CN115820464B

CN115820464B - 一株蜂窝孢类芽孢杆菌jauccb0001及其在促进长根菇生长中的应用

Info

Publication number: CN115820464B
Application number: CN202211029266.XA
Authority: CN
Inventors: 胡殿明; 宋海燕; 徐苗; 高扬; 胡海静
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2022-08-01
Filing date: 2022-08-01
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-08-01
Also published as: CN115820464A

Abstract

本发明公开了一株蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001及其在促进长根菇生长中的应用。所述蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的微生物学分类命名为蜂窝孢类芽孢杆菌，拉丁文学名为Paenibacillusfavisporus，已于2022年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2022843。本申请筛选得到的菌株可有效促进长根菇菌丝的生长，将其以液态促生菌剂的方式喷洒在菌丝已经生理成熟的长根菇菌棒上，能促进长根菇子实体的生长，显著增加每棒出菇量，且子实体长度、菌柄直径、菌盖直径均有增加。本申请菌株有效增加了长根菇的产量，从而增加了长根菇的经济效益。

Description

一株蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001及其在促进长根菇生长中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001及其在促进长根菇生长中的应用。

背景技术

长根菇(Oudemansiella raphanipes)，又称黑皮鸡枞，有较高的食用和药用价值，属食药兼用菌。长根菇肉质细嫩，味道鲜美，富含蛋白质、氨基酸、脂肪、糖类(碳水化合物)、维生素、微量元素以及真菌多糖、三萜类、朴菇素、生物碱、牛黄酸、磷脂、叶酸等多种营养成分。其中，长根菇富含的蛋白质、氨基酸、脂肪酸、多糖以及其他生物活性物质，具有多种药理活性，包括降血压、抗菌、抗肿瘤等。另外，在长根菇中含有一种长根菇酮(oudenone)，具有降血压、抑肿瘤等作用。长根菇在我国四川、福建、江西、浙江等地已经进行规模化的商业栽培，产品主要有鲜菇、干菇，在各地农贸市场、超市常年供应。年鲜菇产量为3～5万吨。市场价格可达20-60元/公斤。

目前，长根菇通常采用菌棒覆土栽培模式，该栽培模式需要先生产长满菌丝的菌棒，然后在菌棒表面覆土，再出菇。长根菇现有的栽培模式存在产量低、质量不稳定、子实体个体较小等问题，严重阻碍了长根菇产业的发展。长根菇促生菌是在长根菇栽培过程中与长根菇共同生长并对长根菇生长、出菇等具有促进作用的微生物，充分利用长根菇促生菌，不仅可以提高长根菇的产量和质量，而且成本低且不会造成环境污染等问题，可以大大提高长根菇生产效益。所以，申请人认为，筛选能够促进长根菇生长的微生物具有重要意义。

发明内容

本发明为了解决现有长根菇栽培技术中存在的产量低、质量不稳定、子实体个体较小的问题，提供了一株蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001及其在促进长根菇生长中的应用。

第一方面，本发明提供了一种蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001，是采用以下技术方案得以实现的。

一株蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001，其微生物学分类命名为蜂窝孢类芽孢杆菌，拉丁文学名为Paenibacillus favisporus，已于2022年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2022843。

第二方面，本发明提供了一种蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的应用，是采用以下技术方案得以实现的。

一种上述蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001在促进长根菇生长中的应用。

优选的，蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001以液态促生菌剂的方式喷洒在菌丝已经生理成熟的长根菇菌棒上。

第三方面，本发明提供了一种长根菇促生菌剂，是采用以下技术方案得以实现的。

一种长根菇促生菌剂，包括上述蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001。

进一步的，促生菌剂中蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的浓度为1.7×10⁷-3.8×10⁷CFU/mL。

第四方面，本发明提供一种长根菇促生菌剂的制备方法，是采用以下技术方案得以实现的。

一种上述长根菇促生菌剂的制备方法，包括以下步骤：

S1.将权利要求1所述蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001菌株接种在TSA固体培养基上，置于29-30℃培养40-50h，得到活化的菌株；

2)将蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的活化菌株接种到TSB液体培养基中，28-30℃，170-190r/min的条件下培养25-28h，制得种子液；

3)将制得的种子液接种于发酵培养基中，接种量为5～10v％，在28～32℃、搅拌转速为150～200r/min的条件下培养48～72h，即得发酵液；

4)将细菌菌株的发酵液在4℃、8000-9000rpm条件下离心10-15min得到细菌的菌体沉淀，加入无菌水后配制成促生菌剂。

进一步的，步骤S1中，TSA固体培养基的成分包括胰蛋白胨16.96-17.04g/L，葡萄糖2.14-2.54g/L，大豆胨2.96-3.04g/L，氯化钠4.95-5.05g/L，磷酸二氢钾2.46-2.54g/L，琼脂19-21g/L，pH 7.3±0.2。

进一步的，步骤S2中，TSB液体培养基的成分包括胰蛋白胨16.96-17.04g/L，葡萄糖2.14-2.54g/L，大豆胨2.96-3.04g/L，氯化钠4.95-5.05g/L，磷酸二氢钾2.46-2.54g/L，pH 7.3±0.2。

进一步的，步骤S3中，发酵培养基的成分包括胰蛋白胨16-18g/L，葡萄糖2-3g/L，大豆胨2-4g/L，氯化钠4-6g/L，磷酸二氢钾2-3g/L，pH7.3±0.2。

第五方面，本发明提供一种长根菇促生长的方法，是采用以下技术方案得以实现的。

一种长根菇促生长的方法，包括以下步骤：将上述长根菇促生菌剂喷洒在菌丝已经生理成熟的长根菇菌棒上，每个长根菇菌棒均匀喷洒8-12ml促生菌剂，待促生菌剂被菌棒吸收后，在袋口覆盖2.5-3.5cm厚的土，然后浇灌240-300ml无菌水直至覆土完全吸透水分，处理完之后每天早晚各喷一次清水，加大昼夜温差，白天温度提高至25-29℃，晚间降低到15-19℃；空气相对湿度保持在88-92％，保持覆土始终处于湿润状态；CO₂浓度维持在800-1200ppm进行催蕾培养20-30d，陆续开始长出小菇蕾，待菇蕾长到5～7cm长，菌盖未展平时进行采收。

本申请具有以下有益效果：

与现有技术相比，本发明筛选得到的蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001能够明显促进长根菇菌丝的生长，促进长根菇子实体的生长，每棒出菇量显著增加，长根菇子实体更大，质量更好。另外，子实体长度、菌柄直径、菌盖直径均有增加。本发明提高了长根菇的产量，进而提高了长根菇的经济效益，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001与长根菇菌株在平板上共培养7d后的结果图(其中，左图为实验组，右图为对照组)；

图2是本发明蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的系统发育树图；

图3是本发明蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的革兰氏染色镜检图；

图4是本发明蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001对长根菇子实体产量的影响图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进行进一步的说明。本发明所用的设备、材料、试剂等如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1

1)细菌的分离

长根菇栽培袋购买自江西省宜春市万载县富洲农业开发有限公司，将栽培袋的顶部、中部和底部的菌丝混合得到15g样品，取1g样品装到1.5ml离心管中，加入400μL 0.1M磷酸缓冲液(北京金克隆，AA0598)，用无菌的小刀片捣碎基质然后涡旋5min分离紧贴在菌丝表面的细菌，从离心管中取100μL上清液分别在R2A培养基(蛋白胨0.5g，酵母浸出粉0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2±0.2)和LB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2)上涂布，涂布后的平板培养基放在30℃恒温培养箱培养。

2)细菌的纯化

挑取R2A培养基和LB固体培养基两种平板培养基上长出的菌落转移到新的TSA培养基(胰蛋白胨17g，葡萄糖2.5g，大豆胨3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.2)上，连续画线得到细菌的纯培养物。

3)增菌培养

将细菌的纯培养物接种到TSB液体培养基(胰蛋白胨17g，葡萄糖2.5g，大豆胨3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.2)中进行增菌培养。

4)细菌的保存

取TSB液体培养基中的细菌发酵液与50％甘油(1:1)混合，保存在-20℃冰箱中备用。

实施例2

促生细菌的筛选

将分离纯化的细菌菌株与长根菇菌丝在R2A培养基上共培养为实验组，实验组的操作步骤：按照无菌操作要求将细菌的纯培养物在R2A琼脂平板相对的两边1.5cm处画两条平行相对的菌落线条，然后放在28℃培养3d后用打孔器取直径1cm生长一致的长根菇菌丝块(24℃，培养6d)接种到已经长出细菌菌落的R2A琼脂平板的中心。对照组除未在R2A琼脂平板上接种细菌纯培养物外，其它步骤与实验组相同。对照组和实验组均设置5个重复，共培养7d后拍照并记录菌丝的生长情况。本申请筛选到一株细菌JAUCCB0001能够显著促进长根菇菌丝的生长，结果如表1、图1所示。

表1平板共培养菌丝促生实验结果

注：表中数据为均值±标准差。*表示在p<0.05水平有显著差异。

实施例3

细菌JAUCCB0001的形态、分子鉴定以及生理生化特征分析：

1)细菌的形态鉴定

菌落外观呈圆形，边缘规则，直径较小，颜色乳白，菌落表面光滑，不透明，粘稠状，中央隆起。

2)细菌的革兰氏染色

按照常规革兰氏染色方法进行实验，结果显示细菌JAUCCB0001呈革兰氏阴性。

3)细菌的生理生化特征分析

使用HBI微生物生化鉴定条(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，HBIG14)对JAUCCB0001细菌菌株进行生理生化测试，结果如表2所示。

表2菌株的生理生化特征

注：阳性用“+”表示，阴性用“-”表示

4)细菌的分子鉴定

DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒(北京金克隆生物技术有限公司，EX1150)；PCR试剂：2×TSINGKE Master Mix(green)(北京擎科生物有限公司，TSE002)；27F/1492R细菌通用引物(北京擎科生物有限公司)；电泳试剂：1×TAE缓冲液；核酸染料GelRed(北京擎科，TSJ003)；2000bp DNA Marker(北京擎科，TSJ011-100)。

按试剂盒说明书的方法提取细菌的DNA，用细菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG SEQ ID NO.1)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT SEQ ID NO.2)扩增菌株样品的16S rRNA基因序列。25μL的PCR体系包含PCR试剂12.5μL，DNA模板2μL，正向引物和反向引物各1μL，8.5μL双蒸水。扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。PCR后的产物在1％琼脂糖凝胶电泳检验出条带后送擎科公司测序，获得序列如SEQ ID NO.3所示。根据16S rRNA基因序列构建系统发育树，结果参见图2。

蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB000116S rRNA基因序列(SEQ ID NO.3)

TGCAGTCGAGCGGACTTGATGAGGAGCTTGCTCCTCTGATGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGCAAGACCGGGATAACCCACGGAAACGTGAGCTAATACCGGATATCTCATTTCCTCTCCTGGGGAGATGACGAAAGACGGAGCAATCTGTCACTTGCAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCCGATAGAGTAACTGCTATCGGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCATTTAAGTCTGGTGTTTAAGGCCAAGGCTCAACCTTGGTTCGCACTGGAAACTGGGTGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGGCCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTAGTTGCCAGCACTTCGGGTGGGCACTCTAGAATGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCAGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAGCAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAG

结合形态特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析，该菌株鉴定为蜂窝孢类芽孢杆菌(Paenibacillus favisporus)。

实施例4

1)液态促生菌剂的制备

将蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001菌株接种在TSA固体培养基(胰蛋白胨17g/L，葡萄糖2.5g/L，大豆胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.3±0.2)上，置于30℃培养箱倒置培养48h，得到活化的菌株；

将蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的活化菌株接种到TSB液体培养基(胰蛋白胨17g/L，葡萄糖2.5g/L，大豆胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，pH7.3±0.2)中，28℃，180r/min的条件下培养26h，制得种子液。

将制得的种子液接种于发酵培养基(胰蛋白胨17g/L，葡萄糖3g/L，大豆胨4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，pH 7.3±0.2)中，接种量6％(体积百分比)，在28℃、控制发酵罐的搅拌转速为180r/min的条件下培养48h，即得发酵液。将发酵液在4℃高速冷冻离心机8000rpm离心15min得到细菌的菌体沉淀，加入无菌水后配制成液态促生菌剂，液态促生菌剂中蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的浓度为1.74×10⁷CFU/mL。

2)蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001在促进长根菇生长中的应用

采用的长根菇菌种来自江西省宜春市万载县富洲农业开发有限公司，该菌种已保藏在江西农业大学菌种保藏中心(编号JAUCC 4927)，采用17×33×0.05cm聚乙烯塑料袋装栽培料(毡木屑40％、棉籽壳30％、麸皮20％、玉米粉5％、蛋白3％、生石灰1％、石膏粉1％)，按含水量65％补足水分，拌料均匀，高温高压灭菌2h，冷却后接种长根菇菌种块。

培养菌丝条件：室温20～25℃，遮光处理，相对湿度70％以下，每隔2h通风换气30min，出现污染的菌袋立即清理。培养45d后菌丝长满菌袋，继续培养30d左右，培养基表面出现黑褐色菌皮，表明菌丝已经达到生理成熟。

处理组设置：将液态促生菌剂倒入无菌的喷壶中，在接种后培养75d的菌丝已经生理成熟的长根菇菌棒中均匀喷洒液态促生菌剂，每棒喷洒10mL液态促生菌剂，待液态促生菌剂被菌棒吸收后，在袋口覆盖3cm厚的土，然后浇灌250mL无菌水直至覆土完全吸透水分。对照组(CK)的处理方式是将处理组液态促生菌剂替换为10mL灭菌无菌水，其它步骤相同。每组设置8个重复，放置出菇房中培养，进入催蕾期，每天早晚各喷一次清水，加大昼夜温差，白天温度提高至27℃，晚间降低到17℃；空气相对湿度保持在90％，保持覆土始终处于湿润状态；CO₂浓度维持在1000ppm左右。催蕾培养30d后，陆续开始长出小菇蕾。菇蕾长到5～7cm长，菌盖未展平时进行采收。观察并记录长根菇子实体的产量和农艺性状，结果如表3和图4所示。

表3农艺性状分析

注：表中数据为均值±标准差。**表示在p<0.01水平有极显著差异。

如表1、表3所示，本申请蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001可有效促进长根菇菌丝的生长，促进长根菇子实体的生长，每棒出菇量显著增加，子实体长度，菌柄直径，菌盖直径均有增加，能够增加长根菇的产量，增加长根菇的经济效益。本申请筛选得到的细菌选自正常生长的长根菇菌棒本身基质，对长根菇的生长无不利影响，为大规模生产绿色促生菌剂提供可能，减少了化学促生剂的使用，实现了绿色生产。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001，其微生物学分类命名为蜂窝孢类芽孢杆菌，拉丁文学名为Paenibacillus favisporus，已于2022年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2022843。

2.一种权利要求1所述蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001在促进长根菇生长中的应用。

3.一种长根菇促生菌剂，其特征在于：包括权利要求1所述的蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001。

4.根据权利要求3所述的一种长根菇促生菌剂，其特征在于：促生菌剂中蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的浓度为1.7×10⁷-3.8×10⁷CFU/mL。

5.一种权利要求3或4所述长根菇促生菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.将权利要求1所述蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001菌株接种在TSA固体培养基上，置于29-30℃培养40-50 h，得到活化的菌株；

S2.将蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的活化菌株接种到TSB液体培养基中，28-30℃，170-190 r/min 的条件下培养25-28 h，制得种子液；

S3.将制得的种子液接种于发酵培养基中，接种量为5～10 v％，在28～32℃、搅拌转速为150～200 r/min的条件下培养48～72 h，即得发酵液；

S4.将细菌菌株的发酵液在4°C、8000-9000 rpm条件下离心10-15 min得到细菌的菌体沉淀，加入无菌水后配制成促生菌剂。

6.根据权利要求5所述的一种长根菇促生菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S1中，TSA固体培养基的成分包括胰蛋白胨 16.96-17.04 g/L，葡萄糖 2.14-2.54 g/L，大豆胨2.96-3.04 g/L，氯化钠 4.95-5.05 g/L，磷酸二氢钾 2.46-2.54 g/L，琼脂 19-21 g/L，pH7.3±0.2。

7.根据权利要求5所述的一种长根菇促生菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S2中，TSB液体培养基的成分包括胰蛋白胨 16.96-17.04 g/L，葡萄糖2.14-2.54 g/L，大豆胨 2.96-3.04 g/L，氯化钠 4.95-5.05 g/L，磷酸二氢钾 2.46-2.54 g/L，pH 7.3±0.2。

8.根据权利要求5所述的一种长根菇促生菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S3中，发酵培养基的成分包括胰蛋白胨 16-18 g/L，葡萄糖 2-3 g/L，大豆胨 2-4 g/L，氯化钠 4-6g/L，磷酸二氢钾 2-3 g/L，pH7.3±0.2。

9.根据权利要求5所述的一种长根菇促生菌剂的制备方法，其特征在于：促生菌剂中蜂窝孢类芽孢杆菌JAUCCB0001的浓度为 1.7×10⁷-3.8×10⁷CFU/mL。

10.一种长根菇促生长的方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求3或4所述长根菇促生菌剂喷洒在菌丝已经生理成熟的长根菇菌棒上，每个长根菇菌棒均匀喷洒8-12ml促生菌剂，待促生菌剂被菌棒吸收后，在袋口覆盖2.5-3.5cm厚的土，然后浇灌240-300ml无菌水直至覆土完全吸透水分，处理完之后每天早晚各喷一次清水，加大昼夜温差，白天温度提高至25-29°C，晚间降低到15-19°C；空气相对湿度保持在88-92%，保持覆土始终处于湿润状态；CO₂浓度维持在800-1200ppm，进行催蕾培养20-30d，陆续开始长出小菇蕾，待菇蕾长到5~7cm长，菌盖未展平时进行采收。