CN101935647B - 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种提取微生物DNA的试剂盒及方法。该试剂盒包括裂解液、抑制物去除液和结合液，所述裂解液包含50-200mM的Tris-HCl、50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB、0.5-2％的PVP和0.5-2％的SDS；抑制物去除液为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵和50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；结合液包含3-6M的盐酸胍、10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇。本发明试剂盒及方法提取的微生物DNA纯度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游实验，适用于从包含微生物的样品中提取DNA。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种提取微生物DNA的试剂盒，还涉及一种提取微生物DNA的方法。
背景技术
微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体。它们个体微小，结构简单，却与人类生活关系密切，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工业、农业、环保等诸多领域。
土壤微生物资源丰富，是陆地生态系统中重要的生命体，其对外界环境很敏感，抗逆性较差，很容易受到各种不良外界环境的影响。因此，土壤微生物是常用的土壤生态系统变化的预警及敏感指标。从土壤中获得微生物的传统方法是富集、培养、再分离，但是由于自然生态环境中的绝大部分微生物还无法在实验室被成功培养，因此相当多的菌种由于无法培养而不能被充分的开发和利用。同时，在此过程中也造成微生物多样性的丢失及种群构成发生变化，这样就使得对土壤微生物群落结构、功能以及动态监测的研究受到了极大的局限性和偏差。随着分子生物学和分子生态学技术的不断发展，不经过传统培养，直接从土壤中提取微生物DNA，通过变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、单链构象多态性(SSCP)或者是限制性片段长度多态性(RFLP)等分子生物学方法来研究土壤微生物的多样性及种群情况，已成为更能揭示土壤生态系统真实性的新途径。因此，从自然环境中提取微生物的基因组DNA，不仅能检测不能培养的细菌，还能跟踪某些目标菌株或重组基因，从而揭示土壤微生物生态系统中基因的多样性和监测土壤生态系统的变化。
但是，土壤成分复杂，通常含有较多的可与微生物DNA共同提取出来的物质，如腐殖酸、黄酸、酚类化合物、重金属离子等，这些物质可抑制PCR扩增中的Taq DNA聚合酶以及酶切反应中的限制性内切酶的活性，影响下游实验；同时，微生物仅为土壤样品中极小的一部分，微生物细胞常常紧密吸附于土壤颗粒表面，因此，从土壤样品中高效地获得微生物DNA具有相当的难度。另外，不同土壤样品之间差异较大，使得不同类型的土壤会影响土壤微生物DNA的提取效果，这对从环境样品中高效的提取DNA来说就更为困难。
目前从土壤中提取微生物DNA的方法可分为直接法和间接法两类。直接法采用原位裂解土壤微生物的方法，这种方法获得的基因组DNA都是粗提液，含有较多的杂质如腐殖酸、黄酸等，会抑制下游实验，必需再经过纯化回收才能使用；而间接法则采用差速离心回收菌体，然后再裂解菌体提取基因组DNA，但是这种提取方法需要专门的仪器，而且操作步骤繁琐，耗时较多，也容易造成物种的丢失。针对土壤中微生物DNA提取的难点和特点，一些大型生物公司研发出了提取土壤中微生物DNA的商业试剂盒，如Mo Bio UltraClean Soil DNAKit(MoBio Laboratories，Inc.，Solana Beach，Calif.)，虽然这种商业试剂盒使用起来非常方便、快捷，但提取微生物DNA的效果并不理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取微生物DNA的试剂盒，采用该试剂盒提取微生物DNA纯度高、通用性好、可靠性高、提取速度快。
本发明的另一个目的在于提供一种提取微生物DNA的方法，该方法提取的微生物DNA纯度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游实验。
为实现上述目的，本发明提供一种提取微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒包括：
裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和结合液，所述裂解液I包含pH8.0 50-200mM的Tris-HCl、pH8.0 50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB和0.5-2％的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0.5-2％的SDS，所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7.5 10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇。
本发明所述裂解液I、裂解液II既含有阳离子去污剂，又含有阴离子去污剂，能够针对广泛的微生物群落，彻底裂解样品，同时还含有去除多糖多酚效果的成分，能使核酸和多糖多酚分离；所述的抑制物去除液I和抑制物去除液II能够最大限度的去除腐殖酸、黄酸、蛋白质等杂质；结合液能够提高核酸和玻璃纤维素膜的结合能力。
优选地，所述裂解液I包含pH8.0 100mM的Tris-HCl、pH8.0100mM的EDTA、1.5M的NaCl、1％的CTAB和1％的PVP。
优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2％的SDS。
优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。
优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。
优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7.5 20mM的Tris-HCl和30％的异丙醇。
本发明所述提取微生物DNA的试剂盒还包括：
提取缓冲液、漂洗液、洗脱液和玻璃纤维素膜，所述提取缓冲液包含50-150mM的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述漂洗液包含pH7.5 5-20mM的Tris-HCl、50-80％的无水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纤维素膜孔径为0.45μm。
本发明所述的提取缓冲液能够降低土壤、粪便、淤泥、泥沙以及岩石样品对微生物细胞的吸附作用，为提取微生物DNA提供最优的缓冲环境；漂洗液可以去除玻璃纤维素膜上吸附的蛋白和其他代谢产物，如多糖、纤维素、脂类等；洗脱液是一种不含核酸酶的低盐高pH值的溶液，能够把吸附在玻璃纤维素膜上的DNA洗脱下来；玻璃纤维素膜采用Whatman公司的GF\B型号。
优选地，所述提取缓冲液包含120mM的异硫氰酸胍和181mM的磷酸钠。
优选地，所述漂洗液包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、80％的无水乙醇和100mM的NaCl。
优选地，所述洗脱液为pH8.0 10mM的Tris-HCl。
本发明还提供一种提取微生物DNA的方法，包括以下步骤：
步骤1、将提取缓冲液和样品充分混匀，加入裂解液I振荡，再加入裂解液II水浴，离心取上清液，所述样品为土壤、粪便、泥沙、岩石或淤泥，所述提取缓冲液包含50-150mM的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述裂解液I包含pH8.0 50-200mM的Tris-HCl、pH8.0 50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB和0.5-2％的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0.5-2％的SDS；
步骤2、向步骤1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混匀，冰浴，离心取上清液，所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵；
步骤3、向步骤2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混匀，冰浴，离心取上清液，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；
步骤4、步骤3所述上清液与玻璃纤维素膜、结合液充分作用后漂洗，然后洗脱所述玻璃纤维素膜上吸附的DNA，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7.5 10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇，所述漂洗液包含pH7.5 5-20mM的Tris-HCl、50-80％的无水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-30mM的Tris-HCl。
优选地，所述裂解液I包含pH8.0 100mM的Tris-HCl、pH8.0100mM的EDTA、1.5M的NaCl、1％的CTAB和1％的PVP。
优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2％的SDS。
优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。
优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。
优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7.5 20mM的Tris-HCl和30％的异丙醇。
优选地，所述漂洗液包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、80％的无水乙醇和100mM的NaCl。
优选地，所述洗脱液为pH8.0 10mM的Tris-HCl。
由以上技术方案可知，采用本发明所述提取微生物DNA的试剂盒及方法，所提取的微生物DNA纯度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游实验。
附图说明
图1示从土壤中提取微生物DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
泳道M：分子量Marker，从上至下依次为23kb、9.4kb、6.5kb；泳道1：本发明从土壤中提取的微生物DNA条带；泳道2：Mo BioUltraClean Soil DNAKit从土壤中提取的微生物DNA条带；
图2示从土壤中提取微生物DNA的扩增16S rRNA基因的琼脂糖凝胶电泳图；
泳道M：分子量Marker，从上至下依次为2.0kb、1.0kb、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-4：Mo Bio UltraClean Soil DNA Kit方法从土壤中提取的微生物DNA梯度稀释0倍、10倍、50倍、100倍后作为模板扩增16S rRNA基因的PCR产物结果；泳道5-8：本发明从土壤中提取的微生物DNA梯度稀释0倍、10倍、50倍、100倍后作为模板扩增16S rRNA基因的PCR产物结果。
具体实施方式
本发明公开了一种提取微生物DNA的试剂盒，还公开了一种提取微生物DNA的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的试剂盒及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明，所述提取微生物DNA的试剂盒包括：
裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和结合液，所述裂解液I包含pH8.0 50-200mM的Tris-HCl、pH8.0 50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB和0.5-2％的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0.5-2％的SDS，所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7.5 10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇。
本发明所述裂解液I、裂解液II既含有阳离子去污剂，又含有阴离子去污剂，能够针对广泛的微生物群落，彻底裂解样品，同时还含有去除多糖多酚效果的成分，能使核酸和多糖多酚分离；所述的抑制物去除液I和抑制物去除液II能够最大限度的去除腐殖酸、黄酸、蛋白质等杂质；结合液能够提高核酸和玻璃纤维素膜的结合能力。
优选地，所述裂解液I包含pH8.0 100mM的Tris-HCl、pH8.0100mM的EDTA、1.5M的NaCl、1％的CTAB和1％的PVP。
优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2％的SDS。
优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。
优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。
优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7.5 20mM的Tris-HCl和30％的异丙醇。
本发明所述提取微生物DNA的试剂盒还包括：
提取缓冲液、漂洗液、洗脱液和玻璃纤维素膜，所述提取缓冲液包含50-150mM的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述漂洗液包含pH7.5 5-20mM的Tris-HCl、50-80％的无水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纤维素膜孔径为0.45μm。
本发明所述的提取缓冲液能够降低土壤、粪便、淤泥、泥沙以及岩石样品对微生物细胞的吸附作用，为提取微生物DNA提供最优的缓冲环境；漂洗液可以去除玻璃纤维素膜上吸附的蛋白和其他代谢产物，如多糖、纤维素、脂类等；洗脱液是一种不含核酸酶的低盐高pH值的溶液，能够把吸附在玻璃纤维素膜上的DNA洗脱下来；玻璃纤维素膜采用Whatman公司的GF\B型号。
优选地，所述提取缓冲液包含120mM的异硫氰酸胍和181mM的磷酸钠。
优选地，所述漂洗液包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、80％的无水乙醇和100mM的NaCl。
优选地，所述洗脱液为pH8.010mM的Tris-HCl。
本发明还提供一种提取微生物DNA的方法，包括以下步骤：
步骤1、将提取缓冲液和样品充分混匀，加入裂解液I振荡，再加入裂解液II水浴，离心取上清液，所述样品为土壤、粪便、泥沙、岩石或淤泥，所述提取缓冲液包含50-150mM的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠，所述裂解液I包含pH8.0 50-200mM的Tris-HCl、pH8.0 50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB和0.5-2％的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0.5-2％的SDS；
步骤2、向步骤1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混匀，冰浴，离心取上清液，所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵；
步骤3、向步骤2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混匀，冰浴，离心取上清液，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；
步骤4、步骤3所述上清液与玻璃纤维素膜、结合液充分作用后漂洗，然后洗脱所述玻璃纤维素膜上吸附的DNA，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7.5 10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇，所述漂洗液包含pH7.5 5-20mM的Tris-HCl、50-80％的无水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-30mM的Tris-HCl。
优选地，所述裂解液I包含pH8.0 100mM的Tris-HCl、pH8.0100mM的EDTA、1.5M的NaCl、1％的CTAB和1％的PVP。
优选地，所述裂解液II为使用终浓度为2％的SDS。
优选地，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。
优选地，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。
优选地，所述结合液包含5M的盐酸胍、pH7.5 20mM的Tris-HCl和30％的异丙醇。
优选地，所述漂洗液包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、80％的无水乙醇和100mM的NaCl。
优选地，所述洗脱液为pH8.0 10mM的Tris-HCl。
取相同样品量采用本发明的方法和MO BIO公司的Mo BioUltraClean Soil DNA Kit(MoBio Laboratories，Inc.，Solana Beach，Calif.)的方法分别提取DNA，本发明所提取的DNA的OD260/OD280值与MOBIO公司的试剂盒所提取的DNA相当，但OD260/OD230值比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA更接近标准值，表明本发明所提取的DNA杂质较少；在通过PCR扩增16S rRNA基因的部分片段来进一步检测所提取DNA纯度的实验中，本发明提取的DNA在稀释0倍、10倍、50倍、100倍后都扩增出预期大小的PCR产物，而MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA只有在稀释DNA的前提下才扩增出PCR产物，PCR扩增实验结果进一步表明本发明提取的DNA纯度高，可用于下游实验。
下面结合实施例进一步阐述本发明。
实施例1：本发明所述提取微生物DNA的试剂盒
本发明所述提取微生物DNA的试剂盒包括：
提取缓冲液：120mM的异硫氰酸胍、181mM pH值为7.0的Na3PO4。具体配制方法：称取异硫氰酸胍1.42克，加入足够的蒸馏水进行充分溶解，然后加入pH为7.0、浓度为1M的Na3PO418.1ml，充分混匀，定容到100ml。
裂解液I：100mM的Tris-HCl(pH为8.0)、100mM的EDTA(pH为8.0)、1.5M的NaCl、1％的CTAB、1％的PVP。具体配制方法：分别称取1克CTAB和1克PVP10，加适量蒸馏水分别溶解，然后加入1M的Tris-HCl(pH为8.0)10ml，0.5M的EDTA(pH为8.0)20ml，5M的NaCl 30ml，然后定容到100ml。
裂解液II：终浓度为2％的SDS。
抑制物去除液I：250mM的乙酸铵。具体配制方法：取250μl 10M的乙酸铵，加入蒸馏水定容到10ml。
抑制物去除液II：120mM的硫酸铝铵。
结合液：5M的盐酸胍、20mM的Tris-HCl(pH为7.5)、30％的异丙醇。具体配制方法：称取47.75克盐酸胍，加蒸馏水充分溶解，然后加入1M的Tris-HCl(pH为7.5)2ml，异丙醇30ml，定容到100ml，充分混匀。
漂洗液：10mM的pH值为7.5的Tris-HCl、100mM的NaCl、80％的无水乙醇。具体配制方法：量取pH值为7.5，浓度为1M的Tris-HCl1ml，再量取5M的NaCl 2ml，加入适量的RNase-free的蒸馏水混匀，再加入80ml的无RNase-free的无水乙醇，定容到100ml，充分混匀。
洗脱液：10mM的Tris-HCl，pH值为8.0。
玻璃纤维素膜吸附柱：0.45μm玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型，1.5mL离心柱。
实施例2：从土壤中提取微生物DNA
利用实施例1所述试剂盒进行提取。
1、提取试剂
提取缓冲液：120mM的异硫氰酸胍、181mM pH值为7.0的Na3PO4。
裂解液I：100mM的Tris-HCl(pH为8.0)、100mM的EDTA(pH为8.0)、1.5M的NaCl、1％的CTAB、1％的PVP。
裂解液II：终浓度为2％的SDS。
抑制物去除液I：250mM的乙酸铵。
抑制物去除液II：120mM的硫酸铝铵。
结合液：5M的盐酸胍、20mM的Tris-HCl(pH为7.5)、30％的异丙醇。
漂洗液：10mM的pH值为7.5的Tris-HCl、100mM的NaCl、80％的无水乙醇。
洗脱液：10mM的Tris-HCl，pH值为8.0。
玻璃纤维素膜吸附柱：0.45μm玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型，1.5mL离心柱。
2、提取方法
(1)取大树下靠近根系的土壤样品，用单层纱布筛去树根和大块土壤，称取0.5克，置于5ml的灭菌离心管中，加入1.5ml提取缓冲液，涡旋振荡30秒充分混匀；
(2)加入120μl的裂解液I，涡旋振荡充分混匀，37℃，200rpm振荡30分钟；
(3)加入200μl裂解液II，70℃水浴10分钟，期间每隔3分钟涡旋混匀一次，12000rpm离心1分钟，取上清；
(4)加入上清1/2体积的抑制物去除液I，充分混匀，冰浴10分钟，12000rpm离心3分钟，取上清；
(5)加入上清1/3体积的抑制物去除液II，充分混匀，冰浴10分钟，12000rpm离心3分钟，取上清；
(6)加入上清1.5倍体积的结合液，充分混匀，把所得混合液(可以分几次)加入到含有玻璃纤维素膜的吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃流出液；
(7)在吸附柱上加入漂洗液，12000rpm离心30秒，弃流出液；再加入漂洗液洗涤一次，弃流出液，然后再12000rpm离心2分钟；
(8)转移吸附柱到一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱中加入事先65℃温浴的洗脱液100μl，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集流出液。收集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提土壤样品中微生物DNA。
实施例3：提取的微生物DNA浓度及纯度检测
与实施例1相同、等量的土壤样品用Mo Bio UltraClean Soil DNAKit提取微生物DNA，对实施例1所提取的微生物DNA及用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA进行浓度及纯度检测，结果参见表1。
表1 微生物DNA浓度及纯度检测
| 本发明方法 | Mo Bio UltraClean Soil DNA Kit | |
| DNA浓度(μg/ml) | 104 | 86 |
| OD260/OD280 | 1.7 | 1.86 |
| OD260/OD230 | 0.94 | 0.87 |
结果显示，实施例1所提取的微生物DNA浓度大于用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA浓度；本发明所提取的DNA的OD260/OD280值与标准值(1.8)无明显差异，但OD260/OD230值比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA更接近标准值(1.7-2.0)。以上结果表明，相同样品量，本发明所提取的DNA浓度高，且杂质较少。
实施例4：提取的微生物DNA琼脂糖凝胶电泳检测
将实施例1所提取的微生物DNA及实施例2用Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit提取的微生物DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见图1。结果显示，本发明所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度明显亮于Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA的条带。以上结果进一步表明，本发明所提取的微生物DNA纯度高、杂质少。
实施例5：提取的微生物DNA扩增16S rRNA基因
将实施例1所提取的微生物DNA及实施例2用Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit提取的微生物DNA梯度稀释为0倍、10倍、50倍、100倍后作为模板，使用16S rRNA基因通用引物27F和1492R扩增16SrRNA基因的部分片段来进一步检测所提取土壤样品基因组DNA的纯度，结果参见图2。
其中，扩增引物为：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR反应体系与反应条件参见表1、表2。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应条件
| 预变性 | 变性 | 退火 | 延伸 | 末次延伸 |
| 94℃3min | 94℃45s | 50℃45s | 72℃1min30s，35个循环 | 72℃10min |
结果显示，本发明提取的DNA在稀释0倍、10倍、50倍、100倍后都扩增出预期大小的PCR产物，而MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA只有在稀释DNA的前提下才扩增出PCR产物，PCR扩增实验结果进一步表明本发明提取的DNA纯度高，可直接用于下游实验。
实施例6：从粪便中提取微生物DNA
1、本发明所述提取微生物DNA的试剂盒
本发明所述提取微生物DNA的试剂盒包括：
提取缓冲液：50mM的异硫氰酸胍、150mM pH值为7.0的Na3PO4。
裂解液I：50mM的Tris-HCl(pH为8.0)、50mM的EDTA(pH为8.0)、0.5M的NaCl、0.5％的CTAB、0.5％的PVP。
裂解液II：终浓度为0.5％的SDS。
抑制物去除液I：100mM的乙酸钠。
抑制物去除液II：50mM的硫酸铝。
结合液：3M的盐酸胍、10mM的Tris-HCl(pH为7.5)、5％的异丙醇。
漂洗液：5mM的pH值为7.5的Tris-HCl、50mM的NaCl、50％的无水乙醇。
洗脱液：5mM的Tris-HCl，pH值为7.0。
玻璃纤维素膜吸附柱：0.45μm玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型，1.5mL离心柱。
2、提取方法
采用上述提取试剂提取微生物DNA。
(1)称取1.0克粪便样品，置于5ml的灭菌离心管中，加入3.0ml提取缓冲液，涡旋振荡30秒充分混匀；
(2)加入240μl的裂解液I，涡旋振荡充分混匀，37℃，200rpm振荡30分钟；
(3)加入400μl裂解液II，70℃水浴10分钟，期间每隔3分钟涡旋混匀一次，12000rpm离心1分钟，取上清；
(4)加入上清1/2体积的抑制物去除液I，充分混匀，冰浴10分钟，12000rpm离心3分钟，取上清；
(5)加入上清1/3体积的抑制物去除液II，充分混匀，冰浴10分钟，12000rpm离心3分钟，取上清；
(6)加入上清1.5倍体积的结合液，充分混匀，把所得混合液(可以分几次)加入到含有玻璃纤维素膜的吸附柱中，12,000rpm离心30秒，弃流出液；
(7)在吸附柱上加入漂洗液，12000rpm离心30秒，弃流出液；再加入漂洗液洗涤一次，弃流出液，然后再12000rpm离心2分钟；
(8)转移吸附柱到一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱中加入事先65℃温浴的洗脱液100μl，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集流出液。收集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提粪便中微生物DNA。
3、提取的微生物DNA浓度及纯度检测
参照实施例2对本发明从粪便中提取的微生物DNA和用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit从粪便中提取微生物DNA进行浓度及纯度检测。结果显示，从粪便中所提取的微生物DNA浓度大于用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA浓度；本发明所提取的DNA的OD260/OD280值与标准值(1.8)无明显差异，但OD260/OD230值比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA更接近标准值(1.7-2.0)。表明，相同样品量，本发明从粪便中所提取的DNA浓度比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA浓度高，且杂质较少。
4、提取的微生物DNA琼脂糖凝胶电泳检测
将本发明从粪便中提取的微生物DNA及用Mo Bio UltraClean SoilDNA Kit从粪便中提取的微生物DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，本发明所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度明显亮于Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit提取的微生物DNA的条带。结果进一步表明，本发明所提取的微生物DNA纯度高、杂质少。
5、提取的微生物DNA扩增16S rRNA基因
参照实施例4方法，对从粪便中所提取的微生物DNA扩增16SrRNA基因。结果显示，本发明提取的DNA在稀释0倍、10倍、50倍、100倍后都扩增出预期大小的PCR产物，而MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA只有在稀释DNA的前提下才扩增出PCR产物，PCR扩增实验结果进一步表明本发明提取的DNA纯度高，可直接用于下游实验。
实施例7：从淤泥中提取微生物DNA
1、本发明所述提取微生物DNA的试剂盒
本发明所述提取微生物DNA的试剂盒包括：
提取缓冲液：150mM的异硫氰酸胍、200mM pH值为7.0的Na3PO4。
裂解液I：200mM的Tris-HCl(pH为8.0)、150mM的EDTA(pH为8.0)、3M的NaCl、2％的CTAB、2％的PVP。
裂解液II：终浓度为1％的SDS。
抑制物去除液I：300mM的乙酸钾。
抑制物去除液II：200mM的硫酸铵。
结合液：6M的盐酸胍、50mM的Tris-HCl(pH为7.5)、50％的异丙醇。
漂洗液：20mM的pH值为7.5的Tris-HCl、200mM的NaCl、65％的无水乙醇。
洗脱液：30mM的Tris-HCl，pH值为8.5。
玻璃纤维素膜吸附柱：0.45μm玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型，1.5mL离心柱。
2、提取方法
采用上述提取试剂提取微生物DNA。
(1)称取2.0克淤泥样品，置于5ml离心管中，12,000rpm离心3分钟，弃上清，把沉淀涡旋打散，加入3.0ml提取缓冲液，涡旋振荡30秒充分混匀。
(2)加入240μl的裂解液I，涡旋振荡充分混匀，37℃，200rpm振荡30分钟。
(3)加入400μl裂解液II，70℃水浴10分钟，期间每隔3分钟涡旋混匀一次，12,000rpm离心1分钟，取上清。
(4)加入上清1/3体积的抑制物去除液I，充分混匀，冰浴10分钟，12,000rpm离心3分钟，取上清。
(5)加入上清1/2体积的抑制物去除液II，充分混匀，冰浴10分钟，12,000rpm离心3分钟，取上清。
(6)加入上清1.5倍体积的结合液，充分混匀，把所得混合液(可以分几次)加入到含有玻璃纤维素膜的吸附柱中，12,000rpm离心30秒，弃流出液。
(7)在吸附柱上加入漂洗液，12,000rpm离心30秒，弃流出液；再加入漂洗液洗涤一次，弃流出液，然后再12,000rpm离心2分钟。
(8)转移吸附柱到一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱中加入事先65℃温浴的洗脱液100μl，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集流出液。收集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提淤泥中微生物DNA。
3、提取的微生物DNA浓度及纯度检测
参照实施例2对本发明从淤泥中提取的微生物DNA和用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit从淤泥中提取微生物DNA进行浓度及纯度检测。结果显示，从淤泥中所提取的微生物DNA浓度大于用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA浓度；本发明所提取的DNA的OD260/OD280值与标准值(1.8)无明显差异，但OD260/OD230值比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA更接近标准值(1.7-2.0)。表明，相同样品量，本发明从淤泥中所提取的DNA浓度比MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA浓度高，且杂质较少。
4、提取的微生物DNA琼脂糖凝胶电泳检测
将本发明从淤泥中提取的微生物DNA及用Mo Bio UltraClean SoilDNA Kit从淤泥中提取的微生物DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，本发明所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度明显亮于Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit提取的微生物DNA的条带。结果进一步表明，本发明所提取的微生物DNA纯度高、杂质少。
5、提取的微生物DNA扩增16S rRNA基因
参照实施例4方法，对从淤泥中所提取的微生物DNA扩增16SrRNA基因。结果显示，本发明提取的DNA在稀释0倍、10倍、50倍、100倍后都扩增出预期大小的PCR产物，而MO BIO公司的试剂盒所提取的DNA只有在稀释DNA的前提下才扩增出PCR产物，PCR扩增实验结果进一步表明本发明提取的DNA纯度高，可直接用于下游实验。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I、抑制物去除液II、结合液、提取缓冲液、漂洗液、洗脱液和玻璃纤维素膜组成，所述裂解液I由pH8.0 50-200mM的Tris-HCl、pH8.0 50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB和0.5-2％的PVP组成，所述裂解液II为使用终浓度为0.5-2％的SDS，所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵，所述结合液由3-6M的盐酸胍、pH7.5 10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇组成，所述提取缓冲液由50-150mM的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠组成，所述漂洗液由pH7.5 5-20mM的Tris-HCl、50-80％的无水乙醇和50-200mM的NaCl组成，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纤维素膜孔径为0.45μm。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液I由pH8.0100mM的Tris-HCl、pH8.0 100mM的EDTA、1.5M的NaCl、1％的CTAB和1％的PVP组成。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液II为使用终浓度为2％的SDS。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述结合液由5M的盐酸胍、pH7.520mM的Tris-HCl和30％的异丙醇组成。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述提取缓冲液由120mM的异硫氰酸胍和181mM的磷酸钠组成，所述漂洗液由pH7.510mM的Tris-HCl、80％的无水乙醇和100mM的NaCl组成，所述洗脱液为pH8.010mM的Tris-HCl。
8.一种提取微生物DNA的方法，包括以下步骤：
步骤1、将样品和提取缓冲液按质量体积比1g∶3ml或2g∶3ml充分混匀，按样品和裂解液I 1g∶240μl的质量体积比加入裂解液I振荡，按样品和裂解液II 1g∶400μl的质量体积比再加入裂解液II水浴，离心取上清液，所述样品为土壤、粪便、泥沙、岩石或淤泥，所述提取缓冲液由50-150mM的异硫氰酸胍和150-200mM的磷酸钠组成，所述裂解液I由pH8.050-200mM的Tris-HCl、pH8.0 50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB和0.5-2％的PVP组成，所述裂解液II为使用终浓度为0.5-2％的SDS；
步骤2、向步骤1所述上清液加入抑制物去除液I，步骤1所述上清液与抑制物去除液I的体积比为2∶1，充分混匀，冰浴，离心取上清液，所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵；
步骤3、向步骤2所述上清液加入抑制物去除液II，步骤2所述上清液与抑制物去除液II的体积比为3∶1，充分混匀，冰浴，离心取上清液，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵；
步骤4、向步骤3所述上清液加入结合液，步骤3所述上清液与结合液的体积比为2∶3，充分混匀，所得混合液加入到含有玻璃纤维素膜的吸附柱中离心、漂洗，然后洗脱所述玻璃纤维素膜上吸附的DNA，所述结合液由3-6M的盐酸胍、pH7.5 10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇组成，所述漂洗液由pH7.5 5-20mM的Tris-HCl、50-80％的无水乙醇和50-200mM的NaCl组成，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-30mM的Tris-HCl。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述裂解液I由pH8.0100mM的Tris-HCl、pH8.0 100mM的EDTA、1.5M的NaCl、1％的CTAB和1％的PVP组成，所述裂解液II为使用终浓度为2％的SDS，所述抑制物去除液I为250mM的乙酸铵，所述抑制物去除液II为120mM的硫酸铝铵，所述结合液由5M的盐酸胍、pH7.520mM的Tris-HCl和30％的异丙醇组成。
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