CN1936005A - 从土壤中提取微生物基因组dna的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从土壤中提取微生物基因组DNA的试剂盒和提取方法，试剂盒包括：试剂A(浸洗液)、试剂B(预处理液)、试剂C(裂解液)、试剂D：为RNA酶A、试剂E Al₂ (SO₄) ₃、试剂F十六烷基三甲胺、试剂G(DNA联接液)、试剂H(DNA洗涤液)、试剂K(DNA洗脱液)；提取方法包括：样品浸洗、样品预处理：微生物裂解：腐殖质去除：DNA联接：蛋白杂质去除：DNA吸附：DNA洗涤：DNA洗脱；优点是提取方法迅速，可以在3小时内完成、DNA损失少、提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高，包含的微生物物种信息全面、操作简单，不要求特殊仪器，成本低。

Description

从土壤中提取微生物基因组DNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种从各种土壤样品中提取微生物基因组DNA的试剂盒，进一步涉及使用该试剂盒提取微生物基因组DNA的方法。

背景技术

现代土壤微生态学研究要求对土壤中微生物基因组DNA进行提取，并用于下游的分子操作，比如：PCR、SSCP、DGGE、AFLP等。但是相对于单纯培养的微生物而言，土壤微生物DNA提取存在一些困难，常规方法获得的DNA难以满足下游分子操作要求。这主要是由以下两种原因造成。

(1)土壤成分复杂，包含多种PCR的抑制物，例如：重金属、多糖类、多酚类、腐殖质等。其中腐殖质由于具有与DNA类似的性质，因此可以在DNA常规抽提中与DNA共沉淀，腐殖质极少量的存在就可以强烈地抑制PCR反应。土壤腐殖质包括三部分：腐殖酸、富里酸和胡敏素。前两者可以溶于碱性溶液，而后者即不溶于酸也不溶于碱。采用常规方法提取土壤微生物DNA溶液呈现的黄褐色是腐殖酸、富里酸存在的表现。

(2)土壤等环境微生物相对于单纯培养的微生物更难以裂解。将常规纯培养微生物的DNA提取方法用于土壤等环境微生物DNA提取所获得的微生物细胞裂解率低，因此所获DNA不能反映原始样品的物种丰度。此外，也造成DNA产量偏低。

因此需要研制适用于土壤微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法，解决使用常规方法所获得的DNA样品存在腐殖质等PCR抑制物以及细胞裂解率低、DNA产量低的问题。

发明的内容

本发明目的是提供一种从土壤样品中快速、高效提取微生物基因组DNA的试剂盒及方法，从而解决用分子手段研究土壤微生物群落时常规提取方法获取的DNA样品杂质多、细胞裂解程度低、含PCR抑制物(主要是腐殖质)等问题。

本发明从土壤中提取微生物基因组DNA的试剂盒，其试剂包括：

(1)试剂A(浸洗液)：成分：50-300mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，15-100mM乙二胺四乙酸(EDTA)，100-300mM NaCl，2-10mM柠檬酸钠，10-50mM CaCl₂，0.5％吐温-80(Tween-80)，0.2-0.5％ pH8.5的甘油；

(2)试剂B(预处理液)：含60-80％乙醇；

(3)试剂C(裂解液)：含50-200mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，50-200mM乙二胺四乙酸(EDTA)，4-8％pH 8.0-8.5的十二烷基苯磺酸钠(SDS)；

(4)试剂D：为RNA酶A(RNAase A)，含量为5-30mg/ml；

(5)试剂E：为50-150mM Al₂(SO₄)₃；

(6)试剂F：为150-400g/L十六烷基三甲胺(CTAB)；

(7)试剂G(DNA联接液)：含6-10M异硫腈酸胍(GuSCN)，100-300mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，调整pH至5-6；

(8)试剂H(DNA洗涤液)：10-100mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，与无水乙醇1∶2-1∶4V/V混合；

(9)试剂K(DNA洗脱液)：5-15mM pH8.0三羟基甲基氨基甲烷(Tris)或ddH₂O。上述试剂盒的优选配方为：

试剂A，200mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，100mM乙二胺四乙酸(EDTA)，100mM NaCl，2mM柠檬酸钠，10mM CaCl₂，0.5％吐温-80(Tween-80)，0.5％pH8.5的甘油；

试剂B，为70％乙醇；

试剂C，100mM Tris，50mM 乙二胺四乙酸(EDTA)，8％pH8.0的十二烷基苯磺酸钠(SDS)；

试剂D，30mg/ml RNA酶A(RNAase A)；

试剂E，100mM Al₂(SO₄)₃；

试剂F，200g/L十六烷基三甲胺(CTAB)；

试剂G，7M异硫腈酸胍(GuSCN)，300mM pH5.8的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)；

试剂H，50mM pH 8.0的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)与无水乙醇3∶7混合。

本发明的主要原理为：土壤腐殖质可溶于碱性溶液的部分(腐殖酸和富里酸)在经试剂A(碱性)浸洗后，可以除去部分，同时试剂A中的甘油有吸附腐殖质的作用。在60-70℃裂解处理时，在较高温度及SDS作用下，土壤中的可溶性腐殖质绝大部分释放到裂解液中。在pH4-9范围内，Al³⁺对腐殖质具有较强的亲和力，Al³⁺-腐殖质复合体可以离心去除。CTAB具有吸附腐殖质的能力，但单独使用时其吸附作用不明显。当Al³⁺剂与CTAB联用时，可以达到最好的去除腐殖质效果。EDTA可以螯合重金属离子，并抑制DNA酶(DNAase)。

试剂A含有分散土壤颗粒、减少微生物细胞粘附土壤颗粒的Tween-80，在其作用下，微生物细胞更大程度地释放并暴露在裂解液环境中，增加了裂解率；试剂A同时含有CaCl₂，在其作用下，微生物细胞膜的通透性增加，从而增强了裂解液的渗透能力。试剂B是70％乙醇，低温预处理样品后，微生物的细胞膜及细胞壁受到一定程度的破坏，对于试剂C中的细胞裂解成分更加敏感，同时一些溶于乙醇的有机杂质也得以除去。延长SDS裂解处理的时间到30-40min及提高SDS浓度，可以保证绝大部分的细胞都能得到裂解，DNA逸出。试剂D则用于降解RNA。试剂G中SCN^-能强烈变性蛋白质，在高浓度的SCN^-作用下，在SDS裂解液中溶解、离心尚未除去的蛋白，得以沉淀，而DNA继续保留。同时试剂G提供一种高盐、低pH环境，在这种环境下DNA可以与硅胶膜发生特异吸附。在低浓度的缓冲液或水中DNA又从硅胶膜释放，从而达到分离纯化目的。

试剂A用于分散土壤颗粒、减少微生物细胞粘附土壤颗粒，增加微生物细胞的通透性并洗离部分腐殖质。试剂B可以部分程度的破坏微生物细胞膜和细胞壁，并增加其对裂解液的敏感性。试剂C则提供一个细胞裂解的pH环境，并含裂解的主要成分及抑制DNA酶(DNAase)的成分。试剂D则用于降解RNA，防止RNA对下游操作造成干扰。试剂E及F用于吸附腐殖质。试剂G为DNA联接液，在高浓度GuSCN、低pH下，蛋白质沉淀，DNA可与硅胶结合。试剂H用于冲洗掉DNA以外的成分，在一定浓度的乙醇存在下，冲洗过程中，DNA不会溶失。试剂K提供低盐稳定pH环境，用于洗脱DNA。

使用上述从土壤中提取微生物基因组DNA的试剂盒提取微生物基因组DNA的方法，依次包括以下步骤：

(1)样品浸洗：取土壤0.8-1.5g，加入1-1.5ml试剂A，采用牙签充分捣碎，悬浮并振荡3min(手动振荡)，8000-10000转/分，离心5-10min；

(2)样品预处理：取沉淀，加入1-3ml试剂B，采用牙签充分捣碎，悬浮，冰上放置10-30min，8000-12000转/分，离心5-10min；

(3)微生物裂解：弃上清，沉淀中加入试剂C 1-1.5ml，4-8μl试剂D，采用牙签充分捣碎，悬浮，65℃水浴20-30min，期间振摇数次；10000-12000转/分，离心5-10min；

(4)腐殖质去除：取上清逐滴加入试剂E 75-150μl，试剂F 25-60μl，加入颠倒混合2min；12000转/分，6min.，小心吸取上清；

(5)DNA联接：上清中加入3-4.5ml试剂G，室温下放置10-30min；

(6)蛋白杂质去除：12000-14000转/分，离心10min，取上清；

(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，上清移入吸附柱，每次600-800μl，3000-6000转/分，离心0.5min；弃离心管中液体，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；倒掉离心管中液体，将DNA吸附柱放置在一支新的离心管中；

(8)DNA洗涤：DNA吸附柱中加入试剂H 500-800μl，3000-6000转/分，离心0.5min；弃离心管中液体；重复本步骤中DNA洗涤操作1-2次；将DNA吸附柱重新放入离心管中，空管8000-9000转/分，离心1min；

(9)DNA洗脱：将DNA吸附柱移入一支新的离心管中，DNA吸附柱底部中央加入30-100μl预热至65℃的试剂K，65℃水浴2min，6000-9000转/分，离心1min；重新将离心收集的液体加入到DNA吸附柱底部中央，65℃水浴1min，6000-9000转/分，离心1min；离心管中收集液体即为土壤微生物DNA溶液，-20℃保存。

本发明的优点和积极效果：①提取方法迅速，可以在3小时内完成。②可以去除绝大部分的腐殖质，而基因组DNA损失少。③提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害。④所获DNA完整，分子片段大于10kb，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7以上，产量高，包含的微生物物种信息全面。⑤操作简单，不要求特殊仪器，成本低。⑥本发明除可用于土壤微生物DNA提取外，也可用于各种沉积物微生物DNA提取。

具体实施方式

下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。

实施例1：

按以下配方制作土壤微生物基因组DNA提取试剂盒：

试剂A：为浸洗液，成分：200mM Tris，100mM EDTA，100mM NaCl，2mM柠檬酸钠，10mMCaCl₂，0.5％Tween-80，0.5％甘油，pH8.5。

试剂B：为预处理液，含70％乙醇。

试剂C：为裂解液，含100mM Tris(pH 8.0)，50mM EDTA，8％SDS(pH 8.0)。

试剂D：为RNAase A，含量为30mg/ml。

试剂E：为100mM Al₂(SO₄)₃

试剂F：为200g/L CTAB。

试剂G：为DNA联接液，含10M GuSCN(异硫腈酸胍)，300mM Tris，调整pH至5.8。

试剂H：为DNA洗涤液，50mM Tris(pH 7.5)，与无水乙醇3∶7(V/V)混合。

试剂K：为DNA洗脱液，10mM Tris(pH 8.0)。

DNA吸附柱：硅胶柱

按以下程序提取微生物基因组DNA：

1.取1g红树林土壤加入1ml试剂A，采用牙签充分捣碎，悬浮，并振荡2min(手动振荡)。

2.9000转/分离心6min，取沉淀，加入1ml试剂B，采用牙签充分捣碎，悬浮后，-20℃放置10min，期间振荡3次。

3.9000转/分离心6min，取沉淀。加入1ml试剂C，5μl试剂D，65℃水浴30min，期间振荡数次(保证足够分散)。

4.12000转/分6min，取上清，逐滴加入试剂E 100μl，加入试剂F 50μl，振荡2min。

5.12000转/分，6min，小心吸取上清，上清移入新的离心管。

6.加入3倍体积的试剂G(约3ml)，室温放置10min，期间振荡数次。13000转/分离心10min，小心吸取上清于一支新的离心管。

7.吸取700μl上清移入DNA吸附柱，3000转/分，离心0.5min，弃离心管中液体，重新将DNA吸附柱放置在离心管中。

8.重复7中步骤，直至所有上清均离心吸附完毕。

9.在DNA吸附柱中加入试剂H 800μl，6000转/分，离心0.5min。弃滤液，重新将吸附柱放置在离心管中。

10.重复步骤(9)2次。

11.将吸附柱放置在一支新的离心管中，空管8000转/分，离心1min。

12.将吸附柱放置在一支新的离心管中，在吸附柱中加入60μl预热至60℃的试剂K，60℃水浴2min。8000转/分，1min。

13.将洗脱液重新加入到吸附柱中，60℃水浴1min。8000转/分，1min。离心管中收集液体即为土壤微生物DNA溶液，-20℃保存。

实施例2：

按以下配方配制各种试剂：

试剂A：为浸洗液，成分：100mM Tris，80mM EDTA，100mM NaCl，2mM柠檬酸钠，10mM CaCl₂，0.4％Tween-80，0.5％甘油(pH8.5)。

试剂B：为预处理液，含70％乙醇。

试剂C：为裂解液，含100mM Tris，100mM EDTA，5％SDS(pH 8.0)。

试剂D：为RNAase A，含量为20mg/ml。

试剂E：为100mM Al₂(SO₄)₃

试剂F：为200g/L CTAB。

试剂G：为DNA联接液，含7M GuSCN，200mM Tris，调整pH至5.8。

试剂H：为DNA洗涤液，50mM Tris(pH 7.5)，与无水乙醇3∶7(V/V)混合。

试剂K：为DNA洗脱液，ddH₂O。

DNA吸附柱：硅胶柱

按以下程序提取微生物基因组DNA：

1.取1g菜地土壤加入1.5ml试剂A，采用牙签充分捣碎，悬浮，并振荡2min(手动振荡)。

2.9000转/分离心6min，取沉淀，加入1.5ml试剂B，采用牙签充分捣碎，悬浮后，-20℃放置10min，期间振荡3次。

3.9000转/分离心6min，取沉淀。加入1ml试剂C，5μl试剂D，65℃水浴30min，期间振荡数次(保证足够分散)。

4.12000转/分6min，取上清，逐滴加入试剂E 100μl，加入试剂F 50μl，振荡2min

5.12000转/分，6min，小心吸取上清，上清移入新的离心管。

6.加入3倍体积的试剂G(约3ml)，室温放置10min，期间振荡数次。13000转/分离心10min，小心吸取上清于一支新的离心管。

7.吸取800μl上清移入DNA吸附柱，4000转/分，离心0.5min，弃离心管中液体，重新将DNA吸附柱放置在离心管中。

8.重复7中步骤，直至所有上清均离心吸附完毕。

9.在DNA吸附柱中加入试剂H 800μl，5000转/分，离心0.5min。弃滤液，重新将吸附柱放置在离心管中。

10.重复步骤(9)2次。

11.将吸附柱放置在一支新的离心管中，空管8000转/分，离心1min。

12.将吸附柱放置在一支新的离心管中，在吸附柱中加入50μl预热至60℃的试剂K，60℃水浴2min。8000转/分，1min。

13.将洗脱液重新加入到吸附柱中，60℃水浴1min。8000转/分，1min。离心管中收集液体即为土壤微生物DNA溶液，-20℃保存。

Claims (3)

1.一种从土壤中提取微生物基因组DNA的试剂盒，其试剂包括：

(1)试剂A：成分50-300mM三羟基甲基氨基甲烷、15-100mM乙二胺四乙酸，100-300mMNaCl，2-10mM柠檬酸钠，10-50mM CaCl₂，0.5％吐温-80，0.2-0.5％ pH8.5甘油；

(2)试剂B：含60-80％乙醇；

(3)试剂C：含50-200mM三羟基甲基氨基甲烷，50-200mM乙二胺四乙酸，4-8％pH8.0-8.5十二烷基苯磺酸钠；

(4)试剂D：为RNA酶A，含量为5-30mg/ml；

(5)试剂E：为50-150mM Al₂(SO₄)₃；

(6)试剂F：为150-400g/L十六烷基三甲胺；

(7)试剂G：含6-10M GuSCN，100-300mM三羟基甲基氨基甲烷，调整pH至5-6；

(8)试剂H：10-100mM pH 8.0三羟基甲基氨基甲烷，与无水乙醇1∶2-1∶4 V/V混合；

(9)试剂K：5-15mM pH8.0三羟基甲基氨基甲烷或ddH₂O。

2.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征是试剂包括：

试剂A，200mM三羟基甲基氨基甲烷，100mM乙二胺四乙酸，100mM NaCl，2mM柠檬酸钠，10mM CaCl₂，0.5％吐温-80，0.5％pH8.5的甘油；

试剂B，为70％乙醇；

试剂C，100mM三羟基甲基氨基甲烷，50mM乙二胺四乙酸，8％pH8.0的十二烷基苯磺酸钠；

试剂D，30mg/ml RNA酶A；

试剂E，100mM Al₂(SO₄)₃；

试剂F，200g/L十六烷基三甲胺；

试剂G，7M GuSCN，300mM pH5.8的三羟基甲基氨基甲烷；

试剂H，50mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷与无水乙醇3∶7混合。

3.一种使用权利要求1或2中所述的试剂盒提取微生物基因组DNA的方法，依次包括以下步骤：

(1)样品浸洗：取土壤0.8-1.5g，加入1-1.5ml试剂A，采用牙签充分捣碎，悬浮并振荡3min(手动振荡)，8000-10000转/分，离心5-10min；

(2)样品预处理：取沉淀，加入1-3ml试剂B，采用牙签充分捣碎，悬浮，冰上放置10-30min，8000-12000转/分，离心5-10min；

(3)微生物裂解：弃上清，沉淀中加入试剂C 1-1.5ml，4-8μl试剂D，采用牙签充分捣碎，悬浮，65℃水浴20-30min，期间振摇数次；10000-12000转/分，离心5-10min；

(4)腐殖质去除：取上清逐滴加入试剂E 75-150μl，试剂F25-60μl，加入颠倒混合2min；12000转/分，6min.，小心吸取上清；

(5)DNA联接：上清中加入3-4.5ml试剂G，室温下放置10-30min；

(6)蛋白杂质去除：12000-14000转/分，离心10min，取上清；

(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，上清移入吸附柱，每次600-800μl，3000-6000转/分，离心0.5min；弃离心管中液体，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；倒掉离心管中液体，将DNA吸附柱放置在一支新的离心管中；

(8)DNA洗涤：DNA吸附柱中加入试剂H500-800μl，3000-6000转/分，离心0.5min；弃离心管中液体；重复本步骤中DNA洗涤操作1-2次；将DNA吸附柱重新放入离心管中，空管8000-9000转/分，离心1min；

(9)DNA洗脱：将DNA吸附柱移入一支新的离心管中，DNA吸附柱底部中央加入30-100μl预热至65℃的试剂K，65℃水浴2min，6000-9000转/分，离心1min；重新将离心收集的液体加入到DNA吸附柱底部中央，65℃水浴1min，6000-9000转/分，离心1min；离心管中收集液体即为土壤微生物DNA溶液，-20℃保存。