CN109868269A - 细菌基因组dna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌基因组DNA提取方法，DNA的提取方法包括以下步骤：1)取细菌悬浮液离心除去上清液，用无菌的NE缓冲液洗涤沉淀，接着重悬于无菌TE缓冲液，得一混合液；2)在所述混合液中加入甲提取液，混合并放置；3)在所述混合液中加入乙提取液，混合并孵育；4)在所述混合液中加入乙酸铵混合调整；5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液，并混合至相混匀；6)将所述混合液转移至Phase Lock Gel Heavy管中混合，并离心，保留顶部水相；7)在所述水相中加入冷的无水乙醇混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA。本发明的提取方法可有效用于细菌基因组DNA提取，提取效率高，操作简单、方便。

Description

细菌基因组DNA提取方法

技术领域

本发明涉及一种细菌基因组DNA提取方法。

背景技术

第三代基因测序系统Pacbio测序具有读长长、单分子，无GC偏好性、测序的同时可以检测碱基修饰的独特优势，应用广泛。以往基于传统方法对于测序的细菌基因组DNA的提取方法，需要在4℃以下，以高于10000g/分钟的高速离心下分离提取DNA过程中的有机相和含有DNA的无机相，在这样的严苛的实验条件下，不仅使得实验操作的复杂，而且容易导致实验结果不稳定。此外，传统的细菌基因组DNA的提取方法，提取出的DNA纯度不高，易受到提取液等杂质的污染，而试剂盒法提取DNA的成本又高。因此需要一种简便、高效地细菌基因组DNA的提取方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的细菌基因组DNA提取方法，基于该提取方法的提取效率高，操作简便。

本发明的另一个目的是提供上述提取的细菌基因组DNA的用途。

为达上述目的，本发明提供：

一种细菌基因组DNA的提取方法，至少包括以下步骤：

1)取细菌悬浮液20～40ml，于0～4℃下，以及2000～6000g/分的速度下，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE 缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液；

2)在所述混合液中加入甲液，进行混合，于-10～0℃下，放置45～60分钟；

3)在所述混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃下，孵育40～70分钟；

4)在所述混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合；

5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀；

6)将所述混合液转移至锁相凝胶(Phase Lock Gel Heavy)管中，进行混合，以1000-3000 g/分钟的速度，离心5～10分钟，取出顶部水相至新的离心管中；

7)在所述水相中加入冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA；

其中，NE缓冲液为0.15mol/l氯化钠(NaCl)、50mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)；TE缓冲液为50mmol/l三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH 8.0、50mmol/l EDTA；甲液为0.5～1ml 25mmol/l Tris pH 8.0、10～20ul 10mg/ml溶菌酶(ReadyLyse)、30～70ul 10mg/ml核糖核酸酶 (RNase)；乙液为0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml蛋白酶K。

可选地，在所述6)中，保留的所述顶部水相为加入8～15ml苯酚/氯仿溶液并混合，以 1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟；加入8～15ml氯仿/异戊醇溶液并混合，以1000～ 2000g/分钟的速度，离心5～10分钟后的顶部水相。

可选地，所述苯酚/氯仿溶液为苯酚与氯仿体积比为25/24。

可选地，所述氯仿/异戊醇溶液为氯仿与异戊醇的体积比为24/1。

可选地，在7)中，将所述细菌组DNA在4℃下溶解在所述TE缓冲液中，保存。

更进一步地，向溶解有细菌组DNA的所述TE缓冲液中，加入NaCl，调整NaCl的浓度为1～2mol/l，接着再次加入所述冷的冷100％的无水乙醇，获得白色絮状沉淀。

可选地，所述混合为倒置混合，但不产生涡旋。

使用本发明的提取方法提取的细菌组DNA用于在第三代基因测序Pacbio测序系统。

在本发明中，利用了DNA比多糖以及蛋白更易溶于水的特性，与现有技术相比，本发明的提取过程操作简便，在整个DNA的提取过程中不需要在大于10000g/分钟的高速低温离心，即可以常温下可以分离含DNA相与有机相，且不需要多次转移处理，降低污染几率和产率。根据本发明的提取方法提取的DNA更纯净，结果更加稳定，提取过程中杂质更容易从样本中分离出去，应用微量紫外-可见光分光光度计测试DNA的纯度和浓度，证明本发明中采取的提取方法得到的DNA在260nm处有单一明显峰值，260nm/230nm吸光度的比值更高。此外，本发明的提取方法使用的试剂简单易得，成本较低，避免了试剂盒法操作的高成本，以及还需要蛋白质过柱的缺陷。

附图说明

图1基因组DNA样本的紫外可见吸收谱图；

图2基因组DNA样本的凝胶电泳图。

具体实施方式

以下将结合附图和具体的实施方式，对本发明进行更详细的描述，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明的提取方法包括，1)取细菌悬浮液20～40ml，于0～4℃下，以及2000～6000g/ 分钟的速度下，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液。

在1)中，细菌悬浮液为细菌在250ml烧瓶中以250g/分钟的速度下在GYE培养基(20g/l 葡萄糖、15g/l酵母膏、35g/l乙醇)中培养过夜，生长至静止期，不过度生长下获得的。

在1)中，NE缓冲液由0.15mol/l NaCl、50mmol/l EDTA组成，经NE缓冲液至少洗涤沉淀两次后，可以去除表面大量多糖，降低在后续的提取操作过程中的污染问题，提高提取效率。

在1)中，TE缓冲液由50mmol/l Tris pH 8.0、50mmol/l EDTA组成，使用无菌TE缓冲溶液2.0～3.0ml，例如2.0ml、2.5ml，在该范围内的TE缓冲溶液，可以充分将细菌悬浮，以便进行分离。

将1)中得到的混合液在-20℃冷冻，在进行如下所述的2)时，于室温下解冻。

本发明的提取方法还包括，2)在混合液中加入甲液，进行混合，于-10～0℃下，放置45～60 分钟。

在2)中，甲液为0.5～1ml 25mmol/l Tris pH 8.0、10～20ul 10mg/ml溶菌酶、30～70ul 10mg/ml核糖核酸酶，例如，05ml 25mmol/l Tris pH 8.0、10ul 10mg/ml溶菌酶、50ul 10mg/ml 核糖核酸酶，在该范围内的甲液，可以充分溶解蛋白质，释放DNA。

本发明的提取方法还包括，3)在混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃孵育40～70分钟。

在3)中，乙液为0.5％SDS、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml蛋白酶K。

在3)中，加入乙液的混合液于35～40℃孵育40～70分钟，期间每10-15分钟倒置混合一次。

本发明的提取方法还包括，4)在混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合，调整混合液的pH值。

本发明的提取方法还包括，5)在混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀。

在5)中，苯酚/氯仿溶液为8～15ml，例如8ml、10ml、15ml，苯酚与氯仿的体积比为25与24。

本发明的提取方法还包括，6)将混合液转移至Phase Lock Gel Heavy管中，例如50ml Phase Lock Gel Heavy管，混合后，离心5～10分钟，保留顶部水相。

在6)中，Phase Lock Gel Heavy管为一种分相凝胶，可以将溶有DNA的水相与溶有有机质的机相中间以固体方式隔开，充分避免有机相对溶有DNA的水相的污染。

在6)中，仔细检查顶部水相，保留的顶部水相为加入8～15ml苯酚/氯仿溶液并混合，其中苯酚与氯仿的体积比为25与24，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟；加入8～ 15ml氯仿/异戊醇溶液并混合，其中氯仿与异戊醇的体积比为24与1，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟的顶部水相。

在6)中，将顶部水相转移至无菌管中，留存。

本发明的提取方法还包括，7)在水相中加入冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为基因组DNA。

在7)中，白色絮状沉淀在3000～5000g/分钟的速度下，离心5～10分钟除去表面的液体。

在7)中，将得到的细菌组DNA在4℃下溶解在TE缓冲溶液中，保存。

更进一步地，向溶解有细菌组DNA的TE缓冲溶液中，加入NaCl，调整NaCl的浓度为1～2mol/l，接着再次加入冷的冷100％的无水乙醇，获得白色絮状沉淀。

更进一步地，重复7)中的操作至少一次。

根据本发明制备方法进行的混合为倒置混合，不产生涡旋。

使用本发明的提取方法提取的细菌组DNA完整度和纯度都比较高，能够较好的适用于三代Pacbio测序。

实施例1

1)在250ml烧瓶中以250g/分钟的速度下在30ml GYE培养基中培养细菌过夜，将细菌悬浮液转移到50ml离心管中，并在4℃下以2000g/分钟的速度离心15分钟，除去上清液，并在15ml NE缓冲液(0.15mol/l NaCl、50mmol/l EDTA)中洗涤沉淀两次，并将每个管中的细胞重悬于2.0ml无菌TE缓冲溶液(50mmol/l Tris pH 8.0、50mmol/l EDTA)，得一混合物。

2)在1)中获得的混合液中加入甲液，混合均匀，但不要涡旋，放在冰上45分钟，其中，甲液为0.5ml 25mmol/l Tris pH 8.0、10ul 10mg/ml溶菌酶、30ul 10mg/ml核糖核酸酶。

3)在2)中获得的混合液中加入1.0ml乙液，进行混合，于35℃下，孵育70分钟，每10-15分钟混合一次，其中，乙液为0.5％SDS、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml 蛋白酶K。

4)在3)中获得的混合液中加入1.0ml 7.5mol/l乙酸铵，轻轻但完全混合。

5)在4)中获得的混合液中加入8ml的苯酚/氯仿溶液(25/24V/V)，并混合至相混匀。

6)将5)中获得的混合液转移至50ml Phase Lock Gel Heavy管中，并倒置直至相混合，以1000g/分钟的速度，离心10分钟，取出顶部水相，转移至无菌的离心管中。

7)在6)中获得的水相中加入两倍体积的冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮

状沉淀为细菌基因组DNA。

8)将7)中获得的白色絮状沉淀卷绕在1ml移液管尖端转移到2ml的无菌试管中，以3000g/分钟的速度离心5分钟除去表面液体，70％的乙醇冲洗，3000g/分钟的速度离心5分钟，打开管子，在台面上干燥15分钟以除去乙醇，不要完全干燥，在4℃下溶解在TE缓冲溶液中，保存。

实施例2

1)在250ml烧瓶中以250g/分钟的速度下在30ml GYE培养基中培养细菌过夜，将细菌悬浮液转移到50ml离心管中，并在4℃下以6000g/分钟的速度离心10分钟，除去上清液，并在25ml NE缓冲液(0.15mol/l NaCl、50mmol/l EDTA)中洗涤沉淀两次，并将每个管中的细胞重悬于3.0ml无菌TE缓冲溶液(50mmol/l Tris pH 8.0、50mmol/l EDTA)，得一混合物。

2)在1)中获得的混合液中加入甲液，混合均匀，但不要涡旋，放在冰上60分钟，其中，甲液为1ml 25mmol/l Tris pH 8.0、20ul 10mg/ml溶菌酶、70ul 10mg/ml核糖核酸酶。

3)在2)中获得的混合液中加入5.0ml乙液，进行混合，于40℃下，孵育60分钟，每10-15分钟混合一次，其中，乙液为0.5％SDS、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml 蛋白酶K。

4)在3)中获得的混合液中加入2.0ml 7.5mol/l乙酸铵，轻轻但完全混合。

5)在4)中获得的混合液中加入15ml的苯酚/氯仿溶液(25/24V/V)，并混合至相混匀。

6)将5)中获得的混合液转移至5 0ml Phase Lock Gel Heavy管中，并倒置直至相混合，以1500g/分钟的速度，离心10分钟，顶部为水相。

7)仔细检查顶部水相，加入15ml苯酚/氯仿(25/24V/V)，并混合，以1000～2000g/分钟的速度，离心10分钟，加入15ml氯仿/异戊醇(24/1V/V)并混合，以1000～2000g/ 分钟的速度，离心5～10分钟，取出顶部水相并转移至无菌的离心管中。

8)在7)中获得的水相中加入两倍体积的冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA。

9)将8)中获得的白色絮状沉淀卷绕在1ml移液管尖端转移到2ml的无菌试管中，以3000g/分钟的速度离心5分钟除去表面液体，70％的乙醇冲洗，3000g/分钟的速度离心5分钟，打开管子，在台面上干燥15分钟以除去乙醇，在4℃下溶解在TE缓冲溶液中，保存。

实施例3

1)在250ml烧瓶中以250g/分钟的速度下在30ml GYE培养基中培养细菌过夜，将细菌悬浮液转移到50ml离心管中，并在4℃下以4000g/分钟的速度离心10分钟，除去上清液，并在20ml NE缓冲液(0.15mol/l NaCl、50mmol/l EDTA)中洗涤沉淀两次，并将每个管中的细胞重悬于2.5ml无菌TE缓冲溶液(50mmol/l Tris pH 8.0、50mmol/l EDTA)，得一混合物，在-20℃冷冻保存。

2)在1)中获得的混合液于室温下解冻，解冻后加入甲液，混合均匀，但不要涡旋，放在冰上45分钟，其中，甲液为0.5ml 25mmol/l Tris pH 8.0、10ul 10mg/ml溶菌酶、50ul10mg/ml 核糖核酸酶。

3)在2)中获得的混合液中加入1.0ml乙液，进行混合，于37℃下，孵育60分钟，每10-15分钟混合一次，其中，乙液为0.5％SDS、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml 蛋白酶K。

4)在3)中获得的混合液中加入1.8ml 7.5mol/l乙酸铵，轻轻但完全混合。

5)在4)中获得的混合液中加入10ml的苯酚/氯仿溶液(25/24V/V)，并混合至相混匀。

6)将5)中获得的混合液转移至50ml Phase Lock Gel Heavy管中，并倒置直至相混合，以1500g/分钟的速度，离心5分钟，顶部为水相。

7)仔细检查顶部水相，加入10ml苯酚/氯仿(25/24V/V)，并混合，以1500g/分钟的速度，离心5分钟，加入15ml氯仿/异戊醇(24/1V/V)并混合，以1500g/分钟的速度，离心5 分钟，取出顶部水相并转移至无菌的离心管中。

8)在7)中获得的水相中加入两倍体积的冷100％的无水乙醇，并进行混合，得到白色絮状沉淀的细菌基因组DNA。

9)将8)中获得的白色絮状沉淀卷绕在1ml移液管尖端转移到2ml的无菌试管中，以3000g/分钟g/分钟的速度离心5分钟除去表面液体，70％的乙醇冲洗，3000g/分钟的速度离心5分钟，打开管子，在台面上干燥15分钟以除去乙醇，不要完全干燥，并在4℃下溶解在 TE缓冲溶液中，保存。

10)在9)中获得的TE缓冲液中，加入NaCl，调整NaCl的浓度为1～2mol/l，冷100％的无水乙醇洗涤，获得白色絮状沉淀，重复上述7)～9)，获得基因组DNA。

参考例

1)在250ml烧瓶中以250g/分钟的速度下在30ml GYE培养基中培养细菌过夜,将细菌悬浮液转移到50ml离心管中，并在4℃下以4000g/分钟的速度下离心10分钟,除去上清液，并将每个管中的细胞重悬于2.5ml无菌TE缓冲溶液(50mmol/l Tris pH 8.0、50mmol/lEDTA) 得一混合物。

2)在1)中获得的混合液中加入甲液，混合均匀，但不要涡旋，放在冰上60分钟，其中，甲液为0.5ml 25mmol/l Tris pH 8.0、20ul 10mg/ml溶菌酶、70ul 10mg/ml核糖核酸酶。

3)在2)中获得的混合液中加入1.0ml乙液，进行混合，于40℃下，孵育60分钟，每10-15分钟混合一次，其中，乙液为0.5％SDS、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml 蛋白酶K。

4)在3)中获得的混合液中加入1.8ml 7.5mol/l乙酸铵，轻轻但完全混合。

5)在4)中获得的混合液中加入10ml苯酚/氯仿溶液(25/24V/V)，并混合至相混匀，于4℃下，以15000g/分钟的速度，离心10分钟，取出顶部水相并在转移至离心管中。

6)如果5)中获得的水相不澄清，加入10ml苯酚/氯仿并混合，以大于10000g/分钟的的速度于4℃离心10分钟，留顶部水相并在转移至离心管中。

7)如果6)中获得的水相不澄清，加入10ml氯仿/异戊醇(24/1V/V)并混合，以大于10000g于4℃离心10分钟，留顶部水相并在转移至无菌的离心管中。

8)在7)中获得的水相中加入2体积的冷100％乙醇并进行混合，并进行混合，得到白色絮状沉淀的细菌基因组DNA。

9)将8)中获得的白色絮状沉淀卷绕在1ml移液管尖端转移到2ml的无菌试管中，以3000g/分钟的速度离心5分钟除去表面液体，70％的乙醇冲洗，3000g/分钟的速度离心5分钟，打开管子，在台面上干燥15分钟以除去乙醇，不要完全干燥，并在4℃下溶解在TE缓冲溶液中，保存。

应用本发明的细菌基因组DNA提取方法实施例2与参考例提取方法提取，对假单胞菌进行基因组DNA的提取，随后，一方面，应用微量紫外-可见光分光光度计测试细菌组DNA的纯度和浓度，曲线1表示参考例提取方法获得的细菌基因组DNA紫外可见吸收谱图，曲线2表示实施例2提取方法获得的细菌基因组DNA紫外可见吸收谱图，结果如附图1所示，应用本发明的细菌基因组DNA提取方法实施例2(曲线2)进行提取，其260nm处有单一明显峰值，230nm处无明显峰，260nm/230nm吸光度的比值大于参考例提取方法所提取的细菌基因组DNA的260nm/230nm吸光度的比值；另一方面，应用凝胶电泳图验证基因组DNA的纯度，从左到右依次为参考例、实施例2，以及DNA ladder(用于比对DNA大小的标准品)的凝胶电泳带，结果如附图2所示，应用本发明的细菌基因组DNA提取方法实施例2进行提取，凝胶电泳显示条带更加一致。证明本发明的细菌基因组DNA抽提方法，很好的避免了有机物与无机物污染，所获得基因组DNA纯度更高。

Claims (6)

1.一种细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

1)取细菌悬浮液20～40ml，于室温以2000～6000g/分速度，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液；

2)在所述混合液中加入甲液，进行混合，于冰上，放置45～60分钟；

3)在所述混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃下，孵育40～70分钟；

4)在所述混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合；

5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀；

6)将所述混合液转移至锁相凝胶管中，进行混合，以1000-3000g/分钟的速度，离心5～10分钟，保留顶部水相；

7)在所述水相中加入冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA；

其中，NE缓冲液为0.15mol/l NaCl、50mmol/l EDTA；TE缓冲液为50mmol/l Tris pH8.0、50mmol/l EDTA；甲液为0.5～1ml 25mmol/l Tris pH 8.0、10～20ul 10mg/ml溶菌酶、30～70ul 10mg/ml核糖核酸酶；乙液为0.5％SDS、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml蛋白酶K。

2.如权利要求1所述的细菌组DNA的提取方法，其特征在于，在所述6)中，保留的所述顶部水相为加入8～15ml苯酚/氯仿溶液并混合，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟；加入8～15ml氯仿/异戊醇溶液并混合，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟后的顶部水相。

3.如权利要求1或2所述的细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述苯酚/氯仿溶液为苯酚与氯仿体积比为25/24。

4.如权利要求1所述的细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，在7)中，将所述细菌组DNA在4℃下溶解在所述TE缓冲溶液中，保存。

5.如权利要求4所述的细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，向溶解有细菌组DNA的所述TE缓冲溶液中，加入NaCl，调整NaCl的浓度为1～2mol/l，接着再次加入所述冷的冷100％的无水乙醇，获得白色絮状沉淀。

6.如权利要求1-5任意一项所述的细菌组DNA的提取方法，其特征在于，所述混合为倒置混合。