CN102965362A

CN102965362A - 一种肝素黄杆菌肝素酶ⅱ的制备方法

Info

Publication number: CN102965362A
Application number: CN2012104928015A
Authority: CN
Inventors: 马小来; 史绍鹏; 李锂
Original assignee: SHENZHEN HEPALINK PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2032-11-28
Also published as: CN102965362B

Abstract

本发明提供肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养，再接到发酵培养基，离心收集沉淀，沉淀超声破碎，离心得到肝素黄杆菌肝素酶的粗酶液，然后将粗酶液通过硫酸铵沉淀分离去部分杂质，再通过一次SP-SepharoseFF层析分离出肝素酶Ⅱ，再通过肝素亲和柱层析、CellufineSulfate柱层析、SP-HPLC等步骤的精细纯化最终制备出高纯度肝素酶Ⅱ。

Description

一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法

技术领域

本发明涉及一种肝素酶Ⅱ的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙保护之下，含硫酸铵沉淀分离、SP-Sepharose FF柱层析、肝素亲和柱层析、Cellufine Sulfate柱层析、SP-HPLC等步骤的纯化制备肝素酶Ⅱ的方法。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ。肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是分子量大约43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9.0左右，应用和研究非常广泛。

肝素酶的纯化工作有许多研究报道，Yang等（J Biol Chem, 1985, 260 (3):1849-1857）用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，制得纯肝素酶Ⅰ，活性收率大约1%。Daniel等（J Bio Chem, 1992,267(34): 24347-24355）用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-Sepharose柱层析、HA-HPLC、Mono-S FPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶Ⅰ，比活性达到130IU/mg，活性回收率为10.8%；用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-Sepharose柱层析、HA-HPLC、GPC-HPLC等四步纯化，最终获得纯的肝素酶Ⅱ，比活性达到19IU/mg，活性回收率为1.02%；用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-Sepharose柱层析、HA-HPLC、Mono-S FPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶Ⅲ，比活性达到63.5IU/mg，活性回收率为2.74%。

发明人（食品与药品，2005，32（5）：446-450）使用羟基磷灰石吸附/解吸、DEAE－Sepharose柱层析、CM－Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到肝素酶Ⅰ，活性收率13.4%；并（J Chrom B,2006,843(2):209-215）通过硫酸铵沉淀、octyl-sepharose 柱层析、CM-650柱层析、SP-650 柱层析、sephadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯化的肝素酶Ⅰ，收率达到17.8%。在2009年5月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ制备方法”（专利申请号200910039360.1）中，建立了一种全新的纯化制备工艺，获得高达30%的纯酶活性收率，制备的肝素酶Ⅰ比活高达223IU/mg。在2011年8月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ制备方法”（专利申请号201110241260.4）中，给出一种同时制备纯化出肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的方法，制备的肝素酶Ⅰ、Ⅲ比活高达417和235IU/mg，肝素酶Ⅱ比活为15.3IU/mg。

本专利给出一种肝素酶Ⅱ的制备方法，通过多步柱层析，制备出高纯度肝素酶Ⅱ，比活进一步提高到27.2 IU/mg。方法高效、可重复，所得酶纯度极高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高纯度肝素酶Ⅱ的制备方法，该方法可纯化出高纯度肝素酶Ⅱ，其比活高于文献最高报道值。

本发明包括下述步骤：

（1）肝素酶粗酶液的制备：

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃、150rpm培养1天。然后按5%接种量接入发酵培养基，23℃、150rpm培养2-3天。菌液10000rpm、4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在25mM Tris-HCl缓冲液中，冰浴超声（150W，超5s，停5s）。4℃、10000rpm离心30min，上清即为粗酶液；

（2）硫酸铵沉淀除杂质：

冰浴中向粗酶加入等体积的溶于10-25mM Tris-HCl 缓冲液的饱和硫酸铵溶液，缓慢滴加，加完后冰浴中缓慢搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min。取上清，冰浴中向其中再缓慢加入干燥的硫酸铵粉末（153g/L溶液）至饱和度70%，搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min。弃上清，将沉淀以25mM Tris-HCl缓冲液适量溶解，装入截留分子量10KD透析袋中对100倍体积上述缓冲液过夜透析，得去除杂质后的酶液；

（3）肝素酶Ⅱ的SP柱（使用SP-sepharose FF填料）分离：

将步骤(1)所得粗酶液上一根用10-25mM的Tris-HCl平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的洗脱液，收集液各管随洗脱的进行呈两个分离完全的活性峰靠前的那个为肝素酶Ⅱ，靠后的那个为肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ的混合物；

（4）肝素酶Ⅱ的肝素亲和层析（HEP柱，填料为键合了肝素的Sepharose 4B）纯化：

步骤（3）肝素酶Ⅱ活性峰洗脱液透析后上一根用5-10mM Tris-HCl缓冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.1M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析；

（5）肝素酶Ⅱ的CS（Cellufine Sulfate）柱纯化：

步骤（4）得到的酶液上一根用10-50mMTris-HCl缓冲液平衡过的Cellufine Sulfate柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1.5M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析；

（6）肝素酶Ⅱ的SP-HPLC纯化：

步骤（5）得到的酶液上一根用10mM Tris-HCl缓冲液平衡过的SP-HPLC柱，以同样缓冲液中氯化钠线形梯度0-1.0M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶Ⅱ。

其中，步骤(1)所述的种子培养基的组成为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L ，酵母粉 5 g/L，NaCl为5 g/L，pH7.0。

步骤（1）所述的发酵培养基组成为：肝素8g/L，K₂HPO₄ 2.5 g/L，NaH₂PO₄ 2.5 g/L，NH₄Cl 2.0 g/L，MgCl₂ 0.5 g/L，组氨酸 0.5 g/L，甲硫氨酸 0.5 g/L，微量元素（NaMoO₃、CuCl₂、FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、CaCl₂各1×10^-4M）。

步骤（1）、（2）、（3）、（5）、（6）所述Tris-HCl缓冲液均含10mM CaCl₂、且其pH6.5-8.0，优选pH范围为7.0-7.5。

步骤（4）所述Tris-HCl缓冲液，其pH6.5-8.0，优选pH范围为7.0-7.5。

步骤（4）所使用的肝素亲和层析（HEP柱）的填料为键合了肝素的Sepharose 4B，亲和配基与填料的偶联采用GE公司标准方法，见GE Healthcare公司CNBr-activated Sepharose?4B使用说明书（Instructions 71-7086-00AF）

本发明中肝素酶活性检测和蛋白浓度检测方法，见发明人在2011年8月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ制备方法”（专利申请号201110241260.4）。

本发明所述制备方法中，肝素酶Ⅱ在纯化过程中使用了保护剂CaCl₂，这保持了肝素酶Ⅱ活性的稳定，提高了收率。

本发明还采用了肝素亲和柱层析法纯化肝素酶Ⅱ的方法，这个方法特异性好，纯化效率很高。曾有报道认为酶对填料中的肝素存在降解，所以肝素柱不能用于纯化肝素酶。本发明经过长期实验检验，认为肝素亲和柱是能够用于肝素酶Ⅱ纯化的，而且效果很好。需要注意的是，可能因为纯化中酶的降解作用，该填料在使用大约10次后效果下降，需要再生一次，然后即可重新使用。

经过本发明的制备工艺，最终得到比活高达27.19 IU/mg的肝素酶Ⅱ，从1L发酵液的菌体中得到9.29 IU的肝素酶Ⅱ纯酶。

与已报道方法相比，酶Ⅱ比活超过了最高报道19 IU/mg（可查到的最高报道值出现在文献Daniel LL, Robert JL. Purification and Characterication of Heparin Lyases from Flavobacterium heparinum. J BioChem, 1992,267(34):24347- 24355.）。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例：

a、将肝素黄杆菌从种子斜面接1环菌到50ml种子培养基（组成为牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 5 g/L，pH7.0）中，23℃、150rpm培养1天；将得到的50ml种子液接入1L发酵培养基（组成为肝素8g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，NaH₂PO₄ 2.5g/L，NH₄Cl 2.0g/L，MgCl₂ 0.5g/L，组氨酸 0.5g/L，甲硫氨酸 0.5g/L，微量元素（NaMoO₃、CuCl₂、FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、CaCl₂各1×10^-4M），23℃、150rpm培养2-3天，4℃、10000rpm离心30分钟，收集沉淀；沉淀悬浮在100ml、25mM 的Tris-HCl(含CaCl₂ 10mM， pH7.0)缓冲溶液中，冰浴超声2小时，250W、超5s、停5s模式，4℃、10000rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液；

b、冰浴中向粗酶加入等体积的溶于25mM Tris-HCl（pH7.0，含CaCl₂ 10 mM）缓冲液的饱和硫酸铵溶液，缓慢滴加，加完后冰浴中缓慢搅拌30min，然后18000rpm离心30min。取上清，冰浴中再缓慢加入干燥的硫酸铵粉末（153g/L溶液）至饱和度70%，搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min。弃上清，将沉淀以25mM Tris-HCl（pH7.0，含CaCl₂ 10mM）缓冲液30ml溶解，装入截留分子量10KD透析袋中对100倍体积上述缓冲液过夜透析，得38ml酶液，总肝素酶活力100.7IU，总蛋白642.11mg；

c、将硫酸铵沉淀后的酶上一根SP-sepharose FF柱（2.5cm×10cm），以25mM Tris-HCl（pH7.0，含10mM CaCl₂）平衡100ml，以同样缓冲液中NaCl线形梯度0-0.5M洗脱400ml。洗脱速度1ml/min，自动收集，每管3-4ml，检测每管的肝素降解能力。可发现酶分为两个活性峰，收集前面那个活性峰所属各管酶液，装入截留分子量10KD透析袋中对100倍体积10mM Tris-HCl（pH7.0）缓冲液过夜透析，得26ml酶液，总肝素酶活力17.69IU，总蛋白1.74mg；

d、将SP柱分离后的酶上一根用10mM Tris-HCl（pH7.0）缓冲液平衡过的HEP柱（1.6cm×10cm），以同样缓冲液平衡3个柱体积，10mM Tris-HCl（pH7.0）缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.1M洗脱，收集有活性的洗脱液若干管，合并、透析，得56ml酶液，总肝素酶活力10.13IU，总蛋白0.98mg；

e、将HEP柱纯化后的酶上一根用50mM Tris-HCl（含CaCl₂ 10 mM，pH7.0）缓冲液平衡过的CS柱（1.6cm×10cm），以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，得15ml酶液，总肝素酶活力10.02IU，总蛋白0.38mg；

f、将CS柱纯化后的酶上一根连接在Waters e2796型HPLC纯化设备上的Waters公司的Protein-Pak?SP HPLC柱（8HR，1000?，8μm)，以10mM Tris-HCl（含CaCl₂ 10 mM，pH7.0）缓冲液平衡柱子，每次上样1ml，以同样缓冲液含氯化钠线形梯度0-1.0M洗脱，流速0.8ml/min。收集洗脱液若干部分，合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到1ml肝素酶Ⅱ，总肝素酶活力9.29IU，总蛋白0.34mg；

最终从1L发酵液的菌体中得到9.29 IU的肝素酶Ⅱ纯酶，比活高达27.19 IU/mg。

Claims

1.一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法，所述方法包括下述步骤：

（1）肝素酶粗酶液的制备：

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃、150rpm培养1天，然后按5%接种量接入发酵培养基，23℃、150rpm培养2-3天，菌液10000rpm、4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在25mM Tris-HCl缓冲液中，冰浴超声（150W、5s、5s），4℃、10000rpm离心30min，上清即为粗酶液；

（2）硫酸铵沉淀除杂质：

冰浴中向粗酶加入等体积的溶于10-25mM Tris-HCl 缓冲液的饱和硫酸铵溶液，缓慢滴加，加完后冰浴中缓慢搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min，取上清，冰浴中向其中再缓慢加入干燥的硫酸铵粉末（153g/L溶液）至饱和度70%，搅拌30min，然后18000rpm离心30min，弃上清，将沉淀以25mM Tris-HCl缓冲液适量溶解，装入截留分子量10KD透析袋中对100倍体积上述缓冲液过夜透析，得去除杂质后的酶液；

（3）肝素酶Ⅱ的SP柱分离：

将步骤（1）所得粗酶液上一根用10-25mM的Tris-HCl平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的洗脱液，收集液各管随洗脱的进行呈两个分离完全的活性峰靠前的那个为肝素酶Ⅱ，靠后的那个为肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ的混合物；

（4）肝素酶Ⅱ的肝素亲和层析纯化：

（5）肝素酶Ⅱ的CS（Cellufine Sulfate）柱纯化：

（6）肝素酶Ⅱ的SP-HPLC纯化：

步骤（5）得到的酶液上一根用10mM Tris-HCl缓冲液平衡过的SP-HPLC柱，以同样缓冲液中氯化钠线形梯度0-1.0M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶Ⅱ；

其中，步骤（1）所述的种子培养基的组成为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L ，酵母粉 5 g/L，NaCl为5 g/L，pH7.0；

步骤（1）所述的发酵培养基组成为：肝素8g/L, K₂HPO₄ 2.5 g/L, NaH₂PO₄ 2.5 g/L, NH₄Cl 2.0 g/L, MgCl₂ 0.5 g/L, 组氨酸 0.5 g/L, 甲硫氨酸 0.5 g/L, 微量元素（NaMoO₃, CuCl₂, FeCl₂, CoCl₂, MnCl₂, CaCl₂，各1×10^-4M）；

步骤（1）、（2）、（3）、（5）、（6）所述Tris-HCl缓冲液均含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0, 优选pH范围为7.0-7.5。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所用SP层析柱的填料优选使用SP-sepharose FF填料，也可使用其他以SP为分离功能基团的蛋白纯化填料或离子交换树脂。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）所用肝素亲和层析柱的填料优选使用键合了肝素的Sepharose 4B，也可使用其他键合了肝素的蛋白纯化填料或离子交换树脂。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述Tris-HCl缓冲液为Tris-HCl溶液，pH6.5-8.0, 优选pH范围为7.0-7.5。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）所用Cellufine Sulfate层析柱的填料优选使用CHISSO公司的亲和层析填料Cellufine Sulfate，也可使用其它公司同类的亲和填料。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（6）所用HPLC设备可为任何一种有一定制备能力的HPLC设备，其SP-HPLC层析柱优选使用Waters公司的Protein-Pak?SP HPLC柱（8HR，1000?，8μm)，也可使用其他以SP为分离功能基团的HPLC柱子。