CN104498478A - 一种通过预处理提高粘细菌dna质量的基因组提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，根据粘细菌在培养过程中生成大量胞外多糖粘液包裹细菌，使细胞在液体中不易分散这一现象，通过在预处理时向洗涤后的粘细菌中加入非离子型表面活性剂，超声震荡仪振荡，然后加入SDS基因提取缓冲液和蛋白酶k水浴，进一步使表面活性剂在液体中混匀使细胞充分裂解；此方法整体操作快速、简便，所用试剂和实验仪器均属于实验室常用仪器试剂，适合于普通常规的实验操作；适用范围广泛，可适用于所有粘细菌的基因组DNA提取，纯化能力强，得到的DNA可以满足于后续PCR扩增、DNA测序等操作。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种粘细菌基因组DNA的提取方法，尤其涉及一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法。
背景技术
粘细菌(myxobacteria)是革兰氏阴性杆菌，能够进行滑行运动，主要存在于腐殖质、食草性动物粪便、土壤和树皮组织中，具有复杂的多细胞社会学行为，可以形成种类丰富、功能多样的生物活性物质。粘细菌虽是原核生物，但却具有许多与真核生物类似的生理生化特性，如相似的细胞间的传导模式来调控其运动与子实体发生过程。根据“底物类型的差异”，粘细菌可划分为两类：溶细菌类群和溶纤维素类群，前者可以溶解酵母或其他真菌、细菌等微生物的完整活细胞，包括15个属；后者不能降解活细菌(可以降解死细菌)，但能够降解纤维素或半纤维素，只有两个属，包括堆囊菌属(Sorangium)和Byssophage属。粘细菌的一个非常显著的特点是能够产生明显生物活性和结构特异的天然产物，且代谢产物种类丰富，它是除了真菌和放线菌之外的一种能够产生丰富次级代谢产物的重要微生物资源。
纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)是粘球菌目，堆囊菌亚目。埃博霉素(Epothilone)是由纤维堆囊菌产生的一种大环内酯类次级代谢产物，根据取代基的不同已发现的埃博霉素类的物质有6种，分别为A、B、C、D、E、F，埃博霉素B和D具有明显的抗肿瘤活性。对于现已发现的粘细菌来说，可以根据子实体和菌落的形态特征为主要依据，以生理特性为辅来进行判定，但是都具有局限性。很多的粘细菌的子实体在反复转接纯化后容易变形甚至会消失，使得它的分类地位很难确定，并且对于新种来说，形态的观察分析更不可靠，针对以上情况，必须采用分子手段进行鉴定。目前为止对粘细菌的许多次级代谢产物的表达基因序列尚未弄清，因此还没有有效的分子标记手段，粘细菌的基因转换体系仍不成熟，利用分子生物学手段有目的的改造粘细菌的研究仍处于初级阶段。
由于纤维堆囊菌在培养过程中，通过分泌大量的胞外酶来降解周围的大分子，具有细胞密度依赖性，而细胞群体产生的胞外酶可以更高效的达一个相对较高的浓度，同时也可减少扩散效应，细胞之间互惠互利。此外，纤维堆囊菌生长时到能够分泌大量的胞外多糖粘液，致使细胞易于团聚，不易分散，这就不利于后续分子操作，如基因组DNA的提取、基因组克隆、基因组文库构建和Southern杂交等。现有技术中一般的基因组提取方法提取到的粘细菌总DNA纯度较低，且DNA提取物非常不稳定。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的问题，提供一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，该方法能够高效、快速的提取粘细菌的总DNA基因组，并且得到的DNA基因组纯度高。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，包括以下步骤：
1)预处理：
将粘细菌在CNST培养基上于28-30℃下培养5-7天，然后将菌体转移至离心管中，向离心管中加入无菌水冲洗菌体后，向菌体中加入非离子型表面活性剂水溶液，振荡使菌体分散均匀；其中，每0.3-0.5g菌体中加入非离子型表面活性剂水溶液的体积为300-500μL；
2)细胞裂解：
向振荡后的离心管中加入提取缓冲液、蛋白酶k溶液，然后于65-70℃下加热，使非离子表面活性剂分散均匀；其中，每0.3-0.5g菌体中加入提取缓冲液的体积为500-1000μL；每0.3-0.5g菌体中加入蛋白酶k溶液的体积为20-30μL；
3)去除蛋白质：
向步骤2)的离心管中加入氯仿与异戊醇的混合液，混合均匀得到乳浊液，进行离心后取上清液；其中，每0.3-0.5g菌体中加入氯仿与异戊醇的混合液的体积为500-1000μL；
4)DNA沉淀洗涤：
向步骤4)的上清液中加入醋酸钠溶液和异丙醇，混合均匀后进行离心，所得沉淀为粗提DNA；将粗提DNA纯化后得到基因组DNA。
所述步骤1)中CNST培养基成分按质量百分数计，包括KNO30.05％、NaH2PO40.025％、MgSO4·7H2O 0.1％、FeCl30.001％、微量元素溶液1mL/L，用1mol/L KOH调pH值至7.2，琼脂粉15-20g/L，其余为水，121℃灭菌30min；所述微量元素溶液包括MnCl2·4H2O 100mg/L、NaMoO4·2H2O、10mg/L、KI 20mg/L、CoCl220mg/L、H3BO310mg/L、EDTA 8g/L。
所述步骤1)中非离子型表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或HLB值为10-16的蔗糖单酯。
所述蔗糖单酯为蔗糖单酯S-1170或S-1570。
所述非离子型表面活性剂水溶液的质量浓度为0.3％-0.5％。
所述步骤(1)中粘细菌的菌种为纤维堆囊菌ATCC25532；步骤1)中振荡是采用超声振荡仪实现的，并且振荡的时间为5-10min。
所述步骤2)中提取缓冲液包括pH值为8.0、5-20mmol/L的Tris-HCl，pH值为8.0、2-20mmol/L的EDTA；质量浓度为1-10％的SDS，余量为水；每0.3-0.5g菌体中加入提取缓冲液的体积为750μL；步骤2)中蛋白酶k溶液的浓度为20-30mg/L；步骤2)中加热的时间为0.5-1小时。
所述步骤2)中提取缓冲液包括pH值为8.0、10mmol/L的Tris-HCl，pH值为8.0、5mmol/L的EDTA，质量浓度为5％的SDS，余量为水。
所述步骤3)中氯仿与异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
所述步骤4)中醋酸钠溶液的浓度为2-3mol/L，加入量为上清液体积的0.05-0.1倍；异丙醇的加入量为上清液体积的0.6-1倍；步骤4)中纯化具体为：用质量分数为70％的乙醇溶液洗涤粗提DNA，然后除去乙醇；步骤3)和步骤4)中离心的温度、转速和时间分别为4-10℃，10000-14000g，10-20min。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
1、由于细胞在破裂过程中，粘细菌分泌的多糖粘液使细胞团聚，不利于DNA提取，所以本发明采用非离子型表面活性剂对粘细菌进行处理，非离子型表面活性剂在水中能够分散均匀，可有效解决粘细菌分泌的胞外多糖粘液将细胞包裹，细胞在液体中不能完全分散的问题，所以能够提取得到全基因组，另外，加入的非离子型表面活性剂在后续基因组提取过程中，溶于氯仿等有机溶剂中，因此不会在基因组中造成残留，不会影响得到的DNA基因组的性能，本发明得到的DNA的性能稳定，纯度高，收率具体能达到1-5μg/g。
2、本发明采用非离子型表面活性剂进行预处理后，采用提取缓冲液、蛋白酶k溶液使细胞裂解，在提取缓冲液、蛋白酶k溶液的作用下细胞的裂解效果好，DNA释放完全，使得提取DNA的纯度高。
3、本发明整体操作快速、简便，所用试剂和实验仪器均属于实验室常用仪器试剂，适合于普通常规的实验操作，易于实现和放大生产。
4、本发明适用范围广泛，可适用于所有粘细菌的基因组DNA提取，得到的DNA基因组的纯度高，满足于后续PCR扩增、DNA测序等操作。
进一步的，非离子表面活性剂为HLB值为10-16的蔗糖单酯，蔗糖单酯的型号为：蔗糖酯S-1170(HLB值为11)或S-1570(HLB值为15)。由于蔗糖单酯能溶于温水，在细胞破壁阶段水浴加热时可以完全分散；此外，蔗糖酯又能溶于氯仿和乙醇，在后续DNA提取过程中容易去除，在弱酸弱碱条件下稳定，因此，选取蔗糖单酯对粘细菌进行预处理可以使细胞充分分散，提取得到全基因组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步地说明，所述是对本发明的解释而不是限制。
本发明所用粘细菌的菌种为纤维堆囊菌ATCC25532。本发明中CNST培养基成分按质量百分数计，包括KNO30.05％、NaH2PO40.025％、MgSO4·7H2O 0.1％、FeCl30.001％、微量元素溶液1mL/L，用1mol/L KOH调pH值至7.2，琼脂粉15-20g/L，余量为水，121℃灭菌30min；所述微量元素溶液包括MnCl2·4H2O 100mg/L、NaMoO4·2H2O、10mg/L、KI 20mg/L、CoCl220mg/L、H3BO310mg/L、EDTA 8g/L。SDS为十二烷基磺酸钠。本发明中的吐温20、吐温40、吐温60、吐温80聚环氧乙烷失水的山梨醇单月桂酸酯。
实施例1
1)预处理
将粘细菌在放置有1.5-2cm宽的灭菌滤纸片3-4片的CNST培养基上于28℃下培养7天，然后将菌体0.3g转移至2.0mL离心管中，向离心管中加入1.0mL无菌水冲洗菌体，在6000r/min转速下离心5min，弃去上清液，保留菌体；向菌体中加入300μL的质量浓度为0.3％的蔗糖单酯S-1570水溶液，然后用超声振荡仪振荡5min使菌体分散均匀；其中，粘细菌的菌种为纤维堆囊菌ATCC25532
2)细胞裂解
向振荡后的离心管中加入500μL的DNA提取缓冲液和浓度为20mg/L的蛋白酶k溶液25μL，在65℃水浴下加热1小时。其中，提取缓冲液包括pH值为8.0、10mmol/L Tris-HCl；pH值为8.0、5mmol/L的EDTA；质量浓度5％的SDS，余量为水。
3)去除蛋白质
向水浴下加热后的离心管中加入500μL氯仿与异戊醇的混合物(氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒混匀成乳浊液，然后在4℃下、10000g的转速下离心10min，吸取上清液至新离心管中；重复此步骤2次以除去蔗糖单酯S-1570。
4)DNA沉淀洗涤
向得到的上清液中加入上清液体积的0.1倍的2mol/L的醋酸钠溶液和上清液体积的0.6倍的异丙醇，上下颠倒混匀，然后于4℃、10000g的转速下离心10min，弃去上清液，得到粗提DNA；用750μL的质量分数为70％的乙醇溶液洗涤粗提DNA，再于4℃、10000g的转速下离心10min，弃去上清液，在烘箱中80℃烘干40min使乙醇完全挥发，得到基因组DNA；将得到的基因组DNA溶解到50μL无菌水中保存，收率为1μg/g。
实施例2
1)预处理
将粘细菌在放置有1.5-2cm宽的灭菌滤纸片3-4片的CNST培养基上于30℃下培养5天，然后将菌体0.4g转移至2.0mL离心管中，向离心管中加入1.0mL无菌水冲洗菌体，在6000r/min转速下离心5min，弃去上清液，保留菌体；向菌体中加入500μL的浓度为0.4％的蔗糖单酯S-1570水溶液，用超声振荡仪振荡10min使菌体分散均匀。
2)细胞裂解
向振荡后的离心管中加入600μL的DNA提取缓冲液和浓度为23mg/L的蛋白酶k溶液28μL，在70℃水浴加热50min。其中，提取缓冲液包括pH值为8.0、10mmol/L的Tris-HCl；pH值为8.0、15mmol/L的EDTA；质量浓度5％的SDS，余量为水。
3)去除蛋白质
向水浴下加热后的离心管中加入750μL氯仿与异戊醇的混合物(氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒混匀成乳浊液，然后在4℃、12000g的转速下离心10min，吸取上清液至新离心管中；并重复此步骤2次。
4)DNA沉淀洗涤
向得到的上清液中加入与上清液体积的0.05倍的3mol/L的醋酸钠溶液和上清液体积的0.8倍的异丙醇，上下颠倒混匀，然后于4℃、12000g的转速下离心10min，弃去上清液，得到粗提DNA；用1000μL的质量分数为70％的乙醇溶液洗涤粗提DNA，再于4℃、12000g的转速下离心10min，弃去上清液，在烘箱中90℃烘干40min使酒精完全挥发，得到基因组DNA；收率为5μg/g。将得到的基因组DNA溶解到50μL无菌水中保存。
实施例3
1)预处理
将粘细菌在放置有1.5-2cm宽的灭菌滤纸片3-4片的CNST培养基上于29℃下培养6天，然后将菌体0.5g转移至2.0mL离心管中，向离心管中加入1.0mL无菌水冲洗菌体，在6000r/min转速下离心5min，弃去上清液，保留菌体；向菌体中加入300μL的质量浓度为0.5％的吐温80水溶液，然后用超声振荡仪振荡8min使菌体分散均匀。
2)细胞裂解
向振荡后的离心管中加入750μL的DNA提取缓冲液(pH值为8.0、15mmol/L的Tris-HCl；pH值为8.0、2mmol/L的EDTA；质量浓度10％的SDS)和浓度为20mg/L的蛋白酶k溶液30μL，在68℃水浴加热30min。
3)去除蛋白质
向水浴下加热后的离心管中加入1000μL氯仿与异戊醇的混合物(氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒混匀成乳浊液，然后在4℃、14000g的转速下离心10min，吸取上清液至新离心管中；重复此步骤2次。
4)DNA沉淀洗涤
向得到的上清液中加入与上清液体积0.08倍的2mol/L的醋酸钠溶液和上清液等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，然后在4℃、14000g的转速下离心10min，弃去上清液，得到粗提DNA；用1500μL的质量分数为70％的乙醇溶液洗涤粗提DNA，再于4℃、14000g转速下离心10min，弃去上清液，在烘箱中100℃烘干20min使乙醇完全挥发，得到基因组DNA；收率为3μg/g。将得到的基因组DNA溶解到50μL无菌水中。
本实施例中的吐温80可以替换为吐温20、吐温40、吐温60。
实施例4
1)预处理
将粘细菌在放置有1.5-2cm宽的灭菌滤纸片3-4片的CNST培养基上于28℃下培养5.5天，然后将菌体0.35g转移至2.0mL离心管中，向离心管中加入1.5mL无菌水冲洗菌体，在6000r/min转速下离心5min，弃去上清液，保留菌体；向菌体中加入400μL的质量浓度为0.4％的蔗糖单酯S-1170，然后用超声振荡仪振荡5min使菌体分散均匀。
2)细胞裂解
向振荡后的离心管中加入1000μL的DNA提取缓冲液(20mmol/LTris-HCl，pH为8.0；20mmol/L EDTA，pH为8.0；质量浓度7％的SDS)和浓度为30mg/L的蛋白酶k溶液20μL，在65℃水浴加热1小时。
3)去除蛋白质
向水浴下加热后的离心管中加入600μL氯仿与异戊醇的混合物(氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒混匀成乳浊液，然后在10℃、10000g的转速下离心10min，吸取上清液至新离心管中；重复此步骤2次。
4)DNA沉淀洗涤
向得到的上清液中加入与上清液体积的0.08倍的3mol/L的醋酸钠溶液和与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，然后在4℃，10000g的转速下离心10min，弃去上清液，得到粗提DNA；用1500μL的质量分数为70％的乙醇溶液洗涤DNA，再于6℃、10000g的转速下离心20min，弃去上清液，在烘箱中100℃烘干20min使乙醇完全挥发，得到基因组DNA；将得到的基因组DNA溶解到50μL无菌水中。
实施例5
1)预处理
将粘细菌在放置有1.5-2cm宽的灭菌滤纸片3-4片的CNST培养基上于30℃下培养6.5天，然后将菌体0.45g转移至2.0mL离心管中，向离心管中加入1.5mL无菌水冲洗菌体，在6000r/min转速下离心10min，弃去上清液，保留菌体；向菌体中加入500μL的质量浓度为0.3％的蔗糖单酯S-1170的水溶液，用超声振荡仪振荡5min使菌体分散均匀。
2)细胞裂解
向振荡后的离心管中加入900μL的DNA提取缓冲液(5mmol/LTris-HCl，pH值为8.0；10mmol/L EDTA，pH值为8.0；质量浓度1％的SDS)，再加入浓度为27mg/L的蛋白酶k溶液22μL，在70℃水浴下加热40min。
3)去除蛋白质
向水浴下加热后的离心管中加入850μL氯仿与异戊醇的混合物(氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒混匀成乳浊液，然后在7℃、12000g的转速下离心20min，小心吸取上清液至新离心管中；重复此步骤2次。
4)DNA沉淀洗涤
向得到的上清液中加入与上清液体积0.1倍的2mol/L的醋酸钠溶液和上清液体积的0.8倍的异丙醇，上下颠倒混匀，然后于4℃，12000g的转速下离心10min，弃去上清液，得到粗提DNA；用1000μL的质量分数为70％的乙醇溶液洗涤DNA，再于10℃，12000g的转速下离心20min，弃去上清液，在室温下静置过夜使乙醇完全挥发，得到基因组DNA；将得到的DNA溶解到50μL无菌水中。
为了解决粘细菌分泌的多糖粘液使细胞团聚不利于DNA的提取问题，本发明采用非离子型表面活性剂对粘细菌进行预处理使细胞完全分散，有效地解决了细胞团聚现象。其中非离子表面活性剂选用HLB值为10-16的蔗糖单酯，如蔗糖酯S-1170(HLB值为11)、蔗糖酯S-1570(HLB值为15)。由于蔗糖单酯能溶于温水，在细胞破壁阶段水浴加热时可以完全分散；此外，蔗糖酯又能溶于氯仿和乙醇，在后续DNA提取过程中容易去除，在弱酸弱碱条件下稳定，因此，选取蔗糖单酯对粘细菌进行预处理可以使细胞充分分散，提取得到全基因组。
Claims (10)
1.一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)预处理：
将粘细菌在CNST培养基上于28-30℃下培养5-7天，然后将菌体转移至离心管中，向离心管中加入无菌水冲洗菌体后，向菌体中加入非离子型表面活性剂水溶液，振荡使菌体分散均匀；其中，每0.3-0.5g菌体中加入非离子型表面活性剂水溶液的体积为300-500μL；
2)细胞裂解：
向振荡后的离心管中加入提取缓冲液、蛋白酶k溶液，然后于65-70℃下加热，使非离子表面活性剂分散均匀；其中，每0.3-0.5g菌体中加入提取缓冲液的体积为500-1000μL；每0.3-0.5g菌体中加入蛋白酶k溶液的体积为20-30μL；
3)去除蛋白质：
向步骤2)的离心管中加入氯仿与异戊醇的混合液，混合均匀得到乳浊液，进行离心后取上清液；其中，每0.3-0.5g菌体中加入氯仿与异戊醇的混合液的体积为500-1000μL；
4)DNA沉淀洗涤：
向步骤4)的上清液中加入醋酸钠溶液和异丙醇，混合均匀后进行离心，所得沉淀为粗提DNA；将粗提DNA纯化后得到基因组DNA。
2.根据权利要求书1所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述步骤1)中CNST培养基成分按质量百分数计，包括KNO3 0.05％、NaH2PO4 0.025％、MgSO4·7H2O0.1％、FeCl3 0.001％、微量元素溶液1mL/L，用1mol/L KOH调pH值至7.2，琼脂粉15-20g/L，其余为水，121℃灭菌30min；所述微量元素溶液包括MnCl2·4H2O 100mg/L、NaMoO4·2H2O、10mg/L、KI 20mg/L、CoCl2 20mg/L、H3BO3 10mg/L、EDTA 8g/L。
3.根据权利要求书1所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述步骤1)中非离子型表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或HLB值为10-16的蔗糖单酯。
4.根据权利要求书3所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述蔗糖单酯为蔗糖单酯S-1170或S-1570。
5.根据权利要求书1或3所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂水溶液的质量浓度为0.3％-0.5％。
6.根据权利要求书1所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中粘细菌的菌种为纤维堆囊菌ATCC25532；步骤1)中振荡是采用超声振荡仪实现的，并且振荡的时间为5-10min。
7.根据权利要求书1所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述步骤2)中提取缓冲液包括pH值为8.0、5-20mmol/L的Tris-HCl，pH值为8.0、2-20mmol/L的EDTA；质量浓度为1-10％的SDS，余量为水；每0.3-0.5g菌体中加入提取缓冲液的体积为750μL；步骤2)中蛋白酶k溶液的浓度为20-30mg/L；步骤2)中加热的时间为0.5-1小时。
8.根据权利要求书7所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述步骤2)中提取缓冲液包括pH值为8.0、10mmol/L的Tris-HCl，pH值为8.0、5mmol/L的EDTA，质量浓度为5％的SDS，余量为水。
9.根据权利要求书1所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述步骤3)中氯仿与异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
10.根据权利要求书1所述的一种通过预处理提高粘细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于，所述步骤4)中醋酸钠溶液的浓度为2-3mol/L，加入量为上清液体积的0.05-0.1倍；异丙醇的加入量为上清液体积的0.6-1倍；步骤4)中纯化具体为：用质量分数为70％的乙醇溶液洗涤粗提DNA，然后除去乙醇；步骤3)和步骤4)中离心的温度、转速和时间分别为4-10℃，10000-14000g，10-20min。
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| CN1597927A (zh) * | 2004-09-13 | 2005-03-23 | 山东省科学院生物研究所 | 巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶的基因及其制备方法 |
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2014
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