CZ20021385A3

CZ20021385A3 - Nové oligosacharidy, způsob jejich přípravy a farmaceutické kompozice tyto oligosacharidy obsahující

Info

Publication number: CZ20021385A3
Application number: CZ20021385A
Authority: CZ
Inventors: Pierre Mourier; Elisabeth Perrin; Christian Viskov; Jean-Marie Stutzmann; Florence Wahl
Original assignee: Aventis Pharma S. A.
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2002-07-17
Also published as: NO323409B1; ZA200203102B; KR100778166B1; CA2388369C; KR20070087263A; UA72545C2; BR0014939A; CA2388369A1; NO20021859L; EP1226148B1; IL149154A0; WO2001029055A3; MXPA02003945A; HRP20020330B1; SK5272002A3; SK287459B6; HK1050535A1; EE05091B1; CY1112274T1; YU29802A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká oligosacharidů obecného vzorce I

jejich směsí, jejich diastereoizomerů, způsobu jejich přípravy a farmaceutických kompozic, které tyto oligosacharidy obsahují.

Dosavadní stav techniky

Sulfátované disacharidy mající na redukčním konci

I, β-anhydro-strukturu byly popsané H.P.Wessel-em v

J. Carbohydrate Chemistry, 11(8), 1039-1052 (1992), přičemž v této publikaci nebyla pro tyto sloučeniny popsána žádná farmakologická účinnost.

Sulfátované trisacharidy obsahující opakující se strukturní jednotku 1,6-anhydro byly rovněž popsané v patentu EP 84 999 a autory Y.Ichikawa a kol. v • ·

Carbohydr.Res,141,273-282 (1985) jako meziprodukty pro přípravu vyšších oligosacharidů. Tyto trisacharidy mají slabou účinnost anti-Xa.

Ve výše uvedeném obecném vzorci I n znamená celé číslo 0 až 25, R_x, R₃, R₄ a R₅, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M, R₂ a R₆, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M nebo skupinu COCH₃ a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík.

Tyto oligosacharidy takto obsahují sudý počet sacharidů.

V obecném vzorci I R₄ výhodně znamená atom vodíku.

V obecném vzorci I n výhodně znamená celé číslo 0 až 10, zejména 0 až 6 a obzvláště 1 až 6.

Oligosacharidy obecného vzorce I mohou být připravené působením hydoxidu alkalického kovu nebo kvartérního amoniumhydroxidu na oligosacharidy obecného vzorce II

(II) ve kterém které jsou n znamená celé číslo 0 až 25, R_x, R₃, stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo

R₄ a R_r, • · • · ·

skupinu SO₃M, R₂ a R₆, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M nebo skupinu COCH₃a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík nebo jejich směs.

Tato reakce se provádí ve vodném prostředí při teplotě 40 až 80 °C a hodnotě pH 10 až 13.

Jako použitelný hydroxid alkalického kovu lze uvést, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid litný a hydroxid česný.

Jako použitelný kvartérní amoniumhydroxid lze uvést tetrabutylamoniumhydroxid.

Množství hydroxidu alkalického kovu nebo kvartérního amoniumhydroxidu musí být dostatečné k tomu, aby hodnota pH reakční směsi zůstala stejná v průběhu celé doby trvání reakce. Takto je tedy nezbytné v průběhu reakce kontinuálně přidávat hydroxid alkalického kovu nebo kvartérní amoniumhydroxid.

Výhodně je hydroxid alkalického kovu nebo kvartérní amoniumhydroxid ve formě 1 až 5% vodného roztoku.

Výhodně se reakce provádí při teplotě 60 až 70 °C.

Výhodně hodnota pH reakční směsi činí 11 až 12,5.

• « • · e · <

• · · « • · *·· ·

Reakce se přeruší okyselením reakční směsi, například přidáním kyselé pryskyřice, jakou je například pryskyřice Amberlite IR120^R (Fluka).

Oligosacharidy obecného vzorce I mohou být případně přečištěny permeační gelovou chromatografii za použití gelu polyakrylamid-agarosového typu, jakým je komerčně dostupný gel Ultrogel ACA202 (Biosepra), prováděnou postupem, který je dále popsán pro separaci meziproduktových oligosacharidů obecného vzorce II. Oligosacharidy obecného vzorce I, ve kterém n znamená 0 nebo 1, mohou být také případně přečištěny na sloupci aluminy za použití eluční soustavy tvořené směsí vody a ethanolu.

Meziproduktové oligosacharidy obecného vzorce II a jejich směsi mohou být získány chromatografickou separací na gelu směsi oligosacharidů III získanou enzymatickou depolymerací heparinu nebo bázickou depolymerací benzylesteru heparinu nebo polosyntetického benzylesteru heparinu.

Tato chromatografie se provádí v kolonách naplněných gelem polyakrylamid-agarosového typu, jakým je například gel, který je komerčně dostupný pod obchodním označením Ultrogel ACA202 (Biosepra). Výhodně se použije baterie kolon naplněných polyakrylamid-agarosovým gelem. Počet použitých kolon je závislý na objemu, samotném gelu a na oligosacharidech, které mají být rozděleny. Směs se eluuje roztokem obsahujícím fosfátový pufr a chlorid sodný. Výhodně je roztokem fosfátového pufru roztok obsahující 0,02 mol/1 NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7) a 0,1 mol/1 chloridu sodného. Detekce jednotlivých frakcí se provádí za použití ultrafialové (254 nm) a iontové (IBF) spektrometrie. Takto ·· • · to to to · · ·· • ··· to · · ··♦· ♦ · · • · · · · · · ··· ·· ·· · * získané frakce mohou být potom případně přečištěny například chromatografii SAX (strong anion exchange) postupy, které jsou pro odborníky známé, a zejména postupy popsanými K.G.Rice-m a R.J.Linhardt-em v Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989), A.Larnkjaer-em, S.H.Hansen-em a P.B.Ostergaard-em v Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995) a v patentovém dokumentu W090/01501 (příklad 2) . Tyto frakce se potom lyofilizují a potom odsolí na koloně naplněné gelem, jakou je například kolona s gelem Sephadex G10 (Pharmacia Biochemicals).

V případě, že se přečištění neprovádí chromatografii SAX, mohou býr lyofilizáty případně přečištěny jednoduchým nebo frakčním vysrážením prováděným postupy, které jsou odborníkům známé, zejména postupem popsaným ve francouzském patentu FR 2 548 672. Obecně se pracuje následujícím způsobem.

Lyofilizovaná frakce určená k přečištění se rozpustí při teplotě asi 25 °C v asi deseti objemech destilované vody. Přídavkem methanolu nebo ethanolu se vysráží požadovaný oligosacharid, přičemž se kontroluje jeho čistota vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii (CLHP, Chromatographie Liquide Haute Performance). Přídavek methanolu nebo ethanolu se určí v závislosti na požadované čistotě a výtěžku uvedeného oligosacharidu. Stejně tak může být tato operace provedena v několika následných stupních, přičemž se vychází z původního roztoku lyofilizátu. Za tím účelem se přidává nesolubilizující činidlo (methanol nebo ethanol) v malých dávkách a po každém přídavku uvedeného činidla se izoluje získaná sraženina. Takto získané sraženiny se analyzují vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii. Podle požadované čistoty a požadovaného

výtěžku se sloučí pouze ty frakce sraženiny, které uvedenou požadovanou čistotu a požadovaný výtěžek zaručují.

V případě meziproduktů obecného vzorce II, ve kterém n = 0, 1 nebo 2 je výhodné vycházet ze směsi III získané enzymatickou depolymerací.

\

Tato enzymatická depolymerace se prování za použití heparinu I (EC 4.2.2.7) v prostředí roztoku fosfátového pufru s pH 7 v přítomnosti chloridu sodného a bovinního sérového albuminu (BSA) při teplotě mezi 10 a 18 °C, výhodně při teplotě 15 °C, po dobu 8 až 10 dnů, výhodně po dobu 9 dnů. Tato depolymerace se přeruší například zahřátím reakčni směsi na teplotu 100 °C po dobu 2 minut, načež se směs zpracuje lyofilizací. Je výhodné použít 7 UI heparinázy I na 25 g heparinu. Roztok fosfátového pufru obecně obsahuje 0,05 mol/l NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7) v přítomnosti 0,1 mol/l chloridu sodného. Koncentrace bovinního sérového albuminu obecně činí 2 %.

Pokud jde o meziprodukty obecného vzorce II, ve kterém n = 0, 1, 2, 3 nebo 4, je výhodné vycházet ze směsi III získané depolymerací benzylesteru heparinu.·

Benzylester heparinu může být připraven postupy popsanými v patentových dokumentech US 5 389 618, EP 40 144 a FR 2 548672. Stupeň esterifikace bude výhodně činit 50 až 100 %. Výhodně se bude míra esterifikace pohybovat v rozmezí od 70 do 90 %.

·· ··

• · · · • »· 0···

Uvedená depolymerace se provede ve vodném prostředí pomocí hydroxidu alkalického kovu (například hydroxid lithný, hydroxid sodný, hydroxid draselný nebo hydroxid česný) nebo kvartérního amoniumhydroxidu (například tetrabutylamoniumhydroxid), výhodně při molaritě 0,1 až 0,2 mol/1, při teplotě 40 až 80 °C a po dobu 5 až 120 minut. V rámci výhodného provedení se pracuje po dobu 5 až 15 minut, při teplotě 60 až 7 0 °C a za použití roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,15 mol/1. Depolymerační reakce se přeruší neutralizací přidáním kyseliny, jakou je například kyselina octová. Po přidání 10 % hmotn./obj. octanu sodného se směs oligosacharidů vysráží přidáním methanolu, výhodně 2 objemu methanolu na 1 objem reakční směsi, a zfiltruje.

V rámci výhodného provedení vynálezu se směs oligosacharidů, získaná po chemické depolymeraci ve formě vodného roztoku, obohatí ultrafiltrací na membránách s příslušným nominálním separačním prahem (typ Pellicon z regenerované celulózy komerčně dostupný u společnosti Millipore), přičemž typ membrány je zvolen v závislosti na typu obohaceného oligosacharidů, který má být izolován. V případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, se použije membrána s nominálním separačním prahem rovným 1 kDa, v případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 1, se použije membrána se separačním prahem 1 kDa nebo 3 kD, v případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 2, se použije membrána se separačním prahem 3 kDa, a v případě oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 3 nebo 4, se použije membrána se separačním prahem 5 kDa. V průběhu této operace se permeát zachová, zatímco zadržený podíl se považuje za odpad. Takto frakce obohaceného produktu může představovat 50 až 10 % výchozí směsi oligosacharidů, přičemž se zachová alespoň 80 % požadovaného oligosacharidů.

* • · ♦ ·

V případě meziproduktů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0 až 25, je výhodné vycházet ze směsi III získané depolymerací benzylesteru polosyntetického sulfátovaného polysacharidu. Uvedený benzylester polosyntetického sulfátovaného polysacharidu se připraví z polosyntetických sulfátovaných polysacharidu získaných z polysacharidu K5 postupy popsanými v patentových dokumentech WO94/29352 a WO96/14425. Esterifikační, depolymerační a izolační podmínky jsou stejné jako podmínky popsané výše pro benzylester heparinu.

Ve všech výše uvedených postupech může být výchozí heparin vepřového, ovčího, kozího nebo bovinního (hovězího) původu a může pocházet z hlenu, plic nebo kůže zvířat. Výhodně se použije heparin z vepřového nebo ovčího hlenu nebo z hovězích plic a výhodněji heparin z vepřového hlenu.

Oligosacharidy obecného vzorce I mají protizánětové vlastnosti a mohou být takto použity pro prevenci nebo léčení onemocnění spojených se zánětovými procesy zahrnujícími produkci cytotoxických látek, jakou je například oxid dusnatý (NO), jehož indukovatelná forma je uvolňována zejména neutrofily nebo makrofágy v případě, že migrují a jsou aktivovány v úrovni tkáně. Aktivace, migrace, adheze a infiltrace neutrofilů probíhá v úrovni tkáňových zón ischemizovaných následkem okluze nebo spasmu vaskularizující tepny uvedené tkáně. K těmto ischemiím může docházet buď v cerebrální úrovni (vaskulámí mozková příhoda), nebo v úrovni myokardu (infarkt myokardu) anebo v úrovni dolních okončetin (tak zvané periferní ischemie).

Oligosacharidy obecného vzorce I mohou být takto použity pro prevenci nebo/a léčení neurodegenerativních onemocnění, u kterých cerebrální zánět hraje zhoubnou roli vedoucí případně ke smrti, přičemž z těchto onemocnění lze uvést cerebrální ischemie, srdeční ischemie (infarkt myokardu), periferní ischemie, poranění centrální nervové soustavy a zejména poranění lebky, páteře nebo kombinovaná poranění lebky a páteře, roztroušená skleróza, neuropatické bolesti a periferní neuropatie, nemoci motoneuronu a z nich zejména amyotrofní laterální skleróza, neuro-AIDS, Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a Huntingtonova chorea a některé formy osteoartritid, zejména v úrovni kloubů.

Protizánětová účinnost uvedených produktů je demonstrována in vivo v rámci testu produkce Ν0_χ (dusitan a dusičnan) indukované lipopolysacharidem (LPS) pocházejícím z Escherichia Coli, přičemž tento test se provádí podle protokolu popsaného autory M.Yamashita a kol. v Eur.J.Pharmacol.,338, 2, 151-158 (1997) nebo autory J.E.Shellito a kol. v Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,13,1,45-53 (1995) .

Myším samečkům CD1 (Charles River) s tělesnou hmotností mezi 25 a 35 g se v čase TO intravenozně injikuje bolus 0,5 mg/kg oligosacharidu, načež se jim v čase T+15 minut subkutánně injikuje 1 nebo 2 mg/kg oligosacharidu. V čase T+30 minut se jim podá 100 mg/kg lipopolysacharidu (LPS) pocházejícího z Escherichia Coli (Sigma L3129, serotyp 0127:B8). V čase T+3 hodiny se pokusným zvířatům opětovně subkutánně injikuje 1 nebo 2 mg/kg oligosacharidu. V čase T+5 hodin a 30 minut se pokusným zvířatům oční punkcí odebere vzorek krve a v plasmě krevního vzorku se stanoví koncentrace ΝΟ_χ (dusitan a dusičnan) Griessovou kolorimetrickou metodou po redukci dusičnanu na dusitan nitrát-reduktázou za použití následujícího postupu: 12 • 9 9

99 • 9

9 9 • · 9 9

9

9999 mikrolitru vzorku plazmy se smísí s 88 mikrolitry deionizované vody a získaná směs se inkubuje za tmy po dobu jedné hodiny při okolní teplotě v přítomnosti 40 mikrolitru fosfátového pufru (0,31M, pH 7,5), 20 mikrolitrů beta-NADPH (redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát) (0,86 mM) , 20 mikrolitrů FDA (flavinadenindinukleotid) (0,11 mM) a 20 mikrolitrů nitrát-reduktázy (2U/ml) (Boehringer Mannhein). Ke směsi se potom přidá 10 mikrolitrů ZnSO₄ (IM) za účelem vysrážení proteinů a po promíchání se vzorky odstředí při 20000g po dobu 5 minut. Nakonec se 50 mikrolitrů supernatantu inkubuje po dobu 10 minut při okolní teplotě v přítomnosti 100 mikrolitru Griessova reakčního činidla (1% sulfanilamid ve 0,1% směsi kyseliny fosforečné a naftylethylendiaminu v deionizované vodě (obj./obj.)). Odečítají se optické hustoty při 540 nm za použití mikrodeskového spektrofotometru. Každá hodnota se stanovuje dvakrát. Jako standard pro kolorimetrickou metodu se použijí KNO₃ a NaNO₂.

Při tomto testu oligosacharidy podle vynálezu inhibují více než 50 % tvorby Ν0_χ.

Jakožto výhodné oligosacharidy obecného vzorce I lze zejména uvést oligosacharidy obecného vzorce I, ve kterém:

n je rovno 0,

R_x a R₆ znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík a směs jeho diastereoisomerů; n je rovno 1,

R_x, R₂, R₃, R₅ a Rg znamenají skupinu SO₃Na,

R₄ znamená atom vodíku a

M znamená sodík a směs jeho diastereoisomerů;

to toto·· * to ····

n je rovno 2,

R_lZ R₂, R₃, R₅, R₆ znamenají skupinu SO₃Na,

R₄ znamená atom vodíku a

M znamená sodík a směs jeho diastereoisomerů;

n je rovno 2,

R , R₂, R₃, R_g znamenají skupinu SO₃Na,

R₅ znamená atom vodíku nebo skupinu SO₃Na,

R₄ znamená atom vodíku a

M znamená sodík a směs jeho diastereoisomerů (derivát 1,6 anhydro Als-Is-IIs).

Následující příklady ilustrují přípravu oligosacharidů obecného vzorce I a příslušných meziproduktů.

V těchto příkladech máji následující zratky tyto významy:

ÁIs:(kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-enopyranosyluronová) - (l-»4) -2-deoxy-2-sulfonamino-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosa, čtyřsodná sůl nebo také ÁUAp2S-(1—>4) -a-D-GlcNp2S6S;

Is: (kyselina 2-suldfo-a-L-idopyranosyluronová)-(l-»4)-2deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosa, čtyřsodná sůl nebo také a-L-IdoAp2S- (l-»4) -a-D-GlcNp2S6S;

lis: (kyselina a-L-idopyranosyluronová) - (1—>4) -2-deoxy-2-sulfoamido-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosa, troj sodná sůl nebo také α-L-IdoAp- (l->4) -a-D-GlcNp2S6S;

• ··

IIIs: (kyselina 2-sulfo-a-L-idopyranosyluronová-(l->4) -2deoxy-2-sulfoamino-a-D-glukopyranosa, troj sodná sůl nebo také a-L-IdoAp2S-(1—»4) —a-D-GlcNp2S;

IdoAp: kyselina isopyranosyluronová;

GlcNp: 2-deoxy-2-aminoglukopyranosa;

ÁUap: kyselina 4-deoxy-a-L-threo-hex-enopyranosyluronová;

S: sulfát.

Příklady provedení vynálezu

Příklad A

Příprava oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0,1 a 2 enzymatickou depolymerací a separací.

g heparinu se rozpustí ve 250 ml roztoku fosfátového pufru obsahujícího 0,05 mol/1 NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH = 7) , 0,2 mol/1 chloridu sodného a 2 % bovinního sérového albuminu. Do této směsi se zavede 7 UI heparinázy I (EC 4.2.2.2.7) a získaný roztok se ochladí na teplotu 15 °C a potom se udržuje na této teplotě v průběhu celé depolymerační reakce. Průběh této reakce se sleduje odebíráním alikvotních vzorků reakční směsi a jejich permeační gelovou analýzou. Po devíti dnech se enzymatická reakce přeruší zahříváním reakční směsi na teplotu 100 °C po dobu dvou minut. Ochlazená reakční směs se potom lyofilizuje. Takto se získá směs oligosacharidů III.

Získaná směs oligosacharidů III se potom chromatografuje následujícím postupem.

Chromatografie se provádí polyakrylamid-agarosovým gelem označením Ultrogel ACA 202 a v kolonách známým pod uvedená směs »« » *· ·· > ·» » ·» · » · · · » · · > · ···» » · · · » ♦ · « · ·

.. · ·· ···· naplněných obchodním se eluuje roztokem obsahujícím fosfátový pufr (0,02 mol/1

NaH₂PO₄/Na₂HPO₄) s pH = 7 a 0,1 mol/1 chloridu sodného.

Detekce se provádí ultrafialovou (254 nm) a iontovou (IBF) spektrometrií. Získané produkty mohou být případně přečištěny chromatografií SAX (strong anion exchange) nebo frakčním srážením provedeným postupem popsaným v patentovém dokumentu FR 2 548 672. Izolované produktové frakce se lyofilizují a potom odsolí v koloně naplněné gelem Sephadex R

G10 (Pharmacia Biochemicals).

Uvedeným postupem se získají 3 g disacharidu Is, 1100 mg směsi hexasacharidu typicky obsahující 55 % derivátu

ÁIs-Is-IIs a 10 % ÁIs-Is-IIIs. Tato posledně uvedená směs může být buď přečištěna postupy, které jsou odborníkům známé, za účelem rozdělení všech složek směsi nebo použita jako taková pro převedení na 1,6-anhydro-derivát obecného vzorce I. Je třeba poznamenat, že v průběhu tohoto převedení hexasacharid Als-Is-IIIs nemůže vést k tvorbě sloučenin obecného vzorce I.

Příklad B

Příprava oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n znamená 0, 1, 2, 3 nebo 4 depolymerací benzylesteru heparinu a separací

a) Příprava benzylesteru heparinu

Benzylester heparinu se připraví postupem popsaným v příkladu 3 patentu US 5,389,618.

··· ·

b) Depolymerace

100 g benzylesteru heparinu se rozpustí v 1,9 1 demineralizované vody. Směs se zahřeje za míchání na teplotu 60 °C. Po získání homogenního roztoku se do tohoto roztoku zavede najednou asi 35 ml 23% roztoku hydroxidu sodného. Po 10 minutách se roztok ochladí a neutralizuje 80 ml asi 2N roztoku kyseliny octové. K tomuto roztoku se přidá 10 % (hmotn./obj.) octanu sodného. Směs oligosacharidů se vysráží přidáním asi 2 objemů methanolu. Sraženina se izoluje filtrací, dvakrát promyje methanolem a potom vysuší za sníženého tlaku při teplotě 50 °C. Po vysušení se získá 73,8 g směsi oligosacharidů II.

c) Obohacení oligosacharidem, ve kterém η - 1 g výše uvedeným způsobem získané směsi oligosacharidů se rozpustí v asi 35 objemech vody. Tento roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu 3 kDa (Pellicon). Když se odtáhne 600 ml permeátu, tento permeát se zředí 500 ml vody. V operaci se pokračuje až do okamžiku, kdy se odtáhne dalších 450 ml dodatečného permeátu. Obě frakce permeátu se sloučí a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku. Získá se 6,1 g nažloutle bílého produktu. Analýza tohoto pevného produktu provedená permeační gelovou chromatografii ukazuje, že tento produkt obsahuje asi 30 % oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 1.

d) Frakcionace směsí oligosacharidů podrobených ultrafiltraci • ♦· ·· í ·· « · · ·» · ··» »··* · • ·» ·♦·*··· • · · ♦ · · ·· ♦ ·* ·· · • · »» »··«

Obohacená směs se frakcionuje v kolonách naplněných polyakrylamid-agarosovým gelem, který je znám pod označením Ultrogel ACA 202 (použijí se čtyři kolony v sérii, přičemž průměr kolon činí 10 cm a výška kolon činí 50 cm) . 5 g směsi obohacené ultrafiltrací se rozpustí ve 25 ml vody a eluuje roztokem chloridu sodného o koncentraci 0,2 mol/1 při průtoku 5 ml/min. Na spodku kolony se jímají 25 ml frakce eluátu. Detekce produktů se provede ultrafialovou (254 nm) a iontovou (IBF) spektrometrií. Frakce produktu, pro který η = 1 se izolují, lyofilizují a potom odsolí v koloně naplněné gelem Sephadex G10. Po lyofilizaci se získá g tetrasacharidu obsahujícího typicky 70 % derivátu

Als-Is vzorce II (R_x, R₂, R₃, R₅, R_g = SO₃Na a M = Na) . Tento derivát Als-Is může být případně přečištěn chromatografií SAX (strong anion exchange) nebo výhodně frakčním srážením provedeným postupem popsaným v patentu FR

548 672.

Příklad 1

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 5 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0063 mol/1. Hodnota pH roztoku se potom změří a stanoví jako cílová hodnota (pH = 11,35). Za míchání se najednou přidá 30 mg oligosacharidů vzorce II, ve kterém n je rovno 0, R_x a R_gznamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se potom reguluje a udržuje na hodnotě pH = 11,35 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/1. Po deseti hodinách se přeruší přidávání hydroxidu sodného a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se potom nastaví na hodnotu mezi 6 a 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR120. Směs se zfiltruje přes membránu Whatman GF/B a potom zahustí za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě blízké 25 °C. Produkt se vyjme 0,5 ml destilované vody a potom lyofilizuje. Takto se získá 29 mg směsi diastereoisomerů oligosacharidu vzorce I, ve kterém n je rovno 0, a R_g znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík [ kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluronová- (1—>4) -1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfoamino-β-Όmannopyranóza, troj sodná sůl, protonové spektrum (D₂O, 400 MHz, T=298K,delta v ppm):

3,15 (lH,s,H2),

3,75(2H,m,H6 a H3),

3,88 (lH,m,H4),

4,20(lH,d,J=8Hz,H6),

4,22(1H,t,J=5Hz,H3'),

4,58 (lH,m,H2^z),

4,75(lH,m,H5),

5,53 (1H,S,H1),

5,60(1H,dd,J=6 a ΙΗζ,ΗΙ'),

6,03(1H, d, J=5Hz,H4');

kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluronová- (l-»4) -1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfoamido-p-D-glukopyranóza, trojsodná sůl, protonové spektrum (D₂O, 400 MHz, T=298K,delta v ppm):

3,34 (lH,dd,J=7 a 2Hz,H2),

3,72 (1H,t,J=8Hz,H6),

3,90(lH,m,H3),

4,03(lH,s,H4),

4,20(lH,d,J=8Hz,H6),

4,23(1H,t,J=5Hz,H3'),

4,58(lH,m,H2^z),

4,78(lH,m,H5),

5,50 (1H,s,H1),

5,60(1H,dd,J=6 a ΙΗζ,ΗΙ'),

6,03 (1H, d, J=5Hz, H4'] .

Příklad 2

Do reaktoru udržovaného na teplotě 62 °C se zavede 33,3 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0063 mol/1. Hodnota pH roztoku se změří a stanoví se jako cílová hodnota (pH = 11,15). Za míchání se přidá najednou 200 mg oligosacharidů vzorce II, ve kterém n je rovno 1, R_lZ R₂, R , R₅ a R₆ znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na hodnotě 11,15 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/1. Po 12 hodinách se přeruší přidávání hydroxidu sodného a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se nastaví na hodnotu mezi 6 a 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR120. Směs se zfiltruje přes membránu Whatman GF/B a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě blízké 25 °C. Produkt se vyjme 3 ml destilované vody a potom lyofilizuje. Takto se získá 230 mg oligosacharidů vzorce I, ve kterém n je rovno 1, R_x, R₂, R₃, R₅ a R_g znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík, ve formě směsi diastereomerů [ kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluronová- (l->4) -2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl- (l-»4) -kyselina 2-O-sulfo-α-L-isopyranosyluronová- (1—>4) -1, 6-anhydro-2-deoxy-2-sulfo amino-p-D-mannopyranóza, heptasodná sůl:

protonové spektrum (D₂O, 4 00 MHz, T=298K,delta v ppm) :

3,15 (1H,S,H2),

3,25 (lH,m,H2),

3,60 (lH,m,H3), mezi 3,70 a 4,70 (14H,blok,H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5',H4fH5/H6, H2'/H3'),

4,75(lH,m,H5), mezi 5,20 a 5,40(2H,m,H1' a Hl” ) ,

5,45 (lH,m,Hl^z ) ,

5,56 (lH,m,Hl),

5, 94(lH,d,J=5Hz,H4), ·· • · • · ··· • ft· • · ft • · • ftft • ···· • · ·· • ft · • ft ft « • · • ftft · kyselina-4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluron ová- (l->4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl- (1—>4)-kyselina-2-O-sulfo-a-L-isopyranosyluronová-(l->4 )-1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfoamido-3~D-glukopyranóza, heptasodná sůl, protonové spektrum (D₂0, 400 MHz, T=298K,delta v ppm):

3,25(lH,m,H2),

3,42(lH,dd,J=4 a lHz,H2),

3,60(lH,m,H3 ), mezi 3,70 a 4,70(14H,blok,H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5',H4 /H5/H6, H2 ' ' '/H3' ' ') ,

4,75(lH,m,H5, mezi 5,20 a 5,40(2H,m,Hl' a Hl ) ,

5,45 (lH,m,Hl') ,

5,52(lH,m,Hl),

5,94(lH,d,J=5Hz,H4)] .

Příklad 3

Do reaktoru udržovaného na teplotě 62 °C se zavede 16,7 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0063 mol/l. Změří se hodnota pH roztoku a tato hodnota se stanoví jako cílová hodnota pH (pH = 11,7). Za míchání se přidá najednou 100 mg oligosacharidu vzorce II, ve kterém n je rovno 2, R_x, R₂, R₃, R₅ a Rg znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na hodnotě 11,7 komtinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/l. Po 10 hodinách se přeruší přidávání hydroxidu sodného a reakčni směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se potom nastaví na hodnotu mezi 6 a 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR120. Směs se zfiltruje přes membránu Whatman GF/B, načež se zahustí k suchu za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě • · • · » · ·

Β · · • · · · · ·

blízké 25 °C. Produkt se vyjme 3 ml destilované vody a potom lyofilizuje. Takto se získá 108 mg oligosacharidu obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 2, R_x, R₂, R₃, R₅ a R_g znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík, ve formě směsi diastereoizomerů; jako A až F se označují konstituční cukry hexasacharidů, přičemž A znamená zbytek 1,6-anhydro a F znamená zbytek nenasycené kyseliny uronové [ kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluronová- (1—>4) -2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulf o-a-D-glukopyranosyl- (1-+4) -kyselina 2-O-sulfo-a-L-idopyranosyluronová- (1—>4) -2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl- (1—>4) -kyselina 2-O-sulfo-a-L-isopyranosyluronová- (1-+4) -1,6-anhydro-2-deoxy-2-sulfoamino-3-D-mannopyranóza, undekasodná sůl, protonové spektrum (D₂O, 600 MHz, T=298K,delta v ppm):

3,15(1H,S,H2(A)),

3,25(2H,m,H2(C+E)),

3.60 (2H,m,H3(C+E)), mezi 3,65 a 4,50 (19H,blok,H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+

E)/H5(C+E)/H6(A+C+E)),

4.60 (1H,s,H2(F),

4,80 (3H,m,H5(A+B+D) ,

5,18 (1H,S,H1(D)) ,

5,30(1H,s,Hl(B)),

5,34(lH,d,Hl(C)),

5,36(lH,d,Hl(E)),

5, 46(1H, s,H1(F)),

5,57 (1H,S,H1(A)),

5,95 (lH,d,J=5Hz,H4(F)) ;

kyselina

4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluronová- (1-+4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl(l->4) -kyselina 2-O-sulfo-a-L-isopyranosyluronová- (1-+4) -2deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl-(1-+4) -kyselina 2-O-sulfo-a-L-idopyranosyluronová- (1-+4) -1, 6-anhy20 • ·· ·· · ·· ·· ···· · · · · · · · ··· · · · · · · · • ··· · · · ···· · · · · ····· ·· · ······ dro-2-deoxy-2-sulfoamino-p-D-glukopyranóza, udekansodná sůl, protonové spektrum (D₂O, 600 MHz, T=298K,delta v ppm) :

3,25(2H,m,H2(C+E)),

3,42(lH,m,H2(A)),

3,60(2H,mH3(C+E)), mezi 3,65 a 4,50(19H,blok,H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+

Ε) /H5(C+E)/H6(A+C+E)),

4,60(lH,s,H2(F)),

4,80(3H,m,H5(A+B+D),

5,18(1H,S,H1(D)),

5,31(1H,S,H1(B)),

5,34(lH,d,Hl(C)),

5,36 (lH,d,Hl(E)),

5,46(lH,s,Hl(F)),

5,52(1H,S,H1(A)),

5,95(lH,d,J=5Hz,H4(F))] .

Příklad 4

Do reaktoru udržovaného na teplotě 62 °C se zavedou 4 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,0316 mol/1. Změří se hodnota roztoku a tato hodnota se stanoví jako cílová hodnota pH (pH = 11,8). Za míchání se najednou přidá

100,8 mg směsi oligosacharidů vzorce II, ve kterém n je rovno 2, obsahující 55 % derivátu Als-Is-Is (R_x, R₂, R₃, R₅a R₆ znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík) , 35 % derivátu Als-Is-IIs (R₁, R₂, R₃ a R_g znamenají skupinu SO₃Na, R₅ znamená buď skupinu SO₃Na nebo atom kyslíku, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík) a 10 % derivátu ÁIs-Is-IIIs (Η_χ, R₂, R₃, R₅ a R_g znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík, přičemž skupina SO₃M uhlíku C6 je nahrazena atomem vodíku).

• · • · • 444 · · · ···· ··· · 4 · 4 · · 4 • 444·· 4 4 · · 4 · 4 · 4 4 · 4 4 4 ···

444 ·4 44 4 ·· 4444

Hodnota ρΗ se kontroluje a udržuje na hodnotě 11,8 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,5 mol/1. Po 11 hodinách se přeruší přidávání hydroxidu sodného a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Hodnota pH roztoku se nastaví na 6 až 7 přidáním pryskyřice Amberlite IR120. Směs se zfiltruje přes membránu Whatman GF/B a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě blízké 25 °C. Produkt se vyjme 1,5 ml destilované vody a potom lyofilizuje. Takto se získá 110 mg směsi oligosacharidů obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 2, obsahující zejména derivát 1,6-anhydro-Als-Is-Is (R_x, R₂, R₃, R₅ a Rg znamenají skupinu SO₃Na, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík) a derivát 1,6-anhydro-Als-Is-IIs (R_x, R₂, R₃ a Rg znamenají skupinu SO₃Na, R_$ znamená buď skupinu SO₃Na nebo atom vodíku, R₄ znamená atom vodíku a M znamená sodík). Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií v modu iontových párů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I. V tomto případě vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že proběhla transformace v případě derivátů Als-Is-Is, Als-Is-IIs.

Příklad 5

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,6 ml roztoku hydroxidu lithného o koncentraci 0,025 mol/1. změří se hodnota pH a tato se stanoví jako cílová hodnota (pH - 11,68). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, R_x a Rg znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 11,68 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu lithného o koncentraci 0,466 mol/1. Po 8 hodinách se přidávání roztoku hydroxidu lithného přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená • ···«· ······· · · • · · · · ··· ····· · · · ·«···· vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií v modu párových iontů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 0, R_x a R_g znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík nebo lithium. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že uvedená transformace proběhla na 100 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 81,2 %.

Příklad 6

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,3 ml roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,0063 mol/1. změří se hodnota pH a tato se stanoví jako cílová hodnota (pH = 11,1). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidu obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, R_x a R_g znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 11,1 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,515 mol/1. Po 24 hodinách se přidávání roztoku hydroxidu draselného přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii v modu párových iontů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 0, R_x a R_gznamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík nebo draslík. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že uvedená transformace proběhla na 100 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 75,6 %.

Příklad 7

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,3 ml roztoku hydroxidu česného o koncentraci 0,0063 mol/1.

• ·· ··· ·· ·· • · · « ··· · · · · • · · · · · · · · · • ··· · · · ···· · · · · • · · · · · · · ····· «· « ······ změří se hodnota pH a tato se stanoví jako cílová hodnota (pH = 10,75). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0,

R_x a R_g znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 10,75 kontinuálním přidáváním roztoku hydroxidu česného o koncentraci 0,476 mol/1. Po 20 hodinách se přidávání roztoku hydroxidu česného přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii v modu párových iontů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 0, R_x a R_g znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík nebo cesium. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že uvedená transformace proběhla na 90,3 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 73 %.

Příklad 8

Do reaktoru udržovaného na teplotě 66 °C se zavede 8,3 ml roztoku tetrabutylamoniumhydroxidu o koncentraci 0,0063 mol/1. změří se hodnota pH a tato se stanoví jako cílová hodnota (pH = 10,95). Za míchání se potom najednou přidá 50 mg oligosacharidů obecného vzorce II, ve kterém n je rovno 0, R_x a R₆ znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík. Hodnota pH se kontroluje a udržuje na 10,95 kontinuálním přidáváním roztoku tetrabutylamoniumhydroxidu o koncentraci 0,521 mol/1. Po 16 hodinách se přidávání roztoku tetrabutylamoniumhydroxidu přeruší a reakční směs se ochladí na teplotu 25 °C. Analýza provedená vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii v modu párových iontů umožňuje sledovat transformaci na derivát obecného vzorce I, ve kterém n je rovno 0, a R_g znamenají skupinu SO₃Na a M znamená sodík nebo tetrabutylamonium. V tomto případě, vysoce výkonná kapalinová chromatografie ukazuje, že • · • · • · · · ···· • · · · · ·· · ····· ······· · · • · · · · · · ·· · · · ······ uvedená transformace proběhla na 96,7 %. Výtěžek stanovený za použití vnějšího standardu činí 65 %.

Léčiva podle vynálezu obsahují jako účinnou látku alespoň jeden oligosacharid obecného vzorce I nebo směs oligosacharidu obecného vzorce I ve formě kompozice, ve které jsou uvedený oligosacharid nebo uvedená směs oligosacharidu obsaženy v kombinaci s libovolným jiným farmaceuticky kompatibilním produktem, který může být inertní nebo fyziologicky účinný. Léčiva podle vynálezu mohou být aplikována intravenózním, subkutánním, orálním, rektálním, topickým nebo inhalačním podáním.

Sterilními kompozicemi pro intravenózní nebo subkutánní podání jsou obecně vodné roztoky. Tyto kompozice mohou rovněž obsahovat přísady, zejména smáčecí činidla, izotonizující činidla, emulgační činidla, dispergační činidla a stabilizační činidla. Sterilizace kompozic může být provedena několika způsoby, například sterilizující filtrací, ozářením nebo přidáním sterilizačních činidel ke kompozici. Uvedené kompozice mophou být rovněž připraveny ve formě pevných kompozic, které mohou být rozpuštěny bezprostředně před použitím ve sterilní vodě nebo v libovolném jiném sterilním injikovatelném prostředí.

Jako pevné kompozice pro orální podání mohou být použity tablety, pilulky, prášky (želatinové kapsle, sáčky) nebo granule. V těchto kompozicích je účinná látka smíšena pod proudem argonu s jedním nebo několika inertními ředidly, jakým jsou škrob, celulóza, sacharóza, laktóza nebo silika. Tyto kompozice mohou rovněž obsahovat látky jiné než ředidla, a to například jedno nebo několiv maziv, jakými jsou zejména stearát hořečnatý nebo talek, činidlo • ·

• · · · • · · · · · · podporující orální absorpci, barvivo, zapouzdřovací materiál (dražé) nebo lak.

Jako kapalné kompozice pro orální podání mohou být použity farmaceuticky přijatelné roztoky, suspenze, emulze, sirupy a elixíry obsahující inertní ředidla, jakými jsou zejména voda, ethanol, glycerol, rostlinné oleje nebo parafinový olej. Tyto kompozice mohou obsahovat i jiné látky než ředidla, a to například smáčedla, sladidla, zhutňovadla, aromatizační látky nebo stabilizátory.

Kompozicemi pro rektální podání jsou čípky nebo rektální kapsle, které vedle účinné látky obsahují pomocné látky, jakými jsou kakaové máslo, polosyntetické glyceridy nebo polyethylenglykoly.

Kompozicemi pro topické podání mohou být například krémy, lotiony, náplasti, kolutoria, nosní kapky nebo aerosoly.

Dávky účinných látek podle vynálezu závisí na požadovaném účinku, na době léčení a na zvoleném způsobu podání; tyto dávky se obecně pohybují mezi 0,5 a 10 mg na kilogram tělesné hmotnosti pacienta a den při subkutánním podání, t.j. 3 až 60 mg denně pro dospělého pacienta s tělesnou hmotností 60 kg.

Vhodné dávkování obecně stanoví ošetřující lékař v závislosti na věku, tělesné hmotnosti a ostatních individálních faktorech pacienta.

• ti

ti· titi ti · · · • ti ti • ti · ti • ti ti titi titititi

Vynález se rovněž týká způsobu prevence nebo léčení nemocí spojených se zánětlivým procesem zahrnujícím produkci cytotoxixkých látek, mezi které patří zejména oxid dusnatý (NO) . Oligosacharidy obecného vzorce I mohou být takto použity pro prevenci nebo/a léčení neurodegenerativních chorob, při kterých cerebrální zánět hraje zhoubnou úlohu, které mohou vést ke smrti a ze kterých lze uvést ischemie centrální nervové soustavy, mozkové ischemie, ischemie sítnice a kochlei, srdeční ischemie (infarkt myokardu), periferní ischemie, poruchy centrální nervové soustavy a zejména úrazy lebky, páteře a kombinované úrazy lebky a páteře, poškození sítnice a kochlei, roztroušenou sklerózu, neuropatické bolesti a periferní neuropathie, nemoci motoneuronu a z nich amyotrofní laterální sklerózu, neuro-AIDS, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntigtonovu choreu a některé formy osteoartritidy, zejména v úrovni kloubů.

• 9 9

9

99

9999

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Oligosacharidy obecného vzorce I ve kterém n znamená celé číslo 0 až 25, R_x, R₃, R₄ a R₅, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M, R₂ a R_g, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M nebo skupinu COCH₃a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík, směs těchto oligosacharidů a jejich diastereoizomery.
2. Oligosacharidy podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R₄ znamená atom vodíku, směs těchto oligosacharidů a jejich diastereoizomery.
3. Oligosacharidy podle některého z nároků 1 nebo 2,obecného vzorce I, ve kterém n znamená celé číslo 0 až 10, směs těchto oligosacharidů a jejich diastereoizomery.
4. Oligosacharidy podle některého z nároků 1 nebo 2 obecného vzorce I, ve kterém n znamená celé číslo 0 až 6, směs těchto oligosacharidů a jejich diastereoizomery.

• ·· 99 9 ·· *9

99 9 9 999 999·

999 99 9 9 9» 9

9 ·« « · 9 9999999 9 9

9 9999 999

99 9 99 99 9 99 9999
5. Oligosacharidy podle některého z nároků 1 nebo 2 obecného vzorce I, ve kterém n znamená celé číslo 1 až 6, směs těchto oligosacharidů a jejich diastereoizomery.
6. Způsob přípravy oligosacharidů obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačený tím, že se působí hydroxidem alkalického kovu nebo kvartérním amoniumhydroxidem na oligosacharidy obecného vzorce II (II)

R.

ve kterém n znamená celé číslo 0 až 25, R.

a R_c

1' 3' “4 “ ^ix5' které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M, R₂ a R_g, které jsou stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku nebo skupinu SO₃M nebo COCH₃ a M znamená sodík, vápník, hořčík nebo draslík, nebo na jejich směs, načež se získané oligosacharidy nebo jejich směsi izolují.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že se reakce provede ve vodném prostředí při teplotě 40 až 80 °C a hodnotě pH 10 až 13.
8. Způsob podle některého z nároků 6 nebo 7, vyznačený t i m, že se použije 1 až 5% vodný roztok hydroxidu alkalického kovu nebo kvartérního amoniumhydroxidu.

·· · * 4 ··

4 · • 4

4 ·4

4 4 4 4

4 · ·

4 4 4 4

4 4 4

44 4444
9. Způsob podle některého z nároků 6 až 8, vyznačený t i m, že se reakce provádí při teplotě 60 až 70 °C.
10. Způsob podle nároků 6 až 9, vyznačený tím, že reakční hodnota pH je rovna 11 až 12,5.
11. Způsob podle nároků 6 až 10, vyznačený tím, že hydroxidem alkalického kovu nebo kvartérním amoniumhydroxidem je hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lithný, hydroxid česný nebo tetrabutylamoniumhyhydroxid.
12. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden oligosacharid podle nároku 1.
13. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden oligosacharid podle některého z nároků 1 až 5.
14. Použití oligosacharidů obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 5 pro přípravu léčiva určeného pro prevenci nebo léčení nemocí spojených se zánětlivým procesem zahrnujícím produkci oxidu dusnatého (NO).
15. Použití oligosacharidů obecného vzorce I podle nároku 14 pro přípravu léčiva určeného pro prevenci a léčení cerebrálních, srdečních nebo vaskulárních periferních ischemií, osteoartritid, poranění centrální nervové a 99 »« 9 ·« 99

99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 999 · 9 9 99·· · 9 9 9 • * 9 9 9 99« •99 99 99 9 99 9999 soustavy, poranění lebky, poranění páteře a kombinovaného poranění lebky a páteře, roztroušené sklerózy, neuropatických bolestí, periferních neuropatií, nemocí motoneuronu, amyotrofní laterální sklerózy, neuro-AIDS, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby a Huntingtonovy chorei.