NO323409B1

NO323409B1 - Nye oligosakkarider, deres fremstilling, farmasoytiske preparater inneholdende oligosakkaridene samt deres anvendelse.

Info

Publication number: NO323409B1
Application number: NO20021859A
Authority: NO
Inventors: Jean-Marie Stutzmann; Florence Wahl; Pierre Mourier; Elisabeth Perrin; Christian Viskov
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2002-04-19
Publication date: 2007-04-30
Also published as: IL149154A0; HRP20020330B1; FR2800074B1; TR200201102T2; WO2001029055A3; WO2001029055A2; HK1050535A1; EA004046B1; EE05091B1; CN1241932C; NO20021859D0; CN1379781A; HUP0203821A2; MXPA02003945A; NO20021859L; YU29802A; JP4733329B2; AU781414B2; RS50829B; SK287459B6

Description

Foreliggende oppfinnelse angår oligosakkarider med formelen:

deres blandinger, deres diastereoisomerer, deres fremstilling farmasøytiske preparater inneholdende oligosakkaridene, samt anvendelse derav.

Sulfaterte disakkarider med en reduserende ende med en 1,6-anhydro-struktur er beskrevet av H.P. Wessel i "J. Carbohydrate Chemistry", 11(8), 1039-1052 (1992); imidlertid er ingen farmakologisk aktivitet nevnt.

Sulfaterte trisakkarider med en 1,6-anhydro-del er likeledes beskrevet i EP 84999 av Y. Ichikawa et al. i "Carbohydr. Res.", 141,273-282 (1985) som mellomprodukt for fremstilling av høyere oligosakkarider. Disse trisakkarider har en lav anti-Xa-aktivitet.

I formel (I) er n et helt tall fra 0 til 25, Ri, R3, R4 og R5 er like eller forskjellige og betyr et hydrogenatom eller en SOsM-rest, R2 og R$ er like eller forskjellige betyr et hydrogenatom eller en SO3M- eller COCH3-rest og M er natrium, kalsium, magnesium eller kalium.

Disse oligosakkarider har således et partall sakkarider.

I formel (I) er R4 fortrinnsvis et hydrogenatom.

Fortrinnsvis er n et helt tall fra 0 til 10 og særlig 0 til 6, og aller helst 1 til 6.

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av oligosakkarider med formel (I) kjennetegnet ved at man omsetter et alkalimetall- eller kvatemært ammoniumhydroksyd med oligosakkarider med formelen:

der

ner et helt tall fra 0 til 25,

Ri, R3, R4 og Rs er like eller forskjellige og betyr et hydrogenatom eller en SC^M-rest', R2 og Re er like eller forskjellige og betyr et hydrogenatom, eller en SO3M- eller COCH3-rest og

M er natrium, kalsium, magnesium eller kalium, eller en blanding av disse,

og isolerer oligosakkaridene eller deres blandinger.

Denne reaksjon skjer i vandig medium ved en temperatur fra 40 til 80 °C og ved en pH-verdifralOtil 13.

Som alkalimetallhydroksyd som kan benyttes, kan nevnes natrium-, kalium-, litium-eller cesiumhydroksyd.

Som kvaternært ammoniumhydroksyd som kan benyttes, kan nevnes tetrabutylammoniumhydroksyd.

Mengden alkalimetall- eller kvaternært ammoniumhydroksyd må være tilstrekkelig til at pH-verdien i reaksjonsblandingen forblir stabil under hele reaksjonens varighet. Det er således nødvendig under hele reaksjonen kontinuerlig å tilsette alkalimetall- eller kvaternært ammoniumhydroksyd.

Fortrinnsvis foreligger alkalimetall- eller det kvatemære ammoniumhydroksyd i form av en vandig 1 til 5 %-ig oppløsning.

Fortrinnsvis skjer reaksjonen ved en temperatur fra 60 til 70 °C.

Helst er reaksjonens pH-verdi 11 til 12,5.

Reaksjonen stanses ved surgjøring av reaksjonsmediet, for eksempel ved tilsetning av en sur harpiks som harpiksen Amberlite IR120® (Fluka).

Oligosakkaridene med formel (I) kan eventuelt renses ved permeasjon på gel av typen polyakrylamid-agarose som den som markedsføres under navnet Ultrogel ACA202®

(Biosepra) i henhold til den protokoll som er beskrevet nedenfor for separering av intermediære oligosakkarider med formel (II). Oligosakkaridene med formel (I) der n er 0 eller 1 kan også eventuelt renses på en aluminiumoksydkolonne der man som eluerings-middel benytter en blanding av vann og etanol.

De intermediære oligosakkarider med formel (II) og deres blandinger kan oppnås ved separering ved kromatografi på gel av en blanding av oligosakkaridene (III), oppnådd ved enzymatisk depolymerisering av heparin eller basisk depolymerisering av benzylesteren av heparin eller en hemisyntese benzylester av heparin.

Denne kromatografi skjer på kolonner som er fylt med gel av typen polyakrylamid-agarose som den som markedsføres under merket Ultrogel ACA202® (Biosepra). Fortrinnsvis benytter man et kolonnebatteri av polyakrylamidagarosegel. Antallet kolonner som benyttes tilpasses som funksjon av volumet, geleen og oligosakkaridene som skal separeres. Blandingen elueres med en oppløsning inneholdende en fosfatbuffer og natriumklorid. Fortrinnsvis er fosfatbufferoppløsningen en 0,02 mol/l oppløsning av NaH2P04:Na2HP04 (pH 7) inneholdende 0,1 mol/l natriumklorid. Detekteringen av de forskjellige fraksjoner realiseres ved UV-spektrometri (254 nm) og ionisk spektrometri (IBF). De således oppnådde fraksjoner kan derefter eventuelt renses, for eksempel ved SAX-kromatografi (strong anion exchange) i henhold til metoder som velkjente for fagmannen og særlig i henhold til de metoder som er beskrevet av K.G. Rice og R.J. Linhardt i "Carbohydrate Research", 190,219-233 (1989); av A. Lamkjær, S.H. Hansen og P.B. Østergaard i "Carbohydrate Research", 266,37-52 (1995) samt i WO 90/01501 (eksempel 2). Fraksjonene blir derefter lyofilisert og så avsaltet på en kolonne fylt med en gel, for eksempel en Sephadex G10®-kolonne (Pharmacia Biochemicals).

Når rensingen ikke gjennomføres ved SAX-kromatografi, kan lyofilisatene eventuelt renses ved enkel precipitering eller fraksjoneres i henhold til velkjente metoder for fagmannen og særlig i henhold til den metode som er beskrevet i FR 2548672. Rent generelt arbeider man i henhold til følgende protokoll: Denne lyofiliserte fraksjon som skal renses, oppløses ved 25 °C i rundt 10 volumer destillert vann. Ved tilsetning av metanol eller etanol bringer man det ønskede oligosakkarid til precipitering ved å kontrollere dets anrikning ved HPLC. Tilsetningen av metanol eller etanol bestemmes som funksjon av renheten og det ønskede utbyttet av det angjeldende oligosakkarid. Videre kan denne operasjon gjennomføres i flere suksessive trinn fra lyofilisat-utgangsoppløsningen. For dette formål tilsetter man et uoppløselig-gjørende middel (metanol eller etanol) i små porsjoner og isolerer det oppnådd preci-pitat efter hver tilsetning. De således oppnådde precipitater analyseres ved HPLC. I henhold til ønsket renhet og utbytte samler man de adekvate precipitatfraksjoner.

For mellomproduktene med formel (II) der n = 0,1 eller 2, oppnås disse fortrinnsvis fra en blanding (III), oppnådd ved enzymatisk depolymeirsering.

Denne depolymerisering skjer ved hjelp av heparin I (EC 4.2.2.7) i en fosfatbuffer-oppløsning med pH 7 i nærvær av natriumklorid og BSA (bovinserumalbumin), ved en temperatur mellom 10 og 18 °C, fortrinnsvis 15 °C, i et tidsrom mellom 8 og 10 dager og fortrinnsvis 9 dager. Depolymeriseringen stanses ved oppvarming av reaksjonsmediet til 100 °C i 2 minutter og blandingen gjenvinnes ved lyofilisering. Det er foretrukket å benytte 7 IE (internasjonale enheter) heparinase I for 25 g heparin. Fosfatbufferoppløsningen omfatter generelt 0,05 mol/l NaH2P04:Na2HP04 (pH 7) i nærvær av 0,1 mol/l natriumklorid. BSA-konsentrasjonen er generelt 2 %.

For mellomproduktene med formel (II) der n = 0, 1,2,3 eller 4, er det foretrukket å gå ut fra en blanding (III) oppnådd ved depolymerisering av en benzylester av heparin.

Benzylesteren av heparin kan fremstilles i henhold til de metoder som er beskrevet i US 5 389 618, EP 40 144 og FR 2 548 672. Forestringsgraden ligger fortrinnsvis mellom 50 og 100 %. Fortrinnsvis ligger den mellom 70 og 90 %.

Depolymeirseringen skjer i vandig medium ved hjelp av et alkalimetallhydroksyd (litium-, natrium-, kalium- eller cesiumhydroksyd) eller et kvaternært ammoniumhydroksyd (for eksempel tetrabutylammoniumhydroksyd), fortrinnsvis ved en molaritet mellom 0,1 og 0,2 mol/l, ved en temperatur mellom 40 og 80 °C og fortrinnsvis i 5 til 120 minutter. I en foretrukken arbeidsmodus arbeider man i 5 til 15 minutter ved en temperatur mellom 60 og 70 °C med en natriumhydroksydoppløsning på 0,15 mol/l. Depolymeriseirngsreaksjonen stanses ved nøytralisering ved tilsetning av en syre som eddiksyre. Efter tilsetning av 10 vekt-% natriumacetat presipiteres oligosakkaridblandingen ved tilsetning av metanol, fortrinnsvis 2 volumer pr. 1 volum reaksjons-medium, og det hele filtreres.

I henhold til et foretrukket aspekt ved oppfinnelsen blir oligosakkaridblandingen som oppnås efter kjemisk depolymeirsering, i form av en vandig oppløsning, anriket ved ultrafiltrering på membraner med en nominell egnet kutt-terskel (type Pellicon av regenerert cellulose, markedsført av Millipore); typen membran tilpasses som funksjon av den type anrikede oligosakkarider som skal gjenvinnes. For oligosakkaridene (II) der n = 0, benytter man en membran med en nominell kutt-terskel på 1 kDa, for oligosakkaridene (II) der n = 1, benytter man enl kDa-membran eller 3 kDa-membran, for oligosakkaridene (II) der n = 2, benytter man en 1 kDa-membran, for oligosakkaridene (ii) der n = 3 eller 4, benytter man en S kDa-membran. Under denne operasjon gjenvinnes permeatet og retentatet kasseres. Således kan den anrikede produktfraksjon representere 50 til 10 % av utgangsblandingen av oligosakkarider, mens man bevarer minst 80 % av det ønskede oligosakkarid.

For mellomproduktene med formel (II) der n = 0 til 25, er det foretrukket å gå ut fra en blanding (III) som oppnås ved depolymerisering av en benzylester av sulfatert hemisyntese-polysakkarid. Benzylesteren av sulfatert hemisyntese-polysakkarid fremstilles fra sulfaterte hemisyntese-polysakkarider som oppnås fra polysakkarid K5 og i henhold til de metoder som er beskrevet i WO 94/29352 og WO 96/14425. Forestrings-, depoly-meriserings- og gjenvinningsbetingelsene er de samme som beskrevet ovenfor for benzylesteren av heparin.

I alle de tidligere prosesser kan utgangsheparinet være av porcin, ovin, kaprin eller bovin-opprinnelse og kan stamme fra mucus, lunger eller huden av dyrene. Fortrinnsvis benyttes et porcin eller ovin mucus-heparin eller et kveglunge-heparin, aller helst heparin fraporcin-mucus.

Oligosakkaridene med formel (I) oppviser anti-inflammatoriske egenskaper og kan således benyttes for prevensjon eller terapi av sykdommer forbundet med en inflammatorisk prosess som implikerer produksjonen av cytotoksiske substanser som nitrogen-monoksyd (NO) hvis induktible form settes fri særlig av neutrofiler eller makrofager når disse migrerer og aktiveres i et vev. Aktiveringen, migreringen, adhesjonen og infil-treringen av neutrofiler skjer i iskemiske tissulære soner som følge av en okklusjon eller en spasme i en arteri som vaskulariserer dette vev. Disse iskemier kan skje enten på cerebralt nivå (cerebral vaskulær aksident) eller i myokardium (myokardisk infarkt) eller i de nedre lemmer (såkalt perifere iskemier). Oligosakkaridene med formel (I) kan også benyttes for prevensjon og/eller terapi av neurodegenerative sykdommer der cerebral inflammasjon spiller en ødeleggende rolle som kan føre til død, blant hvilke man kan nevnes cerebrale iskemier, kardiale iskemier (myokardialt infarkt), perifere iskemier, traumatismer i sentralnervesystemet og særlig kranie-, spinale eller kranio-spinale traumatismer, plaque-sklerose, neuropatiske smerter og perifere neuropatier, motoneurone sykdommer som amyotrofisk lateralsklerose, neuro-aids, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntingtons chorea, og visse former for osteoartritt, særlig med artikulær lokasjon.

Oppfinnelsen tilveiebringer et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det som aktiv bestanddel inneholder minst et oligosakkarid ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av oligosakkarider med formel (I) ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for anvendelse ved prevensjon eller terapi av sykdommer forbundet med en inflammatorisk prosess som inkluderer produksjon av nitrogenoksyd (NO).

Den anti-inflammatoriske aktivitet for disse produkter er demonstrert in vivo i en test på produksjonen av NOx (nitritt og nitrat) som induseres av lipopolysakkarid (LPS) som stammer fra E. coli i henhold til den protokoll som er beskrevet av M. Yamashita et al. i "Eur. J. Pharmacol.", 338,2, 151-158 (1997) eller av J.E. Shellito et al. i "Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.", 13,1,45-53 (1995).

Man injiserer i CDl-hannmus (Charles River, 25-35 g) ved TO, ved intravenøs bolus, 0,5 mg/kg oligosakkarid, ved T+15 minutter, subkutant, 1 eller 2 mg/kg oligosakkarid. Ved T+30 minutter administreres 100 mg/kg lipopolysakkarid (LPS) fra E. coli (Sigma L3129, serotype 0127:B8). Ved T+3 timer injiseres på nytt, subkutant, 1 eller 2 mg/kg oligosakkarid. Ved T+5 timer og 30 minutter hentes en blodprøve ved punktering av øyet og NOx (nitritt og nitrat)-konsentrasj onene i plasma bestemmes ved kolometriske metoder i henhold til Griess efter reduksjon av nitrat til nitritt med nitrat-reduktase på følgende måte: 12 ul plasmaprøve blandes med 88 ul deionisert vann og inkuberes.i mørke i 1 time ved omgivelsestemperatur med 40 ul fosfatbuffer (0,3IM, pH 7,5), 20 ul p-NADPH (redusert nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat) (0,86 mM), 20 ul FDA (flavin-adenindinukleotid) (0,11 mM) og 20 ul nitratreduktase (2 U/ml) (Boehringer Mannheim). 10 ul ZnS04 (IM) tilsettes for å precipitere proteinet og efter blanding sentrifugeres prøvene ved 20 000 g i 5 minutter. Til slutt inkuberes 50 ul supematant i 10 minutter ved omgivelsestemperatur med 100 ul Griess-reaktant (1 % sulfanilamid i en blanding av underfosforsyre og 0,1 % naftyetylendiamin i deionisert vann (volum/- volum)). Den optiske densitet avleses ved 540 nm med et mikroplaque spektrofotometer og hvert punkt bestemmes 2 ganger. KNO3 og NaNC>2 benyttes som standard for den kolorimetriske metode.

I denne test inhiberer oligosakkaridene ifølge oppfinnelsen mer enn 50 % av dannelsen av NOx.

Blant de oligosakkarider med formel (I) som er foretrukket, skal særlig nevnes de oligosakkarider der: n er lik 0, Ri og Rg er en SOjNa-rest og M er natrium og blandingen av disse

diastereoisomerer.

n er lik 1, Ri, R2, R3, R$ og R<$ betyr en SOsNa-rest, R» betyr et hydrogenatom og M

er natrium, samt blandingen av disse diastereomerer.

n er lik 2, Ri, R2, R3, R5 og Re betyr en SOsNa-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M

er natrium og blandingen av disse diastereoisomerer.

n er lik 2, Ri, R2, R3 og Re betyr en SOsNa-rest, R5 betyr et hydrogen eller en S03Na-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium og blandingen av disse diastereoisomerer (derivatet 1,6-anhydro AIs-Is-IIs).

De følgende eksempler er representative for fremstillingen av oligosakkaridene med formel (I) og deres mellomprodukter.

I eksemplene har forkortelsene følgende betydninger:

Als: (4-deoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-enopyranosyluronsyre)-(l-»-4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glucopyranose, tetranatirumsalt, eller også AUAp2S-(1 ->4)-a-D-GlcNp2S6S

Is: (2-sulfo-a-L-isopyranosyluronsyre)-(l->4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopyranose, tetranatirumsalt, eller også a-L-IdoAp2S-(l-»4)-ct-D-GlcNp2S6S

Ils: (a-L-idopyranosyluronsyre)-( 1 -»4)-2-deoksy-2-suIfoammo-6-0-sulfo-a-D-gluco-pyranose, trinatriumsalt, eller også cc-L-Ido-Ap-l-»4)-a-D-GlcNp2S6S

His: (2-sulfo-a-I^idopyranosyluornsyre)-(1^4)-2-deoksy-2-sulfoammo-a-D-gluco^ pyranose, trinatriumsalt, eller også a-L-IdoAp2S-(l->4)-a-D-GlcNp2S

IdoAp: idopyranosyluronsyre

GlcNp: 2-deoksy-2-aminoglucopyranose

AUap: 4-deoksy-a-L-treo-heks-enopyranosyluronsyre

S: sulfat

EKSEMPLER PÅ FREMSTILLING AV BLANDINGER MED FORMEL (II)

Eksempel A - Fremstilling av oligosakkarider med formel (II) der n = 0,1 og 2

med enzymatisk depolymerisering og separering

25 g heparin oppløses i 250 ml av en fosfatbufferoppløsning inneholdende 0,05 mol/l NaH2P04:Na2HP04 (pH 7), 0,2 mol/l natriumklorid og 2 % BSA. Til blandingen settes 7IE heparinase I (EC 4.2.2.2.7) og den oppnådde oppløsning avkjøles til 15 °C og holdes ved denne temperatur under hele depolymeriseringsreaksjonens varighet. Reaksjonsforløpet følges ved prøver av aliquoter og analyser ved gelpermeasjonskromatografi. Efter rundt 9 timer renses den enzymatiske reaksjon ved oppvarming av reaksjonsmediet til 100 °C i 10 minutter. Den avkjølte blanding blir derefter lyofilisert. Man oppnår på denne måte en blanding oligosakkarider (III).

Den oppnådde blanding av oligosakkarider (III) kromatograferes derefter i henhold til følgende metode: Kromatografien skjer på kolonner som er fylt med polyakrylamid-agarosegel som er kjent under betegnelsen Ultrogel AC A202 og blandingen elueres med en oppløsning inneholdende en fosfatbuffer (0,02 mol/l NaH2P04:Na2HP04) pH 7 og 0,1 mol/l natriumklorid. Detekteringen skjer ved UV-spektrometri (254 nm) og ionisk spektrometri (IBF). Produktene kan eventuelt renses ved SAX-kromatografi eller ved fraksjonert precipitering i henhold til den metode som er beskrevet i FR 2548672. Fraksjonene av de gjenvunne produkter lyofiliseres og avsaltes på denne kolonne fylt med Sephadex G10® (Pharmacia Biochemicals).

Ved denne metode oppnås 3 g disakkarid Is, 1100 mg av en blanding av heksasakkarid karakteristisk inneholdende 55 % av derivatet AIs-Is-Is, 35 % AIs-Is-IIs og 10 % AIs-Is-IIIs. Denne siste blanding kan renses i henhold til i og for seg kjente metoder for å sepa-rere hver av bestanddelene eller kan anvendes som sådant for omdanning til 1,6-anhydro-derivatet med formel (I). Man skal merke seg at under denne transformering kan heksasakkaridet AIs-Is-IIIs ikke føre til dannelse av forbindelser med formel (I).

Eksempel A - Fremstilling av oligosakkarider med formel (II) der n = 0,1,2,3

eller 4 med depolymerisering av benzylesteren av heparin og

separering

a - Fremstilling av benzylesteren av heparin

Benzylesteren av heparin fremstilles i henhold til eksempel 3 ig US 5 389 618.

b - Depolymerisering

100 g benzylester av heparin oppløses i 1,91 demineralisert vann. Blandingen bringes til 60 °C under omrøring. Efter oppnåelse av en homogen oppløsning innføres på en gang ca. 35 ml 23 %-ig natriumhydroksydoppløsning. Efter 10 minutters reaksjon avkjøles oppløsningen og nøytraliseres med 80 ml av en ca. 2N eddiksyreoppløsning. Til denne oppløsning settes 10 % vekt/volum natriumacetat. Blandingen av oligosakkarider preci-piteres ved tilsetning av ca. 2 volumer metanol. Precipitatet isoleres ved filtrering, vaskes med metanol 2 ganger og tørkes under redusert trykk ved 50 °C. Efter tørking oppnås 73,8 g av en blanding av oligosakkarider (II).

c - Anrikning av oligosakkaridet der n = 1

30 g av oligosakkairdblandingen som oppnås ovenfor oppløses i ca. 35 volumer vann. Denne oppløsning ultrafiltreres p å 3 kDa-membraner (Pellicon). Når 600 ml permeat er trukket gjennom, fortynnes retentatet med 500 ml. Operasjonen følges inntil avtrekking av 450 ml ytterligere permeat. De to permeatfraksjoner forenes og konsentreres til tørr tilstand under redusert trykk. Man oppnår 6,1 g av et gulaktig, hvitt faststoff. Analysen av faststoffet ved gelpermeasjonskromatografi antyder at den inneholder ca. 30 % oligosakkarid med formel (II), der n = 1.

d - Fraksjonering av de ultrafiltrerte oligosakkaridblandinger

Denne anrikede blanding fraksjoneres på kolonner fylt med polyakrylamid-agarose-gel av typen Ultrogel ACA202 (man benytter 4 kolonner i serie med en diameter på 10 cm og en høyde på 50 cm). 5 g blanding som er anriket ved ultrafiltrering oppløses i 25 ml vann og elures med en oppløsning av 0,2 mol/l natriumklorid i en hastighet på 5 ml/min. Man gjenvinner nederst i kolonnen fraksjoner på 25 ml. Detektering av produktene gjennomføres ved UV-spektrometri (254 nm) og ionisk spektrometri (IBF). Produkt-fraksjonene er n = 1 gjenvinnes, lyofiliseres og avsaltes på en kolonne fylt med Sephadex G10-gel. Efter lyofilisering oppnås 1 g tetrasakkarid som karakteristisk inneholder 70 % av derivatet AIs-Is med formel (II) (Ri, R2, R3, R$, Re = S03Na; R, = H og M = Na). Derivatet AIs-Is kan eventuelt renses ved SAX-kromatografi eller i henhold til et foretrukket aspekt, ved fraksjonert precipitering i henhold til en metode som er beskrevet i FR 2 548 672.

Eksempel 1

Til en reaktor holdt ved 66 °C innføres 5 ml av en natriumhydroksydoppløsning på 0,0063 mol/l. pH-verdien i oppløsningen måles og benyttes som mål verdi (pH = 11,35). Under omrøring tilsettes på en gang 30 mg oligosakkarid med formel (II) der n er like 0, Ri og Re betyr en S03Na-rest og M er natrium. pH-verdien reguleres og holdes ved pH 11,35 ved kontinuerlig tilsetning av en 0,5 moi/l natriumhydroksydoppløsning. Efter 10 timer stanses tilsetningen av natriumhydroksyd og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 °C. pH-verdien i oppløsningen bringes så til mellom 6 og 7 ved tilsetning av harpiksen Amberlite IR120. Blandingen filtreres på en Whatman GF/B-membran og konsentreres til tørr tilstand ved 2,7 kPa og en temperatur nær 25 °C. Produktet tas opp i 0,5 ml destillert vann og lyofiliseres. Man oppnår 29 mg av en blanding av diastereo-isomer av oligosakkaridet med formel (I), der n er lik 0, R] og Re er en SOjNa-rest og M er natrium.

Protonspektrum i D20,400 MHz, T = 298K, S i ppm: (4-deoksy-2-0-suIfo-a-L-treo-heks-4-enopyranosyluronsyre-(l-^4)-l,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-p-D-mannopyranose.trinatriumsalt): 3,15 (1H, s, H2), 3,75 (2H, m, H6 og H3), 3,88 (1H, m, H4), 4,20 (1H, d, J = 8 Hz, H6), 4,22 (1H, t, J = 5 Hz, H3'), 4,58 (1H, m H2<*>), 4,75 (1H, m, H5), 5,53 (1H, s, Hl), 5,60 (1H, dd, J = 6 og 1 Hz, Hl'), 6,03 (1H, d, J= 5 Hz, H4*); (4-deoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopyranosyluronsyre-(l ->4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-P-D-glucopyranose.trinatriumsalt): 3,34 (1H, dd, J = 7 og 2 Hz, H2), 3,72 (1H, t, J = 8 Hz, H6), 3,90 (1H, m, H3), 4,03 (1H, s, H4), 4,20 (1H, d, J = 8 Hz, H6), 4,23 (1H, t, J = 5 Hz,

H3'), 4,58 (1H, m, H2'), 4,78 (1H, m, H5), 5,50 (1H, s, Hl), 5,60 (1H, dd, J = 6 og 1 Hz, Hl'), 6,03 (1H, d, J = 5 Hz, H4').

Eksempel 2

Til en reaktor holdt ved 62 °C innføres 33,3 ml av en 0,0063 mol/l natriumhydroksyd-oppløsning. pH-verdien i oppløsningen måles og benyttes som målverdi (pH =11,15). Under omrøring tilsettes det en gang 200 mg oligosakkarid med formel (II) der n er lik 1, Ri, R2, R3, R5 og Ré betyr en SC^Na-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium. pH-verdien reguleres og holdes ved pH 11,15 ved kontinuerlig tilsetning av 0,5 mol/l natriumhydroksydoppløsning. Efter 12 timer stanses tilsetningen av natriumhydroksyd og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 °C. pH-verdien i kolonnen bringes så til mellom 6 og 7 ved tilsetning av Amberlite IR120-harpiks. Blandingen filtreres på Whatman GF/B-filteret og konsentreres til tørr tilstand ved 2,7 kPa og en temperatur nær 25 °C. Produktet tas opp med 3 ml destillert vann og lyofiliseres. Man oppnår således 230 mg oligosakkarid med formel (I) der n er lik 1, Ri, R2, R3, R5 og R^betyr en S03Na-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium, i form av en blanding av diastereoisomerer.

Protonspektrum i D20,400 MHz, T = 298K, 8 i ppm: (4-deoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopyranosyIuronsyre-(1^4)-2-deoksy-2-sulfo-amino-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl-(l ->4)-2-0-sulfo-a-L-idopyranyluronsyre-(1^4)-l,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-fi-D-mannopyranose.heptanatriumsalt): 3,15 (1H, s H2), 3,25 (1H, m, H2"), 3,60 (1H, m, H3"), mellom 3,70 og 4,70 (14H, massiv, H3/H4/H6, H27H37H47H5\ H4"/H5'7H6", H2"7H3'"), 4,75 (1H, m, H5), mellom 5,20 og 5,40 (2H, m, Hl * og Hl"), 5,45 (1H, m, Hl"'). 5,56 (1H, m, Hl), 5,94 (1H, d, J = 5 Hz, H4); (4-deoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopyranosyIuronsyre-(l->4)-2-deoksy-2-sulfo-amino-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyluronsyre-(l-^4)-2-0-sulfo-a-L-idopyranosyluronsyre-( 1 -»4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-p-D-glucopyranose.hepta-natriumsalt): 3,25 (IH, m, H2"), 3,42 (1H, dd, J = 4 og 1H, H2), 3,60 (1H, m, H3"), mellom 3,70 og 4,70 (14H, massiv, H3/H4/H6, H2'/H37H4<*>/H5\ H4'7H5'7H6", H2"'/H3"'), 4,75 (1H, m, H5), mellom 5,20 og 5,40 (2H, m, Hl' og Hl"), 5,45 (1H, m, Hl"<*>), 5,52 (1H, m, Hl), 5,94 (1H, d, J = 5 Hz, H4).

Eksempel 3

Til en reaktor holdt ved 62 <*>C innføres 16,7 ml av en 0,0063 mol/l natriumhydroksyd-oppløsning. pH-verdien i oppløsningen måles og benyttes som en måleverdi (pH = 11,7). Under omrøring tilsettes på en gang 100 mg oligosakkarid med formel (II) der n er Uk 2, Ri, R2, R3, R5 og Re betyr en SC^Na-rest og R* betyr et hydrogenatom og M er natrium. pH-verdien reguleres og holdes ved 11,7 ved kontinuerlig tilsetning av en 0,5 mol/l natriumhydroksydoppløsning. Efter 10 timer stanses natriumhydroksyd-tilsetningen og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 °C. pH-verdien i oppløsningen bringes til mellom 6 og 7 ved tilsetning av Amberlite IR120-harpiks. Reaksjonsblandingen filtreres på et Whatman GF/B-filter og konsentreres så til tørr tilstand ved 2,7 kPa og en temperatur nær 25 °C. Produktet tas opp i 3 ml destillert vann og lyofiliseres. Man oppnår 108 mg oligosakkarid med formel (I), der n er lik 2, Ri, R2, R3, R5 og R$ betyr en S03Na-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium, i form av en blanding av diastereoisomerer. Man bemerker at fra A til F er sukrene heksasakkarider, A er 1,6-anhydro-resten og F er den umettede uronsyrerest.

Protonspektrum i D20,600 MHz, T - 298K, 8 i ppm: (4-deoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopyranosyIuronsyre-(l->4)-2-deoksy-2-sulfo-amino-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl-(l->4)-2-0-sulfo-a-L-idopyranyluronsyre-(l->4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopyraosyl-(l->4)-2-0-sulfo-a-L-idopyranosyluronsyre-(l->4)-l ,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino- p-D-manno-pyranose.undecanatriumsalt): 3,15 (1H, s, H2(A)), 3,25 (2H, m, H2(C+E)), 3,60 (2H, m, H3(C+E)), mellom 3,65 og 4,50 (19H, massiv, H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+E)/ H5(C+E)/H6(A+C+E)), 4,60 (1H, s, H2(F)), 4,80 (3H, m, H5(A+B+D)), 5,18 (1H, s, H1(D)), 5,30 (1H, s, H1(B)), 5,34 (1H, d, H1(C)), 5,36 (IH, d, H1(E)), 5,46 (1H, s, H1(F)), 5,57 (1H, s, H1(A)), 5,95 (1H, d, J=5 Hz, H4(F)); (4-deoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopyranosyluronsyre-(l->4)-2-deoksy-2-sulfo-amino-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl-(l->4)-2-0-sulfo-a-L-idopyranosyluronsyre-(l->4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopyranosyl-(l^4)-2-0-sulfo-a-L-iodopyranosyluronsyre-( 1 -»4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-p-D-gluco-pyranose.uhdecanatriumsalt): 3,25 (2H, s, H2(C+E)), 3,42 (IH, m, H2(A)), 3,60 (2H, m, H3(C+E)), mellom 3,65 og 4,50 (19H, massiv, H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+ C+D+E)/H5(C+E)/H6(A+C+E)), 4,60 (IH, s, H2(F)), 4,80 (3H, m,

H5(A+B+D)), 5,18 (IH, s, H1(D)), 5,31 (IH, s, H1(B)), 5,34 (IH, d, H1(C)), 5,36 (IH, d, H1(E)), 5,46 (IH, s, H1(F)), 5,52 (IH, s, H1(A)),

5,95 (IH, d, J=5 Hz, H4(F)).

Eksempel 4

Til en reaktor holdt ved 62 °C settes 4 ml av en 0,0316 mol/l natriumhydroksyd-oppløsning. pH-verdien i oppløsningen måles og benyttes som måleverdi (pH = 11,8). Under omrøring tilsettes på en gang 100,8 mg av en blanding av oligosakkarider med formel (II) der n er lik 2, omfattende 55 % av derivatet AIs-Is-Is (R), R2, R3, Rj og Re betyr en S03Na-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium), 35 % AIs-Is-IIs (Ri, R2,R3 og Re betyr en S03Na-rest, Rj betyr enten en S03Na-rest eller et hydrogenatom, R» betyr et hydrogenatom og M er natrium) og 10 % AIs-Is-IIIs (Ri, R2, R3, R5 og Re betyr en S02Na-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium, der SC^M-funksjonen på C6-karbonatomet er erstattet med et hydrogen). pH-verdien reguleres så til og holdes ved 11,8 ved kontinuerlig tilsetning av en 0,5 mol/l natriumhydroksydoppløsning. Efter 11 timer stanses natriumhydroksyd-tilsetningen og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 °C. pH-verdien i oppløsningen bringes så til mellom 6 og 7 ved tilsetning av harpiksen Amberlite IRI 20. Blandingen filtreres over et Whatman GF/B-filter og konsentreres så til tørr tilstand ved 2,7 kPa og en temperatur nær 25 °C. Produktet tas opp med I, 5 ml destillert vann og lyofiliseres. Man oppnår på denne måte 110 mg av en blanding av oligosakkarider med formel (I), der n er lik 2, særlig inneholdende 1,6-anhydro-derivatet AIs-Is-Is (Ri, R2, R3, R5 og Re betyr en SC^Na-rest, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium), og 1,6-anhydro-derivåtet AIs-Is-IIs (Ri, R2,R3 og Re betyr en SOsNa-rest, R5 betyr enten en SC^Na-rest eller et hydrogenatom, R4 betyr et hydrogenatom og M er natrium). HPLC-analyse ved ioneparmodus tillater å følge transformeringen til derivatet med formel (I). I dette tilfellet viser HPLC-analysen at transformasjonen gjennomføres for derivatene AIs-Is-Is, AIs-Is-IIs.

Eksempel 5

Til en reaktor som holdes ved 66 °C, innføres 8,6 ml av en 0,025 mol/l litiumhydroksyd-oppløsning. pH-verdien til oppløsningen måles og benyttes som måleverdi (pH = II, 68). Under omrøring tilsettes på en gang 50 mg oligosakkarid med formel (II) der n er lik 0, R) og Re betyr en SOsNa-rest og M er natrium. pH-verdien reguleres så til og holdes ved pH 11,68 ved kontinuerlig tilsetning av en 0,466 mol/l litiumhydroksyd-oppløsning. Efter 8 timer stanses litiumhydroksydtilsetningen og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 <*>C. HPLC-analyse ved ioneparmodus tillater å følge transformeringen til derivatet med formel (I), der n er lik 0, Ri og Re betyr en SOsNa-rest og M er natrium eller litium. I dette tilfellet viser HPLC-analysen at transformeringen forløper 100 %. Utbyttet ved ekstern kalibrering er 81,2 %.

Eksempel 6

TU en reaktor som holdes ved 66 °C, settes 8,3 ml av en 0,0063 mol/l kaliumhydroksyd-oppløsning. pH-verdien i oppløsningen måles og benyttes som måleverdi (pH = 11,1). Under omrøring tilsettes på en gang 50 mg oligosakkarid med formel (II) der n er lik 0, Ri og R* betyr en SC^Na-rest og M er natrium. pH-verdien reguleres så til og holdes ved 11,1 ved kontinuerlig tilsetning av en 0,515 mol/l kaliumhydroksydoppløsning. Efter 24 timer stanses tilsetningen av kaliumhydroksyd og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 °C. Ved HPLC i ioneparmodus tillater å følge transformeringen til derivatet med formel (I) der n er lik 0, Ri og Re betyr en SC^Na-rest og M er natrium eller kalium. I dette tilfellet viser HPLC at transformeringen forløper 100 %. Utbyttet ved ekstern kalibrering er 75,6 %.

Eksempel 7

Til en reaktor som holdes ved 66 °C, settes 8,3 ml av en 0,0063 mol/l cesiumhydroksyd-oppløsning. pH-verdien i oppløsningen måles og benyttes som måleverdi (pH = 10,75). Under omrøring tilsettes på en gang 50 mg oligosakkarid med formel (II) der n er lik 0, Ri og Re betyr en SC^Na-rest og M er natrium. pH-verdien reguleres så til og holdes ved 10,75 ved kontinuerlig tilsetning av en 0,476 mol/1 cesiumhydroksydoppløsning. Efter 20 timer stanses tilsetningen av cesiumhydroksyd og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 °C. HPLC-analyse i ioneparmodus tillater å følge transformeringen til derivatet med formel (I) der n er lik 0, Ri og Re betyr en S(>jNa-rest og M er natrium eller cesium. I dette tilfellet viser HPLC at transformeringen forløper til 90,3 %. Utbyttet ved ekstern kalibrering er 73 %.

Eksempel 8

Til en reaktor som holdes ved 66 °C, settes 8,3 ml av en 0,0063 mol/l tetrabutyl-ammoniumhydroksydoppløsning. pH-verdien i oppløsningen måles og benyttes som måleverdi (pH = 10,95). Under omrøring tilsettes på en gang 50 mg oligosakkarid med formel (II) der n er lik 0, Ri og Re betyr en SChNa-rest og M er natrium. pH-verdien reguleres så til og holdes ved 10,95 ved kontinuerlig tilsetning av en 0,521 mol/l tetra-butylammoniumhydroksydoppløsning. Efter 16 timer stanses tilsetningen av cesiumhydroksyd og reaksjonsblandingen avkjøles til 25 °C. HPLC-analyse ved ioneparmodus tillater å følge transformeringen til derivatet med formel (I) der n er lik 0, Ri og Re betyr en SOaNa-rest og M er natrium eller tetrabutylammonium. I dette tilfellet viser HPLC-analyse at transformeringen forløper 96,7 %. Utbyttet ved ekstern kalibrering er 65 %.

Medikamenter kan inneholde som aktiv bestanddel minst et oligosakkarid med formel (I) eller en blanding av oligosakkarider med formel (I) i form av et preparat der det er assosiert til et hvilket som helst annet farmasøytisk, kompatibelt produkt som eventuelt kan være inert eller fysiologisk aktivt. Medikamentene kan benyttes intravenøst, subkutant, oralt, rektalt, topisk eller pulmonært (inhalering).

Sterile preparater for intravenøs eller subkutan administrering er generelt vandige opp-løsninger. Disse preparater kan likeledes inneholde adj uvanter og særlig fuktemidler, isotoniseirngsmidler, emulgatorer, dispergatorer og stabilisatorer. Steriliseringen kan skje på flere måter, for eksempel ved aseptiserende filtrering, ved å innarbeide sterili-serende midler i blandingen eller ved bestråling. De kan likeledes fremstilles i form faste, sterile preparater som kan oppløses på brukstidspunktet i sterilt vann eller et hvilket som helst annet sterilt injiserbart medium.

Som faste preparater for oral administrering kan man benytte tabletter, piller, pulvere (gelatinkapsler, poser) eller granuler. I disse preparater blir den aktive bestanddel blandet med et eller flere inerte fortynningsmidler som stivelse, cellulose, sakkarose, lactose eller litiumdioksyd, under en argonstrøm. Disse preparater kan likeledes omfatte andre stoffer enn fortynningsmidlene, for eksempel et eller flere smøremidler som magnesiumstearat eller talkum, et middel favoriserer oral absorpsjon, farvestoffer, omhyllinger (dragéer) eller en ferniss.

Som flytende preparater for oral administrering kan man benytte farmasøytisk aksep-table oppløsninger, suspensjoner, emulsjoner, siruper og eliksirer inneholdende inerte fortynningsmidler som vann, etanol, glycerol, vegetabilske oljer eller paraffinolje. Disse preparater kan omfatte stoffer i tillegg til fortynningsmidlene, for eksempel fuktemidler, luktstoffer, fortynningsmidler, aromastoffer og stabilisatorer.

Preparater for rektal administrering er suppositorier eller rektalkapsler som i tillegg til den aktive bestanddel inneholder drøyemidler som kakaosmør, semi-syntetiske glyce-rider eller polyetylenglycoler.

Preparater for topisk administrering kan for eksempel være kremer, lotioner, collyrer, collutorier, nesedråper eller aerosoler.

Dosene avhenger av den tilsiktede effekt, behandlingens varighet og den benyttede administreringsvei; de ligger generelt mellom 0,5 og 10 mg/kg/dag subkutant eller 3 til 60 mg/dag for en voksen person på 60 kg.

Rent generelt bestemmer legen den egnede posologi som funksjon av alder, vekt og alle andre relevante faktorer hos individet som skal behandles.

Oligosakkaridene med formel (I) kan således benyttes for prevensjon eller terapi av neurodegenerative sykdommer for hvilke den cerebrale inflammasjon spiller en skadelig rolle som kan føre til død og blant hvilke kan nevnes ischemier i sentralnervesystemet, celebrale ischemier, ischemier i retina og cochlea, kardial ischemier (myokardisk infarkt), perifere ischemier, traumatismer i sentralnervesystemet og særlig kranie-, spinal- eller kranio-spinal traumatismer, traumatismer i retina og cochlea, plaque-skleroser, neuropatiske smerter og perifere neuropatier, motoneuronsykdommer som amyotrofisk lateralsklerose, neuro-aids, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons corea og visse former for osteoartritt, særlig ved artikulær lokasjon.

Claims

1. Oligosakkarider, karakterisert ved formelen: der n et helt tall fra 0 til 25, Ri, R3, R4 og R5 er like eller forskjellige og betyr et hydrogenatom eller en SOsM-rest, R2 og Re er like eller forskjellige betyr et hydrogenatom eller en SO3M- eller COCH3-restog M er natrium, kalsium, magnesium eller kalium, blandinger av slike oligosakkarider og deres diastereoisomerer.

2. Oligosakkarider med formel (I) ifølge krav 1, karakterisert ved at R4 er et hydrogenatom, blandinger av slike oligosakkarider og deres diastereoisomerer.

3. Oligosakkarider ifølge krav I eller 2, karakterisert v e d at n er et helt tall rfa 0 til 10, blandinger av slike oligosakkarider og deres diastereoisomerer.

4. Oligosakkarider ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at n er et helt tall fra 0 til 6, blandinger av slike oligosakkarider og deres diastereoisomerer.

5. Oligosakkarider ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at n er et helt tall fra 1 til 6, blandinger av slike oligosakkarider og deres diastereoisomerer.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av oligosakkarider med formel (I) ifølge krav 1, karakterisert ved at man omsetter et alkalimetall- eller kvaternært ammoniumhydroksyd med oligosakkarider med formelen: der ner et helt tall fra 0 til 25, Ri, R3, R4 og R5 er like eller forskjellige og betyr et hydrogenatom eller en SOjM-rest, R2 og Re er like eller forskjellige og betyr et hydrogenatom, eller en SO3M- eller COCH3-restog M er natrium, kalsium, magnesium eller kalium, eller en blanding av disse, og isolerer oligosakkaridene eller deres blandinger.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at reaksjonen gjennomføres i vandig medium ved en temperatur på 40 til 80 °C og en pH-verdipå 10 til 13.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert v e d at man benytter en vandig 1 til 5 %-ig hydroksydoppløsning av et alkalimetall eller et kvaternært ammonium.

9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 8, karakterisert ved at reaksjonen skjer ved en temperatur fra 60 til 70 °C.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 9, karakterisert ved at pH-verdien i reaksjonen er 11 til 12,5.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 10, karakterisert ved at hydroksydet av kaliummetall eller kvaternært ammonium er et natrium-, kalium-, litium- eller cesiumhydroksyd eller tetrabutyl-ammomumhydroksyd.

12. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder minst et oligosakkarid ifølge krav 1.

13. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder minst et oligosakkarid i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 5.

14. Anvendelse av oligosakkarider med formel (I) ifølge et av kravene 1 til 5 for fremstilling av et medikament for anvendelse ved prevensjon eller terapi av sykdommer forbundet med en inflammatorisk prosess som inkluderer produksjon av nitrogenoksyd (NO).

15. Anvendelse av oligosakkarider med formel (I) ifølge krav 14 for fremstilling av medikamenter til bruk ved prevensjon eller terapi av celebrale, kardiale eller perifere vasku-lære iskemier, osteoartritter, traumatismer i sentralnervesystemet, kranie-, spinal- eller kranio-spinal traumatismer, plaque-sklerose, neuropatiske smerter og perifere neuropatier, motoneuronsykdommer, amyotrofisk lateralsklerose, neuro-aids, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntingtons corea.