CN103509778A - 一种卤代酸脱卤酶的提取纯化方法 - Google Patents

一种卤代酸脱卤酶的提取纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株海洋细菌中具有立体选择性脱卤酶的分离纯化方法及其在生物拆分中的应用。该方法从一株海洋细菌施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中分离纯化得到2种具有立体选择性的2-卤代酸脱卤酶，为L-2-卤代酸脱卤酶和D-2-卤代酸脱卤酶。L-2-卤代酸脱卤酶该酶亚基酶表观分子量在约26kDa，在pH8-11的范围内具有很好的反应活性。该酶选择性催化转化手性的L-2-卤代酸，生成构型转变的D-羟基卤代酸。D-2-卤代酸脱卤酶能够催化转化D-2-卤代酸，生成L-2-羟基酸，作为一种手性手性拆分试剂具有良好的应用前景。

Description

一种卤代酸脱卤酶的提取纯化方法
技术领域
本发明设计卤代酸脱卤酶，具体地说是施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）中的卤代酸脱卤酶的分离纯化方法及其应用。
技术背景
卤代有机化合物是精细化工，医药等重要的原料及中间体。脱卤酶是一类能够使卤素从卤代化合物中释放出来的一类酶。它不仅在降解环境有机卤化物中起到重要的作用，而且其立体选择性催化活性在手性拆分及制备手性化合物上也具有良好的应用前景。
目前，已发现的产脱卤酶的细菌绝大部分来自于陆生环境，来自于海洋环境的微生物则极少。海洋中含有丰富的卤素离子，生活在高卤素浓度环境中的海洋生物所产生的卤素有机物也非常高，然而，菌种、气候、海域环境等因素，都会造成酶的性质及活性差异。因而筛选新的卤代酸脱卤酶会对该酶的工业应用奠定良好的基础。
发明内容
本发明的目的是提供卤代酸脱卤酶的分离提纯的方法及用于外消旋的2-卤代酸的手性转化。
为实现上述目的，本发明技术方案如下：
卤代酸脱卤酶的分离提取方法，其以施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）为原料，提取并分离纯化得到两种卤代酸脱卤酶，且两种酶的立体选择性相反。
具体操作过程如下，
1）收集的菌体，用10-100mM的磷酸盐缓冲液（pH6-9）清洗后，超声破碎细胞；
2）于0-10℃，3000~15000rpm离心10-60min，取上清；
3）上清液中加入硫酸铵制成20-40%的硫酸铵饱和度，搅拌1-2h后，离心取蛋白沉淀物，用pH4-10的磷酸盐缓冲液分别重溶后，得到降解D-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶，进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10000Da。
4）在3）的基础上所得的上清进一步加入硫酸制成60-100%的硫酸铵饱和度，搅拌1-2h后，离心去沉淀的蛋白，用pH4-10的磷酸盐缓冲液重溶后，得到降解L-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶，最后用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa.
所述硫酸铵分级沉淀所得卤代酸脱卤酶还可以采用阴离子交换树脂及琼脂糖树脂进一步纯化，具体为：
1)所得两种卤代酸脱卤酶分别经阴离子柱交换柱层析分离。用NaCl(0-1M)或Na2SO4（0-0.3M）进行线性梯度洗脱，得到活性组分。酶液体积与洗脱液体积比为1:20-40。收集活性组分并测定蛋白含量。
2)将离子交换柱所得活性组分经超滤浓缩后，上凝胶柱，用0.02-0.08M，pH4-9的磷酸钾缓冲液洗脱分离，得到卤代酸脱卤酶。
所述阴离子交换树脂为DEAE-Sepharose FF，Q-Sepharose FF，Q-Sepharose XL或Q-sepharose HP。琼脂糖凝胶树脂为SephacrylS200，Superdex 200或Sephadex G100。
外消旋的2-卤代酸的手性转化方法的具体技术方案如下：1mL反应体系中含加入手性的5-50mM 2-卤代酸，50-100mM缓冲液及脱卤酶。在30℃反应0.5-24h后，加入1%（v/v）浓磷酸（85%,w/v）终止反应，得到转化产物。
所述缓冲液为K2HPO4-K2HPO4（pH7.5）时，酶的加入量为：0.1-0.8mL；缓冲液为Glycine-NaOH(pH 10.0)时，酶的加入量为：0.05-0.1mL。
有益效果
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果
1．从施氏假单胞菌中分离纯化得到卤代酸脱卤酶。利用本技术，在施氏假单胞菌中首次分离纯化得到2种具手性选择性的卤代酸脱卤酶。
2．本发明作为一种具有选择性降解卤代酸的脱卤酶具有良好的应用前景。本发明分离得到的卤代酸脱卤酶可将卤代酸选择性脱卤，得到相应的手性羟基酸。
3．由于能够降解卤代酸，且对两种手性的卤代酸起作用，可应用于环境领域，消除卤代酸对环境的危害。
具体实施方式
卤代酸脱卤酶的分离纯化以海洋细菌施氏假单胞菌为原料，采用硫酸铵沉淀，超滤，离子交换柱和凝胶柱分离等多种分离手段相结合的方法，得到较纯的两种卤代酸脱卤酶。L-2-卤代酸脱卤酶能够选择性催化转化L-2-氯丙酸。表观分子量为25kDa。在pH 8-11之间表现出较好的活性。D-2-卤代酸能够催化转化D-2-氯丙酸。分类地位：施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），属于细菌域(Bacteria)，变形菌门(Proteobacteria)，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，假单胞菌目(Pseudomonadales)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，假单胞菌属(Pseudomonas.)。
下述实施例中所用施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 203096；中国典型培养物保藏中心（武汉大学），地址：武汉市武昌珞珈山（武汉大学），邮编：430072，电话：(027)-68752319；其发表于现有的专利，专利申请号为200310111556.X，专利名称是:施氏假单胞菌ZWLR2-1及其制法和应用，菌能降解1-氯-硝基苯。
1、菌体培养：
1）种子液的培养：将施假单胞菌菌种在2216E固体平板培养基中划线，30℃复苏培养，然后在含2216E培养基（10mL）的试管中培养1天，得种子液A。取3-5mL种子液A接种到含2-氯丙酸培养基（100mL/瓶）中培养，经培养48h后得到种子液B。种子液A及种子液B均在摇床（200rpm，30℃）下暗处培养。
a)2216E培养基：在1L的水中，加入蛋白胨（5.0g/L），酵母浸粉（1g/L），FeCl3(0.1g/L），NaCl（30g/L）及琼脂粉（15g/L），培养基pH为7.5，121℃灭菌后，倒平板制成固体培养基后备用。2216E液体培养基除了不含有琼脂粉外，其它成分同固体培养基。
b)2-氯丙酸（2-CPA）液体培养基：培养基中含Na2HPO4·12H2O（12g/L），NaH2PO4·2H2O（1g/L），NaCl（30g/L），酵母浸粉（0.1gL），(NH4)2SO4(2.0g/L),MgSO4·7H2O(0.1g/L)及10mL微量元素母液（见参考文献Van der Ploeg J,Van Hall G,Janssen DB.Characterization of the haloacid dehalogenase from Xanthobacterautotrophicus GJ10 and sequencing of the dhlB gene[J].Journal OfBacteriology,1991,173(24):7925-7933.）。培养基在121℃灭菌20min，冷却后临用前加入1%(v/v)的2-氯丙酸溶液（1mol/L）。
2）菌体摇瓶扩大培养
a)摇瓶培养：取种子液B 3-5mL，接种到2-氯丙酸（2-CPA）液体培养基（100mL培养基/瓶）中。接种后在30℃下暗处200r/min摇床培养，培养48h或菌体置于指数生长后期后，收集菌体。
b)发酵罐培养：在30L培养罐中加入20L的培养基（同摇瓶培养），种子液B为0.6-0.8L。200r/min，30℃下恒温培养。培养24h后，终止培养并收集菌体。
3）菌体的收集：将发酵液离心（6500rpm×15min，4℃），收集底部沉淀的菌体。菌体经磷酸钾缓冲液（K2HPO4-K2HPO4，50mM，pH7.5）重悬清洗2-3次（即初次离心的菌体用相同的缓冲液重悬，相同条件离心收集菌体。重复该过程2-3次）。最后将菌体置于-70℃保存备用。
2、活性检测：
a)D-2-卤代酸脱卤酶的活性测定
标准反应体系为：在1mL的反应体系中，含有D-2-CPA（10mM），K2HPO4-K2HPO4（100mM，pH7.5）及0.8mL的酶液。在30℃反应3h后加入10%（v/v）浓磷酸（85%）终止反应。如有沉淀，12000rpm离心10min去除沉淀，取上清用HPLC检测2-氯丙酸的含量。
b)L-2-卤代酸脱卤酶的活性测定
标准反应体系为：在1mL的反应体系中，含有L-2-CPA（10mM），Glycine-NaOH（100mM，pH10.0）及0.1mL的酶液。在30℃反应1h后加入10%（v/v）浓磷酸（85%）终止反应。如有沉淀，12000rpm离心10min去除沉淀，取上清用HPLC检测2-氯丙酸的含量。
c)HPLC检测条件：
Hypersil GOLD C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm，Thermo)；流动相，乙腈-水(15:85,pH 2.2)，水中含0.1%（v/v）的浓H3PO4（85%，w/v）；流速，1mL/min；柱温，30℃；检测波长，210nm。实施例1卤代酸脱卤酶的分离纯化
将16.9g冻存的菌体施氏假单胞菌菌体用341mL缓冲液A（50mMK2HPO4-K2HPO4+0.65mM DTT，pH 7.5）重悬，每管分装约25mL后，超声破碎细胞（350w，超声5s，间隔5s，60次为一循环。共2次循环）。离心（12000rpm×30min，4℃）后取上清备用。上清中加入固体硫酸铵制成40%的硫酸铵饱和度，搅拌1h后，离心（12000rpm×30min，4℃）后得沉淀物A。离心后所得上清继续加入硫酸铵饱和度至80%，搅拌1h后，离心（12000rpm×30min，4℃）后得蛋白沉淀物B。
将沉淀物A用76mL缓冲液A重溶，12000rpm×5min离心（4℃）去除沉淀后，所得酶液进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa。取截留的酶液，为酶液A1。沉淀物B用19mL缓冲液A重溶，12000rpm×5min离心（4℃）去除沉淀后，所得酶液进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa，取截留的酶液，为酶液B1。经酶活性检测后，酶液A1中主要含D-2-卤代酸脱卤酶，酶液B1中主要含L-2-卤代酸脱卤酶。（见下表）
Figure BDA00001822279400041
Figure BDA00001822279400051
a:在0.5mL的反应体系中，含10mmol/L D-2-CPA(或L-2-CPA),0.65mmol/L DTT，KH2PO4-K2HPO4(50mmol/L,pH7.5)及酶液，在30℃水浴下反应。
将酶液A1进一步用Q-Sepharose HP柱（7mm×25mm，1mL）分离纯化。在4℃下，取5mL的酶液A1上样，用缓冲液液A清洗6个柱体积后，用含Na2SO4（0-0.3M）缓冲液A线性洗脱20柱体积，最后再用缓冲液B（50mmol/L KH2PO4-K2HPO4+0.65mM DTT+0.3MNa2SO4，pH7.5）清洗10个柱体积。流速为1mL/min，每管收集1mL。取收集的酶液检测D-2-卤代酸脱卤酶活性。在硫酸钠浓度为0.225M时脱卤酶酶被洗脱出来。测定并合并活性组分后，经超滤管浓缩后得酶液A2，进一步用Superdex 200凝胶过滤柱分离纯化。
Superdex200柱（1.6cm×60cm）用缓冲液A平衡2个柱体积后，酶液A2上样1.5mL，用缓冲液A洗脱。流速0.5mL/min，每管收集样品0.5mL，并检测D-2-卤代酸脱卤酶活性。，D-2-卤代酸脱卤酶约在洗脱体积为64mL时被洗脱出来，合并浓缩活性组分，为酶液A3。进一步检测酶液A3的手性选择性，结果表明酶液A3只能降解D-2-CPA(见下表)。
Figure BDA00001822279400052
a，在0.25mL的反应体系中，含10mM L-2-CPA，100mMK2HPO4-KH2PO4（pH7.5）。
b，在0.25mL的反应体系中，含10mM L-2-CPA，100mMK2HPO4-KH2PO4（pH7.5）。
将酶液B1用Q-Sepharose HP柱分离（7mm×25mm，1mL）进行纯化。在4℃下，取5mL的酶液B1上样，用缓冲液液A清洗6个柱体积后，用含Na2SO4（0-0.3M）的缓冲液A进行线性洗脱20柱体积，最后再用缓冲液B清洗10个柱体积。流速为1mL/min，每管收集1mL。取收集的酶液检测L-2-卤代酸脱卤酶活性。大部分的脱卤酶约在洗脱体积约为22mL（此时Na2SO4浓度为0.24M）时洗脱出来，合并活性组分后，经超滤管浓缩后得酶液B2，进一步用Superdex200凝胶过滤柱分离纯化。
Superdex200柱（1.6cm×60cm）用缓冲液A平衡2个柱体积后，酶液B2上样1.5mL，用缓冲液A洗脱。流速0.5mL/min，每管收集样品0.5mL，并检测L-2-卤代酸脱卤酶活性,在约78.4mL时，酶活性达到最高。合并浓缩活性组分，为酶液B3。酶液B3进一步检测其手性选择性。酶液B3只有降解L-2-CPA的活性，结果见下表。
a，在0.5mL的反应体系中，含10mM D-2-CPA，100mMK2HPO4-KH2PO4（pH 7.5）。
b，在0.5mL的反应体系中，含10mM L-2-CPA，100mMGlycine-NaOH（pH 10.0）。
实施例2卤代酸脱卤酶的分离纯化
将16.9g冻存的施氏假单胞菌菌体用341mL缓冲液A（50mMK2HPO4-K2HPO4+0.65mM DTT，pH 7.5）重悬，每管分装约25mL后，超声破碎细胞（350w，超声5s，间隔5s，60次为一循环。共2次循环）。离心（12000rpm×30min，4℃）后取上清备用。上清中加入固体硫酸铵制成40%的硫酸铵饱和度，搅拌1h后，离心（12000rpm×30min，4℃）后得沉淀物A。离心后所得上清继续加入硫酸铵饱和度至80%，搅拌1h后，离心（12000rpm×30min，4℃）后得蛋白沉淀物B。
将沉淀物A用76mL缓冲液A重溶，12000rpm×5min离心（4℃）去除沉淀后，所得酶液进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa。取截留的酶液，为酶液A1。沉淀物B用19mL缓冲液A重溶，12000rpm×5min离心（4℃）去除沉淀后，所得酶液进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa，取截留的酶液，为酶液B1。经酶活性检测后，酶液A1中主要含D-2-卤代酸脱卤酶，酶液B1中主要含L-2-卤代酸脱卤酶。（见下表）
Figure BDA00001822279400071
a:在0.5mL的反应体系中，含10mmol/L D-2-CPA(或L-2-CPA),0.65mmol/L DTT，KH2PO4-K2HPO4(50mmol/L,pH7.5)及酶液，在30℃水浴下反应。
将酶液A1进一步用Q-Sepharose HP柱（7mm×25mm，1mL）分离纯化。在4℃下，取5mL的酶液A1上样，用缓冲液液A清洗6个柱体积后，用含Na2SO4（0-0.3M）缓冲液A线性洗脱20柱体积，最后再用缓冲液B（50mmol/L KH2PO4-K2HPO4+0.65mM DTT+0.3MNa2SO4，pH7.5）清洗10个柱体积。流速为1mL/min，每管收集1mL。取收集的酶液检测D-2-卤代酸脱卤酶活性。在硫酸钠浓度为0.225M时脱卤酶酶被洗脱出来。测定并合并活性组分后，经超滤管浓缩后得酶液A2，进一步用Sephacryl S200凝胶过滤柱分离纯化。
Sephacryl S200柱（1.6cm×60cm）用缓冲液A平衡2个柱体积后，酶液A2上样1.5mL，用缓冲液A洗脱。流速0.5mL/min，每管收集样品0.5mL，并检测D-2-卤代酸脱卤酶活性。，D-2-卤代酸脱卤酶约在洗脱体积为46.2mL时被洗脱出来，合并浓缩活性组分，为酶液A3。进一步检测酶液A3的手性选择性，结果表明酶液A3只能降解D-2-CPA（见下表）。
a，在0.25mL的反应体系中，含10mM L-2-CPA，100mMK2HPO4-KH2PO4（pH7.5）。
b，在0.25mL的反应体系中，含10mM L-2-CPA，100mMK2HPO4-KH2PO4（pH7.5）。
将酶液B1用Q-Sepharose HP柱分离（7mm×25mm，1mL）进行纯化。在4℃下，取5mL的酶液B1上样，用缓冲液液A清洗6个柱体积后，用含Na2SO4（0-0.3M）的缓冲液A进行线性洗脱20柱体积，最后再用缓冲液B清洗10个柱体积。流速为1mL/min，每管收集1mL。取收集的酶液检测L-2-卤代酸脱卤酶活性。脱卤酶约在洗脱体积约为22mL（此时Na2SO4浓度为0.24M）时洗脱出来，合并活性组分后，经超滤管浓缩后得酶液B2，进一步用Sephacyl S200凝胶过滤柱分离纯化。
Sephacryl S200柱（1.6cm×60cm）用缓冲液A平衡2个柱体积后，酶液B2上样1.5mL，用缓冲液A洗脱。流速0.5mL/min，每管收集样品0.5mL，并检测L-2-卤代酸脱卤酶活性,在约56.4mL mL时，酶活性达到最高。合并浓缩活性组分，为酶液B3。酶液B3进一步检测其手性选择性。酶液B3只有降解L-2-CPA的活性，结果见下表。
Figure BDA00001822279400081
a，在0.5mL的反应体系中，含10mM D-2-CPA，100mMK2HPO4-KH2PO4（pH7.5）。
b，在0.5mL的反应体系中，含10mM L-2-CPA，100mM Glycine-NaOH（pH10.0）。
应用例1脱卤酶水解脱卤D-2-氯丙酸，L-2-氯丙酸
分别以D-2-氯丙酸，L-2-氯丙酸为底物，加入相应的D-2-卤代酸脱卤酶及L-2-卤代酸脱卤酶。具体反应如下：
D-2-CPA+H2O→L-乳酸+HCl
L-2-CPA+H2O→D-乳酸+HCl
在1mL的反应体系中，含有D-2-CPA（10mM），KH2PO4-K2HPO4(100mmol/L,pH7.5)，及0.8mL的酶液于30℃下进行反应6h，反应后D-2-CPA的转化率为26.2%。
在1mL的反应体系中，含有L-2-CPA（10mM），Glycine-NaOH(100mmol/L,pH10.0)，，加入0.1mL的酶液于30℃下进行反应1h，反应后L-2-CPA的转化率为>97%
应用例2脱卤酶水解脱卤D-2-溴丙酸，L-2-溴丙酸
分别以D-2-溴丙酸，L-2-溴丙酸为底物，加入相应的D-2-卤代酸脱卤酶及L-2-卤代酸脱卤酶。具体反应如下：
D-2-溴丙酸+H2O→L-乳酸+HCl
L-2-溴丙酸+H2O→D-乳酸+HCl
在1mL的反应体系中，含有D-2-溴丙酸（10mM），KH2PO4-K2HPO4(100mmol/L,pH7.5)，及0.8mL的酶液于30℃下进行反应6h，反应后D-2-溴丙酸的转化率为26%。
在1mL的反应体系中，含有L-2-溴丙酸（10mM），Glycine-NaOH(100mmol/L,pH10.0)，，加入0.1mL的酶液于30℃下进行反应1h，反应后L-2-溴丙酸的转化率为>97%。
应用例3脱卤酶水解脱卤D-2-氯丁酸，L-2-氯丁酸
分别以D-2-氯丁酸，L-2-氯丁酸为底物，加入相应的D-2-卤代酸脱卤酶及L-2-卤代酸脱卤酶。具体反应如下：
D-2-氯丁酸+H2O→L-羟基丁酸+HCl
L-2-氯丁酸+H2O→D-羟基丁酸+HCl
在1mL的反应体系中，含有D-2-氯丁酸（10mM），KH2PO4-K2HPO4(100mmol/L,pH7.5)，及0.8mL的酶液于30℃下进行反应6h，反应后D-2-氯丁酸的转化率为6.7%。
在1mL的反应体系中，含有L-2-氯丁酸（10mM），Glycine-NaOH(100mmol/L,pH10.0)，，加入0.1mL的酶液于30℃下进行反应1h，反应后L-2-氯丁酸的转化率为>30%。
应用例4脱卤酶水解脱卤D-2-溴丁酸，L-2-溴丁酸
分别以D-2-溴丁酸，L-2-溴丁酸为底物，加入相应的D-2-卤代酸脱卤酶及L-2-卤代酸脱卤酶。具体反应如下：
D-2-溴丁酸+H2O→L-2-羟基丁酸+HCl
L-2-溴丁酸+H2O→D-2-羟基丁酸+HCl
在1mL的反应体系中，含有D-2-溴丁酸（10mM），KH2PO4-K2HPO4(100mmol/L,pH7.5)，及0.8mL的酶液于30℃下进行反应6h，反应后D-2-溴丁酸的转化率为>20%。
在1mL的反应体系中，含有L-2-溴丁酸（10mM），Glycine-NaOH(100mmol/L,pH10.0)，，加入0.1mL的酶液于30℃下进行反应1h，反应后L-2-溴丁酸的转化率为>97%。

Claims (6)

1.一种卤代酸脱卤酶的提取纯化方法，其特征在于：以施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）为原料，分离纯化手性选择性相反的2种卤代酸脱卤酶。
2.按照权利要求1所述的卤代酸脱卤酶的提取纯化方法，其特征是，它包括如下步骤：
1)收集的菌体用10-100mM的磷酸盐缓冲液（pH6-9）清洗后，
超声破碎细胞；
2)于0-10°C，3000~15000rpm离心10-60min，取上清；
3)上清液中加入硫酸铵制成20-40%的硫酸铵饱和度，搅拌1-2h后，离心取蛋白沉淀物，得到降解D-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶；
4)在3）的基础上所得的上清进一步加入硫酸制成60-100%的硫酸铵饱和度，搅拌1-2h后，离心取沉淀的蛋白，得到降解L-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶。
3.按照权利要求2所述的卤代酸脱卤酶的提取纯化方法，其特征是：
步骤3）得到降解D-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶用pH4-10的磷酸盐缓冲液重溶后，进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa；
步骤4）得到降解L-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶用pH4-10的磷酸盐缓冲液重溶后，最后用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa。
4.按照权利要求2所述的卤代酸脱卤酶的提取纯化方法，其特征是：
所述硫酸铵分级沉淀所得卤代酸脱卤酶还可以采用阴离子交换树脂及琼脂糖树脂进一步纯化，具体为：
1）所得两种卤代酸脱卤酶分别经阴离子柱交换柱层析分离：用NaCl(0-1M)或Na2SO4（0-0.3M）进行线性梯度洗脱，得到活性组分；酶液体积与洗脱液体积比为1:20-40；收集含有卤代酸脱卤酶活性组分并测定蛋白含量；线性洗脱液组成为含有NaCl（0-1M）的磷酸钾缓冲液（50mM,pH7.5）,或含有Na2SO4（0-0.3M）的磷酸钾缓冲液（50mM，pH7.5）；
2）将离子交换柱所得活性组分经超滤浓缩后，上凝胶柱，用0.02-0.08M，pH4-9的磷酸钾缓冲液洗脱分离，得到卤代酸脱卤酶。
5.按照权利要求4所述的卤代酸脱卤酶的提取纯化方法，其特征在于：所述阴离子交换柱为DEAE-Sepharose FF，Q-Sepharose FF，Q-Sepharose XL或Q-sepharose HP；琼脂糖凝胶树脂为SephacrylS200，Superdex 200或Sephadex G100。
6.按照权利要求1所述的卤代酸脱卤酶的提取纯化方法，其特征在于：所述的脱卤酶可用于对2-卤代酸的手性转化，所述2-卤代酸为氯代丙酸，2-溴代丙酸，2-氯代丁酸或2-溴代丁酸。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694514A (zh) * 2015-03-18 2015-06-10 中国科学院微生物研究所 一种脱卤酶DhmB及其编码基因与应用
CN105483095A (zh) * 2014-10-08 2016-04-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种选择性地提高生产卤代酸脱卤酶的方法
US11053518B2 (en) * 2017-09-28 2021-07-06 Bayer Aktiengesellschaft Method for the preparation of chiral alpha haloalkanoic acids
CN116730817A (zh) * 2023-08-16 2023-09-12 天津久日新材料股份有限公司 一种光引发剂1173的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1546647A (zh) * 2003-12-11 2004-11-17 中国科学院武汉病毒研究所 施氏假单胞菌zwlr2-1及其制法和应用
CN102634502A (zh) * 2012-03-19 2012-08-15 苏州汉酶生物技术有限公司 一种卤醇脱卤酶的生产方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1546647A (zh) * 2003-12-11 2004-11-17 中国科学院武汉病毒研究所 施氏假单胞菌zwlr2-1及其制法和应用
CN102634502A (zh) * 2012-03-19 2012-08-15 苏州汉酶生物技术有限公司 一种卤醇脱卤酶的生产方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.A. LEIGH等: "Partial purification, stereospecificity and stoichiometry of three dehalogenases from a Rhizobium species", 《FEMS MICROBIOLOGY LETTERS》, 31 December 1988 (1988-12-31), pages 353 - 356 *
JUDITH M. SMITH等: "Purification and characterization of D-2-haloacid dehalogenase from Pseudomonas putida strain AJ1/23", 《JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY》, 31 December 1990 (1990-12-31), pages 881 - 886 *
项炯华: "2-氯丙酸脱卤酶的分离纯化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 10 May 2006 (2006-05-10) *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105483095A (zh) * 2014-10-08 2016-04-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种选择性地提高生产卤代酸脱卤酶的方法
CN104694514A (zh) * 2015-03-18 2015-06-10 中国科学院微生物研究所 一种脱卤酶DhmB及其编码基因与应用
US11053518B2 (en) * 2017-09-28 2021-07-06 Bayer Aktiengesellschaft Method for the preparation of chiral alpha haloalkanoic acids
CN116730817A (zh) * 2023-08-16 2023-09-12 天津久日新材料股份有限公司 一种光引发剂1173的制备方法

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