CN105063016B - 一种从黄酒麦曲中提取微生物总dna的方法 - Google Patents
一种从黄酒麦曲中提取微生物总dna的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法，属于分子生物学技术领域。本发明方法是将麦曲置于ddH2O中并结合玻璃珠和超声清洗振荡将菌体进入悬液，离心得到菌体后加入DNA抽提液取，液氮研磨后加入溶菌酶，再加入SDS及蛋白酶K后65℃水浴45～65min，之后加入CTAB提取液后水浴45～65min，得到的DNA粗提液经过纯化后得到总DNA样品。采用本发明方法得到麦曲中总DNA样品DNA质量浓度达到149.6ng/μL，对其中的真菌及细菌PCR扩增后进行电泳得到的条带单一明亮，A260/A280达到1.93，A260/A230达到1.84，说明本方法很好的避免了蛋白、多糖及小分子等的污染，且所得样品不用经过试剂盒纯化，可直接用于后续分子生物学的分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
黄酒麦曲是以轧碎的小麦为原料，经过加水拌曲、压块成型并堆放在一定的温度和湿度条件下，富集培养酿酒有益微生物制得的糖化发酵剂。麦曲中微生物群系复杂，是黄酒酿制的主要微生物来源，这些微生物在黄酒制作过程中共同作用，最终形成了黄酒独特的风格，因此黄酒麦曲有着“酒之骨”的美誉。
黄酒麦曲中微生物的研究一直是麦曲的研究重点，传统的分离培养不仅工作量大，耗时耗力，而且无法全面的了解微生物的组成，利用分子手段研究麦曲则能够避免传统方法的不便。利用分子手段分析一定环境下微生物群落结构时，基因组提取的质量对后续的分析有着很大的影响，高质量的提取麦曲中的宏基因组对全面的剖析麦曲微生物群落结构有着重要作用。
麦曲的制作在自然开放的环境中完成，且制曲时间较长(3个月左右)，微生物来源广泛(制曲用水、小麦、空气微生物等)，造就了麦曲复杂的微生物体系。相关研究中将麦曲制作过程中微生物的生长变化分为孢子发芽期、生长繁殖期和产酶成熟期3个阶段，之后麦曲还要经过长时间的放置过程，随着水分含量的降低，麦曲中的大量霉菌、细菌产生成孢子、芽孢，所以麦曲是一种含有真菌、细菌的营养体、孢子和芽孢的复杂体系，在进行群落结构解析时需要同时获得他们的基因组。麦曲在制作过程中经过了小麦轧碎的操作，小麦中含有丰富的淀粉、蛋白等营养物质，直接进入了麦曲体系，长时间的麦曲制作过程使其中的微生物能够充分的利用麦曲中各种营养物质，同时也产生了各种代谢产物，这都影响了麦曲中DNA的提取。麦曲中起重要作用的霉菌，如米曲霉、米根霉等在制曲完成后大多以孢子形式存在，孢子易于悬浮不易进入提取液，同时孢子不容易破坏孢子壁，这也将会阻碍提取过程。
麦曲总DNA的提取有着重重阻碍，而麦曲总DNA的提取是以分子手段研究麦曲的基础，因此亟需一种高质量提取麦曲总DNA的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对麦曲这种含有真菌、细菌营养体、孢子和芽孢的复杂微生物体系，提供了一种高质量从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法。
所述方法，包括：
(1)在麦曲中加入ddH2O和吐温80，并加入玻璃珠，振荡摇匀，然后在超声波清洗器中振荡5～10min，使麦曲中的菌体尽量进入悬液中，低速离心后取上清；
(2)将步骤(1)得到的悬液高速离心的菌体沉淀；
(3)向步骤(2)得到的菌体中加入DNA抽提液，混悬后液氮条件下充分研磨；
(4)向步骤(3)得到的溶液中加入溶菌酶，于37℃条件下放置30～40min；
(5)向步骤(4)得到的溶液中加入加入SDS溶液并立即蛋白酶K，65℃水浴45～65min；
(6)向步骤(5)得到的溶液中加入CTAB抽提液，65℃水浴45～65min；
(7)将步骤(6)得到DNA粗提液进行纯化得到麦曲总DNA。
在本发明的一种实施方式中，所述用于提取的麦曲的质量为4～6g；ddH2O的加量为12～18mL，吐温80的终质量浓度为0.04～0.06％；
在本发明的一种实施方式中，所述低速离心是指离心力为200～500g，高速离心是指离心力为10000～12000g。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA抽提液配方为100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/L EDTA，pH 8.0，100mmol/LNa3PO4，1.5mol/LNaCl；
在本发明的一种实施方式中，所述DNA抽提液添加量为500～600μL。
在本发明的一种实施方式中，所述溶菌酶的质量浓度为50mg/mL，加入量为8～12μL；
在本发明的一种实施方式中，所述SDS的终质量浓度为1.8～2.2％；蛋白酶K的质量浓度为20mg/mL，加入量为4～6μL。
在本发明的一种实施方式中，所述CTAB抽提液的配方为2％CTAB，1.4mol/LNaCl，1mol/L Tris-HCL，0.5mol/L EDTA；CTAB抽提液的加量为700～1200μL。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA粗提液的纯化，是将样品用等体积的氯仿与异戊醇体积比为24:1的氯仿-异戊醇抽提2～3次，然后用0.6～0.7倍体积的异丙醇沉淀，离心取沉淀，用1ml 70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，去除水分，干燥得DNA，然后加入ddH2O溶解DNA，并加入10～20μL/mL的RNA酶处理，以去除DNA。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA粗提液的纯化，具体是将所得样品用等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)混均后于4℃条件下，12000g，离心10～15min，抽提2～3次；加入0.6～0.7倍体积的异丙醇于-20℃沉淀1h；4℃，12000g离心10min，收集核酸沉淀；加入1ml70％的乙醇于4℃条件下，12000g，离心10min，洗涤沉淀2～3次，倒扣去除过量水分，于37℃干燥DNA；加100μL ddH2O溶解沉淀，加入终浓度为10～20μL/mL的RNA酶，并在37℃下消化30～45min，以去除RNA。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：
(1)取5g麦曲样品加15ml ddH2O置于50ml离心管中并添加终质量浓度为0.04％的吐温80，加入适量玻璃珠，充分振荡5min；4℃条件于KQ 700E超声波清洗器中超声振荡5min；200g离心力离心5min，取上清，10000g离心10min；收集沉淀，加2ml ddH2O混悬均匀转移至2ml EP管；10000g离心10min，得菌沉淀；
(2)菌沉淀加入0.5mL DNA抽提液(100mmol/L Tris-HCL pH 8.0，100mmol/LEDTA，pH 8.0，100mmol/LNa3PO4，1.5mol/LNaCl)混悬，液氮条件下充分研磨菌体；
(3)向(2)得到的溶液中加入10μL溶菌酶(50mg/mL)，37℃条件下放置30min；；
(4)向(3)得到的溶液中加入125μL 10％SDS，立即加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，混均后65℃水浴1h；
(5)向(4)得到的溶液中加入700μL CTAB缓冲液，混均后65℃水浴1h；
(6)步骤(5)所得样品用等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)混均后于4℃条件下，12000g，离心10min，；
(7)重复步骤(6)2次；
(8)向步骤(7)得到的溶液中加入0.6倍体积的异丙醇于-20℃沉淀1h；
(9)将步骤(8)得到溶液于4℃，12000g条件下离心10min，收集核酸沉淀；
(10)向步骤(9)得到的沉淀中加入1ml 70％的乙醇于4℃条件下，12000g，离心10min；
(11)重复步骤(10)2次；
(12)吸去步骤(11)得到样品的清液，收集沉淀，倒扣去除过量液体，于37℃干燥DNA；
(13)向步骤(12)得到的样品中加入100μL ddH2O溶解沉淀，加入终浓度为10μL/mL的RNA酶，并在37℃下水浴消化45min，以去除RNA。
本发明的有益效果：
(1)本发明方法提取得到的麦曲总DNA样品中，DNA质量浓度达到149.6ng/μL，对其中的真菌及细菌PCR扩增后进行电泳得到的条带单一明亮，A260/A280达到1.93，A260/A230达到1.84，说明本发明方法能够将麦曲中以孢子形式存在的真菌、以芽孢形式存在的细菌等菌体DNA得到有效提取，同时能够除去麦曲体系中存在的大量多糖污染。本发明方法得到的总DNA能够直接用于PCR，无需再使用试剂盒对提取的样品进行纯化，从而建立了一种可以用于分子生物学分析、高质量提取麦曲总DNA的方法；
(2)本发明方法先将麦曲与微生物进行分离再进行DNA的提取，对常规麦曲总微生物DNA提取做出了改进。本发明方法通过添加吐温80，促进了霉菌孢子从固体杂质上的洗脱，同时使孢子能够进入提取液中，避免了其在提取提取过程中悬浮于提取液上层导致大量损失；本发明改进了传统SDS法提取含多糖环境效果不佳的缺点，针对麦曲含有的大量多糖，采用CTAB法与SDS法联用，有效的减少了产物中多糖的污染；本发明针对麦曲体系的复杂性，先采用SDS法对样品进行提取，之后再与CTAB法联用，这样的使用顺序一方面提高了对样品提取的强度，同时既减少了单纯采用CTAB法时加入CTAB的用量，也降低了单纯采用SDS法多糖带来的污染；本发明通过控制CTAB的用量有效提高了DNA的提取效果，避免了过少的CTAB用量导致的多糖去除不彻底，以及过多的CTAB添加导致的后续处理中增加了总DNA提取的损失。
附图说明
图1：本发明方法提取的麦曲总DNA电泳图，其中1为麦曲样品，M为MarkerλDNA/PstI；
图2：以本发明方法提取的麦曲总DNA为模板进行16S rDNAPCR扩增电泳图，其中1为麦曲样品16S rDNAPCR扩增产物，M为Marker DL 15000；
图3：以本发明方法提取的麦曲总DNA为模板进行18S rDNAPCR扩增电泳图，其中1为麦曲样品18S rDNAPCR扩增产物，M为Marker DL 15000；
图4：本发明方法提取米曲霉及黑曲霉孢子DNA得到的电泳图，其中M为MarkerλDNA/PstI，1为米曲霉孢子样品，2为黑曲霉孢子样品。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出详细的实施方式和具体的操作过程，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：麦曲中总DNA的提取
本实施例包括以下步骤：
(1)取5.5g麦曲样品加15ml ddH2O置于50ml离心管中并添加终质量浓度为0.04％的吐温80，加入适量玻璃珠，充分振荡5min；4℃条件于KQ 700E超声波清洗器中超声振荡5min；200g离心5min，取上清，10000g离心10min；收集沉淀，加2ml ddH2O混悬均匀转移至2ml EP管；10000g离心10min，得菌沉淀；
(2)菌沉淀加入0.5mL DNA抽提液(100mmol/L Tris-HCL pH 8.0，100mmol/LEDTA，pH 8.0，100mmol/LNa3PO4，1.5mol/LNaCl)混悬，液氮条件下充分研磨菌体；
(3)向(2)得到的溶液中加入10μL溶菌酶(50mg/mL)，37℃条件下放置30min；；
(4)向(3)得到的溶液中加入125μL 10％SDS，立即加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，混均后65℃水浴1h；
(5)向(4)得到的溶液中加入1000μL CTAB缓冲液，混均后65℃水浴1h；
(6)步骤(5)所得样品用等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)混均后于4℃条件下，12000g，离心15min，；
(7)重复步骤(6)1次；
(8)向步骤(7)得到的溶液中加入0.6倍体积的异丙醇于-20℃沉淀1h；
(9)将步骤(8)得到溶液于4℃，12000g条件下离心10min，收集核酸沉淀；
(10)向步骤(9)得到的沉淀中加入1ml 70％的乙醇于4℃条件下，12000g，离心10min；
(11)重复步骤(10)1次；
(12)吸去步骤(11)得到样品的清液，收集沉淀，倒扣去除过量液体，于37℃干燥DNA；
(13)向步骤(12)得到的样品中加入100μL DD水溶解沉淀，加入终浓度为10μL/mL的RNA酶，并在37℃下水浴消化30，以去除RNA。
实施例2：麦曲总DNA的电泳检测及PCR扩增
将实施例1中得到的麦曲总DNA用0.8％琼脂糖对所得麦曲总DNA进行电泳实验，所用Marker为Marker DL 15000，跑胶完成后用伯乐DC XR+凝胶成像仪进行拍照观察得到电泳图(如图1所示)，从电泳图可以看出，电泳条带单一，清晰无杂带，无明显拖尾现象。
将得到的麦曲总DNA进行Touch PCR扩增，对其中真菌的18S rDNA区进行扩增，对细菌的16S rDNA区进行扩增。真菌扩增采用通用引物：上游引物序列NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，下游引物序列NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGCGA-3’，扩增片段大小为1.7kb左右；细菌采用通用引物：上游引物序列27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3’，下游引物序列1492r：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，扩增片段大小为1.5bp左右。
真核微生物PCR反应体系如下(20μL)：Taq PCR master mix 10μL，上下引物各0.2μL，模板1μL，补无菌水至20μL。相应PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min(Touch down PCR，10个循环，每个循环降低1℃)；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min(20个循环)；72℃终延伸7min。
原核微生物PCR反应体系如下(20μL)：Taq PCRmaster mix 10μL，上下引物各0.4μL，模板1μL，补无菌水至20μL。相应PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min(Touch down PCR，10个循环，每个循环降低1℃)；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min(20个循环)；72℃终延伸7min。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，所用Marker为Marker DL 15000，跑胶完成后用伯乐DC XR+凝胶成像仪进行拍照观察得到电泳图(如图2、3所示)。
从图2和图3可以看出，对麦曲总DNA中细菌和真菌相应片段扩增后电泳得到的条带单一，无杂带，扩增特异性强，细菌扩增条带大小为1500bp左右，真菌扩增条带大小为1700左右，说明本发明针对麦曲的提取方法可以高质量的对麦曲中的总DNA进行提取，可以用于对麦曲分子生物学的研究。
实施例4：不同方法对麦曲总DNA提取效率比较
(1)与已有报道方法的对比：
样品1：实施例1得到的麦曲总DNA样品
样品2：按照张中华文献《绍兴黄酒麦曲中微生物群落结构的研究》中的方法提取麦曲总DNA得到的样品
样品3：按照zhou等文献《DNA recovery from soils ofdiverse composition》中方法提取麦曲总DNA得到的样品
三种方法得到麦曲总DNA样品进行纯度和提取质量浓度比较如表1所示：
表1 3种不同方法提取得到的总DNA产量及纯度
从表1可以看出，本发明方法对于麦曲的提取相对于其他两种方法能够更好的避免蛋白、多糖及各种小分子的污染，同时提取的DNA质量浓度最高，达到了149ng/μL，是一种高质量提取麦曲总DNA的方法。
(2)提取试剂对提取效率的影响
样品1：实施例1得到的麦曲总DNA样品
样品2：实施例1中省略吐温添加步骤进行提取所得麦曲总DNA样品。
样品3：实施例1中CTAB提取液添加量为1.8mL时进行提取所得麦曲总DNA样品。
样品4：实施例1中CTAB提取液添加量为0.3mL时进行提取所得麦曲总DNA样品。
改变提取试剂或用量得到麦曲总DNA样品进行纯度和提取质量浓度比较如表2所示：
表2改变提取试剂或用量得到总DNA产量及纯度
由表2看以看出，吐温80的采用对于提高提取效率有着重要作用，同时CTAB的用量应在合适的范围内。
实施例5：米曲霉、黑曲霉孢子DNA的提取
米曲霉、黑曲霉等曲霉菌是麦曲中主要的霉菌，能够为黄酒的发酵提供糖化酶等酶活，是黄酒发酵的重要微生物，在麦曲完成后，这些霉菌大部分已孢子形式存在，本实施例针对以孢子形式存在的霉菌进行提取以验证本发明对于孢子的提取效果。
本实施例首先：
取在斜面培养在产生大量孢子的米曲霉、黑曲霉培养基，各用加有终质量浓度为0.05％吐温80的15ml ddH2O冲洗培养基表层，将孢子洗下来，之后加入适量玻璃珠，充分振荡5min；10000g离心10min；收集孢子沉淀；
然后再进行下一步操作(DNA抽提液)，具体步骤与实施例1的步骤(2)-(13)一致。
将得到的米曲霉及黑曲霉孢子的DNA样品以0.8％琼脂糖进行电泳验证如图4所示。
从图4可以看出，本发明方法对于麦曲中以孢子形式存在的霉菌具有较好的提取效果，适合于麦曲中以孢子形式存在的霉菌的提取。
实施例6：麦曲中微生物总DNA的提取
(1)取4g麦曲样品加12ml ddH2O置于50ml离心管中并添加终质量浓度为0.06％的吐温80，加入适量玻璃珠，充分振荡5min；4℃条件于超声波清洗器中振荡5～10min，使麦曲中的菌体尽量进入悬液中，低速离心后取上清；然后悬液高速离心的菌体沉淀；
(2)菌沉淀加入0.6mL DNA抽提液混悬，液氮条件下充分研磨菌体；
(3)向(2)得到的溶液中加入8μL溶菌酶(50mg/mL)，37℃条件下放置40min；；
(4)向(3)得到的溶液中加入终质量浓度为1.8％的SDS溶液，立即加入4μL蛋白酶K(20mg/mL)，混均后65℃水浴45min；
(5)向(4)得到的溶液中加入700μL CTAB缓冲液，混均后65℃水浴45min；
(6)步骤(5)所得样品用等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)混均后于4℃条件下，高速离心15min，；
(7)重复步骤(6)1次；
(8)向步骤(7)得到的溶液中加入0.7倍体积的异丙醇于-20℃沉淀1h；
(9)将步骤(8)得到溶液于4℃，12000g条件下离心10min，收集核酸沉淀；
(10)向步骤(9)得到的沉淀中加入1ml 70％的乙醇于4℃条件下，12000g，离心10min；
(11)重复步骤(10)1次；
(12)吸去步骤(11)得到样品的清液，收集沉淀，倒扣去除过量液体，于37℃干燥DNA；
(13)向步骤(12)得到的样品中加入100μL DD水溶解沉淀，加入终浓度为20μL/mL的RNA酶，并在37℃下水浴消化30min，以去除RNA。
将按此方法得到的麦曲总DNA进行电泳实验，电泳图显示电泳条带单一，清晰无杂带，无明显拖尾现象。对麦曲总DNA中细菌和真菌相应片段扩增后，电泳得到的条带单一，无杂带，扩增特异性强。同时，总DNA样品进行纯度和提取质量浓度检测，结果显示A260/A280为1.92，A260/A230为1.82，DNA质量浓度(ng/μL)为134.3。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)在麦曲中加入ddH2O和吐温80，并加入玻璃珠，振荡摇匀，然后在超声波清洗器中振荡5～10min，使麦曲中的菌体尽量进入悬液中，低速离心后取上清；
(2)将步骤(1)得到的悬液高速离心的菌体沉淀；
(3)向步骤(2)得到的菌体中加入DNA抽提液，混悬后液氮条件下充分研磨；
(4)向步骤(3)得到的溶液中加入溶菌酶，于37℃条件下放置30～40min；
(5)向步骤(4)得到的溶液中加入加入SDS溶液并立即蛋白酶K，65℃水浴45～65min；
(6)向步骤(5)得到的溶液中加入CTAB抽提液，65℃水浴45～65min；
(7)将步骤(6)得到DNA粗提液进行纯化得到麦曲总DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，每4～6g麦曲中添加12～18mLddH2O和终质量浓度为0.04～0.06％的吐温80。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA抽提液配方为100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100mmol/L EDTA，pH 8.0，100mmol/LNa3PO4，1.5mol/LNaCl。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA抽提液的添加量为500～600μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶的质量浓度为50mg/mL，加入量为8～12μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SDS的终质量浓度为1.8～2.2％；蛋白酶K的质量浓度为20mg/mL，加入量为4～6μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CTAB抽提液的配方为2％CTAB，1.4mol/L NaCl，1mol/L Tris-HCL，0.5mol/L EDTA；CTAB抽提液的加量为700～1200μL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低速离心是指离心力为200～500g，高速离心是指离心力为10000～12000g。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA粗提液的纯化方法是将样品用等体积的氯仿与异戊醇体积比为24:1的氯仿-异戊醇抽提2～3次，然后用0.6～0.7倍体积的异丙醇沉淀，离心取沉淀，用1ml 70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，去除水分，干燥得DNA，然后加入ddH2O溶解DNA，并加入10～20μL/mL的RNA酶处理，以去除DNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA粗提液的纯化方法具体是：所得样品用等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)混均后于4℃条件下，12000g，离心10～15min，抽提2～3次；以0.6～0.7倍体积的异丙醇于-20℃沉淀1h；4℃，12000g离心10min，收集核酸沉淀；加入1ml 70％的乙醇于4℃条件下，12000g，离心10min，洗涤沉淀2～3次，倒扣去除过量水分，于37℃干燥DNA；加100μL ddH2O溶解沉淀，加入终浓度为10～20μL/mL的RNA酶，并在37℃下消化30～45min，以去除RNA。
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