CZ303255B6

CZ303255B6 - Nové oligosacharidy, zpusob jejich prípravy a farmaceutické kompozice tyto oligosacharidy obsahující

Info

Publication number: CZ303255B6
Application number: CZ20021385A
Authority: CZ
Inventors: Mourier@Pierre; Perrin@Elisabeth; Viskov@Christian; Stutzmann@Jean-Marie; Wahl@Florence
Original assignee: Aventis Pharma S. A.
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2012-06-27
Also published as: SK287459B6; SK5272002A3; EP1226148B1; EA200200479A1; NO323409B1; IL149154A; KR20020063881A; HUP0203821A3; CA2388369C; AU7930200A; JP4733329B2; AU781414B2; WO2001029055A3; NZ518539A; CA2388369A1; KR100872215B1; ZA200203102B; PT1226148E; WO2001029055A2; EE05091B1

Abstract

Vynález se týká oligosacharidu obecného vzorce I, jejich smesí a diastereoizomeru, zpusobu jejich prípravy farmaceutických kompozic, které tyto oligosacharidy obsahují jako úcinnou látku, a jejich použití pri lécení napr. cerebrálních, srdecních nebo vaskulárních periferních ischémií, osteoartritid, roztroušené sklerózy, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby a Huntingtonovy chorei.

Description

Vynález se týká oligonukleotidů obecného vzorce I

jejich směsí, jejich diastereo izomerů, způsobu jejich přípravy a farmaceutických kompozic, které tyto oligosacharidy obsahují.

Dosavadní stav techniky

Sulfátované disacharidy mající na redukčním konci 1,6-anhydro-strukturu byly popsané Η. P. Wcssel-em vJ. Carbohydrate Chemistry, 11(8), 1039-1052 (1992), přičemž v této publikaci nebyla pro tyto sloučeniny popsána žádná farmakologická účinnost.

Sulfátované trisacharidy obsahující opakující se strukturní jednotku 1,6-anhydro byly rovněž popsané v patentu EP 84 999 a autory Y. Ichikawa a kol. v Carbohydr. Res., 141,273-282 (1985) jako meziprodukty pro přípravu vyšších oligosacharidů. Tyto trisacharidy mají slabou účinnost anti-Xa.

Podstata vynálezu

Ve výše uvedeném obecném vzorci I n znamená celé číslo 0 až 25, R_t, R₃, R₄ a R₅, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M, R₂ a Ré, kterájsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M nebo skupinu COCH₃ a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík.

Tyto oligosacharidy takto obsahují sudý počet sacharidů.

V obecném vzorci I R₄ výhodně znamená atom vodíku.

V obecném vzorci I n výhodně znamená celé číslo 0 až 10, zejména 0 až 6 a obzvláště 1 až 6.

Oligosacharidy obecného vzorce 1 mohou být připravené působením hydroxidu alkalického kovu nebo kvartémího amoniumhydroxidu na oligosacharidy obecného vzorce II

- 1 CZ 303255 B6

ve kterém n znamená celé číslo 0 až 25, R|, R₃, R4 a R₅, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO3M, R₂ a R_ň, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO3M nebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík nebo jejich směs.

Tato reakce se provádí ve vodném prostředí při teplotě 40 až 80 °C a hodnotě pH 10 až 13.

Jako použitelný hydroxid alkalického kovu lze uvést, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lithný a hydroxid česný.

Jako použitelný kvartérní amoniumhydroxid lze uvést tetrabutylamoniumhydroxid.

Množství hydroxidu alkalického kovu nebo kvartérního amoniumhydroxidu musí být dostatečné k tomu, aby hodnota pH reakční směsi zůstala stejná v průběhu celé doby trvání reakce. Takto je tedy nezbytné v průběhu reakce kontinuálně přidávat hydroxid alkalického kovu nebo kvartérní amoniumhydroxid.

Výhodně je hydroxid alkalického kovu nebo kvartérní amoniumhydroxid ve formě 1 až 5% vodného roztoku.

Výhodně se reakce provádí při teplotě 60 až 70 °C.

Výhodně hodnota pH reakční směsi činí 11 až 12,5.

Reakce se přeruší okyselením reakční směsi, například přidáním kyselé pryskyřice, jakou je například pryskyřice Amberlite IR120® (Fluka).

3ϋ Oligosacharidy obecného vzorce I mohou být případně přečištěny permeační gelovou chromatografií za použití gelu polyakrylamid-agarózového typu, jakým je komerčně dostupný gel Ultrogel ACA202® (Biosepra), prováděnou postupem, který je dále popsán pro separaci meziproduktových oligosacharidů obecného vzorce IL Oligosacharidy obecného vzorce I, ve kterém n znamená 0 nebo 1, mohou být také případně přečištěny na sloupci aluminy za použití eiuční soustavy tvořené směsí vody a ethanolu.

Meziproduktové oligosacharidy obecného vzorce II ajejich směsi mohou být získány chromatografickou separací na gelu směsi oligosacharidů lil získanou enzymatickou depolymeraci heparinu nebo bázickou depolymeraci benzylesteru heparinu nebo polosyntetického benzylesteru hepa40 řinu.

Tato chromatografie se provádí v kolonách naplněných gelem polyakrylamid-agarózového typu, jakým je například gel, který je komerčně dostupný pod obchodním označením Ultrogel ACA202® (Biosepra). Výhodně se použije baterie kolon naplněných polyakrylamid-agarózovým gelem. Počet použitých kolon je závislý na objemu, samotném gelu a na oligosacharidech, které mají být rozděleny. Směs se eluuje roztokem obsahujícím fosfátový pufr a chlorid sodný.

-2 CZ 303255 B6

Výhodně je roztokem fosfátového pufru roztok obsahující 0,02 moJ/1 Na^PCVNa^HPCú (pH 7) a 0,1 mol/1 chloridu sodného. Detekce jednotlivých frakcí se provádí za použití ultrafialové (254 nm) a iontové (1BF) spektrometrie. Takto získané frakce mohou být potom případně přečištěny například ehromatografií SAX (strong anion exchange) postupy, které jsou pro odborníky známé, a zejména postupy popsanými K. G. Rice-m a R. J. Linhardt-em v Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989), A. I.arnkjaer-em, S. H. Hansen-em a Ρ. B. Ostergaard-cm v Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995) a v patentovém dokumentu WO 90/01501 (příklad 2). Tyto frakce se potom lyofilizují a potom odsolí na koloně naplněné gelem, jakou je například kolona s gelem Sephadex G10 (Pharmacia Biochemicals).

V případě, že se přečištění neprovádí ehromatografií SAX, mohou být lyofilizovány případně přečištěny jednoduchým nebo frakčním vysrážením prováděným postupy, které jsou odborníkům známé, zejména postupem popsaným ve francouzském patentu FR 2 548 672. Obecně se pracuje následujícím způsobem.

Lyofilizovaná frakce určená k přečištění se rozpustí při teplotě asi 25 °C v asi deseti objemech destilované vody. Přídavkem methanolu nebo ethanolu se vysráží požadovaný oltgosacharid, přičemž se kontroluje jeho čistota vysoce výkonnou kapalinovou ehromatografií (CLHP, Chromatographie Liquide Haute Performance). Přídavek methanolu nebo ethanolu se určí v závislosti na požadované čistotě a výtěžku uvedeného oligosacharidu. Stejně tak může být tato operace provedena v několika následných stupních, přičemž se vychází z původního roztoku lyofilizátu. Za tím účelem se přidává nesolubilizující činidlo (methanol nebo ethanol) v malých dávkách a po každém přídavku uvedeného činidla se izoluje získaná sraženina. Takto získané sraženiny se analyzují vysoce výkonnou kapalinovou ehromatografií. Podle požadované čistoty a požadova25 ného výtěžku se sloučí pouze ty frakce sraženiny, které uvedenou požadovanou čistotu a požadovaný výtěžek zaručují,

V případě meziproduktů obecného vzorce II, ve kterém n = 0, 1 nebo 2 je výhodné vycházet ze směsi III získané enzymatickou depolymerací.

Tato enzymatická depolymerace se provádí za použití heparinu 1 (EC 4.2.2.7) v prostředí roztoku fosfátového pufru s pH 7 v přítomnosti chloridu sodného a bovinního sérového albuminu (BSA) při teplotě mezi 10 a 18 °C, výhodně pri teplotě 15 °C, po dobu 8 až 10 dnů, výhodně po dobu 9 dnů. Tato depolymerace se přeruší například zahřátím reakční směsi na teplotu 100 °C po dobu

2 minut, načež se směs zpracuje lyofilizací. Je výhodné použít 7 Ul heparinázy I na 25 g heparinu. Roztok fosfátového pufru obecně obsahuje 0,05 mol/1 Na^PCh/NaiHPCL (pH 7) v přítomnosti 0,1 mol/1 chloridu sodného. Koncentrace bovinního sérového albuminu obecně činí 2%.

Pokud jde o meziprodukty obecného vzorce II, ve kterém n = 0, 1, 2, 3 nebo 4, je výhodné vycházet ze směsi III získané depolymerací benzylesteru heparinu.

Benzylester heparinu může být připraven postupy popsanými v patentových dokumentech US 5 389 618, EP 40 144 a FR 2 548672. Stupeň esterifíkace bude výhodně činit 50 až 100 %.

Výhodně se bude míra esterifíkace pohybovat v rozmezí od 70 do 90 %,

Uvedená depolymerace se provede ve vodném prostředí pomocí hydroxidu alkalického kovu (například hydroxid lithný, hydroxid sodný, hydroxid draselný nebo hydroxid česný) nebo kvartérního amoniumhydroxidu (například tetrabutylamoniumhydroxid), výhodně při molaritě 0,1 až

0,2 mol/1, pri teplotě 40 až 80 °C a po dobu 5 až 120 minut. V rámci výhodného provedení se pracuje po dobu 5 až 15 minut, při teplotě 60 až 70 °C a za použití roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,15 mol/I. Depolymeraění reakce se přeruší neutralizací přidáním kyseliny, jakou je například kyselina octová. Po přidání 10 % hmotn./obj. octanu sodného se směs oligosacharidu vysráží přidáním methanolu, výhodně 2 objemů methanolu na 1 objem reakční směsi, a zfiltruje.

-3CZ 303255 B6

V rámci výhodného provedení vynálezu se směs oligosacharidů, získaná po chemické depolymeraci ve formě vodného roztoku, obohatí ultrafiltrací na membránách s příslušným nominálním separačním prahem (typ Pellicon z regenerované celulózy komerčně dostupný u společnosti Millipore), přičemž typ membrány je zvolen v závislosti na typu obohaceného oligosacharidů, který má být izolován. V případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, se použije membrána s nominálním separačním prahem rovným 1 kDa, v případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 1, se použije membrána se separačním prahem 1 kDa nebo 3 kD, v případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 2, se použije membrána se separačním prahem 3 kDa, a v případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém nje rovno 3 nebo 4, se použije membrána se separačním prahem 5 kDa. V průběhu této operace se permeát zachová, zatímco zadržený podíl se považuje za odpad. Takto frakce obohaceného produktu může představovat 50 až 10 % výchozí směsi oligosacharidů, přičemž se zachová alespoň 80 % požadovaného oligosacharidů.

V případě meziproduktů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0 až 25, je výhodné vycházet ze směsi III získané depolymerací benzylesteru polosyntetického sulfátovaného polysacharidů. Uvedený benzyl ester po losyntet ieké ho sulfátovaného polysacharidů se připraví z po losyntet i ckých sulfátovaných polysacharidů získaných z polysacharidů K5 postupy popsanými v patentových dokumentech WO 94/29352 a WO 96/14425. Esterifikační, depolymeraění a izolační podmínky jsou stejné jako podmínky popsané výše pro benzylester heparinu.

Ve všech výše uvedených postupech může být výchozí heparin vepřového, ovčího, kozího nebo bovinního (hovězího) původu a může pocházet z hlenu, plic nebo kůže zvířat. Výhodně se použije heparin z vepřového nebo ovčího hlenu nebo z hovězích plic a výhodněji heparin z vepřového hlenu.

Oligosacharidy obecného vzorce I mají protizánětové vlastnosti a mohou být takto použity pro prevenci nebo léčení onemocnění spojených se zánětovými procesy zahrnujícími produkci cytotoxických látek, jakou je například oxid dusnatý (NO), jehož indukovatelná forma je uvolňována zejména neutrofíly nebo makrofágy v případě, že migrují ajsou aktivovány v úrovni tkáně. Aktivace, migrace, adheze a infiltrace neutrofilů probíhá v úrovni tkáňových zón ischemizovaných následkem okluze nebo spasmu vaskularizující tepny uvedené tkáně. K těmto ischemiím může docházet bud’ v cerebrální úrovni (vaskulámí mozková příhoda), nebo v úrovni myokardu (infarkt myokardu) anebo v úrovní dolních okončetin (tak zvané periferní ischemie).

Oligosacharidy obecného vzorce I mohou být takto použity pro prevenci nebo/a léčení neurodegenerativních onemocnění, u kterých cerebrální zánět hraje zhoubnou roli vedoucí případně ke smrti, přičemž z těchto onemocnění lze uvést cerebrální ischemie, srdeční ischemie (infarkt myokardu), periferní ischemie, poranění centrální nervové soustavy a zejména poranění lebky, páteře nebo kombinovaná poranění lebky a páteře, roztroušená skleróza, neuropatické bolesti a periferní neuropatie, nemoci motoneuronu a z nich zejména amyotrofní laterální skleróza, neuro-AIDS, A Izhei měrová choroba, Parkinsonova choroba a Huntingtonova chorea a některé formy osteoartritid, zejména v úrovni kloubů.

Protizánětová účinnost uvedených produktů je demonstrována in vivo v rámci testu produkce NO_X (dusitan a dusičnan) indukované lipopolysacharidem (LPS) pocházejícím z Escherichia Coli, přičemž tento test se provádí podle protokolu popsaného autory M. Yamashita a kol. v Eur. J. Pharmacol., 338, 2, 151-158 (1997) nebo autory J. E. Sheilito a kol. v Am. J, Respir. Cell Mol. Biol., 13,1,45-53 (1995).

Myším samečkům CD1 (Charles River) s tělesnou hmotností mezi 25 a 35 g se v čase TO intravenózně injikuje bolus 0,5 mg/kg oligosacharidů, načež se jim v čase T+15 minut subkutánně injikuje 1 nebo 2 mg/kg oligosacharidů. V čase T+30 minut se jim podá 100 mg/kg lipopolysacharidu (LPS) pocházejícího z Escherichia Coli (Sigma L3129, serotyp 0127:B8), V čase T+3 hodiny se pokusným zvířatům opětovně subkutánně injikuje 1 nebo 2 mg/kg

-4CZ 303255 B6 oligosacharidů. V čase T+5 hodin a 30 minut se pokusným zvířatům oční punkcí odebere vzorek krve a v plasmě krevního vzorku se stanoví koncentrace NO_X (dusitan a dusičnan) Griessovou kolorimetrickou metodou po redukci dusičnanu na dusitan nitrát-reduktázou za použití následujícího postupu: 12 mikrolitrů vzorku plazmy se smísí s 88 mikrolitry deionizované vody a získaná směs se inkubuje za tmy po dobu jedné hodiny při okolní teplotě v přítomnosti 40 mikrolitrů fosfátového pufru (0,3IM, pH 7,5), 20 mikrolitrů beta-NADPH (redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát) (0,85 mM), 20 mikrolitrů FDA (flavinadenindinukleotid) (0,11 mM) a 20 mikrolitrů nitrát-reduktázy (2U/ml) (Boehringer Mannheim). Ke směsi se potom přidá 10 mikrolitrů ZnSO₄ (IM) za účelem vysrážení proteinů a po promíchání se vzorky odstředí io při 20 000 g po dobu 5 minut. Nakonec se 50 mikrolitrů supernatantu inkubuje po dobu 10 minut pri okolní teplotě v přítomnosti 100 mikrolitrů Griessova reakčního činidla (1% sulfanilamid ve 0,1% směsi kyseliny fosforečné a naftylethylendiaminu v deionizované vodě (obj./obj.)). Odečítají se optické hustoty při 540 nm za použití mikrodeskového spektrofotometru. Každá hodnota se stanovuje dvakrát. Jako standard pro kolorimetrickou metodu se použijí KNO₃ a NaNO₂.

Pří tomto testu oligosacharidy podle vynálezu inhibují více než 50 % tvorby NO_X.

Jakožto výhodné oligosacharidy obecného vzorce 1 lze zejména uvést oligosacharidy obecného vzorce I, ve kterém:

2o - n je rovno 0,

Ri a Ré znamenají skupinu SOyNa a M znamená sodík a směs jeho diastereoizomeru;

- n je rovno 1,

Ri, R₂, R₃, R₅ a Ré znamenají skupinu SO₃Na,

R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík a směs jeho diastereoizomerů;

- n je rovno 2,

Ri, R₂, R₃, R₅ a Ré znamenají skupinu SO₃Na,

R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík a směs jeho diastereoizomerů;

- n je rovno 2,

Ri, R₂, Rs, Ré znamenají skupinu SO₃Na,

R₅ znamená atom vodíku nebo skupinu SO₃Na,

Rt znamená atom vodíku a

M znamená sodík a směs jeho diastereoizomerů (derivát 1,6 anhydro Ais-Is-IIs).

Následující příklady ilustrují přípravu oligosacharidů obecného vzorce I a příslušných mezi45 produktů.

V těchto příkladech mají následující zkratky tyto významy:

Ais: (kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-n-L-threo-hex-enopyranózyluronová)-( ! >4>-2--deoxy 2 sulfonamino-6-O-sulfo-a-D-glukopyranóza, čtyřsodná sůl nebo také AUAp2S-(l->4)-aD—GlcN/?2S6S;

ís: (kyselina 2-sulfo-a-L-idopyranózyluronová)-( 1 -»4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulf0~ α-D-glukopyranóza, čtyřsodná sůl nebo také ct-L-ldoAp2S-(l->4)-íx-D-GlcNp2S6S;

-5CZ 303255 B6 lis: ((kyselina α-I-idopyranózyluronováH 1^4) -2-deoxy-2 suHoamido-6-<>-sulfo—α -Dglukopyranóza, trojsodná sůl nebo také a-L-ldoA/?-{l—>4)-a-D-GlcN/?2S6S;

llls: (kyselina 2-sulfo-ct-L-idopyranózyluronová)~(l->4)~2-deoxy-2-$ulfoamino-a-D-gluko5 pyranóza, trojsodná sůl nebo také a-L-ldoA^2S-(l-»4)-a-L>-GlcN/?2S;

IdoA/j; kyselina idopyranózyluronová;

G IcNp: 2-deoxy-2-am inoglukopy ranóza; io

AU ap: kyselina 4-deoxy-a-L-threo-hex-en opy ra nózy luronová;

S: sulfát.

Příklady provedení vynálezu

Příklad A

Příprava oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0,1 a 2 enzymatickou depolymerací a separací.

g heparinu se rozpustí ve 250 ml roztoku fosfátového pufru obsahujícího 0,05 mol/1

NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH = 7), 0,2 mol/1 chloridu sodného a 2 % bovinního sérového albuminu. Do této směsi se zavede 7 UI heparinázy I(EC 4.2.2.2.7) a získaný roztok se ochladí na teplotu 15 °C a potom se udržuje na této teplotě v průběhu celé depolymerační reakce. Průběh této reakce se sleduje odebíráním alikvotních vzorků reakční směsi ajejich permeační gelovou analýzou. Po devíti dnech se enzymatická reakce přeruší zahříváním reakční směsi na teplotu 100 ° C po dobu dvou minut. Ochlazená reakční směs se potom lyofilizuje. Takto se získá směs oligosacharidů 111.

Získaná směs oligosacharidů III se potom chromatografuje následujícím postupem.

Chromatografie se provádí v kolonách naplněných polyakrylamid-agarózovým gelem známým pod obchodním označením Ultrogel ACA 202 a uvedená směs se eluuje roztokem obsahujícím fosfátový pufr (0,02 mol/1 NaH₂PO₄/Na₂HPO₄) s pH = 7 a 0,1 mol/1 chloridu sodného. Detekce se provádí ultrafialovou (254 nm) a iontovou (IBF) spektrometrií. Získané produkty mohou být případně přečištěny chromatografii SAX (strong anion exchange) nebo trakčním srážením prove40 děným postupem popsaným v patentovém dokumentu FR 2 548 672. Izolované produktové frakce se lyofilizují a potom odsolí v koloně naplněné gelem Sephadex G10® (Pharmacia Biochemicals).

Uvedeným postupem se získají 3 g disacharidu Is, 1100 mg směsi hexasacharidu typicky obsa45 hující 55 % derivátu Ais—Is—lis a 10 % AIs-Is-lIIs. Tato posledně uvedená směs může být buď přečištěna postupy, které jsou odborníkům známé, za účelem rozdělení všech složek směsi nebo použita jako taková pro převedení na 1,6-anhydro—derivát obecného vzorce I. Je třeba poznamenat, že v průběhu tohoto převedení hexasacharid Ais—Is-IIIs může vést k tvorbě sloučenin obecného vzorce I.

-6CZ 303255 B6

Příklad B

Příprava olígosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n znamená 0, 1, 2, 3 nebo 4 depolymerací benzylesteru heparinu a separací

a) Příprava benzylesteru heparinu

Benzy lester heparinu se připraví postupem popsaným v příkladu 3 patentu US 5 389 618.

b) Depolymerace

100 g benzylesteru heparinu se rozpustí v 1,91 demineralizované vody. Směs se zahřeje za míchání na teplotu 60 °C. Po získání homogenního roztoku se do tohoto roztoku zavede najednou asi 35 ml 23% roztoku hydroxidu sodného. Po 10 minutách se roztok ochladí a neutralizuje 80 ml asi 2M roztoku kyseliny octové. K tomuto roztoku se přidá 10 % (hmotn./obj.) octanu sodného. Směs olígosacharidů se vysráží přidáním asi 2 objemů methanolu. Sraženina se izoluje filtrací, dvakrát promyje methanolem a potom vysuší za sníženého tlaku při teplotě 50 °C. Po vysušení se získá 73,8 g směsi olígosacharidů II.

c) Obohacení oligosacharidem, ve kterém η = 1 g výše uvedeným způsobem získané směsi olígosacharidů se rozpustí v asi 35 objemech vody. Tento roztok se podrobí ultrafíltraci přes membránu 3 kDa (Pellicon), Když se odtáhne 600 ml permeátu, tento permeát se zředí 500 ml vody. V operaci se pokračuje až do okamžiku, kdy se odtáhne dalších 450 ml dodatečného permeátu. Obě frakce permeátu se sloučí a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku. Získá se 6,1 g nažloutle bílého produktu. Analýza tohoto pevného produktu provedená permeační gelovou chromatografii ukazuje, že tento produkt obsahuje asi 30 % olígosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 1.

d) Frakcionace směsí olígosacharidů podrobených ultrafíltraci

Obohacená směs se frakcionuje v kolonách naplněných polyakrylamid-agarózovým gelem, který je znám pod označením Ultrogel ACA 202 (použijí se čtyři kolony v sérii, přičemž průměr kolon činí 10 cm a výška kolon činí 50 cm). 5 g směsi obohacené ultrafíltraci se rozpustí ve 25 ml vody a eluuje roztokem chloridu sodného o koncentraci 0,2 mol/l při průtoku 5 ml/min. Na spodku kolony se jímají 25ml frakce eluátu. Detekce produktů se provede ultrafialovou (254 nm) a iontovou (IBF) spektrometrií. Frakce produktu, pro který η = 1 se izolují, lyofílizuj í a potom odsolí v koloně naplněné gelem Sephadex G10. Po lyofilizaci se získá 1 g tetrasacharidu obsahujícího typicky 70 % derivátu AIs-Is vzorce II (R_b R₂, R₃, R5, R« = SO₃Na a M - Na). Tento derivát AIsIs může být případně přečištěn chromatografíí SAX (strong anion exchange) nebo výhodně frakčním srážením provedeným postupem popsaným v patentu FR 2 548 672.

Příklad 1

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 5 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0063 mol/l. Hodnota pH roztoku se potom změří a stanoví jako cílová hodnota (pH 11,35). Za míchání se najednou přidá 30 mg olígosacharidů vzorce II, ve kterém n je rovno 0, R, a Ré znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se potom reguluje a udržuje na hodnotě pH = 11,35 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/l. Po deseti hodinách se přeruší přidávání hydroxidu sodného a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se potom nastaví na hodnotu mezi 6 a 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR120. Směs se zfíltruje přes membránu Whatman GF/B a potom zahustí za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě blízké 25 °C. Produkt se vyjme 0,5 ml destilované vody a potom lyofílizuje. Takto se získá 29 mg směsi diastereoizomerů olígosacharidů vzorce I, ve kte-7CZ 303255 B6 rém n je rovno 0, R| a R, znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík [kyselina 4—deoxy2 O-sulfo uLthreo-hex—4-en opy ranó/yl uroň ová—(1 —>4)— 1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfoamino-p-D-mannopyranóza, trojsodná sůl, protonové spektrum (D₂O, 400 MHz, T=298 K, delta v ppm):

3,15 (lH,s, H2),

3.75 (2H, m, H6 a H3),

3,88 (IH, m, H4),

4,20 (IH, dJ-8Hz, H6),

4.22 (1H, d, J = 5 Hz, H3'),

4,58 (IH, m, H2),

4.75 (IH, m, H5),

5,53 (IH, s, Hl),

5,60 (IH.dd, J-6 a 1 Ηζ,ΗΙ),

6,03 (IH, d, J = 5 Hz, H 4 );

kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex—4-enopyranózyluronová-( 1 ->4}~4,6-anhydro-2deoxy-2-sulfoamido-p-D-glukopyranóza, trojsodná sůl, protonové spektrum (D₂O, 400 MHz, Z = 298 K, delta v ppm):

3,34 (IH, dd, J-7a2Hz, H2),

3,72 (IH, t, J = 8 Hz, H6),

3,90 (IH, m, H3),

4,03 (IH, s, H4),

4,20 (IH, d, J = 8 Hz, H6),

4.23 (IH, t,J-5Hz, H3'),

4,58 (IH, m, H2),

4,78 (IH, m, H5),

5,50 (IH, s, H1),

5,60 (IH, dd, J-6 a 1 Ηζ,ΗΙ'),

6,03 (IH, d, J-5 Hz, H4'].

Příklad 2

Do reaktoru udržovaného na teplotě 62 °C se zavede 33,3 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0063 mol/l. Hodnota pH roztoku se potom změří a stanoví jako cílová hodnota (pH = 11,15). Za míchání se přidá najednou 200 mg oligosacharidu vzorce II, ve kterém n je rovno 1, R₍, R₂, R₃, Rs a R_ó znamenají skupinu SO₃Na, Rt znamená atom vodíku a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na hodnotě 11,15 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/l. Po 12 hodinách se přeruší přidávání hydroxidu sodného a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se nastaví na hodnotu mezi 6 a 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR 120. Směs se zfiltruje přes membránu Whatman GF/B a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě blízké 25 °C. Produkt se vyjme 3 ml destilované vody a potom lyofílizuje. Takto se získá 230 mg oligosacharidu vzorce I, ve kterém n je rovno 1, R_h R₂, R₃, R5 a R(, znamenají skupinu SO₃Na, Rt znamená atom vodíku a M znamená sodík, ve formě směsi diastereomerů [kyselina 4-deoxy-2-Ú-sulfc>—a-L-threo-hex4-enopyranózyluronová-( 1 - >4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6—O-sulfo—a-D-glukopyranózyl—(I ->4 > kyselína 2-O-sulfo-a-L-idopyranózyluronová—(1—>4)-l,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfoaminoβ-D-mannopyranóza, heptasodná sůl:

protonové spektrum (D₂O, 400 MHz, T=298 K, delta v ppm):

-8CZ 303255 B6

3,15 (1H, s, H2),

3,25(1 H, m, H2”),

3,60 (IH, m, H3”), mezi 3,70 a 4,70 (14H, blok, H3/H4/H6, H27H37H4'/H5',H4”/H5”/H6”, H2”7H3”'),

4,75 (IH, m, H5), mezi 5,20 a 5,40 (2H, m, Hl' a Hl”),

5,45 (IH, m, Hl'),

5,56(1H, m, Hl),

5,94 (IH, d, J = 5 Hz, H4), kyselina—Ldeoxy-2-7^sulfo—a-L-threo-hex-4—enopyranózyluronova--(l->4)-2--<leoxy--2sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopyranózyl-( 1 —>4)-kyselina-2-O-sul fo-a-L-idopyranózyluronová-( 1 —>4)-l ,6-anhydro~2-deoxy-2-sulfonamido-[3-D-glukopyranóza, heptasodná sůl, protonové spektrum (D₂O, 400 MHz, Z - 298 K, delta v ppm):

3,25 (IH, m, H2”),

3,42 (IH, dd, J-4 a 1 Hz, H2),

3,60 (IH, m, H3”), mezi 3,70 a4,70 (14H, blok, H3/H4/H6, H27H37H47H5',H4”/H5”/H6”, H2”7H3”'),

4,75 (IH, m, H5), mezi 5,20 a 5,40 (2H, m, Hl' a Hl ”),

5,45 (IH, m, Hl”'),

5,52 (IH, m, Hl),

5,94 (IH, d, J = 5 Hz, H4)J.

Příklad 3

Do reaktoru udržovaného na teplotě 62 °C se zavede 16,7 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0063 mol/1. Změří se hodnota pH roztoku a tato hodnota se stanoví jako cílová hodnota pH (pH 11,7). Za míchání se přidá najednou 100 mg oligosacharidů vzorce II, ve kterém n je rovno 2, R_h R2, R_3} R5 a R$ znamenají skupinu SO₃Na, R4 znamená atom vodíku a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na hodnotě 11,7 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/1. Po 10 hodinách se přeruší přidávání hydroxidu sodného a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se nastaví na hodnotu mezi 6 a 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR 120. Směs se zfíltruje přes membránu Whatman GF/B, načež se zahustí k suchu za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě blízké 25 °C. Produkt se vyjme 3 ml destilované vody a potom lyofílizuje. Takto se získá 108 mg oligosacharidů vzorce I, ve kterém n je rovno 1, R_h R₂, R₃, R₅ a R<, znamenají skupinu SO₃Na, R4 znamená atom vodíku a M znamená sodík, ve formě směsi diastereomerů; jako A až F se označují konstituční cukry hexasacharidů, přičemž A znamená zbytek l,6~anhydro a F znamená zbytek nenasycené kyseliny uronové [kyselina 4—deoxy-2-(7-sulfo—α-L-threo-hex—l-enopyranózyluronová-71 —>4)—2-deoxy~2-sulfoamino-6-(7-sulfo-a-D-glukopyranózyl-( 1 -»4)-kyselina 2-0-sulfo-a-L-idopyranózyluronová-<l -»4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-Osulfo-a-D-glukopyranózyl-(l->4)--kyselina 2-ť7-sulfo-a-L-idopyranózyluronová-( 1 ->4)-l ,6anhydro-2-deoxy--2-sulfoamino-p-Dmannopyranóza, undekasodná sůl:

protonové spektrum (D₂O, 600 MHz, T=298 K, delta v ppm):

3,15 (lH,s, H2 (A)),

3,25 (2H, m, H2(C+E)),

3,60 (2H, m, H3(C+E)),

-9CZ 303255 B6 mezi 3,65 a 4,50 (19H, blok, H2(B+D)/H3 (A+B+D+F)/H4 (A+B+C+D+E)/H5(C+E) /H6 (A+C+E),

4.60 (IH, s, H2(F),

4,80 (3H, m, H5 (A+B+D),

5,18 (IH,s, HI (D)),

5,30 (IH, s, HI (B)),

5,34(1H, d, HI (O),

5,36 (IH, d, Hl (E)),

5,46 (IH, s, HI (F)), ío 5,57 (lH,s, H] (A)),

5,95 (IH, d, J = 5Hz, H4 (F));

kyselina

4-deoxy-2-č>-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranózyluronová-(1-»4)-2-deoxy-2-sulfoamíno15 6-í7-sulfo—α-D- glukopyranózyl--( 1—>4)-kyselina 2-(9-sulfo-a-L-idopyranózyluronová(1^4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-ť7-sulfo-a-D-glukopyranózyl-(]-»4)-kyselina 2-O-sulfoct-L-idopyranózy luronová-( 1 —>4)-l ,6-anhydro-2--deoxy-2-sLilfoamino-p— D-glukopyranóza, undekasodná sůl, zo protonové spektrum (D?O, 600 MHz, T-298 K, delta v ppm):

3,25 (2H, m, H2 (C+E)),

3,42 (IH, m, H2 (A)),

3.60 (2H, mH3 (C+E)), mezi 3,65 a 4,50 (19H, blok, H2 (B+D) /H3 (A+B+D+F) /H4 (A+B+C+D+E) /H5 (C+E) /H6 (A+C+E)),

4.60 (IH, s, H2 (F)),

4,80 (3H, m, H5 (A+B+D),

5,18 (IH, s, HI (D)),

5,31 (IH, s, HI (B)),

5,34(lH,d,H1 (O),

5,36(1H, d, HI (E)),

5,46 (IH, s, HI (F)),

5,52 (IH, s, H1(A)),

5,95(1H,d,J = 5Hz,H4(F))].

Příklad 4

Do reaktoru udržovaného na teplotě 62 °C se zavedou 4 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0316 mol/l. Změří se hodnota pH roztoku a tato hodnota se stanoví jako cílová hodnota pH (pH = 11,8). Za míchání se najednou přidá 100,8 mg směsi oligosacharidu vzorce II, ve kterém n je rovno 2, obsahující 55 % derivátu AIs-Is-Is (R_u R₂, R₃, R₅ a R₆ znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík), 35 % derivátu AIs-Ts-IIs (R_h R₂, R₃ a R₆ znamenají skupinu SO₃Na, R₅ znamená buď skupinu SO₃Na nebo atom kyslíku, R4 znamená atom vodíku a M znamená sodík) a 10 % derivátu Ais—Is—IIIs (R_b R₂, R₃, R₅ a R$ znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík, přičemž skupina SO₃M uhlíku C6 je nahrazena atomem vodíku). Hodnota pH se kontroluje a udržuje na hodnotě 11,8 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/l. Po 11 hodinách se přeruší přidá50 vání hydroxidu sodného a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se nastaví na 6 a 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR120. Směs se zfíltruje přes membránu Whatman GF/B a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě blízké 25 °C. Produkt se vyjme 1,5 ml destilované vody a potom lyofilizuje. Takto se získá 110 mg směsi oligosacharidu vzorce I, ve kterém n je rovno 2, obsahující zejména derivát 1,6—anhydro-AIs-Is-Is (R_t, R₂, R₃,

- 10CZ 303255 B6

Rg a znamenají skupinu SO₃Na, R4 znamená atom vodíku a M znamená sodík) a derivát 1,6anhydro-AIs—Is-IIs (Rj, R₂, R? a Ró znamenají skupinu SO₃Na, R₅ znamená buď skupinu SChNa nebo atom kyslíku, R4 znamená atom vodíku a M znamená sodík). Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii v modu iontových párů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I. V tomto případě vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že proběhla transformace v případě derivátů AIs-Is-Is, Ais-Is-11s.

Příklad 5

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,6 ml roztoku hydroxidu lithného o koncentraci 0,025 mol/l. Změří se hodnota pH a tato hodnota se stanoví jako cílová hodnota (pH = 11,68). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidu obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, R[ a R^ znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 11,68 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu lithného o koncentraci 0,466 mol/l. Po 8 hodinách se přidávání roztoku hydroxidu lithného přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii v modu iontových párů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 0, R₍ a R_z, znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík nebo lithium. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že uvedená transformace proběhla na 100 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 81,2 %.

Příklad 6

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,3 ml roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,0063 mol/l. Změří se hodnota pH a tato se stanoví jako cílová hodnota (pH = 11,1). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidu obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, Ri a Rft znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 11,1 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,515 mol/l. Po 24 hodinách se přidávání roztoku hydroxidu draselného přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii v modu párových iontů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 0, Ri a R₆znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík nebo lithium. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že uvedená transformace proběhla na 100 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 75,6 %.

Příklad 7

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,3 ml roztoku hydroxidu česného o koncentraci 0,0063 mol/l. Změří se hodnota pH a tato se stanoví jako cílová hodnota (pH = 10,75). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidu obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, R) a R« znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 10,75 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu česného o koncentraci 0,476 mol/l. Po 20 hodinách se přidávání roztoku hydroxidu česného přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii v modu iontových párů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 0, Rj a znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík nebo cesium. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že uvedená transformace proběhla na 90,3 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 73 %.

Příklad 8

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,3 ml roztoku tetrabutylamoníumhydroxidu o koncentraci 0,0063 mol/1. Změří se hodnota pH a tato se stanoví jako cílová hodnota (pH = 10,95). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, Rj a R_fi znamenají skupinu SO^Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 10,95 kontinuálním přidáváním roztoku tctrabutylamoniumhydroxidu o koncentraci 0,521 mol/l. Po 16 hodinách se přidávání roztoku tetrabutylamoniumhydroxidu přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií v modu párových iontů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce 1, ve kterém n je rovno 0, R] a R_ň znamenají skupinu SOiNa a M znamená sodík nebo tetrabutylamonium. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že uvedená transformace proběhla na 96,7 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 65 %.

Léčiva podle vynálezu obsahují jako účinnou látku alespoň jeden oligosacharid obecného vzorce 1 nebo směs oligosacharidů obecného vzorce I ve formě kompozice, ve které jsou uvedený oligosacharid nebo uvedená směs oligosacharidů obsaženy v kombinaci s libovolným jiným farmaceuticky kompatibilním produktem, který může být inertní nebo fyziologicky účinný. Léčiva podle vynálezu mohou být aplikována intravenózním, subkutánním, orálním, rektálním, topickým nebo inhalačním podáním.

Sterilními kompozicemi pro intravenózní nebo subkutánní podání jsou obecně vodné roztoky. Tyto kompozice mohou rovněž obsahovat přísady, zejména smáčecí činidla, izotonizující činidla, emulgační činidla, dispergační činidla a stabilizační činidla. Sterilizace kompozic může být provedena několika způsoby, například sterilizující filtrací, ozářením nebo přidáním steril i zač nich činidel ke kompozici. Uvedené kompozice mohou být rovněž připraveny ve formě pevných kompozic, které mohou být rozpuštěny bezprostředně před použitím ve sterilní vodě nebo v libovolném jiném sterilním injikovatelném prostředí.

Jako pevné kompozice pro orální podání mohou být použity tablety, pilulky, prášky (želatinové kapsle, sáčky) nebo granule. V těchto kompozicích je účinná látka smíšena pod proudem argonu s jedním nebo několika inertními ředidly, jakým jsou škrob, celulóza, sacharóza, laktóza nebo silika. Tyto kompozice mohou rovněž obsahovat látky jiné než ředidla, a to například jedno nebo několik maziv, jakými jsou zejména stearát hořečnatý nebo talek, činidlo podporující orální absorpci, barvivo, zapouzdřovací materiál (dražé) nebo lak.

Jako kapalné kompozice pro orální podání mohou být použity farmaceuticky přijatelné roztoky, suspenze, emulze, sirupy a tinktury obsahující inertní ředidla, jakými jsou zejména voda, ethanol, glycerol, rostlinné oleje nebo parafinový olej. Tyto kompozice mohou obsahovat i jiné látky než ředidla, a to například smáčedla, sladidla, zhutňovadla, aromatizační látky nebo stabilizátory.

Kompozicemi pro rektální podání jsou čípky nebo rektální kapsle, které vedle účinné látky obsahují pomocné látky, jakými jsou kakaové máslo, polosyntetické glyceridy nebo polyethylenglykoly.

Kompozicemi pro topické podání mohou být například krémy, lotiony, náplasti, kolutoria, nosní kapky nebo aerosoly.

Dávky účinných látek podle vynálezu závisí na požadovaném účinku, na době léčení a na zvoleném způsobu podání; tyto dávky se obecně pohybují mezi 0,5 a 10 mg na kilogram tělesné hmotnosti pacienta a den při subkutánním podání, t.j. 3 až 60 mg denně pro dospělého pacienta s tělesnou hmotností 60 kg.

Vhodné dávkovači obecně stanoví ošetřující lékař v závislosti na věku, tělesné hmotnosti a ostatních individuálních faktorech pacienta.

- 12CZ 303255 B6

Vynález se rovněž týká způsobu prevence nebo léčení nemocí spojených se zánětlivým procesem zahrnujícím produkci cytotoxických látek, mezi které patří zejména oxid dusnatý (NO). Oligosacharidy obecného vzorce I mohou být takto použity pro prevenci nebo/a léčení neurodegenerativních chorob, při kterých cerebrální zánět hraje zhoubnou úlohu, které mohou vést ke smrti a ze kterých lze uvést ischemie centrální nervové soustavy, mozkové ischemie, ischemie sítnice a kochlei, srdeční ischemie (infarkt myokardu), periferní ischemie, poruchy centrální nervové soustavy a zejména úrazy lebky, páteře a kombinované úrazy lebky a páteře, poškození sítnice a kochlei, roztroušenou sklerózu, neuropatické bolesti a periferní neuropathie, nemoci motoneuronu a z nich amyotrofní laterální sklerózu, neuro-AIDS, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu choreu a některé formy osteoartritidy, zejména v úrovni kloubů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Oligosacharidy obecného vzorce I ve kterém n znamená celé číslo 0 až 25, R_b R₃, R4 a R₅, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M, R₂ a R<„ které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M nebo skupinu COCH₃ a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík, směs těchto oligosacharidů ajejich diastereo izomery.
2. Oligosacharidy podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R4 znamená atom vodíku, směs těchto oligosacharidů ajejich diastereo izomery.
3. Oligosacharidy podle některého z nároků l nebo 2, obecného vzorce Ϊ, ve kterém n znamená celé číslo 0 až 10, směs těchto oligosacharidů ajejich diastereoizomery.
4. Oligosacharidy podle některého z nároků 1 nebo 2 obecného vzorce I, ve kterém n znamená celé číslo 0 až 6, směs těchto oligosacharidů ajejich diastereoizomery.
5. Oligosacharidy podle některého z nároků 1 nebo 2 obecného vzorce I, ve kterém n znamená celé číslo 1 až 6, směs těchto oligosacharidů ajejich diastereoizomery.
6. Způsob přípravy oligosacharidů obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačený tím, že se působí hydroxidem alkalického kovu nebo kvartémím amoniumhydroxidem na oligosacharidy obecného vzorce II

- 13CZ 303255 B6 ve kterém n znamená celé číslo 0 až 25, R_h R₃, R.i a Rs, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M, R₃ a R₆, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M nebo COCH₃ a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík, nebo na jejich směs, načež se získané oligosacharidy nebo jejich směsi izolují.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že se reakce provede ve vodném prostředí při teplotě 40 až 80 °C a hodnotě pH 10 až 13.
8. Způsob podle některého z nároků 6 nebo 7, vyznačený tím, že se použije 1 až 5% vodný roztok hydroxidu alkalického kovu nebo kvartémího amoniumhydroxidu.
9. Způsob podle některého z nároků 6 až 8, vyznačený tím, že se reakce provádí pri teplotě 60 až 70 °C.
10. Způsob podle nároků 6 až 9, vyznačený tím, že reakční hodnota pH je rovna 1 1 až

12,5.
11. Způsob podle nároků 6ažl0, vyznačený tím, že hydroxidem alkalického kovu nebo kvartémím amoniumhydroxidem je hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lithný, hydroxid česný nebo tetrabutylamoniumhydroxid.
12. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden oligosacharid podle nároku 1.
13. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden oligosacharid podle některého z nároků 1 až 5.
14. Použití oligosacharidů obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 5 pro přípravu léčiva určeného pro prevenci nebo léčení nemocí spojených se zánětlivých procesem zahrnujícím produkci oxidu dusnatého (NO).
15. Použití oligosacharidů obecného vzorce I podle nároku 14 pro přípravu léčiva určeného pro prevenci a léčení cerebrálních, srdečních nebo vaskulámích periferních ischemií, osteoartritid, poranění centrální nervové soustavy, poranění lebky, poranění pátere a kombinovaného poranění lebky a páteře, roztroušené sklerózy, neuropatických bolestí, periferních neuropatií, nemocí motoneuronu, amyotrofní laterální sklerózy, neuro-AIDS, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby a Huntingtonovy chorei.