CN114277029B

CN114277029B - 一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外dna的方法

Info

Publication number: CN114277029B
Application number: CN202210217674.1A
Authority: CN
Inventors: 杨凤霞; 张克强; 杨鹏; 丁永祯; 田雪力; 韩秉君
Original assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Current assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-03-08
Also published as: CN114277029A

Abstract

本发明公开了一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，步骤如下：蚯蚓肠道内容物的快速获取；胞外基因组内标基因的构建与制备；蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提取。本发明方法一方面可以将个体细小的赤子爱胜蚓的肠道内容物快速取出，步骤简单、耗时短；另一个方面还可以将肠道内容物中的胞外eDNA进行有效分离与提纯，提取效果稳定可靠、重复性好，提取效率可达到61%。通过核酸蛋白测定仪检测，提取的eDNA的OD260/OD280可以达到1.63，OD260/OD230达到1.72，可以进行后续的分子操作。本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道内容物的提取质量，为后续蚯蚓肠道胞外遗传物质的研究奠定了基础。

Description

一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法

技术领域

本发明属于生物技术科学技术领域，尤其是一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法。

背景技术

蚯蚓转化是畜禽粪污高值、高效资源化利用的一种新兴技术，该技术不仅处理效率高，而且可以变废为宝、实现绿色环保，日益受到人们重视。然而，由于在养殖过程中低剂量抗生素的长期使用，已导致畜禽粪便中出现大量抗生素抗性细菌（Antibioticresistance bacteria, ARB）和抗生素耐药基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs），且当前污染形势十分严峻。如果不加以处理，畜禽粪污中的ARGs可能随着蚯蚓转化过程富集到蚯蚓体内或者残留在蚯蚓粪，进一步加大ARGs 进入食物链的风险，最终威胁人类健康和生命安全。

本申请人前期研究中发现蚯蚓可以一定程度降低粪污中大部分ARGs的含量水平，且蚯蚓肠道是ARGs 消解的重要场所，其中，蚯蚓肠道的独特微生物群落在此过程中也扮演着重要的角色。微生物细胞是ARGs的主要携带者，当微生物细胞自然死亡或因环境改变发生水解死亡后，细胞内DNA包含胞内ARGs在内的遗传物质即会被释放出发来，形成有利于胞外的DNA和ARGs即eDNA与eARGs，且eARGs会通过不同于iDNA的传播方式对细菌耐药性扩散起到一定的作用。因此，针对不同转化时期蚯蚓的不同肠段进行肠道内容物的快速获取及其胞外eDNA的高效提取的进一步探究，对于摸清蚯蚓肠道消解ARGs的关键部位及其消解机理的研究尤为重要。

目前，蚯蚓肠道内容物的获取主要是采用蚯蚓解剖的方法，但该方法主要是适用于个体较大的威廉环毛蚓，且该方法比较耗时，肠道内容物还容易受到体液的污染，而对于个体较细小的赤子爱胜蚓肠道内容的快速获取方法，目前还缺乏相应的快速提取方法；此外，对于不同样品中eDNA的提取方法主要有苯酚-氯仿抽提法、磁珠吸附法CTAB提取法等，但这些方法主要针对组织、血浆和养殖粪水中eDNA的提取。而蚯蚓肠道内容物复杂，蚯蚓体液干扰严重，现有方法无法直接用于蚯蚓肠道中eDNA的提取，因此建立一种蚯蚓肠道内容物快速获取及其eDNA的高效提取方法至关重要。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法（CN105821036A），该提取方法一方面以蚯蚓新鲜粪便为样品，并对样品进行前处理，一方面将蛋白酶K(消化)与土壤DNA提取试剂盒联用，从而使本发明提取方法解决了现有方法无法克服泥沙干扰，造成的蚯蚓肠道微生物总DNA提取效率低的问题；本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道微生物总DNA的提取效率和提取质量，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的总DNA条带明亮清晰，从而能够更加准确全面反应蚯蚓肠道内微生物的状况，为后续微生物群落结构与功能的研究奠定了基础。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，步骤如下：

S1蚯蚓肠道内容物的快速获取：首先从蚓床选取成熟且带有生殖环带的成年新鲜赤子爱胜蚓，将蚯蚓除去体表泥土后，使用固定液进行熏蒸，熏蒸条件45℃，10-15min将其麻醉固定，固定液为无水乙醇、变性酒精、异丙醇的混合液，无水乙醇：变性酒精：异丙醇的体积比为3：1：2，固定后将其捞出放入95%乙醇中进行脱水，待蚓体收缩至首尾相接的圆环状，然后再将蚯蚓取出放入装有纯净水的烧杯中，将蚓体表面乙醇及蚓体清洗干净，用无菌吸收纸吸去体表水分；

然后用无菌解剖剪刀在生殖环带16节末端处及中肠与后肠分界处剪开，利用无菌尖嘴镊子按压固定一侧，再选择无菌宽嘴镊子且使用不会破坏蚯蚓体表的力度均匀脉冲式挤压蚯蚓腹部，将肠道内容物挤出，收集至无菌EP管中，放置于冰上暂存，整个过程在3min内完成；

S2 胞外基因组内标基因的构建与制备：选取一种单拷贝淀粉合成酶基因zSSIIb且在待检环境样本中检测不到的zSSIIb基因作为计算胞外DNA提取效率的内标基因；同时将在样品中不存在的携带绿色荧光蛋白gfp基因的克隆菌GFP-E.coil DH5α 作为内标菌，以验证胞外DNA提取过程中，无胞内基因的污染；

将zSSIIb基因与gfp基因分别通过PCR扩增，切胶回收后获得3’末端带有A碱基的目标基因扩增液，取新鲜PCR回收产物与pEASY-T3 克隆载体轻轻混合，在15-25℃的室温下反应5min，立即置于冰上；将连接产物加于感受态细胞E .coli DH5α中冰浴25min，于42℃热激30秒，立即置于冰上2min；加入新鲜SOC液体培养基，200rpm下37℃孵育1h；取菌液均匀涂布在预先准备好的含 500mM IPTG和 20 mg/ml X-gal的100 μg/ml Amp+SOC抗性平板上，于37℃培养箱中过夜培养；挑选白色菌落接种于100 μg/ml Amp+SOC的液体培养基（SOC培养基组分浓度：组份浓度：2% (W/V) Tryptone，0.5% (W/V) Yeast Extract，0.05% (W/V) NaCl，2.5 mM KCl，10 mM，MgCl2，20 mM glucose，该培养基从市面可以直接购买到，）中，37℃与200rpm条件下培养6-8小时；用质粒试剂盒提取质粒，提取后用核酸蛋白分析仪测定内标基因的浓度；

S3 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提取

S3.1 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的分离

准确称取步骤S1得到的蚯蚓肠道内容物于无菌EP管，取步骤S2提取的含内标基因的标准质粒DNA与S2步骤中构建的绿光蛋白内标菌GFP-E.coil DH5α加入到蚯蚓肠道样品中，再取PVPP (Polyvinyl pyrrolidone) 和0.12 M的pH=8.0的NaH₂PO₄溶液，混合均匀后，于25℃和200rpm的条件下反应10 min；然后10000*g、4℃低温离心10 min，取上清过0.22 μm PVDF（聚偏二氟乙烯）微孔滤膜；再取同量的0.12 M的pH=8.0的NaH₂PO₄溶液和同量的PVPP，按上述过程重复2次，最后将3次得到的滤液合并于新的无菌EP管中；再向合并的滤液中加入木瓜蛋白酶，混合均匀后于56℃下水浴孵育，以最有效地消除蚯蚓肠道粘液对胞外DNA提取效率的影响，待用；

S3.2 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的获取

向步骤S3.1中得到的孵育后上清液中加入等体积的CTAB提取液中，轻轻上下颠倒混匀，置于65℃水浴30min，于6000*g、4℃离心10min，弃上清；加高盐TE缓冲液，重悬沉淀物；再加0.6倍体积冷异丙醇，混匀后置于冰上1h，10000*g、4℃离心20min，沉淀用0.9 ml常规TE缓冲液复溶；然后加入RNA酶，37℃水浴20min，接着加入异硫氰酸胍变性液，轻轻颠倒混匀，再加入等体积三氯甲烷与异戊醇按24:1的体积比混合的混合液，轻轻混匀，于4℃低温10000*g高速离心10min，小心吸取上层溶液于无菌EP管中，初步得到肠道内容物胞外DNA溶液；本发明方法通过添加 RNA酶，37℃水浴20min; 同时结合异硫氰酸胍变性液（6M异硫氰酸胍、50mM Tris-Cl和等量tris 饱和酚，pH=8.0）去除蛋白污染的方法，大幅度去除了RNA与蛋白杂质的污染。

S3.3 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提纯

向S3.2步骤中得到的胞外DNA溶液加入NaCl与无水乙醇，使NaCl的终浓度为0.14mol/L、使无水乙醇的终浓度为70%（体积浓度），在-20℃的条件下沉淀DNA 30 min，12000*g、4℃低温离心20 min，去上清后，用70%冷乙醇洗涤2次，12000*g、4℃低温离心10 min，弃上清后置于冰上，于无菌超净工作台风干，溶于50 μl 65℃预热的无菌ddH₂O中；

S3.4 提取液中内标基因的定量检测

分别利用普通定性PCR基因与实时荧光定量PCR技术方法检测胞外DNA提取液中gfp基因的发生与zSSIIb基因的含量。

进一步地，所述zSSIIb基因是玉米中的一段具有单拷贝特点且在所要提取DNA的蚯蚓肠道内容物样品中检测不到的基因；胞内DNA污染的排除方法是采用的携带绿色荧光蛋白gfp基因的克隆菌GFP-E.coil DH5α的添加法。

进一步地，所述S2中新鲜PCR回收产物：pEASY-T3 克隆载体：感受态细胞E .coliDH5α：新鲜SOC液体培养基：菌液：500mM IPTG：20 mg/ml X-gal的体积比为0.5-4（优选4μL）：1：50：250：100-200：8：40。

进一步地，所述S3中蚯蚓肠道内容物：含内标基因的标准质粒DNA：PVPP：NaH₂PO₄溶液：木瓜蛋白酶：RNA酶：异硫氰酸胍变性液的比例 g：μg：g ：ml：μL：μL：μL为0.3：5：0.3：5：20：5：100，所述内标菌GFP-E.coil DH5α的添加终浓度为10⁸-10⁹ CFU/g肠道内容物。

进一步地，所述S3.2中CTAB提取液为：将CTAB溶解于10mM EDTA和50mMTris中，pH=8.0，CTAB的质量终浓度为1%。

进一步地，所述S3.2中高盐TE缓冲液包括10mM Tris-HCl、0 .1mM EDTA和1MNaCl，pH＝8.0。

进一步地，所述S3.2中TE缓冲液为10mM Tris-HCl、0 .1mM EDTA的混合液，pH＝8.0。

进一步地，所述S3.2中异硫氰酸胍变性液为：6M异硫氰酸胍、50mM Tris-Cl和等量tris 饱和酚，pH=8.0。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明方法一方面可以将个体细小的赤子爱胜蚓的肠道内容物快速取出，步骤简单、耗时短；另一个方面还可以将肠道内容物中的胞外eDNA进行有效分离与提纯，提取效果稳定可靠、重复性好，提取效率可达到61%。通过核酸蛋白测定仪检测，提取的eDNA的OD260/OD280可以达到1.63，OD260/OD230达到1.72，可以进行后续的分子操作。本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道内容物的提取质量，为后续蚯蚓肠道胞外遗传物质的研究奠定了基础。

2、本发明方法是一种蚯蚓肠道内容物的快速获取及其胞外DNA的高效提取方法，该方法不仅能够有效解决蚯蚓体液对蚯蚓肠道内容物的污染，还能够提高蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提取效率。

3、本发明方法通过添加 RNA酶，37℃水浴20min; 同时结合异硫氰酸胍变性液（6M异硫氰酸胍、50mM Tris-Cl和等量tris 饱和酚，pH=8.0）去除蛋白污染的方法，大幅度去除了RNA与蛋白杂质的污染。

4、本发明方法中使用0.14 mol/L NaCl与终浓度为70%的乙醇相结合的方法，进行低温沉淀胞外DNA，以提高DNA沉淀效率。

5、本发明方法中蚯蚓体液干扰消除采用的是向胞外DNA初滤液中向滤液中加入20μL木瓜蛋白酶，混合均匀后于56℃下水浴孵育，以最有效地消除蚯蚓肠道粘液对胞外DNA提取效率的影响。

6、本发明方法中胞内DNA污染的排除方法是采用的携带绿色荧光蛋白gfp基因的克隆菌GFP-E.coil DH5α的添加法。

附图说明

图1为本发明中蚯蚓肠道内容物照片图；其中，（a）、（b）与（c）分别为使用本发明方法获取的赤子爱胜蚓的前肠、中肠与后肠肠道内容物，（d）为通过解剖获得的威廉环毛蚓的肠道内容物。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

然后用无菌解剖剪刀在生殖环带16节末端处及中肠与后肠分界即第45体节处剪开，利用无菌尖嘴镊子按压固定一侧，再选择无菌宽嘴镊子且使用不会破坏蚯蚓体表的力度均匀脉冲式挤压蚯蚓腹部，将肠道内容物挤出，收集至无菌EP管中，放置于冰上暂存，整个过程在3min内完成；同时此法也最大程度地降低蚯蚓体液对肠道内容的污染，且效率最高。熏蒸能够部分液体进入蚯蚓体内，能够保证蚯蚓体表体内蛋白、脂类等不会与外皮等粘连，去除蛋白等更加容易，熏蒸比浸泡的蛋白去除率提高5-8%左右。

S2 胞外基因组内标基因的构建与制备：选取一种单拷贝淀粉合成酶基因zSSIIb且在待检环境样本中检测不到的基因zSSIIb作为计算胞外DNA提取效率的内标基因；同时将在样品中不存在的携带绿色荧光蛋白gfp基因的克隆菌GFP-E.coil DH5α 作为内标菌，以验证胞外DNA提取过程中，无胞内基因的污染；

将基因zSSIIb与基因gfp分别通过PCR扩增，切胶回收后获得3’末端带有A碱基的目标基因扩增液，取新鲜PCR回收产物与pEASY-T3 克隆载体轻轻混合，在15-25℃的室温下反应5min，立即置于冰上；将连接产物加于感受态细胞E .coli DH5α中冰浴25min，于42℃热激30秒，立即置于冰上2min；加入新鲜SOC液体培养基，200rpm下37℃孵育1h；取菌液均匀涂布在预先准备好的含 500mM IPTG和 20 mg/ml X-gal的100 μg/ml Amp+SOC抗性平板上，于37℃培养箱中过夜培养；挑选白色菌落接种于100 μg/ml Amp+SOC的液体培养基（SOC培养基组分浓度：组份浓度：2% (W/V) Tryptone，0.5% (W/V) Yeast Extract，0.05% (W/V) NaCl，2.5 mM KCl，10 mM，MgCl2，20 mM glucose，该培养基从市面可以直接购买到，）中，37℃与200rpm条件下培养6-8小时；用质粒试剂盒提取质粒，提取后用核酸蛋白分析仪测定内标基因的浓度；

S3 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提取

S3.1 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的分离

S3.2 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的获取

S3.3 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提纯

S3.4 提取液中内标基因的定量检测

较优地，用于评估胞外DNA提取效率的zSSIIb内标基因是玉米中的一段具有单拷贝特点且在所要提取DNA的蚯蚓肠道内容物样品中检测不到的基因；胞内DNA污染的排除方法是采用的携带绿色荧光蛋白gfp基因的克隆菌GFP-E.coil DH5α的添加法。

较优地，所述S2中新鲜PCR回收产物：pEASY-T3 克隆载体：感受态细胞E .coliDH5α：新鲜SOC液体培养基：菌液：500mM IPTG：20 mg/ml X-gal的体积比为0.5-4（优选4μL）：1：50：250：100-200：8：40。

较优地，所述S3中蚯蚓肠道内容物：含内标基因的标准质粒DNA：PVPP：NaH₂PO₄溶液：木瓜蛋白酶：RNA酶：异硫氰酸胍变性液的比例 g：μg：g ：ml：μL：μL：μL为0.3：5：0.3：5：20：5：100，所述内标菌GFP-E.coil DH5α的添加终浓度为10⁸-10⁹ CFU/g肠道内容物。

较优地，所述S3.2中CTAB提取液为：将CTAB溶解于10mM EDTA和50mMTris中，pH=8.0，CTAB的质量终浓度为1%。

较优地，所述S3.2中高盐TE缓冲液包括10mM Tris-HCl、0 .1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0。

较优地，所述S3.2中TE缓冲液为10mM Tris-HCl、0 .1mM EDTA的混合液，pH＝8.0。

较优地，所述S3.2中异硫氰酸胍变性液为：6M异硫氰酸胍、50mM Tris-Cl和等量tris 饱和酚，pH=8.0。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1 赤子爱胜蚓前肠、中肠与后肠内容物的获取及其胞外eDNA的提取。

除非特殊说明，以下实施例中所使用的试剂和耗材均为市购。

1. 新鲜成熟蚯蚓的采集

在天津市忠涛蚯蚓养殖专业合作社进行新鲜成熟且带有生殖环带的赤子爱胜蚓样品进行采集，蚯蚓个体重量在0.3-0.5 g。为了避免蚯蚓在运输途中出现的自然排便影响肠道内容物的含量，需要连同部分蚓床基质一同采集，并一同放置于蚯蚓养殖箱中。

2. 蚯蚓肠道内容物的快速获取

蚯蚓肠道内容物的快速获取：首先从蚓床选取成熟且带有生殖环带的成年新鲜赤子爱胜蚓，放在装有无水乙醇的烧杯中，使其快速麻醉，待蚓体收缩至首尾相接的圆环状，将其捞出随即放入装有纯净水的烧杯中，将蚓体表面乙醇及蚓体清洗干净，用无菌吸收纸吸去体表水分，放在无菌培养皿中；然后用无菌解剖剪刀在生殖环带16节末端处及中肠与后肠分界即第45体节处快速剪开，利用无菌尖嘴镊子按压固定一侧，再选择无菌宽嘴镊子且使用不会破坏蚯蚓体表的力度均匀脉冲式挤压蚯蚓腹部，将肠道内容物缓缓挤出，将不同肠段的肠道内容物分别收集至无菌EP管中，放置于冰上暂存，整个过程可在3min内完成。根据上述过程反复处理60-80条鲜活蚯蚓样品。如图1所示，图1为使用上述方法获得的蚯蚓肠道不同肠段内容物的实物照片图。

3. 胞外DNA内标基因的构建与制备

选取一种单拷贝淀粉合成酶基因zSSIIb且在待检环境样本中检测不到的zSSIIb基因作为计算胞外DNA提取效率的内标基因；同时将构建的样品中不存在的携带绿色荧光蛋白gfp基因的克隆菌GFP-E.coil DH5α 作为内标菌，以验证胞外eDNA提取过程中无胞内基因（iDNA）的污染。将zSSIIb基因与gfp基因分别通过PCR扩增切胶回收后获得3’末端带有A碱基的目标基因扩增液，取新鲜PCR回收产物4 μl与1 μl pEASY-T3 克隆载体轻轻混合，在15-25℃的室温下反应5min，立即置于冰上；将连接产物加于50 μl感受态细胞E .coliDH5α中冰浴25min，于42℃热激30秒，立即置于冰上2min；加入250μl新鲜SOC液体培养基，200rpm下37℃孵育1h；取100 μl菌液进行在含8μl IPTG（500mM）和40 μl X-gal（20 mg/ml）的选择性平板上，于37℃培养箱中过夜培养；挑选白色菌落接种于SOC/AMP+的液体培养基中，37℃与200rpm条件下培养6-8小时；用质粒试剂盒提取质粒，提取后用核酸蛋白分析仪测定内标基因的浓度。

4. 蚯蚓肠道内容物胞外eDNA的提取

(1) 蚯蚓肠道内容物胞外eDNA的分离

准确称取0.3 g蚯蚓肠道内容物于50 ml无菌EP管，取5 μg S2步骤提取的含内标基因的标准质粒DNA与S2步骤中构建的绿光蛋白内标菌GFP-E.coil DH5α（其浓度为10⁸-10⁹CFU/g肠道内容物）加入到样品中，再取0.3 g PVPP (Polyvinyl pyrrolidone) 和5 ml0.12 M的NaH₂PO₄溶液（pH=8.0），混合均匀后，于25℃和200 rpm的条件下反应10 min；然后10000*g、4℃低温离心10 min，取上清过0.22 μm PVDF微孔滤膜；再取5 ml 0.12 M的NaH₂PO₄溶液（pH=8.0）和同量的PVPP，按上述过程重复2次，最后将3次得到的滤液合并于新的无菌50 ml EP管中；再向合并的滤液中(a)不加酶/(b)加入20 μL木瓜蛋白酶，分四个酶处理类型，混合均匀后于56℃下水浴孵育，待用。

(2) 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的获取

向上一步骤中得到的上清液中加入等体积的CTAB提取液（1%CTAB溶解于10mMEDTA和50mMTris中，pH=8.0），轻轻上下颠倒混匀，置于65℃水浴30min，于6000*g、4℃离心10min，弃上清；加1ml 高盐TE缓冲液，复溶沉淀物，所述高盐TE缓冲液包括10mM Tris-HCl、0 .1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；再加0.6倍体积冷异丙醇，混匀后置于冰上1h，10000*g、4℃离心20min，沉淀用1ml 常规TE缓冲液复溶，所述常规TE缓冲液包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；然后加入5μL RNA酶，37℃水浴20min; 接着加入100μL异硫氰酸胍变性液（6M异硫氰酸胍、50mM Tris-Cl和等量tris 饱和酚，pH=8.0），轻轻颠倒混匀，再加入等体积三氯甲烷与异戊醇24:1的混合液，轻轻混匀，于4℃低温10000*g高速离心10min，小心吸取上层溶液于5ml无菌EP管中，初步得到肠道内容物胞外DNA溶液。

(3) 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提纯

向上一步步骤中得到的胞外DNA溶液加入NaCl与无水乙醇使其终浓度分别为0.14mol/L 和70%，在-20℃的条件下沉淀DNA 30 min，12000*g、4℃低温离心20 min，去上清后，用70%冷乙醇洗涤2次，12000*g、4℃低温离心10 min，弃上清后置于冰上，于无菌超净工作台风干，溶于50 μl 65℃预热的无菌ddH2O中。

4．使用微量核算蛋白分析仪( NanoVue Plus )，进行所提取的胞外DNA的纯度（OD260/OD280与OD260/OD230）的测定。

5. 利用普通定性PCR基因与实时荧光定量PCR技术方法检测胞外DNA提取液中gfp基因的发生与zSSIIb基因的含量。

对比例

对比例与实施例1的区别在于在蚯蚓肠道内容物胞外eDNA的分离步骤中不添加木瓜蛋白酶作用，其他实时步骤不变。

按照实施例1所述的方法获取的赤子爱胜蚓不同肠段内容物见图1，其不同肠段的内容物不仅纯度高、受蚯蚓体液污染小，而且使后续eDNA提取更加方便快捷，同时也提高了不同肠段蚯蚓肠道内容物eDNA的提取纯度。利用微量核算蛋白分析仪( NanoVue Plus )对所提取的成熟赤子爱胜蚓不同肠段内容物的胞外eDNA的OD260/OD280与OD260/OD230进行测定，结果见表1。结果显示用本发明中的方法提取的蚯蚓肠道内容物中胞外DNA的OD260/OD280值在1.45以上，说明提取胞外DNA中蛋白质残留量低；胞外DNA的OD260/OD230值在1.61以上，说明腐殖酸类等杂质少；因此本发明适合用于提取蚯蚓肠道内容物中的胞外eDNA。并且与对比例（表2）相比，使用木瓜蛋白酶联合方法eDNA提取纯度效果显著提高。

表1 实施例1中蚯蚓不同肠段内容物中胞外eDNA的纯度

表2 对比例中蚯蚓不同肠段内容物中胞外eDNA的纯度

实施例2：PCR扩增检测蚯蚓肠道内容物中胞外DNA的提取效率

在实施例2中，对于16S rRNA基因的引物序列，其上游引物：5’-CGGTGAATACGTTCYCGG-3’，下游引物：5’- GGWTACCTTGTTACGACTT -3’；对于zSSIIb内标基因的引物序列，其上游引物：5’-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3’，下游引物：5’-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG -3’；对于gfp基因的引物序列，其上游引物：5’-TCCGTTCAACTAGCAGACCAT-3’，下游引物：5’- TCATCCATGCCATGTGTAATCC -3’；16S rRNA基因、zSSIIb与gfp内标基因的扩增片段长度分别为126bp、151bp与182bp。

实施例2中的普通PCR扩增反应体系选择的是25 μL的扩增体系，定性PCR扩增反应体系见表3。

表3 定性PCR反应体系

组成	体积 (μL)	最终浓度
			10 × Easy Taq buffer	2.5	1×
2.5 mM dNTPs	2.0	0.2 mM
			EasyTaq DNA polymerase	0.25	2.5 units
F-primer（正向引物）	0.5	0.2 μM
			R-primer（反向引物）	0.5	0.2 μM
ddH<sub>2</sub>O	18.25	—
			DNA Template	1.0	—

定性PCR 反应程序为：首先94℃持续4 min进行DNA预变性，接着是重复35个温度循环（94℃持续30 s，目的基因退火温度下持续30秒，72℃持续1 min）进行扩增，最后72℃持续7 min 进行最后的延伸。

PCR扩增后，取5 μL反应后的PCR产物在1×TAE的电泳缓冲液中用1.5 %的琼脂糖凝胶，进行电泳以检测PCR扩增结果，电泳条件为90 mV，25 min。并在紫外成像仪下观察凝胶上DNA条带情况，以标准DNA已知的分子条带大小为基准，确定目的基因的存在。

在实施例2中，采用20µL 的qPCR反应体系，体系组成见表4所示：

表4 定量qPCR反应体系

体系所含物	加入体积 / µL	工作液浓度
			SYBR premix Ex Ta1(Tli RNaseH plus)(2×)	10	1×
ROX Reference DyeⅡ(50×)	0.4	1×
			Forward Primer (10 µM)	0.4	0.2 µM
Reverse Primer (10 µM)	0.4	0.2 µM
			ddH<sub>2</sub>O	6.8	——
DNA Template	2.0	——

在实施例2中，采用的qPCR反应常规程序是“两步法PCR反应程序”：第一步是预变性95℃进行30S；第二步是在95℃下反应5S和60℃下反应34S，进行40个循环。为了量化结果的准确性，扩增反应完毕后又接着在仪器上检测了PCR产物的熔解曲线。熔解曲线的反应程序是从60℃ – 95 ℃，且每升高1 ℃ 采集一次荧光信号，升高至95℃时停留30 s，最后60℃停留15s即完成溶解曲线。

表5 实施例1中蚯蚓肠道内容物样品中胞外DNA的提取效率

样品编号	提取效率
		前肠段1	48%
前场段2	50%
		中肠段1	55%
中肠段2	56%
		后肠段1	61%
后肠段2	59%

表6 对比例中蚯蚓肠道内容物样品中胞外DNA的提取效率

样品编号	提取效率
		前肠段1	37%
前场段2	38%
		中肠段1	40%
中肠段2	38%
		后肠段1	46%
后肠段2	50%

通过实施例2所述方法检测对蚯蚓肠道不同肠段内容物的提取效率均高于48％，最高可达61％，且在提取的DNA样品中未扩增出gfp的内标基因条带，表明提取过程中不存在胞内基因的污染；与对比例相比，使用本发明的实施例1的eDNA提取效率最佳。因此，本发明适合蚯蚓肠道内容物中胞外eDNA的提取。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 农业农村部环境保护科研监测所

<120> 一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 16S rRNA基因的上游引物(Unknown)

<400> 1

cggtgaatac gttcycgg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 16S rRNA基因的下游引物(Unknown)

<400> 2

ggwtaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> zSSIIb内标基因的上游引物(Unknown)

<400> 3

ctcccaatcc tttgacatct gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> zSSIIb内标基因的下游引物(Unknown)

<400> 4

tcatccatgc catgtgtaat cc 22

Claims

1.一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：步骤如下：

将基因zSSIIb与基因gfp分别通过PCR扩增，切胶回收后获得3’末端带有A碱基的目标基因扩增液，取新鲜PCR回收产物与pEASY-T3 克隆载体混合，在15-25℃的室温下反应5min，立即置于冰上；将连接产物加于感受态细胞E .coli DH5α中冰浴25min，于42℃热激30秒，立即置于冰上2min；加入新鲜SOC液体培养基，200rpm下37℃孵育1h；取菌液均匀涂布在预先准备好的含 500mM IPTG和 20 mg/ml X-gal的100 μg/ml Amp+SOC抗性平板上，于37℃培养箱中过夜培养；挑选白色菌落接种于100 μg/ml Amp+SOC的液体培养基中，37℃与200rpm条件下培养6-8小时；用质粒试剂盒提取质粒，提取后用核酸蛋白分析仪测定内标基因的浓度；

S3 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提取

S3.1 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的分离

准确称取步骤S1得到的蚯蚓肠道内容物于无菌EP管，取步骤S2提取的含内标基因的标准质粒DNA与S2步骤中构建的绿光蛋白内标菌GFP-E.coil DH5α加入到蚯蚓肠道样品中，再取PVPP和0.12 M的pH=8.0的NaH₂PO₄溶液，混合均匀后，于25℃和200rpm的条件下反应10min；然后10000*g、4℃低温离心10 min，取上清过0.22 μm PVDF微孔滤膜；再取同量的0.12M的pH=8.0的NaH₂PO₄溶液和同量的PVPP，按上述过程重复2次，最后将3次得到的滤液合并于新的无菌EP管中；再向合并的滤液中加入木瓜蛋白酶，混合均匀后于56℃下水浴孵育，待用；

S3.2 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的获取

向步骤S3.1中得到的孵育后上清液中加入等体积的CTAB提取液中，上下颠倒混匀，置于65℃水浴30min，于6000*g、4℃离心10min，弃上清；加高盐TE缓冲液，重悬沉淀物；再加0.6倍体积冷异丙醇，混匀后置于冰上1h，10000*g、4℃离心20min，沉淀用TE缓冲液复溶；然后加入RNA酶，37℃水浴20min，接着加入异硫氰酸胍变性液，颠倒混匀，再加入等体积三氯甲烷与异戊醇按24:1的体积比混合的混合液，混匀，于4℃低温10000*g高速离心10min，吸取上层溶液于无菌EP管中，初步得到肠道内容物胞外DNA溶液；

S3.3 蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提纯

向S3.2步骤中得到的胞外DNA溶液加入NaCl与无水乙醇，使NaCl的终浓度为0.14 mol/L、使无水乙醇的终浓度为70%体积浓度，在-20℃的条件下沉淀DNA 30 min，12000*g、4℃低温离心20 min，去上清后，用70%冷乙醇洗涤2次，12000*g、4℃低温离心10 min，弃上清后置于冰上，于无菌超净工作台风干，溶于65℃预热的无菌ddH₂O中；

S3.4 提取液中内标基因的定量检测

分别利用定性PCR基因与实时荧光定量PCR技术方法检测胞外DNA提取液中gfp基因的发生与基因zSSIIb的含量。

2.根据权利要求1所述的高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：所述基因zSSIIb是玉米中的一段具有单拷贝特点且在所要提取DNA的蚯蚓肠道内容物样品中检测不到的基因；胞内DNA污染的排除方法是采用的携带绿色荧光蛋白gfp基因的克隆菌GFP-E.coil DH5α的添加法。

3.根据权利要求1所述的高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：所述S2中新鲜PCR回收产物：pEASY-T3 克隆载体：感受态细胞E .coli DH5α：新鲜SOC液体培养基：菌液：500mM IPTG：20 mg/ml X-gal的体积比为0.5-4：1：50：250：100-200：8：40。

4.根据权利要求1所述的高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：所述S3中蚯蚓肠道内容物：含内标基因的标准质粒DNA：PVPP：NaH₂PO₄溶液：木瓜蛋白酶：RNA酶：异硫氰酸胍变性液的比例 g：μg：g ：ml：μL：μL：μL为0.3：5：0.3：5：20：5：100，所述内标菌GFP-E.coil DH5α的添加终浓度为10⁸-10⁹ CFU/g肠道内容物。

5.根据权利要求1所述的高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：所述S3.2中CTAB提取液为：将CTAB溶解于10mM EDTA和50mMTris中，pH=8.0，CTAB的质量终浓度为1%。

6.根据权利要求1所述的高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：所述S3.2中高盐TE缓冲液包括10mM Tris-HCl、0 .1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0。

7.根据权利要求1所述的高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：所述S3.2中TE缓冲液为10mM Tris-HCl、0 .1mM EDTA的混合液，pH＝8.0。

8.根据权利要求1至7任一项所述的高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，其特征在于：所述S3.2中异硫氰酸胍变性液为：6M异硫氰酸胍、50mM Tris-Cl和等量tris 饱和酚，pH=8.0。