CN104630197A - 一种来自脑膜脓毒性金黄杆菌的肝素酶及其制备和应用 - Google Patents

一种来自脑膜脓毒性金黄杆菌的肝素酶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了从脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)细菌中得到新型肝素酶CMhep，为未经过报道的新型肝素酶。酶的获得是通过将筛选得到的细菌发酵培养、粗酶提取、多步柱层析等步骤最终得到。性质研究表明该酶在酶解肝素方面具有特异性，有望用于低分子肝素制备或肝素类质量检测方面。

Description

一种来自脑膜脓毒性金黄杆菌的肝素酶及其制备和应用
技术领域
本发明涉及前未报道过的新型肝素酶，具体而言是涉及来源于脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)，经过细菌发酵、细胞破碎、多步柱层析分离技术制备出来的一种新型肝素酶CMhep，以及该酶的制备方法及其在肝素和低分子肝素质量检测方面的应用。
背景技术
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，其应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、制备低分子肝素、用于肝素结构的研究和质量检测等。肝素酶最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后又陆续在一些微生物和动物组织中也发现了肝素酶的存在。目前有学术论文报道的肝素酶有10多种，例如Yang V.C.从肝素黄杆菌中发现肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，Robert W. Bellamy等人从杆菌属BH100(FERM BP-2613)细菌中发现的产生于胞外的肝素酶，Wan-Seok Kim等人从粪便拟杆菌HJ-15中发现一种肝素裂解酶[Carbohydrate Research,2012,359:37-43]。
目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ，他们分别是分子量大约为43、78、66kDa的单体蛋白质，等电点均在9.0左右。肝素酶的发现为肝素结构研究和质量检测起了重要的推动作用，其中产自肝素黄杆菌的酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ已经用于肝素类质量检测和低分子肝素生产。
本发明所阐述的肝素酶为未经报道过的新型肝素酶，其理化性质不同于目前已知肝素酶，且酶解肝素时酶切位点选择性强，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明给出了从细菌脑膜脓毒性金黄杆菌中纯化出的一种新型胞内肝素酶CMhep，描述纯化方法和所得酶的性质。CMhep的分子量为102090.5Da，米氏常数为0.0107，等电点为6.05，该肝素酶为目前未经报道的新型肝素酶，能降解肝素（HEP）和硫酸乙酰肝素（HS）。
本发明包括以下：
1. 菌种来源：从中国广东省深圳市南山区园博园土样中分离得到一株菌种（编号YBY-7），在含肝素的培养基中培养时能产生肝素酶。将该菌种培养在斜面培养基上，-70℃保藏。经广东省微生物分析检测中心鉴定，该菌种为脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)。该菌种为一种常见的致病菌，目前没有产肝素酶的相关报道。
2. CMhep肝素酶的制备：
（1） 脑膜脓毒性金黄杆菌的发酵及粗酶液制备：
将菌体从平板或斜面上刮取两环接种到种子培养基中，培养1-2天后，按5-20%接种量接入二级液体种子培养基中，培养1-2天，再按5-20%接种量接入2L发酵培养基中，培养1-5天。收集菌液以10000rpm，4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机4℃，800bar，破碎1-5个循环，离心30min，收取上清，冰浴条件下做硫酸铵沉淀，收取硫酸铵饱和度40%-75%的沉淀。将沉淀溶解于100ml的Tris-HCl缓冲液中，于相同的缓冲液中透析过夜。
（2）Octyl柱的粗纯化：
在步骤（1）中透析后的酶液中加入硫酸铵粉末，冰浴搅拌，使酶液的硫酸铵饱和度达到40%，上样于一根含硫酸铵饱和度为40%的Tris-HCl缓冲液平衡过的Octyl柱，然后以同样缓冲液平衡，再以Tris-HCl缓冲液中硫酸铵饱和度为40%-0的洗脱液线形梯度洗脱，用试管收集各有酶活的洗脱组分，即为肝素酶CMhep，合并后用Tris-HCl缓冲液透析。
（3）CS柱纯化酶：
将步骤（2）中得到的透析后不含硫酸铵的酶液上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后再以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各具有肝素酶活性的组分，用Tris-HCl缓冲液透析。
（4）Q柱纯化酶：
将步骤（3）中得到的透析后的酶液上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，再以同样缓冲液平衡，然后再以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各具有肝素酶活性的组分，用Tris-HCl缓冲液透析。
（5）CS柱再纯化：
将步骤（4）中得到的透析后的酶液上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，以含0.11M氯化钠的同样缓冲液洗脱，检测并收集有活性组分。加入等体积的Tris-HCl缓冲液，混匀后上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中0-1M氯化钠线形梯度洗脱，收集活性组分，合并，浓缩，即得到电泳纯度的肝素酶CMhep。
过程中肝素酶、硫酸乙酰肝素酶活性测定参考专利“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的制备方法”（专利申请号201110241260.4）。蛋白质含量测定及酶纯度测定方法参考文献[Carbohydrate Research,2012,359:37-43]。
步骤（1）所述的种子培养基组成参考专利“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的制备方法”（专利申请号201110241260.4）。
步骤（1）中所述的发酵培养基组成（g/L）为：胰蛋白胨 2， 肝素 8， NaCl 5， (NH4)2SO4 1， KH2PO4 2.5， MgSO4·7H2O 0.5， pH7.0。
步骤(1)、（2）、(3)、(4)、(5)中所述的Tris-HCl缓冲液为含CaCl2的Tris-HCl, pH6.5-8.0，Tris-HCl优选的浓度为10-50mM，最优选的浓度为25mM；CaCl2的含量优选1-50mM，最优选10 mM；优选的pH范围为7.0-7.5，更优选7.0。
步骤(2)所述的Octyl柱为Octyl Sepharose CL-4B，也可为其它的可与肝素酶结合的疏水柱。
步骤(3)、(5)中所述的CS柱为Cellufine Sulfate，也可为结合了肝素的CNBr-activated Sepharose CL-4B等可与肝素酶结合的亲和柱。
步骤(4)中所述的Q柱为Q-Sepharose Fast Flow，也可为Q-Sepharose Big Beads、Q-Sepharose XL、Q-Sepharose High Performance等强阴离子交换柱。
3. 肝素酶的性质
（1）本发明所涉及的肝素酶CMhep用MALDI-TOF-MS质谱法测定其确切分子量为102090.5Da。
（2）本发明所涉及的肝素酶CMhep用等电点聚焦电泳测定其等电点为6.05。
（3）本发明所涉及的肝素酶CMhep，以HEP和HS为底物，最佳反应pH分别为8.0和7.5。
（4）本发明所涉及的肝素酶CMhep以HEP和HS为底物的最佳反应温度分别均为41℃。
（5）对本发明所涉及的肝素酶CMhep，K+、Mg2+、Na+、Mn2+和Ca2+均显示促进酶活的作用，其中Ca2+的作用最强，而Cu2+、Fe2+和Fe3+具有抑制酶活的作用。
本发明提供了一种来源于脑膜脓毒性金黄杆菌的肝素酶，通过该细菌发酵、细胞破碎、硫酸铵沉淀和多步柱层析分离纯化而来。所述肝素酶CMhep的理化性质，包括分子量、等电点均不同于目前已知的其它肝素酶，该肝素酶对HEP和HS酶解，得到的双糖组成与已知肝素酶相比具有特异性，该酶可以用来对肝素及其类似物的结构进行分析，可以用于肝素质量的检测，以及制备低分子肝素。
附图说明
图1. CMhep纯化酶的SDS-PAGE图。
图2. CMhep酶解HEP产物组分SAX-HPLC液相分析图。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：CMhep的制备
a) 脑膜脓毒性金黄杆菌的发酵及粗酶液制备：将菌种从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，30℃，150rpm，培养12小时，然后按10%接种量接入200ml的二级液体种子培养基中，30℃，150rpm，培养24小时，然后按10%接种量接入2L发酵培养基中，30℃，150rpm，培养24小时。取1L菌液10000rpm，4℃离心30min，收集沉淀，悬浮在100ml的25mM Tris-HCl(含10mM CaCl2, pH7.0)的缓冲液中，用高压均质机4℃，800bar，破碎三个循环，然后4℃，10000rpm,离心30min，上清即为粗酶液。做硫酸铵沉淀，收集硫酸铵饱和度为40%-75%的沉淀，将沉淀溶解于100ml的Tris-HCl缓冲液中，于相同的缓冲液中透析过夜。
b）Octyl柱的粗纯化：在步骤a）中透析后的酶液中加入硫酸铵粉末，使硫酸铵的饱和度达到40%，上样于一根用含硫酸铵饱和度为40%的10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的规格为2.0×60cm的Octyl柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积。再以Tris-HCl缓冲液中硫酸铵饱和度为40%-0的洗脱液各150ml线形梯度洗脱，用试管收集各有酶活的洗脱组分，即为肝素酶CMhep，合并后用2L的Tris-HCl缓冲液透析。
c）CS柱纯化：将步骤b）中透析后的酶液上样于用10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的规格为2.5×30cm的CS柱，再以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后在缓冲液加入氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各活性组分，用2L体积的10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液过夜透析。
d) Q柱纯化：将步骤c)中透析过的酶液上样于用10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的规格为2.5×30cm的Q柱，再以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后在缓冲液加入氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各活性组分，用2L体积的10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液过夜透析。
e) CS柱再纯化：将步骤d)中透析过的酶液上样于用10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的CS柱，然后在同样缓冲液中加入0.11M氯化钠，洗脱800ml，收集有活性组分。
f) CS柱浓缩：将步骤e)的有酶活组分加入等体积的缓冲液，上样于一根用10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的CS柱，然后在缓冲液加入氯化钠0-1M线形梯度洗脱，收集各活性组分，用30KD的超滤离心管超滤浓缩至200μL，取出置于1.5ml的EP管中，加300μl的10mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）的缓冲液，再加入500μl甘油，定容至1ml。最终酶做SDS-PAGE，结果如图1所示。纯化流程各步骤所得酶活和蛋白含量如下表所示: 
CMhep纯化步骤 体积(ml) 总蛋白(mg) HEP酶活(IU/ml) 总活力(IU) 比活(IU/mg) 纯化倍数 产率(%)
粗酶 160 65.80 1.052 168.32 0.126 / /
硫铵沉淀 92 25.76 1.546 142.23 5.521 2.16 84.50
Octyl柱 150 5.23 0.361 54.15 10.314 4.04 32.17
CS柱 39 0.89 0.855 33.35 37.174 14.64 19.81
Q柱 23 0.299 1.152 26.50 88.615 34.62 15.74
CS柱II 1 0.078 10.87 10.87 139.36 54.44 6.46
表1. CMhep纯化各步骤酶活和蛋白含量
实施例2：CMhep的性质研究
经MALDI-TOF-MS质谱测定分析CMhep的确切分子量为102090.5Da。
经等电点聚焦电泳测定，CMhep的等电点是6.05。
以不同的底物浓度测定各条件下酶反应的初速度，以求得米氏常数，经测定，CMhep以HEP和HS为底物时米氏常数分别为0.0107和0.1147。
肝素酶CMhep分别以HEP和HS为底物，将底物pH分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0九个梯度，测定上述底物中酶的活性，结果显示，在以HEP为底物时具有活性的pH范围是6.5-9.0，最优的pH为8.0，以HS为底物时，具有活性的pH范围是6.5-9.0，最优的pH为7.5。
肝素酶CMhep分别以HEP和HS为底物，将底物温度分别设置为25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49℃几个梯度，测定上述底物中酶的活性，结果显示，在以HEP和HS为底物时最优的温度条件均为41℃。
金属离子种类对CMhep的影响：分别以10mM Tris-HCl（pH7.0）为缓冲液，考察了在底物HEP和HS中分别添加10mM的Mg2+、Mn2+和Ca2+、Na+、 K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+等金属离子对酶的影响，以不添加任何金属离子为空白对照组，所得结果显示，在添加金属离子的情况下，K+、Mg2+、Na+、Mn2+和Ca2+均显示了促进酶活的作用，其中Ca2+的促进作用最强，酶活大幅度提高，其次Mg2+和Na+也具有明显的促进作用，而Cu2+、Fe2+和Fe3+具有抑制酶活的作用，使酶失活。
金属离子浓度对CMhep的影响：考察了对酶具有促进作用的Mg2+、Na+和Ca2+在0、1、10、50、100、500和1000mM的浓度下肝素酶活性的影响，结果显示在以HEP和HS为底物时，Mg2+对CMhep的活性促进作用最强的分别是100mM和50mM。在以HEP和HS为底物时，Na+对CMhep的活性促进作用最强的均为100mM。Ca2+对CMhep的活性促进作用最强的分别是100mM和50mM。
变性剂对CMhep的影响：分别考察了H2O2、乙腈、SDS、盐酸胍和尿素作为变性剂，并将各自的浓度分别设置为1mM和10mM的H2O2、1%和10%的乙腈、1%的SDS、1M的盐酸胍以及1M的尿素，并设置不添加任何变性剂的空白对照组，以此考察变性剂对肝素酶CMhep活性的影响。在上述变性剂存在的条件下，1%和10%的乙腈、1M尿素对CMhep酶的影响较小，而1mM 和10 mM 的H2O2、1%SDS、1M盐酸胍对CMhep有显著的抑制作用。
实施例3：CMhep酶解HEP的产物特异性研究
a) CMhep底物特异性研究：分别以肝素（HEP）、硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸软骨素（CS）、硫酸皮肤素（DS）为底物，测定CMhep的活性，发现CMhep酶在以CS和DS为底物时没有酶活，在以HEP和HS为底物时有酶活，且活性比约为HEP：HS=1:2。
b) CMhep酶解HEP双糖分析：在50mg的肝素中加入3IU（以肝素为底物的酶活）的CMhep，用缓冲液25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）定容至500μL，37℃条件下酶解24h，然后置于100℃水浴中，灭活5min，样品进行二糖组分液相分析，结果如图2所示，CMhep酶解HEP后，产物主要组分为ⅠS、ⅡS、ⅢS和ⅠA，酶解产物种类较少，与目前已知的肝素黄杆菌酶解HEP的性质和产物不同。因此CMhep酶在肝素质量检测及低分子肝素的制备等方面具有潜在的应用价值。

Claims (8)

1.从脑膜脓毒性金黄杆菌细菌中得到的新型肝素酶CMhep。
2.根据权利要求1所述的从脑膜脓毒性金黄杆菌细菌中得到的新型肝素酶CMhep，其特征在于肝素酶CMhep的分子量为102090.5Da。
3.根据权利要求1所述的从脑膜脓毒性金黄杆菌细菌中得到的新型肝素酶CMhep，其特征在于肝素酶CMhep的等电点为6.05。
4.从脑膜脓毒性金黄杆菌中得到新型肝素酶CMhep的方法，包括以下步骤：
(1) 将脑膜脓毒性金黄杆菌接种于斜面培养基；
(2) 将步骤(1)所述的菌种接种到种子培养基中，培养1-2天后，接入二级液体种子培养基中，培养1-2天，再接入2L发酵培养基中，培养1-5天，收集细胞；
(3) 将步骤(2)所述的细胞悬浮在Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机破碎细胞，离心取上清，冰浴条件下做硫酸铵沉淀，收集饱和度40%-75%的沉淀组分，将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液中，透析；
(4) 将步骤(3)中的酶液上样于一根含硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡过的Octyl柱，再以同样缓冲液平衡，以同样缓冲液中硫酸铵饱和度40%-0线形梯度洗脱，收集洗脱液中有肝素酶活性的组分，合并透析即为肝素酶CMhep；
(5) 将步骤(4)中的CMhep酶液上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后再以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各具有肝素酶活性的组分，透析后上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，以同样缓冲液平衡，然后以Tris-HCl缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各活性组分，透析后上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液含0.11M氯化钠等度洗脱，检测并收集有活性组分，上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中0-1M氯化钠线形梯度洗脱，收集活性组分，合并，浓缩，即得到纯化后的CMhep酶。
5.根据权利要求4所述的从脑膜脓毒性金黄杆菌中得到新型肝素酶CMhep的方法，其特征在于步骤(3)、(4)、(5)、(6)中所述的Tris-HCl缓冲液为含CaCl2的Tris-HCl，pH6.5-8.0，Tris-HCl的浓度为10-50mM。
6.根据权利要求4所述的从脑膜脓毒性金黄杆菌中得到新型肝素酶CMhep的方法，其特征在于步骤(4)所述的Octyl柱为Octyl Sepharose CL-4B， 步骤(5)中所述的CS柱为Cellufine Sulfate， 步骤(5)中所述的Q柱为Q-Sepharose Fast Flow。
7.新型肝素酶CMhep用于肝素、低分子肝素、超低分子肝素的质量检测。
8.新型肝素酶CMhep用于低分子肝素、超低分子肝素的生产制备。
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