CN115820491A - 一种菌株、生物制剂及其应用和烟叶醇化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菌株、生物制剂及其应用和烟叶醇化方法，涉及烟草领域。本发明菌株：芽孢杆菌(Bacillus sp.GYCH1)；保藏编号：CCTCC M 20221805；保藏日期：2022年11月15日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心。本发明生物制剂包括酵母菌、结晶海藻糖以及陈化烟粉。本发明烟叶醇化方法：菌悬液喷洒于烟叶表面得到预处理烟叶；预处理烟叶在无氧气气氛下厌氧发酵得到发酵烟叶1；发酵烟叶1在有氧条件下有氧发酵得到发酵烟叶2；发酵烟叶2经过烘烤、平衡得到醇化后的烟叶。本发明芽孢杆菌抗极端条件能力更强，醇化配方及其好氧与厌氧处理工艺的改进提高了烟叶醇化效率、醇化品质及综合效果。

Description

一种菌株、生物制剂及其应用和烟叶醇化方法

技术领域

本发明涉及烟草领域，具体涉及一种菌株、生物制剂及其应用和烟叶醇化方法。

背景技术

香烟原料生产因区域、气候、品种及栽培技术的不同，往往形成不同的原料特色，为了满足香烟生产企业对原料的需求，烟叶醇化过程中往往施加人为因素，常通过添加酶剂、菌剂及香精香料的方式加速或改善烟叶醇化速度，改善品质。已公开的烟叶醇化菌剂涉及的菌种主要有：乳酸菌(lactic acidbacteria)、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)、酵母菌(saccharomyces)、曲霉(Aspergillus)、节杆菌(Arthrobacter)、产碱菌(Alcaligenes)、木霉(Trichoderma)、散囊菌(Eurotiales)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、黑曲霉(Aspergillusniger)等；已公开的烟叶醇化酶剂主要有：糖化酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、木质素酶、漆酶等。添加人工合成非天然香料会给人体健康带来一定危害，而天然香料的匹配性则极为苛刻，也很难满足日益增长的市场需求；故筛选和优化烟叶醇化微生物仍然是缩短醇化周期、提高醇化效率、改善醇化品质、控制醇化成本的首选。

现有技术中醇化菌剂的菌种是从烟草根际土壤、烟株内生菌及新鲜烟株营养体表面分离获得，烘烤后的叶片或烟丝并非分离菌株的适宜生境，这些菌株在实验室控制条件下具有较好的醇化效果，但因在烘烤后烟叶上的适应性较差，应用工艺操作比较苛刻，醇化效果不稳定，难以达到理想状态。

现有技术中烟叶醇化菌剂、酶剂还具有不同的载体，这或多或少也对醇化结果产生了一定的影响，其中酶剂还存在醇化产物单一且易于形成富集效应，容易出现此消彼长负面效应的概率较高，致使醇化效果不稳定、醇化工艺技术难于控制等缺陷，这也正是很多烟叶醇化制剂难以推广应用于生产实际的原因之一。菌剂、酶剂载体或额外添加的香料物质对醇化后香烟原料的特色和风格会产生不利影响。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是现有的烟叶醇化效率低、醇化品质有待进一步提高，进而提供了一种菌株、生物制剂及其应用和烟叶醇化方法。

一方面，本发明提供了一种菌株，所述菌株的分类学命名：芽孢杆菌(Bacillussp.GYCH1)；保藏编号：CCTCC M 20221805；保藏日期2022年11月15日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明提供的上述芽孢杆菌(Bacillus sp.GYCH1)能产生芽孢，抗极端条件的能力更强，当条件适宜时，菌株活化速度快、代谢生长旺盛；当有逆境条件胁迫时又会形成芽孢，使菌体处于休眠或半休眠状态，无论是在醇化过程中的条件变化，还是作为菌剂存放，都具有显著优势。

另一方面，本发明提供了一种生物制剂，所述生物制剂包括上述菌株。

可选的，所述生物制剂包括酵母菌(Wickerhamomyces sp.)、海藻糖和/或陈化烟粉。

可选的，以重量份计，所述芽孢杆菌的重量份数为15-20份，所述酵母菌的重量份数为10-15份，所述海藻糖的重量份数为5-8份，所述陈化烟粉的重量份数为65-70份。

可选的，所述芽孢杆菌的重量份数为20份，所述酵母菌的重量份数为10份，所述海藻糖的重量份数为5份，所述陈化烟粉的重量份数为65份；

可选的，所述芽孢杆菌的活菌数为3×10⁸-5×10⁸cfu/g；

可选的，所述酵母菌的活菌数为2×10⁸-3×10⁸cfu/g；

可选的，所述海藻糖为结晶海藻糖；

可选的，所述陈化烟粉为烤烟K326制备而成。

本发明提供的上述生物制剂配方中的海藻糖具有独特的生物学功能，能在逆境中有效维持细胞内生物膜和蛋白质、活性肽的稳定性和完整性，被赞誉为生命之糖，具有保障配方中菌株和醇化烟叶天然附生菌活性的作用，它能够稳定大分子物质，可以在醇化烟叶矫味方面发挥一定的作用。

本发明提供的上述生物制剂配方中引入的陈化烟粉(K326)作为菌株载体，除了可以避免带入外源物质干扰醇化烟叶品质，更重要的是可以补充醇化过程中成熟陈化烟叶上的天然优势菌；另外，也方便了配方中菌剂的商品化和应用操作。

再一方面，本发明提供了一种生物制剂的制备方法，所述方法包括：所述芽孢杆菌经过培养后得到发酵液1，所述发酵液1经过离心分离，收集菌体1。

所述方法还包括：所述酵母菌经过培养后得到发酵液2，所述发酵液2经过离心分离，收集菌体2；将烘烤过的烟叶经磨碎和过筛，收集陈化烟粉；所述菌体1、所述菌体2、所述海藻糖以及所述陈化烟粉混合后得到所述生物制剂。

可选的，所述芽孢杆菌是采用LB液体培养基，在温度36℃-38℃和转速180－200r/min条件下进行摇床培养；所述发酵液1的OD₆₀₀值为2－4时，在室温和转速4000－6000r/min条件下进行离心分离2－5min。

可选的，摇床培养的所述温度为37℃，所述转速为180r/min；所述发酵液1的OD值为3时在室温和转速4000r/min条件下离心分离5min。

可选的，所述酵母菌是采用PDA液体培养基，在温度29℃-31℃和转速180－200r/min条件下进行摇床培养；所述发酵液2的OD₆₀₀值为2－4时，在室温和转速4000－6000r/min条件下进行离心分离2－3min。

可选的，所述酵母菌是在温度30℃和转速180r/min条件下摇床培养；所述发酵液2的OD值为3时，在室温和转速4000r/min条件下离心分离3min。

又一方面，本发明提供了上述菌株或上述生物制剂或上述方法制备的生物制剂在烟叶醇化中的应用。

再一方面，本发明提供了一种烟叶醇化方法，所述醇化方法包括：上述生物制剂或上述方法制备的生物制剂与水混合配制成菌悬液；

所述菌悬液喷洒于待醇化烟叶的表面，得到预处理烟叶；

所述预处理烟叶在密闭无氧气氛下进行厌氧发酵，得到发酵烟叶1；

所述发酵烟叶1在密闭有氧条件下进行有氧发酵，得到发酵烟叶2；

所述发酵烟叶2经过烘烤、平衡后得到醇化后的烟叶。

可选的，所述无氧气氛是氮气气氛。

可选的，所述水为无菌水；所述菌悬液是由1重量份所述生物制剂与95-105体积份所述无菌水配制而成，重量份和体积份的比值关系为g/mL或kg/L；和/或

所述菌悬液4体积份喷洒于45-55重量份所述待醇化烟叶的表面，所述重量份和体积份的比值关系为g/mL或kg/L；和/或

所述厌氧发酵是在温度31℃-37℃和相对湿度75％-85％条件下发酵44-52小时；所述有氧发酵是在自然空气中、温度31℃-37℃和相对湿度75％-85％条件下发酵20-28小时；和/或

所述烘烤的温度为100℃-110℃，且所述发酵烟叶2的含水质量比控制在10％-14％时终止烘烤过程；和/或

所述平衡是指烘烤后的烟叶在温度20℃-30℃、相对湿度55％-65％的条件下平衡20-28h。

可选的，所述厌氧发酵是在温度32℃和相对湿度80％条件下发酵48小时；所述有氧发酵是在温度32℃和相对湿度80％条件下发酵24小时；

所述烘烤的温度为105℃；所述发酵烟叶2的含水质量为12％时终止烘烤过程；

所述平衡的温度为26℃，相对湿度60％，所述平衡的时间为24h。

平衡：是指烟草在维持一个特定条件下静置，但烟草内部仍继续发生化学变化的过程，其为烟草行业专业术语。

与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果：

本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.GYCH1)是从醇化烟叶上分离筛选得到的优势菌株，且芽孢杆菌和酵母菌(Wickerhamomyces sp.)二株菌分别具有较高的产淀粉酶和蛋白酶活性，联合使用在烟叶醇化过程中，除了烟叶自身发生促进物质降解和转化的作用外，所述芽孢杆菌在生长过程中还会产生制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对烟叶发酵过程中的霉菌、致病菌具有抑制作用，而对其它烟叶附生菌则具有促进作用；二株菌均具有兼性厌氧的特性，尤其是酵母菌在好氧条件下进行的有氧呼吸和在厌氧条件下进行的无氧呼吸，对大分子有机物质的降解、转化类型和好氧、厌氧条件下形成的产物类型均不相同，二株菌联合使用于烟叶可以起到更加全面和平衡的醇化效果。

本发明生物菌剂的配方、醇化工艺通俗易懂，烟叶醇化效果优良，对科学研究和卷烟生产具有启迪和应用价值。

本发明通过不断的探索、优化，摸索出了烟叶有效的醇化配方及其好氧与厌氧处理工艺，丰富了烟叶醇化方法和途径的多样性，上述两方面的改进提高了烟叶醇化效率、醇化品质以及烟叶综合醇化效果，也提高了卷烟的生产效率和生产安排的灵活性，在实践中可行性强。

本发明提供的芽孢杆菌保藏证明信息：

分类学命名：芽孢杆菌(Bacillus sp.GYCH1)；保藏编号：CCTCC M20221805；保藏日期2022年11月15日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的菌株GYCH1和菌株GYCH2产酶活性曲线图；

图2A是本发明实施例提供的菌株GYCH1的菌落特征图；

图2B是本发明实施例提供的菌株GYCH1的芽孢特征图；

图2C是本发明实施例提供的菌株GYCH1的超微特征的电镜图；

图3是本发明实施例提供的菌株GYCH1的16S rRNA序列系统进化树示意图；

图4是本发明实施例提供的菌株GYCH1的gyrB序列系统进化树示意图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中的酵母菌(Wickerhamomyces sp.)购买于郑州琦珞生物技术有限公司，在本发明中将该酵母菌简称为GYCH2。

实施例1(菌株GYCH1)

1.菌株GYCH1的分离

1.1培养基

分离培养基：300mL烟叶水浸提液(20g烟叶样品加入400mL蒸馏水煮沸提取30min，冷却后两层纱布过滤制得烟叶浸提液)，700mL蒸馏水，牛肉膏0.3克，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂1.5g，pH自然，在120℃高压蒸汽灭菌30min。分离方法：取陈化烟叶粉碎样品(过40目筛)5g装入灭菌三角瓶，加入100mL无菌水，震荡5min，静置5min后，取100μL上清液涂布于固体分离培养基平板，37℃恒温培养48h后，挑取菌落并划线纯化，纯化菌株在15％甘油和零下20℃条件下保存备用。

1.2菌株GYCH1的获得

通过分离培养基的分离培养，划线纯化出一株特征典型、长势旺盛的菌株，将其编号为GYCH1。

2.菌株GYCH1(芽孢杆菌)和菌株GYCH2(酵母菌)的产酶活性测定

2.1培养基和测定方法

(芽孢杆菌)产淀粉酶发酵培养基：可溶性淀粉3g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1 000ml，pH7.0。

(酵母菌)产蛋白酶发酵培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，脱脂奶粉15g，蒸馏水1 000mL，pH7.0。

测定方法：将菌株GYCH1和GYCH2分别接种到装有50mL不同产酶培养基的三角瓶中，35℃、160r/min摇床培养16h，然后取6mL转接于装有75mL产酶培养基的1000mL三角瓶中，相同条件下摇床培养48h，期间每隔4h取样一次，发酵上清液即为粗酶液，即分别得到芽孢杆菌粗酶液和酵母菌粗酶液；采用二硝基水杨酸比色(DNS)法对芽孢杆菌粗酶液进行产淀粉酶活性测定；采用Folin－酚法测定酵母菌产蛋白酶活性(蒋咏梅.微生物育种学实验，科学出版社，2012)，以接种无菌水(CK)为对照。

2.2GYCH1和GYCH2的产酶活性

由图1可知，在GYCH1菌株和GYCH2菌株的发酵产酶历程中，芽孢杆菌GYCH1菌株发酵30h时，淀粉酶活性达到最高为4.8U/ml，6－12h呈指数增长，30h后缓慢下降；酵母菌GYCH2菌株发酵36h产蛋白酶活性达到最高为2.8U/mL，发酵前期整体呈逐渐增高态势，36h后也缓慢下降；相比较而言，两种菌株的产酶活性高峰值相近，整体发酵产酶特性较为一致，这有利于烟叶醇化作用的发挥和控制条件的协调。

2.3菌株GYCH1的多相鉴定

鉴定方法：纯化菌株GYCH1接种到LB培养基上，在37℃下培养2d，在形成典型的菌落后，进行形态学特征观察及生理生化测定；

分子鉴定：采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA ExtractionKitVer.3.0提取菌株的基因组DNA；

16S rRNA的PCR扩增引物：

27F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′，(SEQ ID NO.1)

1492R：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′，(SEQ ID NO.2)

gyrB基因PCR扩增引物：

F：5′－GAGGTCGTCATGACCCAGCA－3′，(SEQ ID NO.3)

R：5′－GTCTTGGTCTGGCCCTCGAACTG－3′，(SEQ ID NO.4)

PCR扩增体系均为：

Ddw(超轻水)	14.25微升
		10×PCR Buffer	2.0微升
dNTP mixture	0.5微升
		Taq聚合酶	0.25微升
引物l(正向引物)	1.0微升
		引物2(反向引物)	1.0微升

PCR反应程序：95℃预变性5min，循环参数：95℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环，循环结束72℃再延伸10min，最后4℃保温。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用条带清晰的产物进行纯化。

对PGR扩增产物进行电泳检测，并测序获得基因序列(北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序)，同源比对后构建进化树。

鉴定结果：

(1)一般形态特征

菌落有皱褶，略凸起，不透明，土黄，无荚膜，有鞭毛；革兰氏阳性，芽孢的大小为(0.4-0.7)μm×(1-1.5)μm，位于菌体中央或稍偏；菌体的大小为(0.4-0.8)μm×(1.0-2.5)μm，电镜图如图2A-图2C所示。

(2)生理生化特征

菌株GYCH1生理生化特征测定结果如表1所示。

表1.菌株GYCHl的生理生化测定表

测定项目	GYCH1	测定项目	GYCH1
				明胶水解试验	+	葡萄糖	+
V-P测定	+	木糖	+
				甲基红	+	乳糖	+
硝酸盐还原	-	麦芽糖	-
				接触酶	+	果糖	+
柠檬酸利用	+	吲哚试验	-
				运动性	+	蛋白酶	+
肌醇	-	脂肪酶	+
				山梨醇	-	淀粉酶	-
甘露醇	+	吲哚	+
				蔗糖	+	硫化氢产生	-

注：“+”阳性，“-”阴性。

(3)菌株GYCH1的分子鉴定

以菌株GYCH1基因组DNA为模板，PGR扩增16S rRNA和gyrB电泳检测后大小符合预期，PGR产物测序后得到16S rRNA(1428bp)和gyrB(969bp)的基因序列；采用MEGA 6.0构建系统发育进化树，结果显示，菌株GYCH1的16S rRNA序列与高地芽孢杆菌(NR042337.1Bacillus altitudinis 41KF2b)聚在同一分支，相似度均为96％，如图3所示；菌株GYCH1的gyrB序列与高地芽孢杆菌(KU955327.1Bacillus altitudinis JSCX－1)聚在同一分支，相似度仅为93％，如图4所示；菌株GYCH1的16S rRNA和gyrB的序列聚类分析结果均未达到相似度达到98％以上鉴定到种的一般要求，再结合形态及生理生化特征，将菌株鉴定为芽孢杆菌属菌株，暂定名为Bacillus sp.GYCH1，将该菌株进行保藏，分类学命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.GYCH1)，保藏编号：CCTCC M 20221805；保藏日期2022年11月15日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

菌株GYCH1的16S rRNA序列(SEQ ID NO.5)：

ATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTA

ACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCC

TTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATT

AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA

CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGA

AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAA

GAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG

CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG

CGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTT

GAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTTGAGGAACACCA

GTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATT

AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTCTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGC

TGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGAC

GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTT

GACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTT

GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGC

CAGCATTCAGTTCGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA

ATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACC

GCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAA

GCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG

CCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGG。

菌株GYCH1的gyrB序列(SEQ ID NO.6)：

AACGCGGTGTTCCAGTTGGAGATTTAGAGATCATTGGTGAAACAGATGTAACAGGGACAACCACT

CATTTTGTGCCAGATCCAGAAATTTTCACTGAAACCATTGAATTTGATTACGACACACTTGCTAACCG

TGTACGTGAGTTAGCTTTCTTAACAAAAGGCGTCAACATCATCATTGAAGACTTACGTGAAGGCAAAG

AGCGAAGAAACGAATACTGCTATGAAGGCGGTATTAAGAGCTATGTAGAACATGTGAATCGCTCGAAG

GAAGTCGTTCATGAAGAACCAGTTTACATCGAGGGTGAAAAAGACGGAATCACCGTTGAAGTTGCACT

GCAATACAACGATTCCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCGCCAATAACATCAACACATATGAAGGCG

GATCACACGAAGCTGGCTTTAAAACCGGTCTGACGCGTGTCATCAATGATTATGCTCGTAAAAATGGC

GTATTCAAAGATGGAGACTCGAATTTGAGCGGTGAAGATGTACGAGAAGGCATAACAGCCATTATCTC

TATCAAACATCCAGACCCTCAATTCGAAGGACAAACGAAGACAAAGCTCGGTAACTCAGAAGCAAGAA

CCATTACCGACTCCCTCTTCTCCGAAGCACTTGAGAAATTCCTCTTAGAGAACCCTGATGCTGCAAAG

AAAATTGTGGAGAAAGGTGTGATGGCAGCTCGTGCAAGAATGGCTGCCAAAAAGGCACGTGAGCTGAC

AAGACGTAAAAGTGCACTGGAAGTCTCTAGCTTGCCTGGGAAACTGGCAGACTGTTCTTCTAAAGATC

CTTCCATCTCTGAGCTTTATATCGTAGAGGGAGATTCTGCGGGCGGATCTGCTAAGCAAGGTCGTGAT

CGACATTTCCAAGCGATCTTACCGTTAAGAGGGAAGATCCTAAACGTTGAAAAAGCCCGACTAGATAAAATTTTATCTAACAACGAGG。

下述实施例2－实施例4是利用实施例1获得的菌株来制备生物制剂。

实施例2(生物制剂1)

A.采用LB液体培养基37℃、180r/min摇床培养上述实施例1获得的芽孢杆菌(Bacillus sp.GYCH1)，发酵液OD₆₀₀(采用600nm测定光密度)值为3时，室温4000r/min离心5min，收集菌体20g，活菌数为3×10⁸-5×10⁸cfu/g；

B.采用PDA液体培养基30℃、180r/min摇床培养酵母菌(Wickerhamomycessp.GYCH2)，发酵液OD₆₀₀(采用600nm测定光密度)值为3时，室温4000r/min离心3min收集菌体10g，活菌数为2×10⁸-3×10⁸cfu/g；

C.结晶海藻糖：市购(林原海藻糖)，称取5g；

D.陈化烟粉：选用K326烘烤干烟叶(广西中烟提供，可市购)，粉碎机充分磨碎，过200目标准筛，收集细粉65g；

将制备好的组分A、B、C和D混合，即得生物制剂1。

实施例3(生物制剂2)

本实施例3与实施例2不同之处在于，芽孢杆菌菌体15g，酵母菌菌体15g，结晶海藻糖8g，陈化烟粉70g，混合得到生物制剂2。

实施例4(生物制剂3)

本实施例4与实施例2不同之处在于，芽孢杆菌菌体18g，酵母菌菌体13g，结晶海藻糖6g，陈化烟粉68g，混合得到生物制剂3。

实施例5是利用上述实施例2制备的生物制剂1来醇化烟叶。

实施例5(烟叶醇化)

称取1g烟叶醇化菌剂(即实施例2制备的生物制剂1)，加入99mL无菌水中并充分混匀，配制成1％菌悬液；吸取4mL菌悬液均匀喷洒在50g烟丝(K326，B2F，广西中烟提供，可市购)上，佩戴无菌手套进行翻拌确保喷洒均匀，设置无菌水处理做对照；将处理后的烟丝转入厌氧培养箱，注入氮气(与大气压相当)置换掉容器中的空气，在温度32℃和相对湿度80％条件下发酵48小时；之后放掉氮气，放入自然空气，有氧条件下32℃和相对湿度80％发酵继续24h；发酵完成后，105℃烘烤烟丝，每1min翻拌烟丝，测量烟丝水分质量百分比为12％时终止烘烤，最后将烟丝在26℃、相对湿度60％条件下平衡24h，使杂气充分释放和挥发，全部发酵工艺终止，即得到醇化烟丝1。

实施例6(烟叶醇化)

本实施例6与实施例5不同之处在于，在温度37℃和相对湿度85％条件下厌氧发酵50小时；有氧温度35℃、相对湿度85％，发酵继续28h；发酵完成后，110℃烘烤烟丝，每1min翻拌烟丝，测量烟丝水分质量百分比为10％时终止烘烤，最后将烟丝在20℃、相对湿度55％条件下平衡28h，使杂气充分释放和挥发，全部发酵工艺终止，即得到醇化烟丝2。

实施例7(烟叶醇化)

本实施例7与实施例5不同之处在于，在温度35℃和相对湿度75％条件下厌氧发酵44h；有氧温度27℃、相对湿度75％发酵继续20h；发酵完成后，100℃烘烤烟丝，每1min翻拌烟丝，测量烟丝水分质量百分比为14％时终止烘烤，最后将烟丝在30℃、相对湿度65％条件下平衡20h，使杂气充分释放和挥发，全部发酵工艺终止，即得到醇化烟丝3。

对比例1(烟叶醇化)

本对比例1与实施例5不同之处在于，对比例1采用无菌水等体积替换所述1％菌悬液对烟丝进行醇化，其他条件不变，得到醇化烟丝4。

对实施例5的醇化烟丝1、实施例6的醇化烟丝2、实施例7的醇化烟丝3和对比例1的醇化烟丝4的醇化品质效果进行验证：

测试过程设3次重复，取平均值；完成醇化后，对醇化烟丝品质进行测定和评估。

品质指标测定方法：采用《YC/T 160－2002》标准进行总植物碱测定；采用《YC/T217－2002》标准进行烟叶中氯、总糖、还原糖、烟碱及钾含量测定，测定结果见表2。

评吸方式：根据单料烟评吸标准设定相应的评吸表(十分制打分)，主要评吸指标为：香气量(A)、丰富性(B)、愉悦性(C)、透发性(D)、细腻度(E)、绵延性(F)、成团性(G)、柔和性(H)、浓度(I)、甜度(J)、杂气(K)、刺激(L)和余味(M)，评吸结果见表3，表3中数字越大代表烟叶中某一风味越好，数字越小，风味越差，满分为10分。

表2.醇化烟叶化学成分分析数据表

品种及等级	处理	烟碱/％	总糖/％	还原糖/％	钾/％	氯/％
							K326，B2F	醇化烟丝4(无菌水)	4.00	22.19	19.87	1.16	0.73
K326，B2F	醇化烟丝1(生物制剂1)	3.82	25.36	22.59	1.47	0.61
							K326，B2F	醇化烟丝2(生物制剂1)	3.85	25.12	22.05	1.42	0.65
K326，B2F	醇化烟丝3(生物制剂1)	3.86	25.05	22.08	1.40	0.64

表3.醇化烟叶评吸结果记录表

由表2测定数据可知，与清水醇化烟丝效果相比，采用本发明的生物制剂1及其好氧－厌氧工艺相结合的方式对烟叶进行醇化后，醇化后烟丝的烟碱和氯有害物质含量明显降低；总糖、还原糖、钾有利物质含量明显升高，说明该烟丝醇化效果优秀。

由表3评吸结果可知，与清水醇化烟丝效果相比，采用本发明的生物制剂1及其好氧－厌氧工艺相结合的方式对烟叶进行醇化后，醇化后的烟丝在香气量、丰富性、愉悦性、透发性、细腻度、绵延性、成团性、柔和性、浓度、甜度、杂气、刺激和余味等口味风味方面有明显改善，说明该醇化烟丝的醇化效果优秀。综合表2的化学分析和表3的风味评吸结果可知，采用本发明的生物制剂醇化的烟丝可评为高品质烟丝。

本发明的生物制剂配方中选用的芽孢杆菌、酵母菌、结晶海藻糖以及陈化烟粉，两种菌株联合使用可促进烟叶醇化和平衡醇化效果；以陈化烟粉作为载体，避免引入外源物干扰醇化烟叶品质，也可补充醇化过程中成熟陈化烟叶的天然优势菌；本发明的上述创新生物制剂配方可提高和优化烟叶醇化品质和综合效果。

本发明创新性的采用好氧-厌氧工艺对烟叶进行醇化过程，在可达到较高醇化品质的同时控制整个醇化过程时间，提高了醇化效果和醇化效率。

本发明采用优选的生物制剂配方和优化后的醇化发酵工艺，通过两方面的改进，进一步提高了烟叶醇化品质效果和醇化效率，可推广使用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.GYCH1)，保藏编号为CCTCC M 20221805。

2.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括权利要求1所述的芽孢杆菌。

3.如权利要求2所述的一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括酵母菌(Wickerhamomyces sp.)、海藻糖和/或陈化烟粉。

4.如权利要求3所述的一种生物制剂，其特征在于，以重量份计，包括：所述芽孢杆菌的重量份数为15-20份，所述酵母菌的重量份数为10-15份，所述海藻糖的重量份数为5-8份，所述陈化烟粉的重量份数为65-70份。

5.如权利要求4所述的一种生物制剂，其特征在于，所述芽孢杆菌的重量份数为20份，所述酵母菌的重量份数为10份，所述海藻糖的重量份数为5份，所述陈化烟粉的重量份数为65份；

可选的，所述芽孢杆菌的活菌数为3×10⁸-5×10⁸cfu/g；

可选的，所述酵母菌的活菌数为2×10⁸-3×10⁸cfu/g；

可选的，所述海藻糖为结晶海藻糖；

可选的，所述陈化烟粉为烤烟K326制备而成。

6.权利要求3－5任一项所述的一种生物制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

所述芽孢杆菌经过培养后得到发酵液1，所述发酵液1经过离心分离，收集菌体1。

7.如权利要求6所述的一种生物制剂的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：

所述酵母菌经过培养后得到发酵液2，所述发酵液2经过离心分离，收集菌体2；

将烘烤过的烟叶经磨碎和过筛，收集陈化烟粉；

所述菌体1、所述菌体2、所述海藻糖以及所述陈化烟粉混合后得到所述生物制剂；

可选的，所述芽孢杆菌是采用LB液体培养基，在温度36℃-38℃和转速180－200r/min条件下进行摇床培养；所述发酵液1的OD₆₀₀值为2－4时，在室温和转速4000－6000r/min条件下进行离心分离2－5min；

可选的，所述酵母菌是采用PDA液体培养基，在温度29℃-31℃和转速180－200r/min条件下进行摇床培养；所述发酵液2的OD₆₀₀值为2－4时，在室温和转速4000－6000r/min条件下进行离心分离2－3min。

8.权利要求1所述的一种芽孢杆菌或权利要求2－5任一项所述的一种生物制剂或权利要求6或7所述的一种生物制剂的制备方法制备的所述生物制剂在烟叶醇化中的应用。

9.一种烟叶醇化方法，其特征在于，所述醇化方法包括：

权利要求2-5任一项所述的一种生物制剂或权利要求6或7所述的一种生物制剂的制备方法制备的所述生物制剂与水混合配制成菌悬液；

所述菌悬液喷洒于待醇化烟叶的表面，得到预处理烟叶；

所述预处理烟叶在密闭无氧气氛下进行厌氧发酵，得到发酵烟叶1；

所述发酵烟叶1在密闭有氧条件下进行有氧发酵，得到发酵烟叶2；

所述发酵烟叶2经过烘烤、平衡后得到醇化后的烟叶。

10.如权利要求9所述的一种烟叶醇化方法，其特征在于，所述水为无菌水；所述菌悬液是由1重量份所述生物制剂与95-105体积份所述无菌水配制而成，重量份和体积份的比值关系为g/mL或kg/L；和/或

所述菌悬液4体积份喷洒于45-55重量份的所述待醇化烟叶的表面，所述重量份和体积份的比值关系为g/mL或kg/L；所述厌氧发酵是在温度31℃-37℃和相对湿度75％-85％条件下发酵44-52小时；所述有氧发酵是在自然空气中、温度31℃-37℃和相对湿度75％-85％条件下发酵20-28小时；和/或

所述烘烤的温度为100℃-110℃，且所述发酵烟叶2的含水质量比控制在10％-14％时终止烘烤过程；和/或

所述平衡是指烘烤后的烟叶在温度20℃-30℃、相对湿度55％-65％的条件下平衡20-28h。

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