ES2238383T3

ES2238383T3 - Uso de heparina de bajo peso molecular para el tratamiento de la osteoartrosis.

Info

Publication number: ES2238383T3
Application number: ES01270336T
Authority: ES
Inventors: Christopher Kern; Christine Hoerber; Eckart Bartnik; Philipp Haus-Seuffert
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-12-16
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2021-12-05
Also published as: DE50105650D1; US20020128226A1; AU2002221935A1; CA2431709A1; EP1345612B1; EP1345612A1; AR031909A1; WO2002047696A1; PT1345612E; MXPA03004965A; ATE290874T1

Abstract

Uso de heparina de bajo peso molecular, con un peso molecular medio de aproximadamente 3000 hasta aproximadamente 10000, de la serie enoxaparina, nardroparina, dalteparina, certroparina, parnaparina, reviparina, ardeparina/RD, heparina/RDH o tinzaparina, o una mezcla de éstas, para la preparación de medicamentos para la profilaxiis y tratamiento de enfermedades, a cuyo transcurso contribuye una actividad aumentada de al menos una de las metaloproteinasas de matriz colagenasa de neutrófilos, agrecanasa, hADAMTS1 y gelatinasa A, de la serie de osteoartrosis, espondilosis, pérdida de cartílago después del traumatismo de articulaciones o de la inmovilización prolongada de articulaciones que sigue a lesiones de los meniscos o de la rótula o de desgarres de ligamentos, o una enfermedad del tejido conjuntivo, como colagenosis, trastornos durante la cura de heridas o enfermedades peridentales.

Description

Uso de heparina de bajo peso molecular para el tratamiento de la osteoartrosis.

Las heparinas de bajo peso molecular (Low Molecular Weight Heparin; LMWH) tienen un peso molecular medio de aproximadamente 3000 a 10000. LMWH adquiribles en el mercado son, por ejemplo:

Enoxaparina (Clexane®, Klexane®, Lovenox®), que se usa para el tratamiento de trombosis (documento US 5.389.618). Enoxaparina-Na es la sal sódica de heparina de bajo peso molecular, que se obtiene por despolimerización alcalina del derivado de éster bencílico de heparina de mucosa intestinal porcina. La cantidad principal de los componentes porta una estructura de 4-enopiranosa-uronato en el extremo no reductor de su cadena. La masa molecular media asciende a aproximadamente 4500 Dalton.

La proporción porcentual de moléculas menores de 2000 Dalton se encuentra entre 12% y 20%. La proporción en porcentaje en masa de cadenas de un tamaño de entre 2000 y 8000 Dalton se encuentra entre 68% y 88%, respecto al patrón de calibración según la Farmacopea Europea, para heparinas de bajo peso molecular. El grado de sulfatación se encuentra en aproximadamente 2 por unidad de di-sacárido. La cadena polisacárida de enoxaparina, como en la heparina, está compuesta por unidades alternantes de glucosaminas sulfatadas y ácidos urónicos, que están enlazados mediante enlaces glicosídicos. La estructura se diferencia de la de la heparina, por ejemplo, porque por el proceso de despolimerización se forma un doble enlace en el extremo no reductor de la cadena.

Puede distinguirse la enoxaparina de la heparina mediante espectroscopia en el UV y por el espectro de resonancia magética nuclear de ^{13}C, que muestran el doble enlace en el anillo terminal, y por cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento. Nardoparina (Fraxiparine®), con una masa molecular media de 4300 \pm 700 Dalton (Da), estando presentes componentes con una masa molecular < 2000 Da (< 15%), de 2000 a 4000 Da (45% \pm 10%) y de 2000 a 8000 Da (85% \pm 10%).

Dalteparina (Fragmin®), con una masa molecular media de 6000 \pm 400 Da, estando presentes componentes con una masa molecular < 3000 Da (5% a 13%) y mayor de 8000 Da (15% a 25%).

Certroparina (Embolex®, Monoembolex®), con una masa molecular media de 5200 \pm 1000 Da, estando presentes componentes con una masa molecular < 2000 Da (10% a 25%) y menor de 8000 Da (75% a 90%). Parnaparina (Fiuxum®, Minidalton®), con una masa molecular media de 5000 \pm 1000 Da, estando presentes componentes con una masa molecular < 3000 Da (20% a 30%) y de 3000 Da a 8000 Da (50% a 60%).

Tinzaparina (Logiparin®), con una masa molecular media de 3400 Da a 5600 Da, estando presentes componentes con una masa molecular < 2000 Da (2% a 16%), 2000 Da a 4000 Da (66% \pm 6%) y mayor de 8000 Da (12% a 38%). Además, se conocen reviparina (Clivarine®) y ardeparina/RD, heparina/RDH (Normiflo®).

Las LMWH, por ejemplo, pueden prepararse a partir de heparina, mediante fraccionamiento por etanol o por filtración por gel, de las fracciones de bajo peso molecular que existen naturalmente en la heparina. Pero la heparina también puede despolimerizarse de forma controlada con la ayuda de ácido nítrico, eliminación \beta u oxidación mediante periodato, o por enzimas y, a continuación, fraccionarse.

En el cuadro patológico de la osteoartrosis, la degradación del agrecano, el proteoglicano principal del cartílago articular, representa un suceso muy temprano y decisivo. La pérdida patológica del agrecano, que representa el proteoglicano principal del cartílago, incluye escisiones proteolíticas en su dominio interglobular. Análisis de secuencias de aminoácidos de metabolitos de proteoglicano, aislados del líquido sinovial de pacientes que padecían un daño de las articulaciones, osteoartrosis o una enfermedad inflamatoria de las articulaciones, mostraron que se produce una escisión proteolítica, preferentemente entre los aminoácidos Glu^{373} y Ala^{374}, en el dominio interglobular del agrecano humano (Lohmander y col. Artritis Rheum. 36, (1993), 1214-1222). La actividad proteolítica que es responsable por esta escisión, se denomina "agrecanasa" y puede contarse como perteneciente a la superfamilia de las metaloproteinasas (MP) o metaloproteinasas de matriz.

En las metaloproteinasas, el cinc es esencial en el centro de acción catalítica. Las MMP escinden colágeno, laminina, proteoglicanos, elastina o gelatina en condiciones fisiológicas y por ello, desempeñan un papel importante en el hueso y en el tejido conjuntivo.

Se conocen un gran número de diferentes inhibidores de las MMP (documentos EP 0606046; WO 94/28889).

La desventaja de los inhibidores conocidos de las MMP es la frecuente deficiencia de especificidad por la inhibición de sólo una clase de MMP. Por ello, la mayoría de los inhibidores de MMP inhiben simultáneamente varias MMP.

En el esfuerzo por encontrar compuestos eficaces para el tratamiento de enfermedades del tejido conjuntivo, se halló que la enoxaparina, usada conforme a la invención, es un fuerte inhibidor de las metaloproteinasas de matriz: colagenasa de neutrófilos (MMP-8), agrecanasa, hADAMTS1 y gelatinasa A (MMP-2), mientras que la enoxaparina es esencialmente ineficaz en las MMP 1, 3, 13 y 14.

Por ello, la invención se refiere al uso de heparina de bajo peso molecular, con un peso molecular medio de aproximadamente 3000 a aproximadamente 10000, de la serie de enoxaparina, nardroparina, dalteparina, certroparina, parnaparina, reviparina, ardeparina/RD, heparina/RDH o tinzaparina, o mezclas de las mismas, para la preparación de medicamentos para la profilaxis y tratamiento de enfermedades, a cuyo transcurso contribuye una actividad aumentada de al menos una de las metaloproteinasas de matriz: colagenasa de neutrófilos (MMP-8), agrecanasa, hADAMTS1 y gelatinasa A (MMP-2), de la serie de osteoartrosis, espondilosis, pérdida de cartílago, después del traumatismo de articulaciones o después de una inmovilización prolongada de articulaciones, que sigue a lesiones del menisco o de la rótula o de desgarro de ligamentos, o una enfermedad del tejido conjuntivo como colagenosis, trastornos durante la cura heridas o enfermedades peridentales.

Se prefiere usar enoxaparina.

La enoxaparina y sales fisiológicamente compatibles de la enoxaparina son conocidas y pueden prepararse, por ejemplo, como está descrito en el documento US 5389618.

El uso conforme a la invención de las heparinas de peso molecular bajo, en general se efectúa por administración parenteral. La administración de las heparinas de bajo peso molecular puede efectuarse mediante inyección subcutánea, intraarticular, intraperitoneal o endovenosa. Se prefiere la inyección intraarticular. También son posibles las administraciones rectal, oral, inhalatoria o transdérmica.

Preferentemente, se preparan y se administran las preparaciones farmacéuticas en dosificación unitaria, conteniendo cada unidad una determinada dosis de la heparina de bajo peso molecular, como componente activo. En las soluciones inyectables en ampollas, esta dosis, por ejemplo, puede ascender a aproximadamente 5 \mug hasta aproximadamente 200 mg, pero preferentemente, a aproximadamente 10 \mug hasta 40 mg.

Para el tratamiento de un paciente adulto de aproximadamente 70 kg de peso, están indicadas dosis diarias de enoxaparina de aproximadamente 10 \mug hasta 500 mg, preferentemente, de aproximadamente 20 mg hasta 100 mg. Sin embargo, en ciertas condiciones también pueden ser apropiadas dosis diarias mayores o menores. La administración de la dosis diaria puede efectuarse tanto mediante una toma diaria en forma de una dosis unitaria, como de varias unidades de dosificación más baja o de varias tomas de dosis fraccionadas, a determinados intervalos.

Además, la invención se refiere al uso de ADAMTS1 para preparar un kit de ensayo para determinar un inhibidor de la agrecanasa, caracterizado porque se incuban ADAMTS1, un sustrato y un inhibidor, y se determinan los neoepítopos generados por la actividad de agrecanasa.

Ejemplo 1 Efecto de la enoxaparina sobre la agrecanasa de condrocitos porcinos

Para generar la actividad de agrecanasa, se estimularon condrocitos porcinos durante 4 días con 10 ng/ml de IL-1 \alpha (Hughes, C. E., Little, C. B., Buettner, F. H., Bartnik, E., Caterson, B., (1998), Differential expression of Aggrecanase and Matrix metalloproteinase activity in chondrocytes isolated from bovine and porcine articular cartillage, J. Biol. Chem. 273, 30576-30582). En una placa de cultivo celular de 96 pocillos, se mezclaron 200 \mul del sobrenadante de condrocitos que presenta actividad de agrecanasa con 100 \mul de (medio de cultivo celular/tampón) DMEM por pocillo. Una hora antes de la adición del sustrato (5 \mug de rAgg1mut (Büttner y col., Biochem. J. (1998), 333, 159-165)), como inhibidor, se adicionaron 5 \mul de enoxaparina, que fue disuelta en H_{2}O, en la concentración correspondiente. La preparación se incubó durante 17 h a 37ºC y, a continuación, se transfirió a una placa de ELISA para detectar con el anticuerpo BC-3 (Hughes y col., Biochem. J. (1995), 305, 799-804) los neoepítopos generados por la actividad de agrecanasa (Büttner y col., Trans. Orthop. Res. Soc. (1998), 23, 916).

En la tabla 1 se representa la actividad enzimática como señal de BC-3 (extinción), de un experimento representativo.

TABLA 1

1

En esta preparación de ensayo, puede determinarse la IC_{50} con aproximadamente 80 \mug/ml de enoxaparina. La enoxaparina inhibe la actividad de agrecanasa de condrocitos porcinos, en la digestión del sustrato rAgg1mut.

Ejemplo 2 Efecto de la enoxaparina sobre la agrecanasa de condrocitos humanos desdiferenciados

Para generar la actividad de agrecanasa, en una placa para cultivo celular de 96 pocillos se estimularon 50000 condrocitos humanos desdiferenciados por pocillo, durante 47 h, con 0,01 ng/ml de IL-1 \alpha y 3 U de TNF \alpha, en 200 \mul de medio DMEM/F12 (1:1). Una hora antes de adicionar el sustrato (2,5 \mug de rAgg1mut), en una placa para cultivo celular de 96 pocillos se mezclaron 200 \mul del sobrenadante de condrocitos, que presentaba actividad de agrecanasa, con 5 \mul de enoxaparina (Clexane) como inhibidor, que fue disuelta en H_{2}O, en la concentración correspondiente. Se incubó la preparación durante 4 h a 37ºC y, a continuación, se transfirió a una placa de ELISA, para detectar mediante el anticuerpo BC-3 los neoepítopos generados por la actividad de agrecanasa.

En la tabla 2 se representa la actividad enzimática como señal de BC-3 (extinción) de un experimento representativo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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En este sistema de ensayo pudo determinarse la IC_{50}, con aproximadamente 200 \mug/ml de enoxaparina.

La enoxaparina inhibe la actividad de agrecanasa de condrocitos humanos desdiferenciados, en la digestión del sustrato rAgg1mut.

Ejemplo 3 Efecto de la enoxaparina sobre la actividad de agrecanasa de proteína humana recombinante ADAMTS1

Para generar la actividad de agrecanasa en ADAMTS1 humana, se transfectaron 293 células con un plásmido de expresión de ADAMTS1, mediante el método del fosfato de calcio. El plásmido de expresión autoconstruido porta la secuencia codificante del gen humano ADAMTS1, al que sigue un FLAG-tag C-terminal, introducido adicionalmente. El gen está bajo el control de expresión del promotor CMV. Se pasan los sobrenadantes de la transfección por una columna de agarosa de anticuerpos M2, y mediante FLAG-péptido, se eluye el hADAMTS1, enlazado al anticuerpo M2 a través de FLAG-tag. El ADAMTS1 humano purificado parcialmente de esta manera, se usa en el ensayo de agrecanasa.

En una placa para cultivo celular de 96 pocillos una hora antes de la adición del sustrato (1 \mug de rAgg1mut), se mezclaron 10 \mul de eluato con ADAMTS1 humano recombinante y 300 \mul de DMEM con 5 \mul de enoxaparina (Clexane) como inhibidor, que fue disuelta en H_{2}O, en la concentración correspondiente. Se incubó la preparación durante 4 h a 37ºC y, a continuación, se transfirió a una placa de ELISA, para detectar con el anticuerpo BC-3 (Hughes y col., Biochem. J. 305, 799-804, 1995) los neoepítopos generados por la actividad de agrecanasa (Buettner y col., Trans. Orthop. Res. Soc. 23, 916, 1998).

En la tabla 3 se representa la actividad enzimática como señal de BC-3 (extinción), de un experimento representativo.

TABLA 3

3

En este ensayo puede determninarse la IC_{50} con aproximadamente 25 \mug/ml de enoxaparina. La enoxaparina inhibe la actividad de agrecanasa del ADAMTS1 humano recombinante en la digestión del sustrato rAgg1mut.

Ejemplo 4 Falta del efecto de enoxaparina sobre el dominio catalítico de MMP-3 en la digestión del sustrato recombinante rAgg1mut

En una placa para cultivo celular de 96 pocillos, una hora antes de la adición del sustrato (5 \mug de rAgg1mut), se mezclaron 31,3 \mul de MMP-3 humano recombinante (dominio catalítico: G98-P273, preparado mediante el método de Ye y col., Biochemistry, 31, 11231-11235, 1992) en tampón de digestión de MMP-3 (MES 0,1 M; NaCl 0,1 M; CaCl_{2} 0,01 M; Brij al 0,5%; pH 6,0) con 5 \mul de enoxaparina (Clexane) como inhibidor, que fue disuelta en H_{2}O, en la concentración correspondiente. Se incubó la preparación durante 8 h a 37ºC y, a continuación, se transfirió a una placa de ELISA para detectar (Buettner y col., Trans. Orthop. Res. Soc. 23, 916, 1998) con el anticuerpo BC-14 (Hughes y col., Biochem. J. (1995), 305, 799-804) los neoepítopos generados por la actividad de MMP-3 (escisión en los aminoácidos N341-F342).

La tabla 4 muestra los resultados de un experimento representativo.

TABLA 4

4

La enoxaparina no manifestaba ningún efecto sobre el dominio catalítico de MMP-3 en la digestión del sustrato recombinante rAgg1mut.

Ejemplo 5 Representación y determinación de la actividad enzimática de la gelatinasa A (MMP-2) y de la colagenasa de neutrófilos (MMP-8)

Ambas enzimas, la gelatinasa A (MMP-2) y la colagenasa de neutrófilos (MMP-8), fueron adquiridas de Roche o, en su caso, Biocon. Para medir la actividad enzimática o del efecto inhibidor de enzimas, durante 15 minutos se incuban 10 \mul de solución tampón que contiene enzima con 10 \mul de H_{2}O que, dado el caso, contiene el inhibidor de enzimas. Se incuban MMP-2 (20 mUnidades) o MMP-8 (20 ng) mediante el método descrito por Knight (Knight y col., (1992) FEBS letters 296, 263), con 10 \mul de una solución acuosa al 10% v/v de dimetilsulfóxido, que contiene 0,1 mmol/l del sustrato generador de fluorescencia (7-metoxicumarin-4-il)acetil-Pro-Leu-Gly-Leu-3-(2',4'-dinitrofenil)-L-2,3-diaminopropionil-Ala-Arg-NH_{2} (Bachem, Heidelberg, Alemania), y se sigue la reacción enzimática en forma espectroscópica por fluorescencia (328 nm (ex)/393 nm (em). La medición de la fluorescencia se efectúa durante 15 minutos. Se averigua la velocidad inicial de la reacción enzimática sin adición de inhibidor y se define como 100% de actividad.

Los compuestos usados eran heparina no fraccionada (UF), con un peso molecular de aproximadamente 15000 Dalton, y una fracción de heparina de 3000 Dalton (LMW) (ambas obtenibles de Sigma) y enoxaparina. Se ensayaron las actividades de MMP de MMP-2 y MMP-8.

Se averiguaron las inhibiciones expuestas en la tabla 5, a una concentración de respectivamente 1 \mug/ml de los compuestos usados, y se compararon con un control sin inhibidor (100%).

TABLA 5

5

Claims

1. Uso de heparina de bajo peso molecular, con un peso molecular medio de aproximadamente 3000 hasta aproximadamente 10000, de la serie enoxaparina, nardroparina, dalteparina, certroparina, parnaparina, reviparina, ardeparina/RD, heparina/RDH o tinzaparina, o una mezcla de éstas, para la preparación de medicamentos para la profilaxiis y tratamiento de enfermedades, a cuyo transcurso contribuye una actividad aumentada de al menos una de las metaloproteinasas de matriz colagenasa de neutrófilos, agrecanasa, hADAMTS1 y gelatinasa A, de la serie de osteoartrosis, espondilosis, pérdida de cartílago después del traumatismo de articulaciones o de la inmovilización prolongada de articulaciones que sigue a lesiones de los meniscos o de la rótula o de desgarres de ligamentos, o una enfermedad del tejido conjuntivo, como colagenosis, trastornos durante la cura de heridas o enfermedades peridentales.

2. Uso conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque como heparina de bajo peso molecular se usa enoxaparina.

3. Uso conforme a las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la administración de la heparina de bajo peso molecular se efectúa mediante inyección subcutánea, intraarticular, intraperitoneal o endovenosa, preferentemente, mediante inyección intraarticular.

4. Uso conforme a la reivindicación 3, caracterizado porque la dosis de la heparina de bajo peso molecular en la solución inyectable asciende a aproximadamente 5 \mug hasta aproximadamente 200 mg, preferentemente, a aproximadamente 10 \mug hasta 40 mg.

5. Uso conforme a la reivindicación 3, caracterizado porque se usan dosis diarias de enoxaparina de aproximadamente 10 \mug hasta 500 mg, preferentemente, de aproximadamente 20 mg hasta 100 mg.

6. Uso conforme a las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la administración de la heparina de bajo peso molecular se efectúa mediante la administración por vía rectal, oral, inhalatoria o transdérmica.

7. Uso de ADAMTS1 para la preparación de un kit de ensayo, para determinar un inhibidor de la agrecanasa, caracterizado porque se incuban en conjunto ADAMTS1, un sustrato y un inhibidor, y se determinan los neoepítopos generados por la actividad de agrecanasa.