CN105821036A - 一种蚯蚓肠道微生物总dna的提取方法 - Google Patents
一种蚯蚓肠道微生物总dna的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105821036A CN105821036A CN201610389986.5A CN201610389986A CN105821036A CN 105821036 A CN105821036 A CN 105821036A CN 201610389986 A CN201610389986 A CN 201610389986A CN 105821036 A CN105821036 A CN 105821036A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lumbricus
- extracting method
- enteric microorganism
- stb gene
- earthworms
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 241001233061 earthworms Species 0.000 title abstract description 7
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 title abstract 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000243684 Lumbricus Species 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 abstract description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 abstract 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003900 soil pollution Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，该提取方法一方面以蚯蚓新鲜粪便为样品，并对样品进行前处理，一方面将蛋白酶K(消化)与土壤DNA提取试剂盒联用，从而使本发明提取方法解决了现有方法无法克服泥沙干扰，造成的蚯蚓肠道微生物总DNA提取效率低的问题；本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道微生物总DNA的提取效率和提取质量，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的总DNA条带明亮清晰，从而能够更加准确全面反应蚯蚓肠道内微生物的状况，为后续微生物群落结构与功能的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，属于生物技术科学领域。
背景技术
由于农业中化肥和农药的不合理使用，以及工业污染的排放，使得土壤污染成为我国越来越严重的环境问题。蚯蚓作为土壤动物最常见一大类群，是土壤污染检测重要的生物标志物，同时也是土壤生物修复的重要的动物。作为重要的是生态系统分解者，蚯蚓对土壤中有机物的消化分解的能力是生态系统物质循环的有力保障，蚯蚓肠道的独特微生物群落在此过程中扮演着重要的角色。蚯蚓肠道微生物的研究过程中，微生物总DNA的提取显得尤为重要。然而蚯蚓肠道含有大量的泥沙，严重影响了微生物总DNA的提取效率。目前很少有研究提取蚯蚓肠道微生物总DNA的方法，而且常采用提取粪便专用试剂盒，例如：DNAStoolMiniKit，Qiagen等，这些方法并不能克服蚯蚓肠道中大量泥沙带来的干扰，提取效率低下。如何克服样品中大量泥沙带来的干扰，提高蚯蚓肠道微生物总DNA提取效率重要保障。因此一种能够有效解决泥沙带来干扰的蚯蚓肠道微生物总DNA提取方法的开发很有必要。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，该提取方法能够有效解决泥沙对蚯蚓肠道微生物总DNA提取效率带来的干扰。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
一种蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，包括如下步骤：
步骤1，提取某条实验蚯蚓的新鲜粪便，冷冻储存；将该实验蚯蚓放回其原生长环境12小时后，再次提取其新鲜粪便，将前后两次提取的粪便混合，并于4℃下冷冻储存；
步骤2，往0.1～0.5g蚯蚓新鲜粪便(冷冻储存不超过24小时的粪便)中依次加入20μL蛋白酶K和100～200μL缓冲液，混合均匀后于56℃下水浴加热，加热后得到液相A；
步骤3，将步骤2的液相A使用土壤基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，得到蚯蚓肠道微生物总DNA；
步骤4，使用微量紫外可见分光光度计，进行DNA含量的测定；
步骤5，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到蚯蚓肠道微生物总DNA的质量。
其中，步骤2中，所述缓冲液的配方为：每1L缓冲液中，含有137mmol氯化钠、2.7mmol氯化钾、10mmol磷酸氢二钾以及2mmol磷酸二氢钾。
其中，步骤2中，所述缓冲液的pH值为7.4。
其中，步骤2中，所述水浴加热的时间为60分钟。
相比于现有的蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，本发明的蚯蚓肠道微生物总DNA提取方法具有的有益效果为：
首先，本发明取样两次且均采用无损伤取样，增加了样品量；
其次，蛋白酶K(消化)与土壤DNA提取试剂盒联用的方法克服了样品中大量泥沙对蚯蚓肠道微生物总DNA提取带来的干扰，本发明肠道微生物总DNA提取效率提高了一倍以上；
最后，本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道微生物总DNA的提取效率和提取质量，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的总DNA条带明亮清晰，从而能够更加准确全面反应蚯蚓肠道内微生物的状况，为后续微生物群落结构与功能的研究奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比实施例得到的蚯蚓肠道微生物总DNA条带对比效果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
本发明蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，包括如下步骤：
步骤1，将某条实验蚯蚓放置于洁净的滤纸上，收集蚯蚓新鲜的粪便，并置于4℃下冷冻储存；
步骤2，将该条蚯蚓放回原生长环境12小时后，再次将其放置于洁净的滤纸上，收集其新鲜的粪便；将前后两次提取的粪便混合并置于4℃下冷冻储存；
步骤3，取蚯蚓新鲜粪便(冷冻储存不超过24小时的粪便)0.2g置于离心管中，加入20μL蛋白酶K和100μL缓冲液，并使用振荡器振荡2分钟混匀，混合均匀后于56℃下水浴加热60分钟，得到液相A；
步骤4，将液相A使用土壤DNA提取试剂盒(SpinKitforSoil试剂盒)进行DNA的提取，得到蚯蚓肠道微生物总DNA；
步骤5，使用微量紫外可见分光光度计(Nanodrop2000)，进行DNA含量的测定；
步骤6，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到微生物总DNA的质量。
本发明提取方法中所使用缓冲液配方为：每1L缓冲液中，含有137mmol氯化钠、2.7mmol氯化钾、10mmol磷酸氢二钾以及2mmol磷酸二氢钾。使用该缓冲液时，采用浓盐酸将缓冲液的PH值调节至7.4。
实施例1得到的蚯蚓肠道微生物总DNA浓度为183.4ng/μL，260/280为1.87。
对比实施例
现有技术中蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，包括如下步骤：
步骤1，取蚯蚓解剖获得蚯蚓粪便；
步骤2，取蚯蚓粪便0.2g，使用DNAStoolMiniKit试剂盒进行DNA的提取，得到蚯蚓肠道微生物总DNA；
步骤3，使用Nanodrop2000，进行DNA含量的测定；
步骤4：使用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的蚯蚓肠道微生物总DNA的质量。
对比实施例得到的蚯蚓肠道微生物总DNA浓度为73.3ng/μL，260/280为1.57。
图1为实施例1和对比实施例得到的蚯蚓肠道微生物总DNA的1％琼脂糖凝胶电泳图，如图1所示，实施例1的蚯蚓肠道微生物总DNA条带明亮清晰，对比实施例的蚯蚓肠道微生物总DNA条带暗淡模糊。
本发明提取方法解决了现有方法无法克服泥沙的干扰，造成蚯蚓肠道微生物总DNA提取效率低的问题，本发明方法以蚯蚓新鲜粪便为样品，先进行样品的前处理，再采用土壤提取试剂盒SpinKitforSoil进行蚯蚓肠道微生物总DNA的提取，提取效率高，且采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的总DNA条带明亮清晰。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，提取某条实验蚯蚓的新鲜粪便，冷冻储存；将该实验蚯蚓放回其原生长环境12小时后，再次提取其新鲜粪便，将前后两次提取的粪便混合，并于4℃下冷冻储存；
步骤2，往0.1～0.5g蚯蚓新鲜粪便中依次加入20μL蛋白酶K和100～200μL缓冲液，混合均匀后于56℃下水浴加热，加热后得到液相A；
步骤3，将步骤3的液相A使用土壤基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，得到蚯蚓肠道微生物总DNA；
步骤4，使用微量紫外可见分光光度计，进行DNA含量的测定；
步骤5，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到蚯蚓肠道微生物总DNA的质量。
2.根据权利要求1所述的蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，其特征在于：步骤2中，所述缓冲液的配方为：每1L缓冲液中，含有137mmol氯化钠、2.7mmol氯化钾、10mmol磷酸氢二钾以及2mmol磷酸二氢钾。
3.根据权利要求1所述的蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，其特征在于：步骤2中，所述缓冲液的pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法，其特征在于：步骤2中，所述水浴加热的时间为60分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610389986.5A CN105821036A (zh) | 2016-06-03 | 2016-06-03 | 一种蚯蚓肠道微生物总dna的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610389986.5A CN105821036A (zh) | 2016-06-03 | 2016-06-03 | 一种蚯蚓肠道微生物总dna的提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105821036A true CN105821036A (zh) | 2016-08-03 |
Family
ID=56531879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610389986.5A Pending CN105821036A (zh) | 2016-06-03 | 2016-06-03 | 一种蚯蚓肠道微生物总dna的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105821036A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277029A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-04-05 | 农业农村部环境保护科研监测所 | 一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外dna的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101935647A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 |
| CN104531892A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-04-22 | 华中农业大学 | 捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN105176970A (zh) * | 2015-07-16 | 2015-12-23 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种适用于高通量测序的样品中微生物dna提取方法 |
-
2016
- 2016-06-03 CN CN201610389986.5A patent/CN105821036A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101935647A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 |
| CN104531892A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-04-22 | 华中农业大学 | 捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN105176970A (zh) * | 2015-07-16 | 2015-12-23 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种适用于高通量测序的样品中微生物dna提取方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ALICE LAYTON ET AL.: "Development of Bacteroides 16S rRNA gene TaqMan-based real-time PCR assays for estimation of total, human, and bovine fecal pollution in water", 《APPL. ENVIRON. MICROBIOL.》 * |
| JINBAO YIN ET AL.: "Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut", 《ECOTOXICOLOGY》 * |
| 尚丽勤 等: "采用PCR-SSCP技术分析蚯蚓粪便的微生物群落结构", 《家畜生态学报》 * |
| 曾志光 等: "猪粪样 DNA 提取方法的比较", 《中国兽医杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277029A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-04-05 | 农业农村部环境保护科研监测所 | 一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外dna的方法 |
| CN114277029B (zh) * | 2022-03-08 | 2022-05-10 | 农业农村部环境保护科研监测所 | 一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外dna的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xie et al. | The phosphorus fractions and alkaline phosphatase activities in sludge | |
| Nagler et al. | The use of extracellular DNA as a proxy for specific microbial activity | |
| Lee et al. | Bacterial populations assimilating carbon from 13C-labeled plant residue in soil: analysis by a DNA-SIP approach | |
| Hu et al. | Contrasting Euryarchaeota communities between upland and paddy soils exhibited similar pH-impacted biogeographic patterns | |
| CN102229926B (zh) | 河流环境样品中微生物dna的简易提取 | |
| CN101712953B (zh) | 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法 | |
| Wang et al. | Isolation of high-quality total RNA from rumen anaerobic bacteria and fungi, and subsequent detection of glycoside hydrolases | |
| Jia et al. | Relationships between soil biodiversity and multifunctionality in croplands depend on salinity and organic matter | |
| CN100410377C (zh) | 从土壤中提取微生物基因组dna的试剂盒及方法 | |
| Miao et al. | A method suitable for DNA extraction from humus-rich soil | |
| Zhang et al. | Soil available phosphorus content drives the spatial distribution of archaeal communities along elevation in acidic terrace paddy soils | |
| Probst et al. | Coupling genetic and chemical microbiome profiling reveals heterogeneity of archaeome and bacteriome in subsurface biofilms that are dominated by the same archaeal species | |
| Blasco et al. | Dynamics of microbial communities in untreated and autoclaved food waste anaerobic digesters | |
| Nguyen et al. | Development of molecular tools for the detection of freshwater diatoms | |
| Fang et al. | Metagenomic insights into production of zero valent sulfur from dissimilatory sulfate reduction in a methanogenic bioreactor | |
| CN103882105A (zh) | 一种石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量测定的方法 | |
| CN111057782A (zh) | 一种基于实时荧光定量pcr检测土壤细菌数量的方法 | |
| Gutiérrez-Lucas et al. | Strategies for the extraction, purification and amplification of metagenomic DNA from soil growing sugarcane | |
| CN105821036A (zh) | 一种蚯蚓肠道微生物总dna的提取方法 | |
| Rothrock et al. | Comparative quantification of Campylobacter jejuni from environmental samples using traditional and molecular biological techniques | |
| Kashi | An improved procedure of the metagenomic DNA extraction from saline soil, sediment and salt | |
| Mahajan et al. | Statistical assessment of DNA extraction methodology for culture-independent analysis of microbial community associated with diverse environmental samples | |
| CN102260666A (zh) | 一种池塘底泥样品高纯度总dna的提取方法 | |
| Zhong et al. | Succession of microbial community in organic waste digestion using simulated intestinal system | |
| Sierocinski et al. | The most efficient microbial community dominates during community coalescence |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160803 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |