MXPA02003945A - Nuevos oligosacaridos, preparacion de los mismos y composiciones farmaceuticas que los contienen. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a oligosacaridos de la formula: (ver formula) sus mezclas, sus diastereoisomeros, su procedimiento de preparacion y las composiciones farmaceuticas que los contienen.

Description

NUEVOS OLIGOSACARIDOS, PREPARACIÓN DE LOS MISMOS Y COMPOSICIONES FARMACÉU ICAS QUE LOS CONTIENEN Descripción de la Invención La presente invención se refiere a oligosacáridos de la fórmula: sus mezclas, sus diastereoisómeros, su procedimiento de preparación y las composiciones farmacéuticas que los contienen. Los disacáridos sulfatados que poseen en el extremo reductor una estructura 1,6-anhidro, se han descrito por H.P. WESSEL, J. Carbohydrate Chemistry, 11(8), 1039-1052 (1992) ; ninguna actividad farmacológica se menciona para estos. Los trisacáridos sulfatados que comprenden un motivo 1, 6-anhidro también se han descrito en la patente EP84999 y por Y. ICHIKAWA et coil., Carbohydr. Res., 141, REF 137870 273-282 (1985) como intermediarios para la preparación de oligosacáridos superiores. Estos trisacáridos tienen una actividad anti-Xa reducida. En la fórmula (I) n es un número entero de 0 a 25, Ri/ 3 R y R5r idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical S0M, R2 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical 'S0M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio. Estos oligosacáridos comprenden asi un número par de sacáridos. En la fórmula (I), R4 es, de preferencia, un átomo de hidrógeno. De manera preferible, n es un número entero de 0 a 10 y, en particular de 0 a 6 y de manera todavía más particular de 1 a 6. Los oligosacáridos de la fórmula (I) pueden ser preparados por la acción de un hidróxido de metal alcalino o de amonio cuaternario en los oligosacáridos de la fórmula: en la cual n es un número entero de 0 a 25, Ri, R3, R4 y R5, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical S03M, R2 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical S03M o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio, o una mezcla de estos. Esta reacción se efectúa en medio acuoso, a una temperatura de 40 a 80°C, a un pH de 10 a 13. Como hidróxido de metal alcalino que puede ser utilizado, se puede citar la sosa, la potasa, el hidróxido de litio y el hidróxido de cesio. Como hidróxido de amonio cuaternario el cual puede ser utilizado, se puede citar el hidróxido de tetrabutilamonio . La cantidad de hidróxido de metal alcalino o de amonio cuaternario debe ser suficiente para que el pH del medio de reacción permanezca estable durante toda la duración de la reacción. Así es necesario adicionar en continuo, a lo largo de la reacción, el hidróxido de metal alcalino o de amonio cuaternario. De preferencia, el hidróxido de metal alcalino o de amonio cuaternario está bajo la forma de solución acuosa de 1 a 5%.

De manera preferida, la reacción se efectúa a una temperatura de 60 a 70 °C. Ventajosamente, el pH de reacción es de 11 a 12.5. La reacción se detiene por acidificación del medio de reacción, por ejemplo por la adición de resina acida tal como la resina Amberlite IR120R (Fluka) . Los oligosacáridos de la fórmula (I) pueden ser opcionalmente purificados por cromatografía por permeación de gel del tipo poliacrilamida-agarosa tal como aquel comercializado bajo la marca Ultrogel ACA202R (Biosepra) según el protocolo descrito posteriormente para la separación de los oligosacáridos intermediarios de la fórmula (II) . Los oligosacáridos de la fórmula (I) para los cuales n es 0 o 1 también pueden ser purificados cpcionalmente sobre una columna de alúmina con, como eluyente, una mezcla de agua-etanol . Los oligosacáridos intermediarios de la fórmula (II) y sus mezclas se pueden obtener por separación por cromatografía sobre gel de una mezcla de oligosacáridos (III) obtenida por despolimerización enzimática de la heparina o despolimerización básica del éster bencílico de la heparina o de un éster bencílico de heparina de semisíntesis .

Esta cromatografía se efectúa sobre las columnas llenas de gel de tipo poliacrilamida-agarosa tal como aquél comercializado bajo la marca Ultrogel ACA202R (Biosepra) . De preferencia, se utiliza una batería de columnas de gel poliacrilamida agarosa. El número de columnas utilizadas se adapta en función del volumen, del gel y de los oligosacáridos a separar. La mezcla se eluye por una solución que contiene un amortiguador de fosfato y de cloruro de sodio. De preferencia, la solución amortiguadora, de fosfato es una solución a 0.02 mol/1 de NaH2P04/Na2HP04 (pH 7) que contiene 0.1 mol/1 de cloruro de sodio. La detección de las diferentes fracciones se realiza por espectrometría UV (254 nm) y iónica (IBF) . Las fracciones así obtenidas después pueden ser opcionalmente purificadas por ejemplo por cromatografía SAX (intercambio iónico fuerte) según los métodos conocidos por el experto en la técnica y principalmente según los métodos descritos por K.G. Rice y R.J. Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989), A. Larnkjaer, S.H. Hansen y P.B. Ostergaard, Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995) y en la patente WO90/01501 (ejemplo 2). Las fracciones después son liofilizadas luego desaladas sobre una columna llena de gel tal como una columna de gel Séphadex G10R (Pharmacia Biochemicals) .

Cuando la purificación no se realiza por cromatografía SAX, los liofilizados pueden ser purificados opcionalmente por precipitación simple o fraccionados según los métodos conocidos por el experto en la técnica y principalmente según el método descrito en la patente FR2548672. De manera general, se opera de acuerdo con el protocolo siguiente: La fracción liofilizada a purificar se disuelve a 25 °C en aproximadamente diez volúmenes de agua destilada. Por la adición de metanol o de etanol, se hace precipitar el oligosacárido deseado controlando su enriquecimiento por cromatografía CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) . La adición de metanol o de etanol se determina en función de la pureza y del rendimiento deseado de dicho oligosacárido. Del mismo modo, esta operación se puede realizar en varias etapas sucesivas a partir de la solución inicial del liofilizado. Por esto, se vuelve a adicionar el agente no solubilizante (metanol o etanol) por pequeñas porciones y se aisla, después de cada adición, el precipitado obtenido. Los precipitados así preparados se analizan por cromatografía CLAR. Según la pureza y el rendimiento deseado, se reúnen las fracciones adecuadas de precipitado.

Para los intermediarios de la fórmula (II) para los cuales n=0, 1 ó 2, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida por despolimerización enzimática. Esta despolimerización se efectúa por medio de heparinasa I (EC 4.2.2.7), dentro de una solución amortiguadora de fosfato de pH 7, en presencia de cloruro de sodio y de BSA (Albúmina de Suero Bovino) , a una temperatura comprendida entre 10 y 18 °C y, de preferencia 15°C, durante 8 a 10.días y, de preferencia, 9 días. La despolimerización se detiene por ejemplo por calentamiento del medio de reacción a 100°C durante 2 minutos y la mezcla se recupera por liofilización. Es preferible utilizar 7UI de heparinasa I para 25 g de heparina. La solución amortiguadora de fosfato comprende generalmente 0.05 mol/I de NaH2P04/Na2HP04 (pH 7) en presencia de 0.1 mol/1 de cloruro de sodio. La concentración de BSA es generalmente de 2%. Para los intermediarios de la fórmula (II) para los cuales n = 0, 1, 2, 3 ó 4, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida por despolimerización de un éster bencílico de la heparina. El éster bencílico de la heparina se puede preparar de acuerdo con los métodos descritos en las patentes US5389618, EP40144, FR2548672. La tasa de esterificación de preferencia estará comprendida entre 50 y 100%. De manera preferida, estará comprendida entre 70 y 90%. La despolimerización se efectúa en medio acuoso, por medio de un hidróxido de metal alcalino (hidróxido de litio, sosa, potasa o hidróxido de cesio, por ejemplo) o de un hidróxido de amonio cuaternario (hidróxido de tetrabutilamonio, por ejemplo) , de preferencia, a una molaridad comprendida entre 0.1 y 0.2 mol/1, a una temperatura comprendida entre 40 y 80 °C, durante 5 a 120 minutos. En un modo preferido, se opera durante 5 a 15 minutos, a una temperatura comprendida entre 60 y 70 °C, con una solución de hidróxido de sodio 0.15 mol/1. La reacción de despolimerización se detiene por neutralización por la adición de un ácido tal como el ácido acético. Después de la adición de 10% en peso por volumen de acetato de sodio, la mezcla de oligosacáridos se precipita por la adición de metanol, de preferencia, 2 volúmenes para 1 volumen del medio de reacción y se filtra. De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, la mezcla de oligosacáridos obtenidos después de la despolimerización química, bajo la forma de una solución acuosa, se enriquece por ultrafiltración sobre membranas con un umbral de corte nominal apropiado (tipo Pellicon en celulosa regenerada comercializada por Millipore) ; el tipo de membrana se adapta en función del tipo de oligosacáridos enriquecidos a recuperar. Para los oligosecáridos (II) para los cuales n = 0, se utilizará una membrana de umbral de corte nominal de 1 kDa, para los oligosacáridos (II) para los cuales n = 1, se utilizará una membrana de 1 kDa o 3 kDa, para los oligosacáridos (II) para los cuales n = 2, se utilizará una membrana de 3 kDa, para los oligosacáridos (II) para los cuales n = 3 ó 4, se utilizará una membrana de 5 kDa. Durante esta operación, el producto permeado es recuperado y el producto retenido es rechazado. Así, la fracción de producto enriquecido puede representar de 50 a 10% de la mezcla de oligosacáridos inicial conservando al menos 80% del oligosacárido deseado. Para los intermediarios de la fórmula (II) para los cuales n = 0 a 25, es preferible a partir de una mezcla (III) obtenida por despolimerización de un éster bencílico de polisacárido sulfatado de semisíntesis. El éster bencílico de polisacárido sulfatado de semisíntesis es preparado a partir de polisacáridos sulfatados de semisíntesis obtenidos a partir del polisacárido K5 y según los métodos descritos en las patentes W094/29352 y W096/14425. Las condiciones de esterifIcación, de despolimerización y de recuperación son las mismas que aquellas descritas precedentemente para el éster bencílico de heparina. En todos los procedimientos precedentes, la heparina inicial puede ser de origen porcino, ovino, caprino o bovino y puede provenir de la mucosidad, pulmones o piel de los animales. De preferencia, se utiliza una heparina de mucosidad de porcino, ovino o de pulmones de vaca y de manera más preferida de mucosidad de porcino. Los oligosacáridos de la fórmula (I) presentan propiedades anti-inflamatorias y pueden ser utilizados así para la prevención o el tratamiento de enfermedades vinculadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de substancias citotóxicas tal como el monóxido de nitrógeno (NO) del cual la forma inductible es liberada principalmente por los neutrófilos o los macrófagos cuando estos migran y son activados al nivel de un tejido. La activación, la migración, la adhesión y la infiltración de neutrófilos se producen al nivel de zonas de tejidos isquémicos a continuación de una oclusión o de un espasmo de una arteria que vascula este tejido. Estas isquemias pueden producirse ya sea al nivel cerebral (accidente vascular cerebral) , o al nivel del miocardio (infarto del miocardio) , o al nivel de las membranas inferiores (isquemias llamadas periféricas) . Los oligosacáridos de la fórmula (I) pueden ser utilizados así para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas para las cuales la inflamación cerebral juega una función deletérea que puede conducir a la muerte entre las cuales se pueden citar las isquemias cerebrales, las isquemias cardíacas (infarto del miocardio) , las isquemias periféricas, los traumatismos del sistema nervioso central y principalmente los traumatismos craneales, espinales y cráneoespinales, la esclerosis en placas, los dolores neurofáticos y las neuropatías periféricas, las enfermedades de la motoneurona de la cual la esclerosis lateral amiotrófica, el neuro-sida, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y corea de Huntington y ciertas formas de osteoartritis principalmente de localización articular. La actividad anti-inflamatoria de estos productos se demuestra en vivo en la prueba de producción de Nox (nitrito y nitrato) inducido por un lipopolisacárido (LPS) que proviene de E. Coli según el protocolo descrito por M. YAMASHITA et coil., Eur. J. Pharmacol, 338, 2, 151-158 (1997) o J.E. SHELLITO et coil. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13, 1, 45-53 (1995) .

Se inyecta, en los ratones CDI machos (Charles River, 25-35g) , en TO por vía intravenosa, bolo de 0.5 mg/kg •del oligssacárido, en T+15 minutos, por vía subcutánea 1 ó 2 mg/kg del oligosacárido. En T+30 minutos, se administran 100 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) que proviene de E. Coli (Sigma L3129, serotipo 0127:B8). En T+3 horas se inyecta de nuevo por vía subcutánea 1 ó 2 mg/kg del oligosacárido. En T+5 horas 30 minutos, una muestra de sangre es recuperada por punción en el ojo y las concentraciones en Nox (nitrito y nitrato) en el plasma son determinadas con el método colorimétrico de Griess después de la reducción de nitrato en nitrito por nitrato reductasa de la manera siguiente: 12 µl de la muestra de plasma son mezcladas con 88 µl de agua desionizada y se incuba en la noche 1 hora a temperatura ambiente con 40 µl de amortiguador de fosfato (0.31M, pH 7.5), 20 µl de ß-NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido) (0.86 mM) , 20 µl de FDA (flavina adenina dinucleótido) (0.11 mM) y 20 µl de nitrato reductasa (2U/ml) (Boehringer Mannheim), 10 µl de ZnS04 (1M) se adicionan para precipitar las proteínas y después de la mezcla, las muestras son centrifugadas a 20 000 g durante 5 minutos. Finalmente, 50 µl del sobrenadante se incuban 10 minutos a temperatura ambiente con 100 µl del reactivo de Griess (sulfanilamida a 1% en una mezcla acida fosfórica/naftietilendiamina 0.1% en agua desionizada (V/V) ) . Las densidades ópticas son leídas a 540 nm con un espectrofotómetro de microplacas; cada punto se determina 2 veces. KN03 y NaN02 son utilizados como estándar para el método colorimétrico. En esta prueba, los oligosacáridos de acuerdo con la invención inhiben en más del 50% la formación de Nox. Entre los oligosacáridos de la fórmula (I) preferidos, principalmente se pueden citar los oligosacáridos para los cuales: - n es igual a 0, Ri y Re representan un radical S03Na y M es sodio y la mezcla de sus diastereoisómeros - n es igual a 1, Ri, R , R , R5, Rg, representan un radical S0Na, R¿¡ representa un átomo de hidrógeno y M es sodio y la mezcla de sus diastereoisómeros - n es igual a 2, Ri, R2, R3, R5, Re representan un radical S03Na, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio y la mezcla de sus diastereoisómeros. - n es igual a 2, Ri, R2, R3, Re, representan un radical S03Na, R5 representa un átomo de hidrógeno o un radical S03Na, R representa un átomo de hidrógeno y M es sodio y la mezcla de sus diastereoisómeros (derivado 1,6 anhidro ?Is-Is-IIs) .

Los ejemplos siguientes son representativos de la preparación de los oligosacáridos de la fórmula (I) y de los intermediarios . En estos ejemplos los significados de las abreviaturas son los siguientes: ?Is : (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-enopiranosilurónico) - (l-»4) -2-desoxi-2-sulfoamino-ß-0-sulfo-a-D-glucopiranosa, sal de tetrasodio o bien ?UAp2S- (1— >4 ) -<x-D-GlcNp2S6S Is : (ácido 2-sulfo-a-L-idopiranosilurónico) - (1—4) -2-desoxi- 2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopiranosa, sal de tetrasodio o bien a-L-IdoAp2S- (l-4) -a-D-GlcNp2S6S lis (ácido a-L-idopiranosiluróníco) - (1— >4 ) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosa, sal de trisodio o bien a-L-IdoAp- (1?4 ) -a-D-GlcNp2S6S IIIs (ácido 2-sulfo-a-L-idopiranosilurónico) - (1— >4 ) -2-desoxi-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosa, sal de trisodio o bien a-L-IdoAp2S- ( 1?4 ) -a-D-GlcNp2S IdoAp : ácido idopiranosilurónico GlcNp : 2-desoxi-2-aminoglucopiranosa ?Uap : ácido 4-desoxi-a-L-treo-hex-enopiranosilurónico sulfato EJEMPLOS DE PREPARACIÓN DE LAS MEZCLAS DE LA FORMULA (II) EJEMPLO A - preparación de los oligosacáridos de la fórmula (II) para los cuales n = 0, 1 y 2 por despolimerización enzimática y separación Se disuelven 25 g de heparina en 250 ml de una solución amortiguadora de fosfato que contiene 0.05 mol/1 NaH2P04/Na2HP04 (pH = 7), 0.2 mol/1 de cloruro de sodio y 2% de BSA (Albúmina de Suero Bovino) . Se introducen en la mezcla 7 Ul de heparinasa I (EC 4.2.2.2.7) y la solución obtenida se enfría a 15 °C luego se mantiene a esta temperatura durante toda la duración de la reacción de despolimerización. El avance de la reacción se sigue por las muestras graduadas de alícuotas y se analizan por cromatografía sobre permeación de gel. Al cabo de 9 días, la reacción enzimática es detenida calentando el medio de reacción a 100 °C durante dos minutos. La mezcla enfriada a continuación es liofilizada. Se obtiene así una mezcla de oligosacáridos (III) . La mezcla de oligosacárídos (III) obtenida a continuación se somete a cromatografía según el método siguiente: La cromatografía se efectúa en las columnas rellenas con gel de poliacrilamida-agarosa conocido bajo la denominación Ultrogel ACA 202 y la mezcla se eluye con una solución que contiene un amortiguador de fosfato (0.02 mol/1 de NaH P04/Na2HP04) pH = 7 y 0.1 mol/1 de cloruro de sodio. La detección se realiza en espectrometría UV (254 nm) y iónica (IBF) . Los productos pueden ser purificados de manera opcional por cromatografía SAX (intercambio aniónico fuerte) o por precipitación fraccionada de acuerdo con el método descrito en la patente FR 2548672. Las fracciones del producto recuperado son liofilizadas luego desaladas sobre una columna llena de gel sephadex G10R (Pharmacia Biochemicals) . Para este método, se obtienen 3 g de disacárido Is, 1100 mg de una mezcla de hexasacárido que contiene típicamente 55% de derivado ?ls-Is-Is, 35% de ?ls-Is-IIs y 10% de ?ls-Is-IIIs. Esta última mezcla puede ser purificada de acuerdo con los métodos conocidos por el experto de la técnica para separar cada uno de los constituyentes o se utiliza como es para la transformación en derivados 1,6 anhidro de la fórmula (I) . Se observa que durante esta transformación el hexasacárido ?ls-Is-IIIs no puede conducir a la formación de compuestos de la fórmula (I) .

EJEMPLO B - preparación y separación de los oligosacáridos de la fórmula (II) para los cuales n = 0, 1, 2, 3 ó 4 por despolimerización del éster bencílico de heparina a - Preparación del éster bencílico de la heparina El éster bencílico de la heparina se prepara de acuerdo con el ejemplo 3 de la patente US 5,389,618. b- Despolimerización Se disuelven 100 g de éster bencílico de la heparina en 1.9 1 de agua desmineralizada. La mezcla se lleva a 60°C bajo agitación. Después de la obtención de una solución homogénea, se introducen, en una sola vez, aproximadamente 35 ml de una solución de hidróxido de sodio a 23%. Después de 10 minutos de reacción, la solución se enfría entonces y se neutraliza por 80 ml de una solución de ácido acético aproximadamente 2 N. A esta solución, se adiciona 10% en peso/volumen de acetato de sodio. La mezcla de oligosacáridos se precipita por la adición de aproximadamente 2 volúmenes de metanol. El precipitado se aisla por filtración, se lava con metanol dos veces luego se seca bajo presión reducida a 50°C. Después del secado, se obtienen 73.8 g de una mezcla de oligosacáridos (II) . c-Enriquecimiento en oligosacáridos para los cuales n = 1 Se disuelven 30 g de la mezcla de oligosacáridos obtenidos con anterioridad en aproximadamente 35 volúmenes de agua. Esta solución se ultrafiltra sobre una membrana de 3 kDa (Pellicon) . Cuando 600 ml del producto permeado se han sacado, se diluye el producto retenido con 500 ml de agua. La operación se prosigue hasta la salida de 450 ml del producto permeado complementario. Las dos fracciones de producto permeado son reunidas luego concentradas a sequedad bajo presión reducida. Se obtienen 6.1 g de un sólido blanco amarillento. El análisis del sólido por cromatografía de permeación sobre gel indica que el contenido de aproximadamente 30% de oligosacárido de la fórmula (II) para el cual n = 1. d - Fraccionamiento de las mezclas de oligosacáridos ultrafiltrados La mezcla enriquecida se fracciona sobre columnas llenas con gel de poliacrilamida-agarosa conocido bajo la denominación Ultrogel ACA 202 (se utilizan 4 columnas en serie de un diámetro de 10 cm y de una altura de 50 cm) . Se disuelven 5 g de la mezcla enriquecida por ultrafiltración en 25 ml de agua, luego se eluye por una columna de 0.2 mol/1 de cloruro de sodio a la velocidad de 5 ml/min. Se recuperan por debajo de la columna las fracciones de 25 ml . La detección de los productos se realiza por espectrometría UV (254 nm) y iónica (IBF) . Las fracciones del producto para el cual n = 1 son recuperadas, liofilizadas luego desaladas sobre una columna llena de gel Sephadex G10. Después de la liofilización, se obtiene 1 g de tetrasacárido que contiene típicamente 70% del derivado ?ls-Is de la fórmula II (Ri, R2, 3, =/ e = S03Na; R4 = H y M = Na) . El derivado ?ls-Is puede ser purificado opcionalmente por cromatografía SAX (intercambio de aniones fuertes) o de acuerdo con un aspecto preferencial por precipitación fraccionada de acuerdo con el método descrito en la patente FR 2548672.

EJEMPLO 1 En un reactor mantenido a 66°C, se introducen 5 ml de una solución de hidróxido de sodio a 0.0063 mol/1. El pH de la solución se mide y se toma como valor de blanco (pH = 11.35) . Bajo agitación, se adicionan una vez 30 mg del oligosacárido de la fórmula (II) para el cual n es igual a 0, Ri y R6 representan un radical S03Na y M es sodio. El pH se regula entonces y se mantiene a pH 11.35 por la adición continua de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1.

Después de 10 horas, se detiene la adición de hidróxido de sodio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El pH de la solución se lleva a 6 y 7 por la adición de resina Amberlite IR20. La mezcla se filtra sobre la membrana Whatman GF/B luego se concentra a sequedad bajo presión (2.7 kPa), a una temperatura de aproximadamente 25 °C. El producto se recupera con 0.5 ml de agua destilada luego se liofiliza. Se obtienen así 29 mg de una mezcla de diastereoisómeros del oligosacárido de la fórmula (I) para el cual n es igual a 0, Ri y Re representan un radical S03Na y M es sodio [ (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico- ( 1— >4 ) -1, 6-anhidro-2-desoxi-2-sulfoamino-ß-D-manopiranosa, sal de trisodio) : Espectro de protones en D20, 400 MHz, T=298K, d en ppm: 3.15 (ÍH, s, H2), 3.75 (2H, m, H6 y H3), 3.88 (1H, m, H4), 4.20 (1H, d, J = 8 Hz, H6) , 4.22 (ÍH, t, J = 5Hz, H3'), 4.58 (ÍH, m, H2' ) , 4.75 (1H, m, H5) , 5.53 (ÍH, s, Hl), 5.60 (1H, dd, J = 6 y 1Hz, HIA, 6.03 (ÍH, d, J = 5Hz, H4'); (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico- (1— >4 ) -1, 6-anhidro-2-desoxi-2-sulfoamino-ß-D-glucopiranosa, sal de trisodio) : Espectro de protones en D20, 400MHz, T=298K, d en ppm: 3.34 (ÍH, dd, J = 7 y 2Hz, H2), 3.72 (ÍH, t, J = 8 Hz, H6), 3.90 (ÍH, m, H3) , 4.03 (1H, s, H4), 4.20 (ÍH, d, J=8 Hz, H6), 4.23 (1H, t, J=5Hz, H3'), 4.58 (1H, m, H2')/ 4.78 (1H, m, H5) , 5.50 (ÍH, s, Hl), 5.60 (ÍH, dd, J=6 y 1Hz, Hl')/ 6.03 (1H, d, J = 5Hz, H4')].

EJEMPLO 2 En un reactor mantenido a 62°C, se introducen 33.3 ml de una solución de hidróxido de sodio a 0.0063 mol/1. El pH de la solución entonces se mide y se toma como el valor de blanco (pH = 11.15) . Bajo agitación, se adicionan en una vez 200 mg del oligosacárido de la fórmula (II) para el cual n es igual a 1, Rl r R2, R3/ R5 y RQ representan un radical S03Na, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio. El pH es regulado entonces y se mantiene a pH 11.15 por la adición continua de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 12 horas, se detiene la adición de hidróxido de sodio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El pH de la solución se lleva de nuevo entre 6 y 7 por la adición de resina Amberlite IR120. La mezcla se filtra sobre una membrana Whatman GF/B luego se concentra a sequedad bajo presión reducida (2.7 kPa) , a una temperatura de aproximadamente 25 °C. El producto se recupera con 3 ml de agua destilada luego se liofiliza. Se obtienen así 230 mg del oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 1, Ri/ i/ R3/ 5 ß/ representan un radical S03Na , R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio , baj o la forma de una mezcla de diastereoisómeros [ ( ácido 4 -desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4 -enopiranosilurónico- ( 1— >4 ) -2-desoxi-2-sul f oamino- 6-0-sulf o-a-D-glucopiranosil- ( l- 4 ) ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- ( l-»4 ) -1, ß-anhidro-2-desoxi-2-sulfoamino-ß-D-manopiranosa, sal de heptasodio) : Espectro de protones en D20, 400MHz, T=298K, d en ppm: 3.15 (1H, s, H2), 3.25 (ÍH, m, H2"), 3.60 (ÍH, m, H3"), entre 3.70 y 4.70 (14H, masivo, H3/H4/H6, H2' /H3 ' /H ' /H5 H4"/H5"/H6", H2" '/H3'") , 4.75 (ÍH, m, H5), entre 5.20 y 5.40 (2H, m, Hl' y Hl") , 5.45 (ÍH, m, Hl"'), 5.56 (ÍH, m, Hl), 5.94 (ÍH, d, J=5Hz, H4); (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico- (1— >4 ) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopiranosil- (1— >4 ) ácido -2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (l->4) -1, 6-anhidro-2-desoxi-2-sulfoamino-ß-D-glucopiranosa, sal de heptasodio) : Espectro de protones en D20, 400 MHz, T=298K, d en ppm: 3.25 (1H, m, H2 'J , 3.42 (1H, dd, J = 4 y 1Hz, H2), 3.60 (ÍH, m, H3"), entre 3,70 y 4.70 (14H, masivo, H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5' , H4"/H5"/H6", H2"'/H3"')/ 4.75 (ÍH, m, H5) , entre 5.20 y 5.40 (2H, m, Hl' y Hl") , 5.45 (1H, m, Hl'" ) , 5.52 (ÍH, m, Hl) , 5.94 (ÍH, d, J=5Hz, H4)].

EJEMPLO 3 En un reactor mantenido a 62°C, se introducen 16.7 ml de una solución de hidróxido de sodio a 0.0063 mol/1. El pH de la solución entonces se mide y se toma como el valor de blanco (pH = 11.7) . Bajo agitación, se adicionan en una vez 100 mg del oligosacárido de la fórmula (II) para el cual n es igual a 2, Ri, R2, R3, R5 y Rs representan un radical S0Na, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio. El pH es regulado entonces y se mantiene a pH 11.7 por la adición continua de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 10 horas, se detiene la adición de hidróxido de sodio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El pH de la solución se lleva de nuevo entre 6 y 7 por la adición de resina Amberlite IR120. La mezcla se filtra sobre una membrana Whatman GF/B luego se concentra a sequedad bajo presión reducida (2.7 kPa) , a una temperatura de aproximadamente 25°C. El producto se recupera con 3 ml de agua destilada luego se liofiliza. Se obtienen así 108 mg del oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 2, Ri, R2, R3, R5/ R6, representan un radical S03Na, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se notan de A a F los azúcares constitutivos de los hexasacáridos, A es el residuo 1,6-anhidro y F el residuo de ácido urónico insaturado. [(ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico- (1— 4 ) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopiranosil- (l-»4) -ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- ( l->-4 ) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil- (1—4 ) -ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (l-»4) -1, 6-anhidro-2-desoxi-2-sulfoamino-ß-D-manopiranosa, sal de undecasodio) : Espectro de protones en D20, 600MHz, T=298K, d en ppm: 3.15 (1H, s, H2(A)), 3.25 (2H, m, H2 (C+E) ) , 3.60 (2H, n, H3 (C+E) ) , entre 3.65 y 4.50 (19H, masivo, H2 (B+D) /H3 (A+B+D+F) /H4 (A+B+C+D+E) /H5 (C+E) /H6 (A+C+E) ) , 4.60 (1H, s, H2(F)), 4.80 (3H, m, H5 (A+B+D) , 5.18 (ÍH, s, H1(D)), 5.30 (1H, s, H1(B)), 5.34 (ÍH, d, Hl (C) ) , 5.36 (ÍH, d, H1(E)), 5.46 (1H, s, H1(F)), 5.57 (ÍH, s, Hl (A) ) , 5.95 (ÍH, d, J = 5Hz, H4(F)); (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico- (l-»4 ) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a- D-glucopiranosil- ( 1—>4 i ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (1—>4) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a- D-glucopiranosil- (1— ) -ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (1— >4 ) -1, 6-anhidro-2-desoxi-2-sulfoamino-ß-D-glucopiranosa, sal de undecasodio) : Espectro de protones en D20, 600 MHz, T=298K, d en ppm: 3.25 (2H, m, H2 (C+E) ) , 3.42 (1H, m, H2 (A) ) , 3.60 (2H, m, H3 (C+E) ) , entre 3.65 y 4.50 (19H, masivo, H2 (B+D) /H3 (A+B+D+F) /H4 (A+B+C+D+E) /H5 (C+E) /H6 (A+C+E) ) , 4.60 (1H, s, H2(F)), 4.80 (3H, m, H5 (A+B+D) , 5.18 (ÍH, s, H1(D)), 5.31 (1H, s, H1(B)), 5.34 (ÍH, d, Hl (C) ) , 5.36 (1H, d, H1(E)), 5.46 (ÍH, s, H1(F)), 5.52 (1H, s, Hl (A) ) , 5.95 (ÍH, d, J = 5Hz, H4 (F) ) ] .

EJEMPLO 4 En un reactor mantenido a 62 °C, se introducen 4 ml de una solución de hidróxido de sodio a 0.0316 mol/1. El pH de la solución entonces se mide y se toma como el valor de blanco (pH = 11.8) . Bajo agitación, se adicionan en una vez 100.8 mg de una mezcla de oligosacáridos de la fórmula (II) para la cual n es igual a 2 que comprende 55% de derivado ?ls-Is-Is (Ri, R2, R3, R5 y R6 representan un radical S03Na, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio) , 35% de ?ls-Is-IIs (Ri, R2, R3 y Re representan un radical S03Na, R5 representa ya sea un radical S03Na o un átomo de hidrógeno, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio) y 10% de ?ls-Is-IIIs (Ri, R2, R3, R5 y R6 representan un radical S03Na, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio, la función SO3M del carbono C6 se remplaza con un hidrógeno) . El pH es regulado entonces y se mantiene a pH 11.8 por la adición continua de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 11 horas, se detiene la adición de hidróxido de sodio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El pH de la solución se lleva de nuevo entre 6 y 7 por la adición de resina Amberlite IR120. La mezcla se filtra sobre una membrana Whatman GF/B luego se concentra a sequedad bajo presión reducida (2.7 kPa) , a una temperatura de aproximadamente 25 °C. El producto se recupera con 1.5 ml de agua destilada luego se liofiliza. Se obtienen así 110 mg de una mezcla de oligosacáridos de la fórmula (I) para la cual n es igual a 2, que contiene principalmente el derivado 1,6 anhidro ?Is-Is-Is (Ri, R2, R3, R5, R6 representan un radical S03Na, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio) y el derivado 1,6 anhidro ?ls-Is-IIs (Ri, R2, R3, Re representan un radical S03Na, R£ representa ya sea un radical S03Na o un átomo de hidrógeno, R4 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio) . El análisis CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) en el modo par de iones permite seguir la transformación en derivados de la fórmula (I) . En este caso, la dosificación CLAR muestra que la transformación se realiza para los derivados ?ls-Is-Is, ?ls-Is-IIs.

EJEMPLO 5 En un reactor mantenido a 66°C, se introducen 8.6 ml de una solución de hidróxido de litio a 0.025 mol/1. El pH de la solución se mide y se toma como valor de blanco (pH = 11.68) . Bajo agitación, se adiciona en una vez 50 mg del oligosacárido de la fórmula (II) para la cual n es igual a 0, Ri y R6 representan un radical S03Na y M es sodio. El pH también se regula y se mantiene a pH 11.68 por la adición continua de una solución de hidróxido de litio a 0.466 mol/1. Después de 8 horas, se detiene la adición de hidróxido de litio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El análisis CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) en el modo par de iones permite continuar la transformación en derivado de la fórmula (I) para la cual n es igual a 0, Ri y Rg representan un radical S03Na y M es sodio o litio. En este caso, la dosificación _ de CLAR muestra que la transformación se realiza al 100%. El rendimiento por contraste externo es de 81.2%.

EJEMPLO 6 En un reactor mantenido a 66°C, se introducen 8.3 ml de una solución de hidróxido de potasio a 0.0063 mol/1. El pH de la solución se mide y se toma como valor de blanco (pH = 11.1) . Bajo agitación, se adiciona en una vez 50 mg del oligosacárido de la fórmula (II) para la cual n es igual a 0, Ri y Rg representan un radical S03Na y M es sodio. El pH también se regula y se mantiene a pH 11.1 por la adición continua de una solución de hidróxido de potasio a 0.515 mol/1. Después de 24 horas, se detiene la adición de hidróxido de potasio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El análisis de CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) en el modo par de iones permite continuar la transformación en derivado de la fórmula (I) para la cual n es igual a 0, Ri y Rg representan un radical S03Na y M es sodio o potasio. En este caso, la dosificación de CLAR muestra que la transformación se realiza al 100%. El rendimiento por contraste externo es de 75.6%.

EJEMPLO 7 En un reactor mantenido a 66°C, se introducen 8.3 ml de una solución de hidróxido de cesio e. 0.0063 mol/1. El pH de la solución se mide y se toma como valor de blanco (pH = 10.75) . Bajo agitación, se adiciona en una vez 50 mg del oligosacárido de la fórmula (II) para la cual n es igual a 0, Ri y R& representan un radical S03Na y M es sodio. El pH también se regula y se mantiene a pH 10.75 por la adición continua de una solución de hidróxido de cesio a 0.476 mol/1. Después de 20 horas, se detiene la adición de hidróxido de cesio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El análisis de CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) en el modo par de iones permite continuar la transformación en derivado de la fórmula (I) para la cual n es igual a 0, Ri y Rg representan un radical S03Na y M es sodio o cesio. En este caso, la dosificación de CLAR muestra que la transformación se realiza al 90.3%. El rendimiento por contraste externo es de 73%.

EJEMPLO 8 En un reactor mantenido a 66°C, se introducen 8.3 ml de una solución de hidróxido de tetrabutilamonio a 0.0063 mol/1. El pH de la solución se mide y se toma como valor de blanco (pH = 10.95) . Bajo agitación, se adiciona en una vez 50 mg del oligosacárido de la fórmula (II) para la cual n es igual a 0, Rx y R6 representan un radical S03Na y M es sodio. El pH también se regula y se mantiene a pH 10.95 por la adición continua de una solución de hidróxido de tetrabutilamonio a 0.521 mol/1. Después de 16 horas, se detiene la adición de hidróxido de cesio y la mezcla de reacción se enfría a 25°C. El análisis de CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) en el modo par de iones permite continuar la transformación en derivado de la fórmula (I) para la cual n es igual a 0, Ri y Rg representan un radical S03Na y M es sodio o tetrabutilamonio. En este caso, la dosificación de CLAR muestra que la transformación se realiza al 96.7%. El rendimiento por contraste externo es de 65%. Los medicamentos de acuerdo con la invención comprenden en calidad de principio activo al menos un oligosacárido de la fórmula (I) o una mezcla de oligosacáridos de la fórmula (I), bajo la forma de una composición en la cual se asocia cualquier otro producto farmacéuticamente compatible, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. Los medicamentos de conformidad con la invención pueden ser empleados por vía intravenosa, subcutánea, oral, rectal, tópica o pulmonar (inhalación) . Las composiciones estériles para la administración intravenosa o subcutánea, son generalmente las soluciones acuosas. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonizantes, emulsíficadores, dispersantes y estabilizadores. La esterilización se puede hacer de varias formas, por ejemplo, por filtración aséptica, incorporando a la composición agentes esterilizadores, por irradiación. Las mismas también se pueden preparar bajo la forma de composiciones sólidas estériles las cuales se pueden disolver al momento del empleo en agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable. Como composiciones sólidas para la administración oral, se pueden utilizar comprimidos, pildoras, polvos (cápsulas de gelatina, comprimidos) o granulos. En estas composiciones, el principio activo se mezcla a uno o varios diluyentes inertes, tales como almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo corriente de argón. Estas composiciones también pueden comprender substancias diferentes a los diluyentes, por ejemplo uno o varios lubricantes tales como el estearato de magnesio o el talco, un agente que favorece la absorción oral, un colorante, un revestimiento (grageas) o un barniz. Como composiciones líquidas para la administración oral, se pueden utilizar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender substancias diferentes a los diluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizadores. Las composiciones para la administración rectal son los supositorios o las cápsulas rectales las cuales contienen, además del producto activo, excipientes tales como la manteca de cacao, glicéridos semisintéticos o polietilenglicoles . Las composiciones para la administración tópica pueden ser por ejemplo cremas, lociones, colirios, colutorios, gotas nasales o aerosoles. Las dosis dependen del efecto buscado, de la duración del tratamiento y de la vía de administración utilizada; las mismas están generalmente comprendidas entre 0.5 mg y 10 mg por kg por día por vía subcutánea ya sea 3 a 60 mg por día para un adulto de 60 kg. De manera general, el médico determinará la posología apropiada en función de la edad, el peso y todos los otros factores apropiados del sujeto a tratar. La invención también se refiere al método de prevención o de tratamiento de enfermedades vinculadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de substancias citotóxicas tal como el óxido de nitrito (NO) . Los oligosacáridos de la fórmula (I) también pueden ser utilizados para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas para las cuales la inflamación cerebral juega un papel deletéreo que puede conducir a la muerte, entre las cuales se pueden citar las isquemias del sistema nervioso central, las isquemias cerebrales, las isquemias de la retina y de la cóclea, las isquemias cardíacas (infarto del miocardio) , las isquemias periféricas, los traumatismos del sistema nervioso central y principalmente los traumatismos craneales, espinales y cráneoespinales, los traumatismos de la retina y de la cóclea, la esclerosis en placas, los dolores neurofáticos y las neuropatías periféricas, las enfermedades de la motoneurona de las cuales la esclerosis lateral amiotrófica, la neuro-sida, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y corea de Huntington y ciertas formas de osteoartritis principalmente en localización articular. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Oligosacáridos de la fórmula: caracterizados porque n es un número entero de 0 a 25, Ri, R3, R y Rs idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical S03M, R2 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical S03M o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio, una mezcla de estos oligosacáridos y sus diastereoisómeros.

2. Los oligosacáridas -de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque para los cuales R4 representa un átomo de hidrógeno, una mezcla de estos oligosacáridos y sus diastereoisómeros.

3. Los oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizados porque para estos n es un número entero de 0 a 10, una mezcla de estos oligosacáridos y sus diastereoisómeros.

4. Los oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizados porque para estos n es un número entero de 0 a 6, una mezcla de estos oligosacáridos y sus diastereoisómeros.

5. Los oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizados porque para los cuales n es un número entero de 1 a 6, una mezcla de estos oligosacáridos y sus diastereoisómeros.

6. Un procedimiento de preparación de los oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se hace reaccionar un hidróxido de metal alcalino o de amonio cuaternario sobre oligosacárídos de la fórmula: en la cual n es un número entero de 0 a 25, Ri, R3, R4 y R5, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical S03M, R2 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical S03M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio, una mezcla de estos y se aislan los oligosacáridos o sus mezclas.

7. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque se" efectúa la reacción en medio acuoso, a una temperatura de 40 a 80 °C y a un pH de 10 a 13.

8. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque se utiliza una solución acuosa de 1 a 5% de hidróxido de metal alcalino o de amonio cuaternario.

9. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 6 u 8, caracterizado porque la reacción se efectúa a una temperatura de 60 a 70°C.

10. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque el pH de reacción es de 11 a 12.5.

11. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque el hidróxido de metal alcalino o de amonio cuaternario es la sosa, la potasa, el hidróxido de litio, de cesio o el hidróxido de tetrabutilamonio .

12. Las composiciones farmacéuticas caracterizadas porque contienen como principio activo al menos un oligosacárido de conformidad con la reivindicación 1.

13. Las composiciones farmacéuticas caracterizadas porque contienen como principio activo al menos un oligosacárido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5.

14. Utilización de oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de un medicamento útil para la prevención o el tratamiento de enfermedades vinculadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de nitrito óxido (NO) .

15. Utilización de los oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 14, para la preparación de medicamentos útiles para* la prevención y el tratamiento de isquemias cerebrales, cardíacas o vasculares periféricas, osteoartritis, traumatismos del sistema nervioso central, traumatismos craneales, espinales y cráneoespinales, de la esclerosis en placas, de dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, enfermedades de la motoneurona, de la esclerosis lateral amiotrófica, de la neuro-sida, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y corea de Huntington.