CN117757701A - 一种芽孢杆菌及其生物制剂、应用和烟叶醇化方法 - Google Patents

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CN117757701A CN202410170759.8A CN202410170759A CN117757701A CN 117757701 A CN117757701 A CN 117757701A CN 202410170759 A CN202410170759 A CN 202410170759A CN 117757701 A CN117757701 A CN 117757701A
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Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌及其生物制剂、应用和烟叶醇化方法，属于烟草领域。本发明提供了一种芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M20221805；所述芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805与酵母菌、结晶海藻糖和陈化烟粉制备生物制剂可以用于烟叶醇化。本发明的芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805抗极端条件能力更强，与酵母菌联合使用可促进烟叶醇化和平衡醇化效果；以陈化烟粉作为载体，避免引入外源物干扰醇化烟叶品质，也可补充醇化过程中成熟陈化烟叶的天然优势菌；采用好氧‑厌氧工艺对烟叶进行醇化，可以在达到较高的醇化品质同时控制整个醇化过程时间。

Description

一种芽孢杆菌及其生物制剂、应用和烟叶醇化方法
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌及其生物制剂、应用和烟叶醇化方法，属于烟草领域。
背景技术
香烟原料生产因区域、气候、品种及栽培技术的不同，往往形成不同的原料特色，为了满足香烟生产企业对原料的需求，烟叶醇化过程中往往施加人为因素，常通过添加酶剂、菌剂及香精香料的方式加速或改善烟叶醇化速度，改善品质。添加人工合成非天然香料会给人体健康带来一定危害，而天然香料的匹配性则极为苛刻，也很难满足日益增长的市场需求；故筛选和优化烟叶醇化微生物仍然是缩短醇化周期、提高醇化效率、改善醇化品质和控制醇化成本的首选。
目前，已公开的烟叶醇化菌剂涉及的菌种主要有：乳酸菌(lactic acidbacteria)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、酵母菌(Saccharomyces)、曲霉(Aspergillus)、节杆菌(Arthrobacter)、产碱菌(Alcaligenes)、木霉(Trichoderma)、散囊菌(Eurotiales)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和黑曲霉(Aspergillus niger)等；已公开的烟叶醇化酶剂主要有：糖化酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、木质素酶和漆酶等。
其中，用于烟叶醇化菌剂的菌种大多是从烟草根际土壤和烟株内生菌及新鲜烟株营养体表面分离获得，烘烤后的叶片或烟丝并非分离菌株的适宜生境，这些菌株在实验室控制条件下具有较好的醇化效果，但因在烘烤后烟叶上的适应性较差，应用工艺操作比较苛刻，醇化效果不稳定，难以达到理想状态。
并且，用于烟叶醇化的菌剂和酶剂还具有不同的载体，这或多或少也对醇化结果产生了一定的影响。同时，用于烟叶醇化的酶剂还存在醇化产物单一且易于形成富集效应，容易出现此消彼长负面效应的概率较高，致使醇化效果不稳定、醇化工艺技术难于控制等缺陷，这也正是很多烟叶醇化制剂难以推广应用于生产实际的原因之一。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的保藏编号为CCTCCNO:M 20221805。
在本发明的一种实施方式中，所述芽孢杆菌的16S rRNA序列如SEQ ID No.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述芽孢杆菌的gyrB基因序列如SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了一种生物制剂，所述生物制剂包括上述芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述生物制剂还包括酵母菌、结晶海藻糖和陈化烟粉。
在本发明的一种实施方式中，以重量份计，所述生物制剂包含上述芽孢杆菌菌体15～20份，酵母菌菌体10～15份，结晶海藻糖5～8份，陈化烟粉65～70份。
在本发明的一种实施方式中，所述芽孢杆菌菌体中，芽孢杆菌的活菌数为3×108～5×108cfu/g。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母菌菌体中，酵母菌的活菌数为2×108～3×108cfu/g。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母菌为汉逊酵母菌(Hansenula sp.)。
在本发明的一种实施方式中，所述陈化烟粉通过K326烘烤干烟叶制备而成。
在本发明的一种实施方式中，以重量份计，所述生物制剂由上述芽孢杆菌菌体20份、酵母菌菌体10份、结晶海藻糖5份和陈化烟粉65份组成。
本发明还提供了一种上述生物制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：培养上述芽孢杆菌，得到培养液，将培养液离心分离，收集芽孢杆菌菌体；
步骤二：培养酵母菌，得到培养液，将培养液离心分离，收集酵母菌菌体；
步骤三：将步骤一制得的芽孢杆菌菌体、步骤二制得的酵母菌菌体、陈化烟粉和结晶海藻糖混合后得到上述生物制剂；
其中，所述步骤一和步骤二没有时间先后顺序。
在本发明的一种实施方式中，所述陈化烟粉是通过将烘烤过的烟叶经磨碎和过筛得到的。
在本发明的一种实施方式中，步骤一中，所述芽孢杆菌采用LB液体培养基，将芽孢杆菌接种至LB液体培养基中后，在温度36～38℃、转速180～200r/min的条件下进行摇床培养，当摇床培养所得培养液的OD值为2～4时，将培养液在室温、转速4000～6000r/min的条件下离心分离2～5min，收集芽孢杆菌菌体。
在本发明的一种实施方式中，步骤二中，所述酵母菌采用PDA液体培养基，将酵母菌接种至PDA液体培养基中后，在温度29～31℃、转速180～200r/min条件下进行摇床培养，当摇床培养所得培养液的OD值为2～4时，将培养液在室温、转速4000～6000r/min的条件下离心分离2～3min，收集酵母菌菌体。
在本发明的一种实施方式中，所述室温为20～30℃。
本发明还提供了上述芽孢杆菌或上述生物制剂或通过上述生物制剂的制备方法得到的生物制剂在烟叶醇化中的应用。
本发明还提供了一种烟叶醇化方法，所述醇化方法包括如下步骤：
步骤一：将上述生物制剂或通过上述生物制剂的制备方法得到的生物制剂与水混合，配制成菌悬液；
步骤二：将步骤一制得的菌悬液喷洒于烟叶表面，得到预处理烟叶；
步骤三：将步骤二制得的预处理烟叶在无氧条件下进行厌氧发酵，得到一次发酵烟叶；
步骤四：将步骤三制得的一次发酵烟叶在有氧条件下进行有氧发酵，得到二次发酵烟叶；
步骤五：将步骤四制得的二次发酵烟叶经过烘烤、平衡后得到醇化后的烟叶。
在本发明的一种实施方式中，所述水为无菌水。
在本发明的一种实施方式中，所述菌悬液中，所述生物制剂与所述无菌水的配比为1：95～105(g/v,g/mL)。
在本发明的一种实施方式中，所述厌氧发酵的时间为44～52h。
在本发明的一种实施方式中，所述厌氧发酵的温度为27～37℃、相对湿度为75～85％、时间为32～56h；
在本发明的一种实施方式中，所述有氧条件是指在自然空气中。
在本发明的一种实施方式中，所述有氧发酵的温度为27～37℃、相对湿度为75～85％、时间为20～28h。
在本发明的一种实施方式中，所述烘烤的温度为100～110℃，当所述二次发酵烟叶的含水质量比控制在10～14％时终止烘烤过程。
在本发明的一种实施方式中，所述平衡是指将烘烤后的烟叶在温度为20～30℃、相对湿度为55～65％的条件下静置20～28h。
本发明还提供了一种醇化烟叶，所述醇化烟叶通过上述烟叶醇化方法制备而得。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明的芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805(Bacillus sp.)是从醇化烟叶上分离筛选得到的优势菌株，根据形态学特征鉴定发现，其能产生芽孢，也就是说，菌株抗极端条件的能力更强，当条件适宜时，菌株活化速度快、代谢生长旺盛；无论是在醇化过程中的条件变化，还是作为菌剂存放，都具有显著优势；在烘烤后烟叶上的适应性较好，应用工艺操作容易，醇化效果稳定，易于达到理想状态。
本发明生物制剂配方中的K326烟叶样品作为芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805的分离源，应用于烟叶醇化中时，除了可以避免带入外源物质干扰醇化烟叶品质，更重要的是可以补充醇化过程中成熟陈化烟叶上的天然优势菌，也方便了配方中菌剂的商品化和应用操作，使醇化效果稳定、易于控制醇化工艺技术。
本发明的生物制剂配方中的海藻糖具有独特的生物学功能，能在逆境中有效维持细胞内生物膜和蛋白质、活性肽的稳定性和完整性，被赞誉为生命之糖，具有保障配方中菌株和醇化烟叶天然附生菌活性的作用，它能够稳定大分子物质，可以在醇化烟叶矫味方面发挥一定的作用。
本发明的芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805和汉逊酵母菌(Hansenula sp.)二株菌均具有较高的产淀粉酶和蛋白酶活性，研究表明，两种菌株的产酶活性高峰值相近，整体发酵产酶特性较为一致，有利于烟叶醇化作用的发挥和控制条件的协调。
本发明通过不断的探索、优化，摸索出了烟叶有效的醇化配方及醇化工艺，二株菌均具有兼性厌氧的特性，二株菌联合使用可以将大分子有机物质的降解、转化类型和好氧、厌氧条件下形成的产物类型最优化，具体的，通过醇化烟丝的醇化品质效果验证可知，本发明的烟叶醇化配方可以促进总糖、还原糖、钾等有利物质的产生，并且抑制烟碱和氯等有害物质的产生；通过本发明的烟叶醇化方法制备的生物制剂的烟叶醇化效果优秀，在香气量、丰富性、愉悦性、透发性、细腻度、绵延性、成团性、柔和性、浓度、甜度、杂气、刺激和余味等口味风味方面由明显改善。
附图说明
图1：本发明实施例提供的菌株的产酶活性曲线图。
图2：本发明实施例提供的芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805形态特征电镜图。图2中，A：芽孢杆菌的菌落特征；B：芽孢杆菌的芽孢特征；C：芽孢杆菌的电镜超微特征。
图3：本发明实施例提供的芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的16SrRNA序列系统进化树示意图。
图4：本发明实施例提供的芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的gyrB序列系统进化树示意图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例/实验例中涉及的酵母菌为购自安琪酵母股份有限公司的安琪生香活性干酵母(汉逊酵母菌，Hansenula sp.)。
下述实施例/实验例中涉及的K326烟叶样品由广西中烟提供。
下述实验例中涉及的16S rRNA的PCR扩增引物为由北京奥科生物技术有限责任公司合成的DNA序列，具体为：
27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.1)；
1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)。
下述实验例中涉及的gyrB基因PCR扩增引物为由北京奥科生物技术有限责任公司合成的DNA序列，具体为：
F:5’-GAGGTCGTCATGACCCAGCA-3’(SEQ ID NO：3)；
R:5’-GTCTTGGTCTGGCCCTCGAACTG-3’(SEQ ID NO：4)。
实验例1：菌株的产酶活性测定
本实验例提供了菌株的产酶活性测定，所述菌株包括芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805(芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805已在申请号为CN202211512969.8的中国专利中公开)和酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenula sp.)，实验过程如下：
步骤一：将芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805以1×108cfu/mL的细胞浓度，以2％的体积比接种到装有产淀粉酶发酵培养基的三角瓶中，将酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenulasp.)以1×108cfu/mL的细胞浓度，以2％的体积比接种到装有产蛋白酶发酵培养基的三角瓶中，分别于35℃、160r/min的转速下摇床培养16h，得到两菌株的培养液；取6mL的培养液转接于装有75mL相应培养基的三角瓶中进行二次培养，相同条件下摇床培养48h，期间每隔4h取样一次，将取得的样品于4℃、6000r/min离心10min，样品上清液即为粗酶液，即分别得到芽孢杆菌粗酶液和酵母菌粗酶液；其中，所述产淀粉酶发酵培养基的成分为：3g可溶性淀粉，10g酵母粉，0.5g磷酸二氢钾，0.5g磷酸氢二钾，0.01g硫酸亚铁，0.5g硫酸镁和1000ml蒸馏水，pH为7.0；所述产蛋白酶发酵培养基的成分为：3g牛肉膏、5g蛋白胨、5gNaCl、15g脱脂奶粉和1000mL蒸馏水，pH为7.0；
步骤二：采用DNS法(郭勇，酶工程，北京：科学出版社，2005)对芽孢杆菌粗酶液进行产淀粉酶活性测定；采用Folin-酚法(蒋咏梅.微生物育种学实验，北京：科学出版社，2012)对酵母菌粗酶液进行产蛋白酶活性测定；以接种无菌水(CK)为对照，产酶活性测定结果如图1所示。
如图1所示，在芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805和酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenulasp.)的发酵产酶历程中，芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805发酵30h时，淀粉酶活性达到最高为4.8U/mL，6～12h呈指数增长，30h后缓慢下降；酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenula sp.)发酵36h产蛋白酶活性达到最高为2.8U/mL，发酵前期整体呈逐渐增高态势，36h后也缓慢下降；相比较而言，两种菌株的产酶活性高峰值相近，整体发酵产酶特性较为一致，这有利于烟叶醇化作用的发挥和控制条件的协调。
实验例2：芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的多相鉴定
本实验例提供了芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的多相鉴定，所述多相鉴定包括形态学特征鉴定、生理生化特征鉴定和分子鉴定，实验过程如下：
实验一(形态学特征鉴定)：将芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805通过平板划线培养的方式接种到LB培养基上，在37℃下培养2天以形成典型的菌落，其扫描电镜图如图2中的A～图2中的C所示。
实验二(生理生化特征鉴定)：将芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805通过平板划线培养的方式接种到LB培养基上，在37℃下培养2天以形成典型的菌落，分别测定其生理生化特征(范俐，微生物学基础与实验技术，厦门：厦门大学出版社，2012)，鉴定结果如表2所示。
实验三(分子鉴定)：使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA ExtractionKit Ver.3.0提取芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805菌株的基因组DNA，以基因组DNA作为PCR模板，分别使用16S rRNA的PCR扩增引物(正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示)和gyrB基因PCR扩增引物(正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)，于表1所示的PCR扩增体系中进行PCR扩增反应；PCR扩增反应程序为：于95℃预变性5min，循环参数：95℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环，循环结束后于72℃再延伸10min，最后4℃保温；PCR扩增反应结束后，使用0.8％(w/v，g/100mL)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，测序获得16S rRNA和gyrB的基因序列；使用MEGA 6.0构建系统发育进化树，16S rRNA和gyrB的基因序列的系统进化树示意图分别如图3和图4所示。
表1PCR扩增体系
芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的扫描电镜图如图2中的A～图2中的C所示，菌落有皱褶、略凸起、不透明、土黄、无荚膜且有鞭毛；革兰氏阳性，芽孢的大小为(0.4～0.7)μm×(1～1.5)μm，位于菌体中央或稍偏；菌体的大小为(0.4～0.8)μm×(1.0～2.5)μm。
芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的生理生化特征测定结果如表2所示：
表2芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的生理生化测定表
测定项目 测定结果 测定项目 测定结果
明胶水解试验 + 葡萄糖 +
V-P测定 + 木糖 +
甲基红 + 乳糖 +
硝酸盐还原 － 麦芽糖 －
接触酶 + 果糖 +
柠檬酸利用 + 吲哚试验 －
运动性 + 蛋白酶 +
肌醇 － 脂肪酶 +
山梨醇 － 淀粉酶 －
甘露醇 + 吲哚 +
蔗糖 + 硫化氢产生 －
注：“+”阳性，“-”阴性。
以提取得到的基因组DNA为模板，PCR扩增16S rRNA和gyrB电泳检测后大小符合预期，PCR产物测序后得到16S rRNA(1428bp，SEQ ID NO.5)和gyrB(969bp，SEQ ID NO.6)的基因序列；如图3所示，芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的16S rRNA序列与高地芽孢杆菌(NR042337.1Bacillus altitudinis41KF2b)聚在同一分支，相似度为96％；如图4所示，芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805的gyrB序列与高地芽孢杆菌(KU955327.1Bacillus altitudinisJSCX-1)聚在同一分支，相似度仅为93％；芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的16SrRNA和gyrB的序列聚类分析结果均未达到相似度达到98％鉴定到种的一般要求，再结合形态及生理生化特征，将菌株鉴定为芽孢杆菌属菌株，属于新种芽孢杆菌。
其中，新种芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的16S rRNA序列：ATAC ATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTTGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTCTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTCGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGG(SEQ ID NO.5)；
新种芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805的gyrB序列：AACGCGGTGTTCC AGTTGGAGATTTAGAGATCATTGGTGAAACAGATGTAACAGGGACAACCACTCATTTTGTGCCAGATCCAGAAATTTTCACTGAAACCATTGAATTTGATTACGACACACTTGCTAACCGTGTACGTGAGTTAGCTTTCTTAACAAAAGGCGTCAACATCATCATTGAAGACTTACGTGAAGGCAAAGAGCGAAGAAACGAATACTGCTATGAAGGCGGTATTAAGAGCTATGTAGAACATGTGAATCGCTCGAAGGAAGTCGTTCATGAAGAACCAGTTTACATCGAGGGTGAAAAAGACGGAATCACCGTTGAAGTTGCACTGCAATACAACGATTCCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCGCCAATAACATCAACACATATGAAGGCGGATCACACGAAGCTGGCTTTAAAACCGGTCTGACGCGTGTCATCAATGATTATGCTCGTAAAAATGGCGTATTCAAAGATGGAGACTCGAATTTGAGCGGTGAAGATGTACGAGAAGGCATAACAGCCATTATCTCTATCAAACATCCAGACCCTCAATTCGAAGGACAAACGAAGACAAAGCTCGGTAACTCAGAAGCAAGAACCATTACCGACTCCCTCTTCTCCGAAGCACTTGAGAAATTCCTCTTAGAGAACCCTGATGCTGCAAAGAAAATTGTGGAGAAAGGTGTGATGGCAGCTCGTGCAAGAATGGCTGCCAAAAAGGCACGTGAGCTGACAAGACGTAAAAGTGCACTGGAAGTCTCTAGCTTGCCTGGGAAACTGGCAGACTGTTCTTCTAAAGATCCTTCCATCTCTGAGCTTTATATCGTAGAGGGAGATTCTGCGGGCGGATCTGCTAAGCAAGGTCGTGATCGACATTTCCAAGCGATCTTACCGTTAAGAGGGAAGATCCTAAACGTTGAAAAAGCCCGACTAGATAAAATTTTATCTAACAACGAGG(SEQ ID NO.6)。
实施例1-1：一种芽孢杆菌
本实施例提供了一种芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M20221805。
实施例2-1：一种生物制剂及其制备方法
本实施例提供了一种生物制剂，所述生物制剂的成分包括：芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、酵母菌菌体、结晶海藻糖和陈化烟粉；所述酵母菌为汉逊酵母菌；以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体20份、酵母菌菌体10份、结晶海藻糖5份和陈化烟粉65份组成。
所述生物制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一：采用LB液体培养基，于37℃、180r/min摇床培养实施例1-1所述的芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805，得到OD值为3的培养液，将培养液于室温、4000r/min下离心分离5min，得到芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805菌体(活菌数为3×108cfu/g)；
步骤二：采用PDA液体培养基，于30℃、180r/min摇床培养酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenula sp.)，得到OD值为3的培养液，将培养液于室温、3000r/min下离心分离3min，得到酵母菌菌体(活菌数为2×108cfu/g)；
步骤三：选用K326烟叶样品(烘烤干烟叶)，使用粉碎机充分磨碎后，过200目标准筛，得到陈化烟粉；
步骤四：将20g的通过步骤一得到的芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805菌体、10g的通过步骤二得到的酵母菌菌体、65g的通过步骤三得到的陈化烟粉和5g的林原海藻糖混合后得到生物制剂。
实施例2-2：一种生物制剂及其制备方法
本实施例提供了一种生物制剂，所述生物制剂的成分包括：芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、酵母菌菌体、结晶海藻糖和陈化烟粉；所述酵母菌为汉逊酵母菌；以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体15份、酵母菌菌体15份、结晶海藻糖8份和陈化烟粉70份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-1的基础上，保留步骤一、步骤二和步骤三，将步骤四替换为：将15g的步骤一得到的芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、15g的步骤二得到的酵母菌菌体、70g的步骤三得到的陈化烟粉和8g的林原海藻糖混合后得到生物制剂。
实施例2-3：一种生物制剂及其制备方法
本实施例提供了一种生物制剂，所述生物制剂的成分包括：芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、酵母菌菌体、结晶海藻糖和陈化烟粉；所述酵母菌为汉逊酵母菌；以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体18份、酵母菌菌体13份、结晶海藻糖6份和陈化烟粉68份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-1的基础上，保留步骤一、步骤二和步骤三，将步骤四替换为：将18g的步骤一得到的芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、13g的步骤二得到的酵母菌菌体、68g的步骤三得到的陈化烟粉和6g的林原海藻糖混合后得到生物制剂。
对比例1-1：一种生物制剂
本对比例提供了一种生物制剂，以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌菌体20份、威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces sp.)菌体10份、结晶海藻糖5份和陈化烟粉65份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-1的基础上，保留步骤一、步骤三和步骤四，将步骤二中“酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenula sp.)”替换为威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces sp.)。
对比例1-2：一种生物制剂
本对比例提供了一种生物制剂，以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌菌体15份、威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces sp.)菌体15份、结晶海藻糖8份和陈化烟粉70份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-2的基础上，保留步骤一、步骤三和步骤四，将步骤二中“酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenula sp.)”替换为威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces sp.)。
对比例1-3：一种生物制剂
本对比例提供了一种生物制剂，以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌菌体18份、威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces sp.)菌体13份、结晶海藻糖6份和陈化烟粉68份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-3的基础上，保留步骤一、步骤三和步骤四，将步骤二中“酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenula sp.)”替换为威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces sp.)。
对比例1-4：一种生物制剂
本对比例提供了一种生物制剂，以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌菌体10份、汉逊酵母菌菌体10份、结晶海藻糖5份和陈化烟粉65份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-1的基础上，保留步骤一、步骤二和步骤三，将步骤四替换为：将10g的步骤一得到的芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、10g的步骤二得到的汉逊酵母菌菌体、65g的步骤三得到的陈化烟粉和5g的林原海藻糖混合后得到生物制剂。
对比例1-5：一种生物制剂
本对比例提供了一种生物制剂，以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌菌体20份、汉逊酵母菌菌体5份、结晶海藻糖5份和陈化烟粉65份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-1的基础上，保留步骤一、步骤二和步骤三，将步骤四替换为：将20g的步骤一得到的芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、5g的步骤二得到的汉逊酵母菌菌体、65g的步骤三得到的陈化烟粉和5g的林原海藻糖混合后得到生物制剂。
对比例1-6：一种生物制剂
本对比例提供了一种生物制剂，以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌菌体20份、汉逊酵母菌菌体10份、结晶海藻糖3份和陈化烟粉65份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-1的基础上，保留步骤一、步骤二和步骤三，将步骤四替换为：将20g的步骤一得到的芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、10g的步骤二得到的汉逊酵母菌菌体、65g的步骤三得到的陈化烟粉和3g的林原海藻糖混合后得到生物制剂。
对比例1-7：一种生物制剂
本对比例提供了一种生物制剂，以重量份计，所述生物制剂由芽孢杆菌菌体20份、汉逊酵母菌菌体10份、结晶海藻糖5份和陈化烟粉60份组成。
所述生物制剂的制备方法为：在实施例2-1的基础上，保留步骤一、步骤二和步骤三，将步骤四替换为：将20g的步骤一得到的芽孢杆菌CCTCC NO:M20221805菌体、10g的步骤二得到的汉逊酵母菌菌体、60g的步骤三得到的陈化烟粉和5g的林原海藻糖混合后得到生物制剂。
实施例3-1：一种烟叶醇化的方法
本实施例提供了一种烟叶醇化的方法，所述方法使用实施例2-1所述的生物制剂，包括如下步骤：
步骤一：称取1g的实施例2-1所述的生物制剂，加入99mL的无菌水配制成1％(m/v，g/100mL)的菌悬液；
步骤二：吸取4mL的菌悬液均匀喷洒在50g的烟丝(K326，B2F等级，广西中烟提供)上，佩戴无菌手套进行翻拌确保喷洒均匀，得到预处理烟丝；
步骤三：将预处理烟丝转入厌氧培养箱，注入与大气压相当的氮气置换掉容器中的空气，于32℃、80％的相对湿度下进行厌氧发酵48h，得到一次发酵烟丝；
步骤四：将一次发酵烟丝中氮气释放，放入自然空气，于有氧条件、32℃、80％的相对湿度下继续有氧发酵24h，得到二次发酵烟丝；
步骤五：于105℃烘烤二次发酵烟丝，每1min翻拌烟丝，当烟丝水分质量百分比为12％时终止烘烤，最后将烟丝于26℃、60％的相对湿度下平衡24h，使杂气充分释放和挥发，得到醇化烟丝。
实施例3-2：一种烟叶醇化的方法
本实施例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为实施例2-2所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
实施例3-3：一种烟叶醇化的方法
本实施例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为实施例2-3所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-1：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为对比例1-1所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-2：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为对比例1-2所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-3：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为对比例1-3所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-4：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为对比例1-4所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-5：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为对比例1-5所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-6：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为对比例1-6所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-7：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为对比例1-7所述的生物制剂，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
对比例2-8：一种烟叶醇化的方法
本对比例提供了一种烟叶醇化的方法，所述烟叶醇化的方法为：在实施例3-1的基础上，将步骤一中的实施例2-1所述的生物制剂替换为清水，保留步骤二至步骤五，得到醇化烟丝。
实验例4：醇化烟丝的醇化品质效果验证
本实验例提供了醇化烟丝的醇化品质效果验证，所述醇化烟丝使用通过实施例3-1～3-3和对比例2-1～2-5得到的醇化烟丝进行，实验过程如下：
实验一(品质指标测定方法)：采用《YC/T 160-2002》标准进行总植物碱测定；采用《YC/T 217-2002》标准进行烟叶中氯、总糖、还原糖、烟碱和钾含量测定，测试过程设3次重复，取平均值，测定结果见表2。
实验二(评吸方式)：根据单料烟评吸标准设定相应的评吸表(十分制打分)，主要评吸指标为：香气量(A)、丰富性(B)、愉悦性(C)、透发性(D)、细腻度(E)、绵延性(F)、成团性(G)、柔和性(H)、浓度(I)、甜度(J)、杂气(K)、刺激(L)和余味(M)，测试过程设3次重复，取平均值，评吸结果见表3。
表3醇化烟叶化学成分分析数据表
对象 烟碱/％ 总糖/％ 还原糖/％ 钾/％ 氯/％
实施例3-1 3.18 23.52 23.89 1.61 0.81
实施例3-2 3.37 22.98 22.72 1.56 0.76
实施例3-3 3.63 22.57 22.86 1.57 0.73
对比例2-1 3.82 25.36 22.59 1.47 0.61
对比例2-2 3.85 25.12 22.05 1.42 0.65
对比例2-3 3.86 25.05 22.08 1.40 0.64
对比例2-4 4.02 21.64 20.39 1.18 0.86
对比例2-5 3.86 20.52 19.63 1.32 0.83
对比例2-6 4.12 20.75 20.95 1.29 0.79
对比例2-7 4.32 21.35 21.02 1.35 0.85
对比例2-8 4.36 21.07 18.53 1.03 0.87
如表3所示，与对比例2-1～2-3的效果相比，采用本发明的实施例3-1～3-3及其好氧-厌氧工艺相结合的方式对烟叶进行醇化后，醇化后烟丝的有害物质(烟碱)的含量明显降低；有利物质(还原糖和钾)的含量明显升高；与对比例2-4～2-8的效果相比，采用本发明的实施例3-1～3-3及其好氧-厌氧工艺相结合的方式对烟叶进行醇化后，醇化后烟丝的有害物质(烟碱和氯)的含量明显降低；有利物质(总糖、还原糖和钾)含量明显升高。综上，说明该醇化后的烟丝醇化效果优秀。
表4醇化烟叶评吸结果记录表
对象 A B C D E F G H I J K L M 总计
实施例3-1 7.5 7.5 7.0 7.5 7.0 8.0 7.0 7.0 6.0 7.0 8.0 6.5 7.0 93.0
实施例3-2 7.5 7.5 7.0 6.5 7.0 6.0 6.0 7.0 6.0 7.0 8.0 6.5 7.0 89.0
实施例3-3 7.5 6.5 7.0 6.5 7.0 6.0 6.0 7.0 6.0 6.0 7.0 6.5 7.0 86.0
对比例2-1 7.5 7.5 7.0 7.5 7.0 8.0 7.0 7.0 7.0 7.0 6.5 6.5 7.0 92.5
对比例2-2 7.5 7.5 7.0 7.0 7.0 7.5 7.0 7.0 7.0 7.0 6.5 6.0 6.5 90.5
对比例2-3 7.0 7.5 7.0 7.0 7.5 7.5 7.0 7.5 7.0 7.0 6.5 6.0 6.5 91.0
对比例2-4 7.5 5.5 6.0 6.5 5.0 5.0 5.0 6.0 5.0 6.0 5.0 6.5 5.0 74.0
对比例2-5 6.0 6.5 6.0 6.5 6.0 5.0 6.0 6.0 5.0 6.0 6.0 5.5 5.0 78.5
对比例2-6 7.5 5.5 6.0 6.5 5.0 5.0 5.0 6.0 5.0 6.0 5.0 6.5 5.0 74.0
对比例2-7 6.5 5.5 6.0 6.5 5.0 5.0 5.0 6.0 5.0 6.0 5.0 6.5 5.0 73.0
对比例2-8 4.0 6.5 6.0 6.0 4.0 6.0 5.5 6.0 5.5 4.5 6.5 4.0 5.5 69.0
如表4所示，与对比例2-1～2-8的效果相比，采用本发明的实施例3-1～3-3及其好氧-厌氧工艺相结合的方式对烟叶进行醇化后，醇化后的烟丝在香气量、丰富性、愉悦性、透发性、细腻度、绵延性、成团性、柔和性、浓度、甜度、杂气、刺激和余味等口味风味方面由明显改善。综上，说明该醇化烟丝的醇化效果优秀。
综合表3的化学分析和表4的风味评吸结果可知，采用本发明的生物制剂醇化的烟丝可评为高品质烟丝；芽孢杆菌CCTCC NO:M 20221805、酵母菌(汉逊酵母菌，Hansenulasp.)的联合使用促进烟叶醇化和平衡醇化效果，以陈化烟粉作为载体，避免引入外源物干扰醇化烟叶品质，也可补充醇化过程中成熟陈化烟叶的天然优势菌。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其特征在于，所述芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 20221805。
2.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括权利要求1所述的芽孢杆菌。
3.如权利要求2所述的一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂还包括酵母菌、结晶海藻糖和陈化烟粉。
4.如权利要求3所述的生物制剂，其特征在于，以重量份计，所述生物制剂包含权利要求1所述芽孢杆菌菌体15～20份，酵母菌菌体10～15份，结晶海藻糖5～8份，陈化烟粉65～70份；
所述芽孢杆菌菌体中，芽孢杆菌的活菌数为3×108～5×108cfu/g；
所述酵母菌菌体中，酵母菌的活菌数为2×108～3×108cfu/g；
所述酵母菌为汉逊酵母菌。
5.如权利要求4所述的生物制剂，其特征在于，以重量份计，所述生物制剂由权利要求1所述芽孢杆菌菌体20份、酵母菌菌体10份、结晶海藻糖5份和陈化烟粉65份组成。
6.一种权利要求2～5任一项所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一：培养权利要求1所述的芽孢杆菌，得到培养液，将培养液离心分离，收集芽孢杆菌菌体；
步骤二：培养酵母菌，得到培养液，将培养液离心分离，收集酵母菌菌体；
步骤三：将步骤一制得的芽孢杆菌菌体、步骤二制得的酵母菌菌体、陈化烟粉和结晶海藻糖混合，得到权利要求2～5任一项所述的生物制剂。
7.权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2～5任一项所述的生物制剂或通过权利要求6所述的生物制剂的制备方法得到的生物制剂在烟叶醇化中的应用。
8.一种烟叶醇化方法，其特征在于，所述醇化方法包括如下步骤：
步骤一：将权利要求2～5任一项所述的生物制剂或通过权利要求6所述的生物制剂的制备方法得到的生物制剂与水混合，配制成菌悬液；
步骤二：将步骤一制得的菌悬液喷洒于烟叶表面，得到预处理烟叶；
步骤三：将步骤二制得的预处理烟叶在无氧条件下进行厌氧发酵，得到一次发酵烟叶；
步骤四：将步骤三制得的一次发酵烟叶在有氧条件下进行有氧发酵，得到二次发酵烟叶；
步骤五：将步骤四制得的二次发酵烟叶经过烘烤、平衡后得到醇化后的烟叶。
9.如权利要求8所述的烟叶醇化方法，其特征在于，所述水为无菌水；
可选的，菌悬液中，所述生物制剂与所述无菌水的配比为1g：95～105mL；
可选的，所述厌氧发酵的时间为44～52h；
可选的，所述厌氧发酵的温度为27～37℃、相对湿度为75～85％、时间为32～56h；
可选的，所述有氧条件是指在自然空气中；
可选的，所述有氧发酵的温度为27～37℃、相对湿度为75～85％、时间为20～28h；
可选的，所述烘烤的温度为100～110℃，当所述二次发酵烟叶的含水质量比控制在10～14％时终止烘烤过程；
可选的，所述平衡是指将烘烤后的烟叶在温度为20～30℃、相对湿度为55～65％的条件下静置20～28h。
10.一种醇化烟叶，其特征在于，所述醇化烟叶由权利要求8或9所述的烟叶醇化方法制备而得。
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