997) y Xiao - Zhu Huang, y col., "Inactivation of the Integrin \beta6 Subunit Gene Reveals a Role of Epithelial Integrins in Regulating Inflammation in the Lungs and Skin," Journal of Cell Biology, 133: 921 - 28 (1996), que se incorpora por referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad).

Además, el compuesto de esta invención también puede antagonizar tanto los receptores de \alphav\beta3 como \alphav\beta5 y es por lo tanto útil para inhibir la resorción ósea, tratar y prevenir osteoporosis, e inhibir la reestenosis vascular, retinopatía diabética, degeneración macular, angiogénesis, aterosclerosis, artritis inflamatoria, cáncer, y desarrollo tumoral metastático.

Peptidilo así como los antagonistas peptidomiméticos del receptor de la integrina \alphav\beta3 se han descrito tanto en la bibliografía científica como en la de patentes. Por ejemplo, se hace referencia a W. J. Hoekstra y B. L. Poulter, Curr. Med. Chem. 5: 195 - 204 (1998) y las referencias citadas en ese documento; los documentos WO 95/32710; WO 95/37655; WO 97/01540; WO 97/37655; WO 98/08840; WO 98/18460; WO 98/18461; WO 98/25892; WO 98/31359; WO 98/30542; WO 99/15506; WO 99/15507; WO 00/03973; EP 852084; EP 854140; EP 854145; las patentes de Estados Unidos números 5.204.350; 5.217.994; 5.639.754; 5.741.796; 5.780.426; 5.929.120; 5.952.341; 6.017.925; y 6.048.831. Se ha presentado evidencia de la capacidad de los antagonistas de los receptores de la integrina \alphav\beta3 para prevenir la resorción ósea in vitro e in vivo (véase V. W. Engleman y col., "A Peptidomimetic Antagonist of the \alphav\beta3 Integrin Inhibits Bone Resortion In Vitro and Prevents Osteoporosis In Vitro," J. Clin. Invest. 99: 2284 - 2292 (1997); S. B. Rodan y col., "A High Affinity Non Peptide \alphav\beta3 Ligand Inhibits Osteoclast Activity In Vitro and In Vivo," J. Bone. Miner. Res. 11: S289 (1996); J. F. Gourvest y col., "Prevention of OVX-Induced Bone Loss With a Non-peptidic Ligand of the \alphav\beta3 Vitronectin Receptor," Bone 23: S612 (1998); M. W. Lark y col., "An Orally Active Vitronectin Receptor \alphav\beta3 Antagonist Prevents Bone Resorption In Vitro and In Vivo in the Ovariectomized Rat" Bone 23: S219 (1998)).

El receptor de la integrina \alphav\beta3 reconoce la secuencia de tripéptidos Arg - Gly - Asp (RGD) en su matriz afín y las glicoproteínas de la superficie celular (véase J. Samanen, y col., "Vascular Indications for Integrin \alphav Antagonists," Curr. Pharmaceut. Design 3: 545 - 584 (1997)). Un núcleo de benzazepina se ha empelado entre otros mediante Genentech y SmithKline Beecham como un mimético de Gly - Asp constreñido conformacionalmente para elaborar los antagonistas de los receptores de la integrina v no peptídicos sustituidos en el extremo N con miméticos de arginina heterocíclicos (véase R. M. Keenan y col., "Discovery of Potent Nonpeptide Vitronectin Receptor (\alphav\beta3) Antagonists," J. Med. Chem. 40: 2289 - 2292 (1997); R. M. Keenan y col., "Benzimidazol Derivatiives As Arginine Mimetics in 1,4-Benzodiazepine Nonpeptide Vitronectin Receptor (\alphav\beta3) Antagonists" Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 3165 - 3170 (1998); and R. M. Keenan y col., "Discovery of an Imidazopyridine-Containing 1,4-Benzodiazepine Nonpeptide Vitronectin Receptor (\alphav\beta3) Antagonist With Efficacy in a Restenosis Model" Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 3171 - 3176 (1998). Las patentes cedidas a SmithKline Beecham que describen tal benzazepina, así como benzodiazepine y benzociclohepteno, antagonistas de los receptores de la integrina \alphav\beta3 incluyen los documentos WO 96/00574, WO 96/00730, WO 96/06087, WO 96/26190, WO 97/24119, WO 97/24122, WO 97/24124, WO 98/14192, WO 98/15278, WO 99/05107, WO 99/06049, WO 99/15170, WO 99/15178 y WO 99/15506, y a Genentech incluyen el documento WO 97/34865. Las estructuras de benzociclohepteno, dibenzocicloheptano y dibenzoxazepina también se han empleado como mimético de Gly - Asp para producir antagonistas de \alphav\beta3 (véase los documentos WO 97/01540, WO 98/30542, WO 99/11626, WO 99/15508, WO 00/33838, patente de Estados Unidos números 6.008.213, y 6.069.158, todas cedidas a SmithKline Beecham).

Otros antagonistas de los receptores de integrina que incorporan las constricciones del anillo conformacional de la estructura central se han descrito en la bibliografía de patentes. Las solicitudes de patentes publicadas o patentes emitidas que describen antagonistas que tienen una constricción fenilo incluyen los documentos WO 98/00395, WO 99/32457, WO 99/37621, WO 99/44994, WO 99/45927, WO 99/52872, WO 99/52879, WO 99/52896, WO 00/06169, EP 0 820.988, EPO 0 820.991, patente de Estados Unidos números 5.741.796; 5.773.644; 5.773.646; 5.843.906; 5.852.210; 5.929.120; 5.952.381; 6.028.223; y 6.040.311. Solicitudes de patentes publicadas o patentes emitidas que describen los antagonistas que tienen una constricción de anillo monocíclico incluyen los documentos WO 99/26945, WO 99/30709, WO 99/30713, WO 99/31099, WO 99/59992, WO 00/00486, WO 00/09503, EP 0 796.855, EP 0 928.790, EP 0 928.793, patentes de Estados unidos números 5.710.159; 5.723.480; 5.981.546; 6.017.926; y 6.066.648. Las solicitudes de patentes publicadas o patentes emitidas que describen antagonistas que tienen una constricción de anillo bicíclico incluyen los documentos WO 98/23608, WO 99/35949, WO 99/33798, EP 0 853.084, patente de Estados Unidos números 5.760.028; 5.919.792; y 5.925.655.

Sin embargo, todavía permanece una necesidad de antagonistas de los receptores selectivos de integrinas \alphav de molécula pequeña, no peptídicos que muestran potencia mejorada, propiedades farmacodinámicas, y farmacocinéticas, tales como biodisponibilidad oral y duración de acción, sobre los compuestos ya descritos. Tales compuestos proporcionarían una potenciación en el tratamiento, prevención, o supresión de diversas patologías enumeradas anteriormente que están mediadas por la unión a receptores de integrinas \alphav y adhesión y activación celular.

En el documento U. S. S. N. 09/505.38726 (25 de enero de 2000), los inventores describen una serie de derivados de dibenzazepina que son antagonistas de lso receptores de integrinas \alphav. En la presente invención, los inventores describen un derivado novedoso de dibenzoxazepina con potentes propiedades antagónicas de los receptores de las integrinas \alphav.

Por lo tanto es un objeto de la presente invención proporcionar un derivado novedoso de dibenzoxazepina, que es útil como antagonista de los receptores de las integrinas \alphav.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un derivado novedoso de dibenzoxazepina que es útil como un antagonista del receptor de \alphav\beta3.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un derivado novedoso de dibenzoxazepina que es útil como un antagonista del receptor de \alphav\beta5.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un derivado novedoso de dibenzoxazepina que es útil como un antagonista dual del receptor de \alphav\beta3/\alphav\beta5.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden el antagonista de los receptores de las integrinas \alphav.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos para preparar las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un uso del derivado novedoso de dibenzoxazepina para la fabricación de un medicamento para provocar un efecto antagonista de los receptores de las integrinas \alphav en un mamífero en necesidad del mismo mediante la administración del compuesto y composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de la presente invención.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto y composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto útil para inhibir la resorción ósea, reestenosis, aterosclerosis, artritis inflamatoria, retinopatía diabética, degeneración macular, angiogénesis, cáncer, y desarrollo tumoral metastático.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto y composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto útil para tratar osteoporosis.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un uso del derivado novedoso de dibenzoxazepina para la fabricación de un medicamento para inhibir la resorción ósea, reestenosis, aterosclerosis, artritis inflamatoria, retinopatía diabética, degeneración macular, angiogénensis, cáncer, y desarrollo tumoral metastático.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un uso del derivado novedoso de dibenzoxazepina para la fabricación de un medicamento para tratar osteoporosis.

Éste y otros objetos serán evidentes fácilmente para la descripción detallada que sigue.

\newpage

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula estructural I:

1

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también se refiere a procedimientos para preparar las composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de la presente invención.

También se describen procedimientos para provocar para provocar un efecto antagonista de los receptores de las integrinas \alphav en un mamífero en necesidad del mismo mediante la administración del compuesto y composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de la presente invención.

También se describen procedimientos para inhibir la resorción ósea, reestenosis, aterosclerosis, artritis inflamatoria, retinopatía diabética, degeneración macular, angiogénesis, cáncer, y desarrollo tumoral metastático mediante la administración de los compuestos y composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de la presente invención.

También se describen procedimientos para tratar osteoporosis mediante la administración de los compuestos y composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención comprende un compuesto de fórmula estructural (I)

2

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

Para uso en medicina, las sales de los compuestos de esta invención se refieren a "sales farmacéuticamente aceptables" no tóxicas. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles en la preparación del compuesto de acuerdo con la invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales de los compuestos básicos abarcadas dentro del término "sales farmacéuticamente aceptables" se refieren a sales no tóxicas del compuesto de esta invención que generalmente se preparan haciendo reaccionar la base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado. Las sales representativas de lso compuestos básicos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, borato, bromuro, camsilato, carbonato, cloruro, clavulanato, citrato, diclorhidrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilrresorcinato, hidrabramina, bromhidrato, clorhidrato, hidroxinaftoato, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, malato, mandelato, dimetilbromuro, metilnitrato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, sal amónica de N-metilglucamina, oleato, oxalato, pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, sulfato, subacetato, succinato, tannato, tartrato, teoclato, tosilato, tietiodida y valerato. Además, cuando el compuesto de la invención lleva un resto ácido, las sales farmacéuticamente aceptables del mismo incluyen, pero so se limitan a, las sales derivadas de bases inorgánicas que incluyen aluminio, amonio, calcio, cobre, férrica, ferosa, litio, magnesio, manganesa, mangánica, potasio, sodio, cinc, y similares. Son particularmente preferidas las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio, y sodio. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarais, secundarias, y terciarias, aminas cíclicas, y resinas de intercambioiónico, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-diemtilaminoetanol, 2-metil-2-amino-1-propanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, glutamina, glucosalina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, triatilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, y similares.

También incluidas dentro de la invención son los solvatos del compuesto de la presente invención.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significará la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que está siendo investigado por un investigador o médico.

El término "antagonista de los receptores de las integrinas \alphav" como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a un compuesto que se une a y antagoniza o bien al receptor \alphav\beta3 o al receptor \alphav\beta5, o un compuesto que se une a y antagoniza una combinación de estos receptores (por ejemplo, un antagonista dual \alphav\beta3/\alphav\beta5).

El término "resorción ósea"como se usa en esta memoria descriptiva se refiere al proceso mediante el que los osteoclastos degradan el hueso.

El compuesto de la presente invención muestra afinidad submicromolar para los receptores de las integrinas \alphav, particularmente los receptores \alphav\beta3 y \alphav\beta5. El compuesto de esta invención por lo tanto es útil para tratar mamíferos que sufren de una afección ósea provocada o mediada por un incremento de la resorción ósea, que están en necesidad de tal terapia. Las cantidades farmacológicamente eficaces del compuesto, que incluyen las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se administran al mamífero, para inhibir la actividad de osteoclastos de mamíferos.

El compuesto de la presente invención se administra en dosificaciones eficaces para antagonizar el receptor \alphav\beta3 cuando se necesita tal tratamiento, como, por ejemplo, en la prevención o tratamiento de osteoporosis.

Ilustrando la invención es el procedimiento en el que el efecto antagonizante de los receptores de las integrinas \alphav es un efecto antagonizante de \alphav\beta3. Más particularmente, el efecto antagonizante de \alphav\beta3 se selecciona entre la inhibición de: resorción ósea, reestenosis, angiogénesis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis inflamatoria, cáncer, y desarrollo tumoral metastático. En una realización del procedimiento, el efecto antagonizante de \alphav\beta3 es la inhibición de la resorción ósea.

Otro ejemplo de al invención es el procedimiento en el que el efecto antagonizante de los receptores de las integrinas \alphav en un efecto antagonizante de \alphav\beta5. Más específicamente, el efecto antagonizante de \alphav\beta5 se selecciona entre la inhibición de reestenosis, angiogénesis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis inflamatoria, cáncer, y desarrollo tumoral metastático.

Además ilustrando la invención está el procedimiento en el que el efecto antagonizante de los receptores de las integrinas \alphav es un efecto dual antagonizante de \alphav\beta3/ \alphav\beta5. Más particularmente, el efecto antagonizante de \alphav\beta5 se selecciona entre la inhibición de: resorción ósea, reestenosis, angiogénesis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis inflamatoria, cáncer, y desarrollo tumoral metastático.

Ilustrando más particularmente la invención está una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro ejemplo de la invención es una composición farmacéutica preparada mediante la combinación del compuestos descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otra ilustración de la invención es un procedimiento para enmascarar una composición farmacéutica que comprende la combinación del compuesto descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Además ilustrando la invención está un uso del derivado novedoso de la benzoxazepina para la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir una afección mediada por antagonismo de un receptor de las integrinas \alphav en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto descrito anteriormente. Preferiblemente, la afección se selecciona entre la resorción ósea, osteoporosis, reestenosis, retinopatía diabética, degeneración macular, angiogénesis, aterosclerosis, artritis inflamatoria, cáncer, desarrollo tumoral y metástasis. Más preferiblemente, la afección se selecciona entre osteoporosis y cáncer. Más preferiblemente, la afección es osteoporosis.

Más específicamente la ejemplificación de la invención es un uso del derivado novedoso de la benzoxazepina para la fabricación de un medicamento para provocar un efecto antagonizante de las integrinas \alphav en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente. Preferiblemente, el efecto antagonizante de las integrinas \alphav es un efecto antagonizante de \alphav\beta3; más específicamente, el efecto antagonizante de \alphav\beta3 se selecciona entre la inhibición de: resorción ósea, inhibición de reestenosis, inhibición de aterosclerosis, inhibición de angiogénesis, inhibición de retinopatía diabética, inhibición de degeneración macular, inhibición de artritis inflamatoria, e inhibición de cáncer o desarrollo tumoral metastático. Más preferiblemente, el efecto antagonizante de \alphav\beta3 es inhibición de la resorción ósea. Como alternativa, el efecto antagonizante de las integrinas \alphav es un efecto antagonizante de \alphav\beta5 o un efecto antagonizante dual de \alphav\beta3/\alphav\beta5. Los ejemplos de los efectos antagonizantes de \alphav\beta5 son la inhibición de reestenosis, aterosclerosis, angiogénesis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis inflamatoria, cáncer, y desarrollo tumoral metastático.

Los ejemplos adicionales de la invención son uso del derivado novedoso de la benzoxazepina para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la resorción ósea y tratamiento y/o prevención de osteoporosis en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente.

Ilustraciones adicionales de la invención son un uso del derivado novedoso de la benzoxazepina para la fabricación de un medicamento para tratar hipercalcemia maligna, osteopenia debida a metástasis ósea, enfermedad periodontal, hiperparatiroidismo, erosiones periarticulares en artritis reumatoide, enfermedad de Paget, osteopenia inducida por inmovilización, y tratamiento por glucocorticoides en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente.

Más particularmente la ejemplificación de la invención es el uso del compuesto descrito anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de osteoporosis en un mamífero en necesidad del mismo. Todavía la ejemplificación de la invención es el uso del compuesto descrito anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de resorción ósea, desarrollo tumoral metastático, cáncer, reestenosis, aterosclerosis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis inflamatoria, y/o angiogénesis.

También la ejemplificación de la invención son composiciones que comprenden además un ingrediente activo seleccionado entre el grupo constituido por:

a): un bifosfonato orgánico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo,

b): un modulador de receptor de estrógeno,

c): un modulador de receptor de andrógeno,

d): un agente citotóxico/antiproliferativo,

e): un inhibidor de la metaloproteinasa de matriz,

f): un inhibidor de factores de crecimiento derivados de epidermis, derivado de fibroblastos, o derivado de plaquetas,

g): un antagonista del receptor VEGF,

h): un anticuerpo para un factor de crecimiento o un receptor del factor de crecimiento,

i): un inhibidor de Plk-1/KDR, Fit-1, Tck/Tie-2, o Tie-1,

j): un inhibidor de la catepsina K,

k): un secretagogo de la hormona de crecimiento,

l): un inhibidor de protón ATPasa de osteoclastos,

m): un inhibidor del activador del plasminógeno uroquinasa (u-PA),

n): una proteínas de fusión anticuerpo - interleuquina - 2 específica de tumor,

o): un inhibidor de la HMG-CoA reductasa, y

p): un inhibidor de la farnesiltransferasa o un inhibidor de la geranilgeraniltransferasa o un inhibidor dual de la farnesil/geranilgeranil transferasa;

y las mezclas de los mismos.

(Véase, B. Millauer y col., "Dominant-Negative Inhibition of Flk-1 Suppresses the Growth of Many Tumor Types In vivo", Cancer Research, 56, 1615 - 1620 (1996), que se incorpora en esta memoria descriptive por referencia en su totalidad).

Preferiblemente, el ingrediente activo se selecciona entre el grupo constituido por:

b): un modulador de receptor de estrógeno,

c): un modulador de receptor de andrógeno,

d): un inhibidor de protón ATPasa de osteoclastos,

e): un inhibidor de la HMG-CoA reductasa, y

f): un inhibidor de la catepsina;

y las mezclas de los mismos.

Los ejemplos no limitantes de tales bifosfonatos incluyen alendronato, cimadronato, clodronato, etidronato, ibandronato, pamidronato, piridronato, risedronato, tiludronato, y zolendronato, y las sales farmacéuticamente aceptables y los esteres de los mismos. Un bifosfonato particularmente preferido es alendronato, especialmente, alendronato monosódico trihidrato.

Los ejemplos no limitantes de moduladores de receptores de estrógeno incluyen estrógeno, progesterona, estradiol, droloxifeno, raloxifeno, y tamoxifeno.

Los ejemplos no limitantes de agentes citotóxicos/antiproliferativos son taxol, vincristina, vinblalstina, y doxorubicina.

La catepsina K, conocida anteriormente como catepsina O2, es una cisteína proteasa y se describe en la publicación de solicitud internacional PCT Nº WO 96/13523, publicada en 9 de mayo de 1996; patente de Estados Unidos Nº 5.501.969, emitida el 3 de marzo de 1996; y la patente de Estados Unidos Nº 5.736.357, emitida el 7 de abril de 1998, todas las cuales se incorporan en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad. Las cisteína proteasas, específicamente las catepsinas, están unidas a un número de afecciones patológicas, tales como metástasis tumoral, inflamación, artritis y remodelación ósea. A pH ácidos, las catepsinas pueden degradar el colágeno de tipo I. Los inhibidores de la catepsina proteasa pueden inhibir la resorción ósea osteoclásica mediante la inhibición de la degradación de fibras de colágeno y de este modo son útiles en el tratamiento de enfermedades de resorción ósea, tal como osteoporosis.

Los miembros de la clase de los inhibidores de la HMG-CoA reductasa, conocidos como las "estatinas" se han encontrado que activan el crecimiento de hueso nuevo, reemplazando la pérdida de masa ósea como resultado de osteoporosis (véase The Wall Street Journal, viernes, 3 de diciembre de 1999, página B1). Por lo tanto, las estatinas mantienen la promesa para el tratamiento de resorción ósea. Los ejemplos no limitantes de estatinas son lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, cerivastatina, y rosuvastatina.

Se ha presentado evidencia del papel crucial del receptor de la uroquinasa - uroquinasa (u-PA-u-PAR) en la angiogénesis, invasión tumoral, inflamación, y remodelación de la matriz durante la curación y desarrollo de heridas [Véase Y. Koshelnick y col., "Mechanisms of signaling through Urokinase Receptor and the Cellular Response," Thrombosis and Haemostasis 82: 305 - 311 (1999) y F. Blasi, "Proteolysis, Cell adhesión, Chemotaxis, and Invasiveenss Are Regulated by the u-PA-u-PAR-PAI-1 System," Thrombosis and Haemostasis 82: 298 - 304 (1999)]. De este modo, los antagonistas específicos de la unión de u-PA a u-PAR inhiben la activación de plasminógeno de superficie celular, desarrollo tumoral, y angiogénesis en modelos tanto in vitro como in vivo.

H. N. LODE y colaboradores en el documento PNAS USA 96: 1591 - 1596 (1999) han observado efectos sinérgicos entre un antagonista de las integrinas \alphav antiangiogénico y una proteína de fusión anticuerpo - citoquina (interleuquina - 2) específica de tumor en la erradicación de metástasis tumoral espontánea. Sus resultados sugieren esta combinación por tener potencial para el tratamiento de cáncer y desarrollo tumoral metastático.

La protón ATPasa se encuentra en la membrana apical del osteoclasto se ha reseñado que juega un papel significativo en el proceso de resorción ósea. Por lo tanto, esta bomba de protones representa una diana atractiva para el diseño de inhibidores de resorción ósea que son potencialmente útiles para el tratamiento y prevención de osteoporosis y enfermedades metabólicas relacionadas (véase C. Farina y col., "Selective inhibitors of the osteoclast vacuolar proton ATPase as novel bone antiresorptive agents," DDT, 4: 163 - 172 (1999)).

Se ha presentado evidencia de que los esteroides andrógenos juegan un papel fisiológico en el desarrollo de la masa ósea en hombres y mujeres y esos andrógenos actúan directamente sobre el hueso. Los receptores de andrógenos se han demostrado en líneas celulares de tipo osteoblasto de seres humanos y los andrógenos se ha mostrado que estimulan directamente la proliferación y diferenciación celular. Para una descripción, se hace referencia a S. R. Davis, "The theraputic use of androgens in women," J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 69: 177 - 184 (1999) y K. A. Hansen y S. P. T. Tho, "Androgens and Bone Health," "Seminars in Reproductive Endocrinology," 16: 129 - 134 (1998). De este modo, los moduladoers de receptoers de andrógenos pueden tener utilidad en el tratamiento y prevención de pérdida ósea en mujeres.

El factor angiogénico VEGF se ha mostrado que estimula la actividad de resorción ósea de osteoclastos de conejo maduros aislados mediante la unión a sus receptores sobre osteoclastos (véase M. Nakagawa y col., "Vascular endothelial growth factor (VEGF) enhance osteoclastic bone resorption and survival of mature osteoclasts," FEBS Letters, 473: 161 - 164 (2000)). Por lo tanto, el desarrollo de antagonistas de VEGF se unen a los receptores de osteoclastos, tales como KDR/Flk-1 y Flt-1, pueden proporcionar todavía un planteamiento adicional al tratamiento o prevención de la resorción ósea.

Los activadores del receptor \gamma activado por un proliferador de peroxisoma (PPAR \gamma), tal como las tiazolidinedionas (TZD's), inhiben la formación de células de tipo osteoclasto y resorción ósea in vitro. Los resultados reseñados por R. Okazaki y col. en Endocrinology, 140, p. 5060 - 5065, (1999) apuntan a un mecanismo local sobre células de médula ósea así como uno sistémico en el metabolismo de glucosa. Los ejemplso no limitantes de los activadores PPAR \gamma incluyen troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, y BRL 49653.

La presente invención también se refiere a combinaciones del compuesto de la presente invención con uno o más agentes útiles en la prevención o tratamiento de osteoporosis. Por ejemplo, el compuesto de la presente invención se puede administrar de manera eficaz en combinación con las cantidades eficaces de otros agentes tales como un bisfosfonato orgánico, un modulador de de receptor de estrógeno, un modulador de receptor de andrógeno, un inhibidor de la catepsina K, un inhibidor de la HMG-CoA reductasa, un activador de PPAR \gamma, un antagonista de receptor VEGF, o un inhibidor de la protón ATPasa de osteoclastos.

Las ilustraciones adicionales de la invención son los usos del derivado novedosos de dibenzoxazepina para la fabricación de un medicamento para tratar cáncer desarrollo tumoral metastático en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito anteriormente y uno o más agentes conocidos para ser citotóxico/antiproliferativo. También, el compuesto de al presente invención se puede administrar en combinación con terapia de radiación para tratar cáncer y desarrollo tumoral metastático.

Además, el antagonista de la integrina \alphav\beta3 de la presente invención se puede administrar de manera eficaz en combinación con un secretagogo de la hormona de crecimiento en el tratamiento terapéutico o profiláctico de trastornos en el metabolismo de calcio o fosfato y enfermedades asociadas. Estas enfermedades incluyen afecciones que pueden beneficiar de una reducción en la resorción ósea. Una reducción en la resorción ósea debe mejorar el equilibrio entre la resorción y formación, reducen la pérdida de hueso o da como resultado el aumento óseo. Una reducción en la resorción ósea puede aliviar el dolor asociado a lesiones osteolíticas y reducen la incidencia y/o crecimiento de aquellas lesiones. estas enfermedades incluyen: osteoporosis (incluyendo deficiencia de estrógenos, inmovilización, inducción de glucocorticoides y senil), osteodistrofia, enfermedad de Pager, miositis osificadora, enfermedad de Bechterew, hipercalcemia maligna, enfermedad ósea metastático, enfermedad periodontal, colelitiasis, urolitiasis, cálculos urinarios, endurecimiento de arterias (esclerosis), artritis, bursitis, neuritis y tétanos. El incremento de resorción ósea puede estar acompañada de concentraciones de calcio y fosfato patológicamente altas en el plasma, que se podría aliviar mediante este tratamiento. De manera similar, la presente invención sería útil en el incremento de masa ósea en pacientes con deficiencia hormonal de crecimiento. De es te modo, las combinaciones preferidas son tratamientos simultáneos o alternativos de un antagonista del receptor \alphav\beta3 de la presente invención y un secretagogo de la hormona de crecimiento, incluyendo opcionalmente un tercer componente que comprende un bifosfonato orgánico, preferiblemente alendronato monosódico trihidrato.

De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, los componentes individuales de la combinación se puede administrar de manera separada en diferentes momentos durante el curso de la terapia o simultáneamente en formas de combinación divididas o individuales. La presente invención se entiende por lo tanto como que abarca todos estos regímenes de tratamiento simultáneo o alternativo, y el término "administración" se va a interpretar de acuerdo con lo anterior. Se entenderá que el alcance de las combinaciones de los compuestos de la invención con otros agentes útiles para tratar afecciones mediadas por integrina incluye en principio cualquier combinación con cualquier composición farmacéutica para tratar osteoporosis.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "composición" pretende abarcar un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que se produce, directamente o indirectamente, por la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especifi-
cadas.

El compuesto de la presente invención se puede administraren tales formas de dosificación oral como comprimidos, cápsulas (cada una de als cuales incluye formulaciones de liberación sostenida o programada), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Del mismo modo, también se puede administrar en forma intravenosa, (bolo o infusión), intrapertoneal, tópica (por ejemplo, gotas de ojos oculares), subcutánea, intramuscular o transdérmica (por ejemplo, parche), todas las formas de uso bien conocidas por los expertos en la técnica. Una cantidad eficaz pero no tóxica del compuesto deseado se puede emplear como un antagonista de
\alphav\beta3.

El régimen de dosificación que utiliza el compuesto de la presente invención se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función hepática y renal del paciente; y el compuesto particular o sal del mismo empleado. Un médico, veterinario o clónico experto en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de fármaco requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afec-
ción.

Cuando se usan dosificaciones orales de la presente invención para los efectos indicados, variarán entre aproximadamente 0,01 mg por kg de peso corporal al día (mg/kg/día) a aproximadamente 100 mg/kg/día, preferiblemente 0,01 a 10 mg/kg/día, y los más preferiblemente 0,1 a 5,0 mg/kg/día. Para la administración oral, las composiciones preferiblemente se proporcionan en la forma de comprimidos que contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100 y 500 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente a tratar. Un médicamente típicamente contiene entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 mg de ingrediente activo. Por vía intravenosa, las dosis más preferidas variarán entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg/minuto durante una infusión de velocidad constante. De manera ventajosa, el compuesto de la presente invención se puede administrar en un sola dosis diaria, o la dosis diaria total de puede administrar en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Además, el compuesto de la presente invención se puede administrar en forma intranasal mediante uso tópico de vehículos intranasales adecuadas, o mediante vías trasndérmicas, usando las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidos por los expertos en la técnica. Para administrar en al forma de un sistema de distribución transdérmico, la administración de dosificación, de hecho, será continua mejor que intermitente a lo largo del régimen de dosificación.

En los procedimientos de la presente invención, el compuesto en esta memoria descriptiva descrito en detalle puede formar el ingrediente activo, y se administra típicamente en mezcla con diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticos adecuados (colectivamente denominados en esta memoria descriptiva materiales ‘vehículos’) seleccionados adecuadamente con respecto a la forma propuesta de administración, en concreto, comprimidos orales, cápsulas, elixires, jarabes y similares, y consistente con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, la administración oral en la forma de un comprimido o cápsula, el componente del fármaco activo se puede combinar con un vehículo oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, inerte tal como lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, manitol, sorbitol y similares; para al administración oral en forma líquida, los componentes fármacos de pueden combinar con cualquier vehículo no tóxico, inerte farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua y similares. Además, cuando se desea o son necesarios, agentes aglutinantes, lubricantes, disgregantes necesarios y agentes colorantes se pueden incorporar en al mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta - lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto, o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en esta forma de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro sódico, y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, goma xantano y
similares.

El compuesto de la presente invención también se puede administrar en la forma de sistemas de distribución de liposomas, tales como pequeñas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de una diversidad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

El compuesto de la presente invención también se puede distribuir mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los que las moléculas de compuesto están acoplados. Los compuestos de la presente invención también pueden estar acoplados con polímeros solubles como vehículos de fármaco dirigibles. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, cocpolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxi-etilaspartamida-fenol, o polietilenóxido-polilisina sustituidos con residuos de palmitoílo. Además, el compuesto de la presente invención se puede acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles en el el logro de liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, poliepsilón caprolactona, poli (ácido hidroxi butírico), poliortoésteres, poliacetales, polihidroxipiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque reticuladas o anfipáticos de hidrogeles.

El compuesto de al fórmula estructural (I) se puede preparar mediante los procedimientos detallados en el esquema 1 y el ejemplo más adelante. Los expertos en la técnica fácilmente entenderán que variaciones conocidas de las condiciones y procedimientos de los siguientes procedimientos preparativos se pueden usar para preparar el compuesto. Salvo que se establezca otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, y todas las temperaturas son grados Celsius.

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Esquema 1

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Ejemplo Ácido {3-[21-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)-etoxi]-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-il}-acético (1 - 8) Éster metílico del ácido 4-metoxi-2-(2-nitrofenoxi)-benzoici ( 1 - 1)

Una solución de 2-fluoronitrobenceno (3,978 g, 28,19 mmoles), 4-metoxisalicilato de metilo (5,131 g, 28,15 mmoles), y carbonato potásico (7,800 g, 56,43 mmoles) en DMF (30 ml) se calentó hasta 50ºC durante toda una noche. El disolvente se retiró a vacío y el residuo se repartió entre diclorometano y agua. El agua se extrajo dos veces más con diclorometano y los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera y se secaron (Na_{2}SO_{4}). Se retiró el disolvente a vacío produciendo el compuesto del título 1 - 1 en forma de un aceite de color amarillo claro.

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 8,01 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,97 (dd, 1H, J = 1,6, 8,1 Hz), 7,44 (dt, 1H, J = 1,6, 7,8 Hz), 7,14 (dt, 1H, J = 1,1, 7,8 Hz), 6,82 (dt, 2H, J = 2,6, 87,8 Hz), 6,63 (d, 1H, J = 2,6 Hz), 3,84 (s, 3H), 3,70 (s, 3H);

Espectro de masas de baja resolución por bombardeo atómico rápido (EMBRBAR). Observado m/e 304 (M^{+} + H).

Éster metílico del ácido 2-(2-aminofenoxi)-4-metoxi-benzoico (1-2)

Una solución de 1 - 1 (7,360 g, 21,87 mmoles) en metanol (200 ml) se añadió a una suspensión de paladio al 10% sobre carbono en etanol (100 ml). La mezcla se agitó bajo presión de gas de hidrógeno a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de celita y el filtrado se evaporó vacío produciendo el compuesto del título 1 - 2 en forma de un aceite.

EMBRBAR: observado m/e 273 (M^{+})

3-Metoxi-10H-dibenzo[1,4]oxazepin-11-ona (1 - 3)

Una solución de 1 - 2 (47,80 g, 179,4 mmoles) en THF (1 l) se trató con hidruro sódico (7,430 g de 60% en aceite, 185,7 mmoles) por partes y se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La reacción se inactivó con cloruro amónico acuoso y se extrajo tres veces con dietil éter. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera y se secaron (Na_{2}SO_{4}). Se retiró el disolvente a vacío produciendo el producto bruto 1 - 3 en forma de cristales de color blanco.

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 8,10 (s, 1H), 7,90 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,24 (dd, 1H, J = 2,3, 7,0 Hz), 7,12 (m, 2H), 7,02 (dd, 1H, J = 2,6, 7,0 Hz), 6,78 (dd, 1H, J = 2,6, 8,8 Hz), 6,74 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 3,86 (s, 3H);

EMBRBAR: Observado m/e 242 (M^{+} + H).

3-Metoxi-10,11-dihidro-dibenzo[1,4]oxazepina (1 - 4)

Una solución de 1 - 3 (1,16 g, 4,80 mmoles) en THF (50 ml) se trató con una solución de LiAlH_{4} 1 M en THF (10,0 ml, 10,0 mmoles) y se calentó hasta 55ºc durante 2 horas. La reacción se inactivó mediante cloruro amónico acuoso y se extrajo con dietil éter. Los disolventes se retiraron a vacío produciendo 1 - 4.

EMBRBAR: Observado m/e 228 (M^{+} + H).

Éster etílico del ácido (3-metoxi-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-il)-acético (1 - 5)

Una solución de 1 - 4 (2,04 g, 8,97 mmoles) en DMSO (10 ml) se enfrió hasta 0ºC y se trató con hidruro sódico (450 mg de 60% en aceite, 11,2 mmoles). La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de la adición de bromoacetato de etilo (1,67 g, 10,0 mmoles) y se calentó hasta 50ºC durante toda una noche. Se retiró el disolvente a vacío y el residuo se diluyó con agua y se extrajo con tres porciones de diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se lavaron y se secaron (Na_{2}SO_{4}). Se retiró el disolvente a vacío. La cromatografía centrífuga preparativa (SiO_{2}, 6 mm, EtOAc al 50%, hexano al 50%) produjo 1 - 5. EMBRBAR: Observado m/e 314 (M^{+} + H).

Éster etílico del ácido (3-hidroxi-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-il)-acético (1 - 6)

Una solución de 1 - 5 (400 mg, 1,27 mmoles) en diclorometano (5 ml) se enfrió hasta -5ºC y se trató con etanotiol (419 mg, 6,75 mmoles) y cloruro de aluminio (815 mg, 6,11 mmoles). Después de 30 minutos, la reacción se inactivó con solución acuosa de cloruro amónico. El disolvente se retiró a vacío y el residuo se diluyó con agua y se extrajo con tres partes de diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera y se secaron (Na_{2}SO_{4}). Se retiró el disolvente a vacío. La cromatografía centrífuga preparativa (SiO_{2}, 4 mm, EtOH al 50%, CH_{2}Cl_{2} al 90%) produjo 1 - 6. EMBRBAR: Observado m/e 300 (M^{+} + H).

Éster etílico del ácido {3-[21-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)etoxi]-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-il)-acético (1 - 7)

Una solución de 1 - 6 (363 mg, 1,21 mmoles) 2-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)etanol (para la preparación, véase, el documento WO 00/33838) (340 mg, 1,91 mmoles), y trifenilfosfina (500 mg, 1,91 mmoles) en THF (7 ml) se enfrió hasta 0ºC y se trató con azodicarboxilato de dietilo (332 mg, 1,91 mmoles), y se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante toda una noche. Se retiró el disolvente a vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía centrífuga preparativa (SiO_{2}, 4 mm, gradiente de éter/hexano) produciendo 1 - 7.

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz): \delta 7,09 - 7,07 (m, 2H), 7,03 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 6,93 - 6,90 (m, 1H), 6,78 - 6,75 (m, 2H), 6,69 (dd, 1H, J = 1,5, 8,1 Hz), 6,61 (dd, 1H, J = 2,4, 8,3 Hz), 6,44 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 4,76 (s, 1H), 4,26 - 4,19 (m, 4H), 3,92 (s, 2H), 3,41 - 3,38 (m, 2H), 3,00 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 1,93 - 1,88 (m, 2H), 1,27 (t, 3H, J = 7,2 Hz).

Ácido {3-[21-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)etoxi]-11H-dibenzo[1,4]oxazepin-10-il)-acético (1 - 8)

Una solución de 1 - 7 (235 mg, 0,511 mmoles) en THF (2 ml) y 1,4-dioxano (2 ml) se trató con NaOH acuoso 1 M (1,54 ml) a temperatura ambiente durante toda una noche. La reacción se neutralizó con HCl acuoso 1 M (1,54 ml) y los disolventes se retiraron a vacío. La cromatografía centrífuga preparativa (SiO_{2}, 2 mm, MeOH al 10%, CH_{2}Cl_{2} al 90%) produciendo 1 - 8.

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz): \delta 10,74 (s, 1H), 7,59 (d, 1H, J 0 7,3 Hz), 7,02 (d, 1H, 7,3 Hz), 6,91 - 6,87 (m, 3H), 6,69 - 6,66 (m, 2H), 6,54 (dd, 1H, J = 2,5, 8,1 Hz), 6,34 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 4,44 (s, 2H), 4,16 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 3,86 (s, 2H), 3,47 (t, 2H, J = 5,5 Hz), 2,98 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,71 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 1,93 - 1,88 (m, 2H).

Espectro de masas de baja resolución por bombardeo atómico rápido: Observado m/e 432 (M^{+} + H).

Esquema A

Sistema de radioligando para ensayo de SPAV3

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Esquema A (continuación)

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Esquema A (continuación)

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Esquema A (continuación)

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N-(4-yodo-fenilsulfonilamino)-L-asparagina (A - 2)

A una solución agitada del ácido A - 1 (4,39 g, 33,2 mmoles), NaOH (1,49 g, 37,2 mmoles), dioxano (30 ml) y H_{2}O (30 ml) a 0ºC se añadió cloruro de pipsilo (10,34 g, 34,2 mmoles). Después de aproximadamente 5 minutos, se disolvió NaOH (1,49, 37,2 mmoles) en 15 ml de H_{2}O (300 ml) y después se lavó con EtOAc. La parte acuosa se enfrió hasta 0ºC y después se acidificó con HCl concentrado. El sólido se recogió y después se lavó con Et_{2}O proporcionando el ácido A - 2 en forma de un sólido de color blanco.

^{1}H RMN (D_{2}O, 300 MHz): \delta 7,86 (d, 2H, J = 8 Hz), 3,70 (m, 1H), 2,39 (m, 2H).

2(S)-N-(4-yodo-fenilsulfonilamino)-\beta-alanina (A - 3)

A una solución agitada de NaOH (7,14 g, 181,8 mmoles) y H_{2}O (40 ml) a 0ºC se añadió Br_{2} (1,30 ml, 24,9 mmoles) gota agota durante un período de diez minutos. Después de aproximadamente 5 minutos, se combinaron al ácido A - 2 (9,9 g, 24,9 mmoles), NaOH (2,00 g, 49,8 mmoles) y H_{2}O (35 ml), se enfriaron hasta 0ºC y después se añadieron en una sola porción a la reacción. Después de agitar durante 20 minutos a 0ºC, la reacción se calentó hasta 90ºC durante 30 minutos y después se enfrió hasta 0ºC. El pH se ajustó hasta aproximadamente 7 mediante la adición gota a gota de HCl concentrado. El sólido se recogió, se lavó con EtOAc, y después se secó a vacío proporcionando el ácido a - 3 en forma de un sólido de color blanco.

^{1}H RMN (D_{2}O, 300 MHz): \delta 8,02 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 4,36 (m, 1H), 3,51 (dd, 2H, J = 5 Hz, 13 Hz), 3,21 (m, 1H).

2(S)-N-(4-yodo-fenilsulfonilamino)-\beta-alanina-clorhidrato de etilo (A - 4)

Se burbujeó gas HCl rápidamente a través de una suspensión de ácido A - 3 (4,0 g, 10,81 mmoles) en EtOAc (50 ml) a 0ºC durante 10 minutos. El baño de enfriamiento se retiró y la reacción se calentó hasta 60ºC. Después de 18 h, la reacción se concentró proporcionando el éster A - 4 en forma de un sólido de color blanco.

^{1}H RMN (CD_{3}OD, 300 MHz): \delta 7,98 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 4,25 (c, 1H, J = 5 Hz), 3,92 (m, 2H), 3,33 (m, 1H), 3,06 (m, 1H), 1,01 (t, 3H, J = 7 Hz).

4-[2-(2-aminopiridin-6-il)etil]benzoato de etilo (A - 5a)

Se agitaron una mezcla del éster A - 5 (700 mg, 2,63 mmoles), (para la preparación véase: el esquema 29 (intermedio 29 - 3) de la patente de Estados Unidos Nº 5.741.796 (21 de abril de 1998)), Pd al 10%/C (350 mg) y EtOH en 1 atmósfera (101,22 kPa) de H_{2.} Después de 20 horas, la reacción se filtró a través de un lecho de celita y después se concentró proporcionando el éster A - 5a en forma de un aceite de color marrón.

TLC R_{f} = 0,23 (sílice, EtOAc al 40%/hexanos)

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 300 MHz): \delta 7,95 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,26 (m, 3H), 6,43 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,35 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,37 (m, 4H), 3,05 (m, 2H), 2,91 (m, 2H), 1,39 (t, 3H, J = 7 Hz).

Clorhidrato del ácido 4-[2-(2-aminopiridin-6-il)etil]benzoico (A - 6)

Una suspensión del eje A - 5a (625 mg, 2,31 mmoles) en HCl 6 M (12 ml) se calentó hasta 60ºC. Después de aproximadamente 20 horas, la reacción se concentró proporcionando el ácido A - 6 en forma de un sólido de color tostado.

^{1}H RMN (CD_{3}OD, 300 MHz): \delta 7,96 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,80 (m, 1H), 7,33 (d, 2H, J = 8 Hz), 6,84 (d, 1H, J = 9 Hz), 6,69 (d, 1H, J = 7 Hz), 3,09 (m, 4H).

Etil 4-[2-(2-aminopiridin-6-il)etil]benzoil-2(S)-(4-yodo-fenilsulfonilamino)-\beta-alanina o (A - 7)

Se agitaron durante aproximadamente 20 horas una solución del ácido 15 - 6 (400 mg, 1,43 mmoles), la amina A - 4 (686 mg, 1,57 mmoles), EDC (358 mg, 1,86 mmoles), HOBT (252 mg, 1,86 mmoles), NMM (632 \mul, 5,72 mmoles) en DMF (10 ml). La reacción se diluyó con EtOAc y después se lavó con NaHCO_{3}, salmuera, se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron. La cromatografía ultrarrápida (sílice, EtOAc después isopropanol al 5%/EtOAc) proporcionó la amida A - 7 en forma de un sólido de color blanco.

TLC R_{f} = 0,4 (sílice, isopropanol al 10%/EtOAc)

^{1}H RMN (CD_{3}OD, 300 MHz): \delta 7,79 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,61 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,52 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,29 (m, 1H), 7,27 (d, 2H, J = 8 Hz), 4,20 (m, 1H), 3,95 (c, 2H, J = 7 Hz), 3,66 (dd, 1H, J = 6 Hz, 14 Hz), 3,49 (dd, 2H, J = 8 Hz, 13 Hz), 3,01 (m, 2H), 2,96 (m, 2H), 1,08 (t, 3H, J = 7 Hz).

4-[2-(2-aminopiridin-6-il)etil]benzoil-2(S)-(4-yodofenilsulfonilamino)-\beta-alanina (A - 8)

Una solución del éster A - 7 (200 mg, 0,3213 mmoles) y HCl 6 N (30 ml) se calentó hasta 60ºC. Después de aproximadamente 20 horas, se concentró la mezcla de reacción. La cromatografía ultrarrápida (sílice, EtOAcEtOH/NH_{4}OH/
H_{2}O 20:20:1:1) proporcionó el ácido A - 8 en forma de un sólido de color blanco.

TLC R_{f} = 0,45 (sílice, EtOAcEtOH/NH_{4}OH/H_{2}O 20:20:1:1)

^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): \delta 8,40 (m, 1H), 8,14 (s a, 1H), 7,81 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,62 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,48 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,27 (m, 3H), 6,34 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,25 (d, 2H, J = 8 Hz), 5,85 (s a, 1H), 3,35 (m, 2H), 2,97 (m, 2H), 2,79 (m, 2H).

4-[2-(2-aminopiridin-6-il)etil]benzoil-2(S)-(4-trimetilestannil-fenilsulfonilamino-\beta-alanina (A - 9)

Una solución del yoduro A - 8 (70 mg, 0,1178 mmoles), [(CH_{3})_{3}Sn]_{2} (49 \mul, 0,2356 mmoles), Pd(PPh_{3})_{4} (5 mg) y dioxano (7 ml) se calentó hasta 90ºC. Después de 2 horas, la reacción se concentró y después se purificó mediante HPLC preparativa (Delta-Pak C_{18} 15 \muM 100Aº, 40 x 100 mm; 95:5 después 5:95 de H_{2}O/CH_{3}CN) proporcionando la sal trifluoroacetato. La sal se suspendió en H_{2}O (10 ml), se trató con NH_{4}OH (5 gotas) y después se liofilizó proporcionando la amina A - 9 en forma de un sólido de color blanco.

^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): \delta 8,40 (m, 1H), 8,18 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,67 (m, 5H), 7,56 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,29 (d, 2H, J = 8 Hz), 6,95 - 7,52 (m, 2H), 6,45 (s a, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 2,97 (m, 2H), 2,86 (m, 2H).

4-[2-(2-aminopiridin-6-il)etil]benzoil-4-^{125}yodo-fenilsulfonilamino-\beta-alanina (A - 10)

Una perla de yodo (Pierce) se añadió a un vial de envío de 5 mCi de Na^{125}I (Amersham, IMS30) y se agitó durante cinco minutos a temperatura ambiente. Se preparó una solución de 0,11 mg de A - 9 en 0,05 ml de H_{2}SO_{4}/MeOH e inmediatamente se añadió al vial Na^{125}I/perla de yodo. Después de agitar durante tres minutos a temperatura ambiente se añadieron aproximadamente 0,04 - 0,05 ml de NH_{4}OH de manera que la mezcla de reacción estaba a pH 6 - 7. La mezcla de reacción entera se inyectó en el HPLC para purificación [columna Vydac péptido-proteína C - 18, 4,6 x 250 mm, gradiente lineal de acetonitrilo al 10% (0,1% (TFA):H_{2}O (TFA al 0,1%) a acetonitrilo al 90% (TFA):H_{2}O (TFA al 0,1%) durante 30 minutos, 1 ml/min]. El tiempo de retención de A - 10 es 17 minutos en estas condiciones. Las fracciones que contenían la mayoría de la radiactividad se reunieron, se liofilizaron y se diluyeron con etanol proporcionando aproximadamente 1 mCi de A - 10, que se eluyó conjuntamente tras análisis de HPLC con una muestra auténtica de A - 8.

Esquema B

Síntesis de radioligando para ensayo de SPAV5

9

Éster etílico del ácido 2(S)-(4-yodo-bencenosulfonilamino)-3-{4-[2-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)etil]-ben- zoilamino}-ropiónico (B - 2).

Una mezcla de B - 1 (0,23 g, 0,72 mmoles); para la preparación véase la patente de Estados Unidos Nº 5.741.796), A - 4 (0,343 g, 0,792 mmoles), EDC (0,179 g, 0,93 mmoles), HOBT (0,126 g, 0,93 mmoles), NMM (0,316 ml, 2,86 mmoles) en acetonitrilo (3 ml) y DMF (3 ml) se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente después de diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua, NaHCO_{3}, y salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, y se concentró. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice (CHCl_{3}/EtOAc/MeOH 70:25:5) proporcionó B - 2 en forma de un sólido
blanco.

TLC R_{f} = 0,22 (sílice, CHCl_{3}/EtOAc/MeOH 70:25:5).

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 300 MHz): \delta 7,79 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,54 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,27 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,04 (d, 2H, J = 7 Hz), 6,60 (m, 1H), 6,29 (d, 1H, J = 7 Hz), 4,83 (s a, 1H), 4,09 (m, 3H), 3,84 (m, 1H), 3,68 (m, 1H), 3,42 (m, 2H), 3,01 (m, 4H), 2,86 (m, 4H), 2,69 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,88 (m, 2H).

Ácido 2(S)-(4-yodo-bencenosulfonilamino)-3-{4-[2-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)etil]-benzoilamino}-pro- piónico (B - 3).

Una mezcla de B - 2 (0,38 g, 0,573 mmoles) 1 HCl 6 N (50 ml) se agitó durante 14 horas a 60ºC. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se concentró, y se cromatografió el residuo sobre gel de sílice (EtOAc/EtOH/NH_{4}OH/H_{2}O 25:10:1:1 a 15:10:1:1) proporcionando B - 3 en forma de un sólido de color blanco.

TLC R_{f} = 0,43 (sílice, EtOAc/EtOH/NH_{4}OH/H_{2}O 10:10:1:1).

^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): \delta 8,42 (m, 1H), 7,79 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,63 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,44 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,27 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,10 (d, 2H, J = 7 Hz), 6,58 (s a, 1H), 6,32 (d, 1H, J = 7 Hz), 3,96 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,30 (m, 5H), 2,96 (m, 2H), 2,78 (m, 2H), 2,62 (m, 2H), 1,77 (m, 2H).

EMAR: para C_{26}H_{27}IN_{4}O_{5}S, esperado 635,0818, encontrado 635,0831.

Ácido 3-{4-[2-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)-etil]-benzoilamino}-2(S)-(4-trimetilestannil-bencenosulfonilamino)-propiónico (B - 4).

Una mezcla de B - 3 (0,10 g, 0,16 mmoles), hexametildiestannano (0,065 ml, 0,32 mmoles), Pd(PPh_{3})_{4,} y dioxano (10 ml) se agitó durante una hora a 90ºC. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se concentró, y el residuo se cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc/EtOH/NH_{4}OH/H_{2}O 50:10:1:1 a 25:10:1:1) proporcionando B - 4 en forma de un sólido blanco.

TLC R_{f} = 0,48 (sílice, EtOAc/EtOH/NH_{4}OH/H_{2}O 15:10:1:1).

^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): \delta 8,38 (m, 1H), 8,14 (m, 1H), 7,63 (m, 4H), 7,28 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,50 (s a, 1H), 6,28 (d, 1H, J = 7 Hz), 3,96 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 3,31 (m, 5H), 2,96 (m, 2H), 2,78 (m, 2H), 2,62 (m, 2H), 1,77 (m, 2H), 0,28 (s, 9H).

Espectro de masas de alta resolución: para C_{29}H_{36}N_{4}O_{5}SSn, esperado 665,1533 (^{112}Sn) y 673,1507 (^{120}Sn), encontrado 665,1517, encontrado 665,1510 y 673,1505.

Ácido 2(S)-(4-^{125}yodo-bencenosulfonilamino)-3-{4-[2-(5,6,7,8-tetrahidro-[1,8]naftiridin-2-il)-etil]-benzoilamino}- 2(S)-(4-trimetilestannil-bencenosulfonilamino)-propiónico (B - 5)

Una barra de agitación, metanol (0,05 ml) y una perla de yodo (pierce) se añadieron a un vial de envío Na^{125}I (10 mCi, Amersham, IMS300) y se agitó durante cinco minutos a temperatura ambiente. Se preparó una solución de B - 4 (aproximadamente 0,1 mg) en metanol (0,04 ml) en metanol (0,025 ml), y esta solución se añadió inmediatamente al vial de Na^{125}I7 perla de yodo. Después de agitar durante dos minutos a temperatura ambiente, la reacción se inactivó con NH_{4}OH (0,04 - 0,05 ml) y la mezcla de reacción entera se inyectó en la HPLC para purificación [columna Vydac péptido-proteína C - 18, 4,6 x 250 mm, gradiente lineal de acetonitrilo al 10%:H_{2}O (TFA al 0,1%) durante 20 minutos, 1 ml/min]. El tiempo de retención de B - 5 es 16 minutos en estas condiciones. Las fracciones que contenían la mayoría de la radiactividad se reunieron, se liofilizaron y se diluyeron con etanol proporcionando aproximadamente 1 mCi de B - 5, que se eluyó conjuntamente tras análisis de HPLC con una muestra auténtica de B - 3.

Instrumentación: La HPLC analítica y preparativa se llevó a cabo usando un sistema de distribución Waters 600E Powerline Multi Solvent con 0,1 ml de perlas con un inyector Rheodyne 7125 y un detector por filas de fotodiodos Waters 990 con un recolector de microfracciones Wilson FC203. Para la HPLC analítica y preparativa, se usó una columna Vydac péptido-proteína C - 18, 4,6 x 250 mm con una columna de defensa modular C - 18 Brownlee. El acetonitrilo usado para los análisis de HPLC era de calidad Fisher Optima. El rediodetector de HPLC usado era un detector de radioisótopos Beckam 170. Se usó una Vydac proteína y péptido C - 18, 3,9 x 250 mm para HPLC analítica y preparativa. Las soluciones de radiactividad se concentraron usando una centrífuga de vacío Speedvac. Las curvas de calibración y concentraciones químicas se determinaron usando un espectrofotómetro por filas de diodos hwelett Packard Modelo 8452ª UV/Vis. Las muestras radiactivas se determinaron en un contador gamma Packard
A5530.

Los procedimientos de ensayo empleados para medir la unión de \alphav\beta3 y \alphav\beta5 y la actividad de inhibición de resorción ósea del compuesto de la presente invención se describen a continuación.

Ensayo de resorción ósea - hoyos

Cuando los osteoclastos se comprometen en la resorción ósea, pueden provocar la formación de hoyos en al superficie del hueso que actúan encima. Por lo tanto, cuando se ensayan compuestos para evaluar su capacidad de inhibir osteoclastos, es útil medir la capacidad de osteoclastos para excavar estos hoyos de resorción cuando se presenta la inhibición del compuesto.

Secciones transversales de 200 micrómetros de espesor consecutivas de un cilindro de 6 mm de diáfisis de fémur bovino se cortan con una sierra de diamante de baja velocidad (Isomet, Beuler, Ltd., Lake Bluff, II). Se reunieron rodajas de hueso, se colocaron en una solución de etanol al 10% y se refrigeraron hasta uso posterior.

Antes de la experimentación, las rodajas de hueso bovino se ultrasonicaron dos veces, 20 minutos cada una en H_{2}O. Las rodajas limpias se limpiaron en placas de 96 pocillos de manera que están disponibles dos franjas de control y una franja para cada dosificación de fármaco. Cada franja representa cultivos o bien triplicados o cuadruplicados. Las rodajas de hueso en placas de 96 pocillos se esterilizan mediante irradiación por UV. Antes de la incubación con osteoclastos, las rodajas de hueso se hidratan mediante la adición de 0,1 ml de \alphaMEM, pH 6,9 que contiene suero bovino fetal al 5% y penicilina al 1%/estreptomicina.

Se diseccionan huesos largos de conejos de 7 - 14 días de edad (New Zealand White Hare), se limpian de tejido blando y se colocan en \alphaMEM que contiene HEPES 20 mM. Los huesos se desmenuzan usando tijeras hasta que las piezas son < 1 mm y se transfieren a un tubo de 50 ml en un volumen de 25 ml. El tubo se agita cuidadosamente a mano durante 60 ciclos, el tejido se sedimenta durante 1 minuto, y se retiró el sobrenadante. Se añaden otros 25 ml de medio al tejido y se agita de nuevo. El segundo sobrenadante se combinaron el primero. Se cuenta el número de células excluyendo los eritrocitos (típicamente aproximadamente 2 x 10^{7} células/ml). Se prepara una suspensión de células constituida por 5 x 10^{6}/ml en medio \alphaMEM que contiene suero bovino fetal al 5%, 1,25(OH)_{2}D_{3} 10 nM, y penicilina - estreptomicina. Se añaden alícuotas de 200 ml a rodajas de hueso bovino (200 mm x 6 mm) y se incubaron durante 2 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada. Se retira el medio cuidadosamente con una micropipeta y se añade medio reciente que contiene los compuestos de ensayo. Los cultivos se incuban durante 48 horas, y se ensayan para evaluar c-telopéptido (fragmento de la cadena a1 del colágeno de tipo I) mediante Crosslaps para el medio de cultivo (Herlev, Dinamarca).

Las rodajas de hueso bovino se exponen a osteoclastos durante 20 - 24 horas y se procesan para tinción. Se retira el medio de cultivo de tejidos de cada rodaja de hueso. Se lava cada pocillo con 200 ml de H_{2}O, y las rodajas de hueso se fijan después durante 20 minutos en glutaraldehído al 2,5%, cacodilato 0,1 M, pH 7,4. Después de la fijación, cualquier desecho celular restante se retira mediante 2 minutos de ultrasonicación en presencia de NH_{4}OH 0,25 M seguido de ultrasonicación 2 x 15 minutos en H_{2}O. Las rodajas de hueso se tiñen inmediatamente durante 6 - 8 minutos con azul de toluidina al 1% filtrado y bórax al 1%.

Después de que se han secado las rodajas de hueso, los hoyos de resorción se cuentan en las rodajas de ensayo y de control. Los hoyos de resorción se ven en un microscopio de fluorescencia Microphot Fx (Nikon) usando un cubo de filtro polarizante Nikon IGS. Los resultados de dosificación de ensayo se comparan con controles y los valores de CI_{50} resultantes se determinan para cada compuesto ensayado.

La adecuación de los datos de extrapolación de este ensayo a los estados patológicos de mamíferos (incluyendo seres humanos) se soporta por la enseñanza encontrada en Sato, M. y col., Journal of Bone and Mineral Research, Vol. 5, Nº.1, pp. 31 - 40, 1990 que se incorpora a esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad. El artículo enseña que ciertos bisfosfonatos se han usado clínicamente y parece que son eficaces en el tratamiento de enfermedad de Paget, hipercalcemia maligna, lesiones osteolíticas producidas por metástasis ósea, y pérdida ósea debida a la inmovilización o deficiencia de hormona sexual. Estos mismos bisfosfonatos después se ensayan en el ensayo de hoyos de resorción descrito anteriormente para confirmar una correlación entre su utilidad conocida y comportamiento positivo en el ensayo.

Ensayo EIB

Duong y col., J. Bone Miner. Res., 8: S378 (1993), describen un sistema para expresar la integrina humana \alphav\beta3. Se ha sugerido que la integrina estimula la unión de osteoclastos a la matriz ósea, ya que los anticuerpos contra la integrina, o moléculas que contienen RGD, tal como equistatina (publicación europea 382 451), puede bloquear de manera eficaz la resorción ósea.

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Mezcla de reacción:

1.: 175 Ml de tampón TBS (Tris \cdot HCl 50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, BSA al 1%, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM).

2.: 25 ml de extracto de células (diluidos con tampón octilglucósido 100 mM proporcionan 2000 cpm/25 \mul)

3.: ^{125}I-equistatina (25 \mul/50.000 cpm) (véase el documento EP 382 451).

4.: 25 v de tampón (unión total) o equistatina no marcada (unión no específica).

Después al mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se separaron las \alphav\beta3 no unida y unida mediante filtración usando un recolector de células Skatron. Los filtros (prehumedecidos en polietilenimina al 1,5% durante 10 minutos) se lavaron después con el tampón de lavado (tris HCl 50 mM CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH 7,2). Después el filtro se contó en un contador gamma.

Ensayo SPAV3 Materiales

1.: Perlas de proximidad de centelleo de aglutinina de germen de trigo (SPA):

2.: Osteoglucopiranósido. Calbiochem

3.: HEPES: Calbiochem

4.: NaCl: Fisher

5.: CaCl_{2}: Fisher

6.: MgCl_{2}: SIGMA

7.: Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF): SIGMA

8.: Opriplaca: PACKARD

9.: Compuesto A - 10 (actividad específica 500 - 1000 Ci/mmol)

10.: Compuesto de ensayo

11.: Receptor de integrina purificado: la \alphav\beta3 se purificó a partir de células 293 que sobreexpresan \alphav\beta3 (Duong y col., J. Bone Min. Res., 8: S378, 1993) de acuerdo con Pytela (Methods in Enzymology, 144: 475, 1987)

12.: Tampón de unión: HEPES 50 mM, pH 7,8 NaCl 100 mM, Ca^{2+}/Mg^{2+}, PMSF 0,5 mM

13.: octilglucósido 50 mM en tampón de unión: tampón 50-OG

Procedimiento 1. Pretratamiento de perlas SPA

500 mg de perlas de SPA liofilizadas se lavaron primero cuatro veces con 200 ml de tampón 50-OG y una vez con 100 ml de tampón de unión, y una vez con 100 ml de tampón de unión, y después de volvió a suspender en 12,5 ml de tampón de unión.

2. Preparación de perlas de SPA y mezcla de receptores

En cada tubo de ensayo, 2,5 \mul (40 mg/ml) de perlas pretratadas se suspendieron en 97,5 \mul de tampón de unión y 20 ml de tampón 50-OG. 5 ml (aproximadamente 30 ng/\mul) de receptor purificado se añadió a las perals en suspensión con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después la mezcla se centrifugó a 2500 rpm en una centrífuga Beckman GPR Benchtop durante 10 minutos a 4ºC. Los sedimentos se volvieron a suspender en 50 \mul de tampón de unión y 25 \mul de tampón 50-OG.

3. Reacción

Lo siguiente se añadió secuencialmente en Optiplate en los pocillos correspondientes.

(i): Receptor/mezcla de perlas (75 \mul)

(ii): 25 \mul de cada uno de los siguiente: el compuesto a ensayar, tampón de ensayo para unión total o A - 8 para unión no específica (concentración final 1 \muM)

(iii): A - 10 en tampón de unión (25 \mul, concentración final 40 pM)

(iv): Tampón de unión (125 \mul)Cada palca se selló con un sellador de placas de PACKARD y se incubó durante toda una noche con agitación a 4ºC.

4. Las placas se contaron usando un PACKARD TOPCOUNT

5. la % de inhibición se calculó como sigue:

: A = cuentas totales

: B = cuentas no específicas

: C = cuentas de muestras

% \ de \ inhibición \ = \ [{A - B) - (C - B)}/(A - B)]/(A - B) \ x \ 100

Ensayo de OCFORM

Se sembraron células de tipo osteoblastos (1,8 células), derivadas originalmente de bóvedas de cráneo en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos CORNING en medio \alphaMEM que contiene ribo- y desoxirribonucleósidos, suero bovino fetal al 10% y penicilina - estreptomicina. Las células se sembraron a 40.000/pocillo por la mañana. Por la tarde, las células de médula ósea se prepararon a partir de ratones Balb/C machos de seis semanas de edad como sigue:

Se sacrificaron ratones, se retiraron las tibias y se colocaron en el medio anterior. Se cortaron los extremos y al médula se sacó de la cavidad en un tubo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 27,5 de calibre. La médula se suspendió pipeteando arriba y abajo. La suspensión se pasó a través de un tamiz de celdas de nylon de > 100 mm. La suspensión resultante se centrifugó a 350 x g durante siete minutos. El sedimento se volvió a suspender, y se diluyó una muestra en ácido acético al 2% para lisar los glóbulos rojos. Las células restantes de contaron en un hemacitómetro. Las células se centrifugaron y se volvieron a suspender a 1 x 10^{6} células/ml. Se añadieron 50 \mul a cada pocillo de 1,8 células produciendo 50.000 células/pocillo y 1,25-dihidroxi-vitamina D_{3} (D_{3}) se añadió a cada pocillo hasta una concentración final de de 10 nM. Los cultivos se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada. Después de 48 horas, se cambió el medio, 72 horas después de la adición de la médula ósea, se añadieron los compuestos de ensayo con medio reciente que contenía D_{3} a pocillos cuadriplicados. Los compuestos se añadieron de nuevo después de 48 horas con medio reciente que contenía D_{3}. Después de 48 horas adicionales, se retiró el medio, las células se fijaron con formaldehído al 10% en solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de un tratamiento de 1 - 2 minutos con etanol: acetona (1 : 1) y se secaron al aire. Después las células se tiñeron para evaluar la fosfatasa ácida resistente a tartrato como
sigue:

Las células se tiñeron durante 10 - 15 minutos a temperatura ambiente con tampón acetato 50 mM, pH 5,0 que contiene tartrato sódico 30 mM, 0,3 mg/ml de sal LB de rojo violeta rápido y 0,1 mg/ml de Naftol AS - MX fosfato. Después de la tinción, las placas se lavaron de manera extensa con agua desionizada y se secaron al aire. Se contó el número de células multinucleadas, de tinción positiva en cada pocillo.

Ensayo SPAV5 Materiales

1.: Perlas de proximidad de centelleo de aglutinina de germen de trigo (SPA): Amersham

2.: Osteoglucopiranósido y Phorbo-12-miristato-13-acetato (PMA): Calbiochem

3.: Tris - HCl, NaClu CaCl_{2}: Fisher

4.: Medio esencial mínimo (MEM): Gibco/BRL

5.: Suero fetal bovino (FBS): Hyclone

6.: MgCl_{2,} MnCl_{2}, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF): SIGMA

7.: compromidos de cóctel de inhibidor de proteasa: Boehringer Mannheim.

8.: Optiplate de 96 pocillos: PACKARD

9.: B - 5 se usó como ligando radiomarcado (actividad específica 500 - 1000 Ci/mmol) y B - 3 (2,5 \muM) se usó para logar inhibición al 100%.

10.: Compuesto de ensayo.

11.: Células HEK293 que sobreexpresan integrinas \alphav\beta3 (Simon y col., J. Biol. Chem. 272, 29830 - 29839, 1997) se cultivan en placas de 150 mm en medio FBA al 10%/MEM (gibco/BRL).

12.: Tampón de lisis: octilglucopiranósido 100 mM, Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, PMSF 0,5 mM e inhibidores de proteica (1 comprimido/50 ml de tampón).

13.: Tampón de lisis: col., Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM y MnCl_{2} 1 mM.

14.: octilglucopiranósido 50 mM en tampón de unión: tampón 50-OG

Procedimiento

1. Lisados de células \alpha_{v}\beta_{5}: Células que expresan las integrinas \alpha_{v}\beta_{5} se cultivaron hasta confluencia. Después las células se hicieron pasar hambre durante toda una noche en medio que contenía FBS al 0,5%, seguido de tratamiento con PMA 100 nM durante 20 minutos. Las células se lavaron 2 veces con solución salina tamponada con fosfato fría (4ºC) y se solubilizaron en tampón de lisis durante 30 minutos en hielo. Los lisados se clarificaron usando un Beckam JA-20 a 20.000 x g. Se determinó la concentración de proteína de lisados clarificados usando un kit micro BCA (Pierce) y se almacenaron en alícuotas a 80ºC.

2. Pretratameinto de perlas de SPA

500 mg de perlas de SPA liofilizadas se lavaron primero cuatro veces con 200 ml de tampón 50-OG y una vez con 100 ml de tampón de unión, y después de volvieron a suspender en 12,5 ml de tampón de unión.

3. Preparación de reacción de unión de SPAV5

A cada pocillo de ensayo se añadieron secuencialmente en placas Optiplate:

(i): tampón de unión para preparar un volumen final de 125 \mul por pocillo.

(ii): 3 \mul (120 \mug/pocillo) de perlas pretratadas diluidas con 22 \mul de tampón 50-OG.

(iii): 15 \mug de proteínas de lisado de células \alpha_{v}\beta_{5}.

(iv): B - 5 a 50.000 cpm

(v): 25 \mul de concentraciones graduadas del compuesto de ensayo.

(vi): Cada placa se selló con sellador de placas de PACKARD y se incubó durante toda una noche con agitación a 4ºC.

4. Las placas se contaron usando un contador de centelleo de microplacas PACKARD TOPCOUNT

5. El % de inhibición se calculó como sigue:

: A = cuentas totales (unión de receptor a B - 5)

: B = cuentas no específicas (unión de receptor a B - 5 en presencia de ligando frío 2,5 \muM)

: C = cuentas de unión de receptor a compuesto de ensayo

% \ de \ inhibición \ = \ [{A - B) - (C - B)}/(A - B)]/(A - B) \ x \ 100

CI_{50} de compuesto de ensayo se calculó como 50% de inhibición.

Ejemplo de una formulación farmacéutica

Una realización especifica de una composición oral, 100 mg del compuesto de tratamiento de la presente invención se formularon con lactosa suficiente finamente dividida proporcionando una cantidad total de 580 a 590 mg para llenar una cápsula de gel dura de tamaño O.

Aunque la invención se ha descrito e ilustrado en referencia a ciertas realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar diversos cambios, modificaciones y sustituciones. Por ejemplo, dosificaciones eficaces diferentes de las dosificaciones preferidas como se ha establecido en esta memoria descriptiva anteriormente pueden ser aplicables como consecuencias de variaciones en la sensibilidad del mamífero que se está tratando para la gravedad de trastornos óseos provocados por resorción, o para otras indicaciones para los compuestos de la invención indicados anteriormente. De modo similar, las respuestas farmacológicas específicas observadas pueden variare de acuerdo con y dependiendo del compuesto activo seleccionado o si están presentes vehículos farmacéuticos, así como el tipo de formulación y modo de administración empleados, y tales variaciones esperadas o diferencias en los resultados se contemplan de acuerdo con los objetos y prácticas de la presente invención.

Claims

1. Un compuesto de la fórmula estructural (I):

10

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. La composición de la reivindicación 2 que comprende adicionalmente un ingrediente activo seleccionado entre el grupo constituido por

b): un modulador de receptor de estrógeno,

c): un agente citotóxico/antiproliferativo,

d): un inhibidor de la metaloproteinasa de matriz,

e): un inhibidor de factores de crecimiento derivados de epidermis, derivado de fibroblastos, o derivado de plaquetas,

f): un antagonista del receptor VEGF,

g): un inhibidor de Flk-1/KDR, Plt-1, Tck/Tie-2, o Tie-1,

h): un inhibidor de la catepsina K,

i): un inhibidor de prenilación, tal como un inhibidor de la farnesiltransferasa o un inhibidor de la geranilgeraniltransferasa o un inhibidor dual de la farnesil/geranilgeranil transferasa;

y las mezclas de los mismos.

4. La composición de la reivindicación 3 en la que dicho ingrediente activo se selecciona entre el grupo constituido por:

b): un modulador de receptor de estrógeno, y

c): un inhibidor de la catepsina K,

y las mezclas de los mismos.

5. La composición de la reivindicación 4 en la que dicho bisfosfonato o sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es alendronato monosódico trihidrato.

6. La composición de la reivindicación 3 en la que dicho ingrediente activo se selecciona entre el grupo constituido por:

a): un agente citotóxico/antiproliferativo,

b): un inhibidor de la metaloproteinasa de matriz,

c): un inhibidor de factores de crecimiento derivados de epidermis, derivado de fibroblastos, o derivado de plaquetas,

d): un antagonista del receptor VEGF,

e): un inhibidor de Flk-1/KDR, Plt-1, Tck/Tie-2, o Tie-1,

y las mezclas de los mismos

7. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inhibir una afección seleccionada entre el grupo constituido por resorción ósea, reestenosis, angiogénesis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis inflamatoria y crecimiento de tumores.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la afección a inhibir es resorción ósea.

9. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir osteoporosis en un mamífero.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9 en el que el medicamento adicionalmente comprende un bisfosfonato orgánico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicho bisfosfonato o sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es alendronato monosódico trihidrato.

12. Uso de un compuesto acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar desarrollo tumoral en un mamífero que está sometido a terapia de radiación.