CN107475244A - 一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，公开了一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA；经琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测；末端修复宏基因组DNA，将marker和小样切下，使用连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；连接产物经λ包装提取物包装，EPI300‑T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。本发明反映在热带雨林这一极端的环境中，微生物及其基因资源极端而丰富，有利于微生物功能基因挖掘与利用。

Description

一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法。
背景技术
瓜类枯萎病是葫芦科上的一种毁灭性土传病害，普通化学药剂不易防治。瓜类枯萎病的防治主要有农业防治(嫁接和培育抗病品种等)、物理防治、化学防治、生物防治等，目前多以化学药剂防治为主。但由于土传病害中的病原菌掩蔽性较强，化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高；同时，化学药剂广泛使用所带来的污染环境、破坏生态平衡等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制；此外，长期使用化学药物，病原菌易产生抗药性，久而久之化学药物失去了原有的作用。因此，符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已显得十分重要和迫切。在生物防治进程中，前人筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，均是基于实验室可纯培养的微生物。然而，环境中只有不到1％的微生物是可用实验室传统纯培养的方法获得，99％以上的微生物是不可纯培养的。土壤微生物种类极其繁多，代谢形式也呈现多样化，其代谢物的化学复杂性和多样性，是筛选抗生素与药物先导化合物的极具潜力的资源库，许多具有独特结构和良好生物活性的微生物代谢产物被相继发现和开发利用，如用于癌症化疗的药物阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、道诺霉素(daunorubicin)和丝裂霉素(mitomycin)等。近10年来，尽管科学家们努力改进筛选方法和测试病原微生物种类，但是基于微生物纯培养技术发现新抗生素药物的成功几率越来越小，且往往会出现重复筛选的现象。热带雨林微生物丰富，与枯萎病菌具有相近的生态位(可解决微生物在土壤环境中的定植问题)。同时，由于高温高湿、酸性重等特性，微生物极端而丰富，可开发成生防资源。然而多数是非培养的。通过构建该环境样品宏基因组文库，并进行后续的筛选。可以避开土传病害隐蔽性强，难以灭杀的问题；化学药物污染环境、破坏生态平衡等问题；病菌抗药性问题等；同时，也避开了微生物分离培养的问题，既能得到可培养微生物基因，也能得到未培养微生物的基因，为微生物资源利用开辟了一个新的途径。
综上所述，现有技术存在的问题是：其一、瓜类枯萎病普通化学药剂不易防治。化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高；同时，化学药剂广泛使用所带来的污染环境、破坏生态平衡等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制；此外，长期使用化学药物，病原菌易产生抗药性，久而久之化学药物失去了原有的作用。其二、筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，均是基于实验室可纯培养的微生物。而基于微生物纯培养技术发现新抗生素药物的成功几率越来越小，且往往会出现重复筛选的现象。因而，利用热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法构建并筛选宏基因组文库，可以充分地挖掘该极端环境样品中微生物及其基因资源。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法。
本发明是这样实现的，一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法包括以下步骤：
步骤一，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
步骤二，末端修复宏基因组DNA，胶回收23kb以上的片段，将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
步骤三，连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。
进一步，所述步骤三中过夜培养，产生了100板，40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
本发明的另一目的在于提供一种由所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法构建的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库包含该极端环境下的细菌、真菌、古菌和病毒等微生物基因资源，既包含实验室可纯培养的，也包含不可纯培养的，其微生物及其基因资源极其丰富。以真菌为例，初步检测含包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
进一步，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
本发明的另一目的在于提供一种由所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建的亚克隆表达文库，所述亚克隆表达文库为es142E、es142G和es153G，库容含576个克隆；从es142E中筛选出活性亚克隆unpks-5，与未培养细菌来源的3-oxoacyl-ACPsynthase基因氨基酸序列相似性为84.15％。
本发明的另一目的在于提供一种由所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建的异源表达体系。
进一步，所述异源表达体系利用内生菌株YA-1，表达pepks、unpks基因，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。
本发明的优点及积极效果为：结合ARDRA酶切分型、18SrRNA基因克隆文库和大的插入片段Fosmid文库构建及筛选的方法，对环境样品真菌测序分析以及序列和功能驱动筛选的手段，为分析热带雨林土壤微生物及其基因资源多样性做一个很好的背景铺垫，反映在热带雨林这一极端的环境中，微生物及其基因资源极端而丰富，有利于微生物功能基因的挖掘与利用。
本发明采集海南五指山和尖峰岭热带雨林土壤样品多份，混合后，提纯并回收合适的DNA(25-48kb)片段，构建宏基因组Fosmid文库，并对文库进行了包括克隆稳定性、插入片段大小和物种多样性等在内的特征分析。其库容30624个Fosmid克隆，平均插入片段36.5kb左右，包含超过1Gb微生物基因信息，无同源序列占87.79％。采用抑菌圈法和牛津杯法以西瓜枯萎病菌为指示菌进行功能初筛和功能复筛，获得有功能的克隆4个：129C、142E、142G和153G。其中，129C和142E的盆栽防治效果均高于50％，分别为63.09％和53.28％，具有较大的生防应用潜力。构建了亚克隆表达文库es142E、es142G和es153G，库容均含576个克隆；筛选出活性亚克隆unpks-5，与未培养细菌来源的3-oxoacyl-ACP synthase基因氨基酸序列相似性为83.1％。
随着测序技术的飞速发展和价格下降，本发明直接测通了129C，经预测和分析，8个ORF在同一转录单元，可能参与抗枯萎病活性产物基因的表达。包括乙酰辅酶A水解酶、酰基辅酶A脱氢酶、聚酮合成酶(polyketide synthetases,pks)、聚酮化合物环化酶(polyketide cyclase)、辅酶A转移酶等。其中，pks关键基因核酸序列全长1641bp，编码547个氨基酸，其与荧光假单胞菌ABAC62(Pseudomonas fluorescens ABAC62)PKS关键基因氨基酸序列相似性最高，为95.14％；与Pseudomonas fuscovaginae的PKS关键基因氨基酸序列相似性次之，为87.96％；与Pseudomonas trivialis氨基酸序列相似性最低，为51.74％。可断定该pks基因及其家族来源于假单胞菌。
本发明结合乙酸乙酯萃取、柱层析、HPLC和GC-MS等手段和方法，提纯并鉴定了活性物质，为2,4-二乙酰基间苯三酚。分离西瓜内生菌株YA-1，并改造成宿主细胞，构建了2个pks基因的异源表达载体，通过启动子、培养基等的选择，建立了抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。构建并特征分析热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库，库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。克隆文库包含多个OTUs，涵盖了子囊菌门、担子菌门、接合菌门和壶菌门的大多数真菌，多样性极为丰富。了解其群落结构多样性，将有助于热带雨林真菌基因资源多样性分析和功能基因的挖掘与利用。
附图说明
图1是本发明实施提供的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法流程图。
图2是本发明实施提供的纯化后的土壤微生物总DNA(M1:Trans15k)示意图。
图3是本发明实施提供的真菌18S rRNA基因PCR扩增(M2:DNA marker Trans4k)示意图。
图4是本发明实施提供的稀缺性曲线示意图；
图中：A：基于ARDRA分型的稀缺性曲线；B基于DOTUR软件分析的稀缺性曲线。
图5是本发明实施提供的热带雨林土壤真菌18S rRNA基因克隆文库系统进化树，自举数据集1000次。
图6是本发明实施提供的间接法(PVPP预处理)提取宏基因组DNA普通琼脂糖凝胶(A)和脉冲电泳(B)(M1:λhindⅢ；M2:Low Range PFG marker)。
图7是本发明实施提供的回收末端修复的宏基因组DNA(M:λDNA/HindⅢ1,2:Metagenomic DNA)示意图。
图8是本发明实施提供的Fosmid质粒DNA电泳(M＝λDNA/HindⅢ,1-18:Randomselective Fosmid DNA)示意图。
图9是本发明实施提供的Fosmid DNA经NotⅠ酶切后脉冲电泳图谱(M＝Low RangePFG Marke)示意图。
图10是本发明实施提供的Fosmid DNA经EcoRⅠ酶切后1％琼脂糖凝胶电泳图谱示意图；A-G分别代表7个不同的克隆；1和5分别代表第1d和第5d(M＝Trans15K)。
图11是本发明实施提供的大规模功能驱动筛宏基因组文库示意图。
图12是本发明实施提供的Fosmid DNA.M:DNA markerλDNA/HindⅢ,1,2,3,4:分别代表129C、142G、142E和153G。
图13是本发明实施提供的Fosmid克隆酶切结果.M1:λDNA/HindⅢ,M2:Trans 2kplus,1,2,3,4:分别代表129C、142G、142E和153G,Fosmidvector:8.2kbp。
图14是本发明实施提供的3-oxoacyl-ACP synthase基因系统进化树示意图。
图15是本发明实施提供的PKS基因系统进化发育分析示意图。
图16是本发明实施提供的高效液相色谱样品制备图谱示意图。
图17是本发明实施提供的化合物GC-MS图谱示意图。
图18是本发明实施提供的化合物2,4-Diacetyl phloroglucinol结构图。
图19是本发明实施提供的YA-116S rRNA基因系统发育分析，Mega 4.0软件中邻近距离法建树，自举数据集1000次。
图20是本发明实施提供的穿梭质粒pWB980载体图谱示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明提供一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法包括以下步骤：
S101：采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
S102：末端修复宏基因组DNA后，胶回收23kb以上的片段，先将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
S103：连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1.热带雨林土壤真菌多样性分析
采集海南五指山和尖峰岭热带雨林土壤样品30份(每样各15份)。采用五点采样法，土壤采样器采集土壤样品，混合后用密封袋带回，土样用10mesh(2mm)筛网过筛，去除小颗粒的石头和残存的植物根系。对该样品真菌多样性分析的流程为：提取和纯化混合样品宏基因组DNA，PCR扩增真菌18S rRNA基因，构建真菌18S rRNA基因克隆文库，结合ARDRA酶切分型、基因克隆文库序列测定和序列分析等技术，建立稀缺性曲线和系统进化树，分析物种丰度、系统进化发育关系。为环境样品微生物多样性，并从中筛选出有益的微生物及其基因资源做一个很好的背景铺垫。
1.1雨林土壤微生物基因组总DNA提取
CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-SDS热处理的方法，直接提取的热带雨林土壤微基因组总DNA，含有较多的腐殖质和褐菌酸等杂质，经北京艾德莱生物科技有限公司生产的多功能DNA纯化回收试剂盒进行纯化后可获得高质量的土壤微生物总DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，片段>15kb(图2)，适合进行后续PCR反应。
1.2 PCR扩增和基因克隆文库构建
以4份DNA原液稀释10倍为模板，扩增真菌18S rRNA基因，每次PCR反应设置3次重复，将12次重复的PCR产物混合后，利用PCR产物回收试剂盒回收。得到600bp左右的DNA片段(图3)。回收产物经连接，转化，蓝白斑筛选，挑白斑，摇菌。共挑取392个克隆，用引物M13F/M13R进行菌液PCR反应，检测阳性克隆，得到365个含有目的插入片段的阳性克隆，阳性率93.1％。阳性克隆菌液中加终浓度为12％的甘油，-20℃保存，即为获取的雨林土壤真菌18SrRNA基因克隆文库。
1.3物种丰度分析
对365个阳性克隆菌液PCR产物进行ARDRA分析，综合分析HinfⅠ和HaeⅢ酶切图谱,得到25个OTU，其中有15个OTU类型代表单克隆，最多的OTU类型包含69个克隆。
本发明中，经ARDRA得到的CoverageC(Chao A,1984)值相对较高，为96.0％。CoverageC理论上表示克隆文库中包含的微生物种类(OTU)占样品中全部微生物种类的比例，它的计算式如下：(a)C＝1-n1/N，N代表文库的库容，n1代表在克隆文库中仅出现一次的OTU数量。如果CoverageC很高，甚至达到100％，表明库容已经饱和。通过ARDRA分析，反应真菌物种丰度的稀缺性曲线趋于平缓，表明文库已经达到饱和，克隆能够代表文库中大多数真菌的多样性(图4A)。本发明在ARDRA的基础上，选取120个阳性克隆进行测序和序列分析，得到116条无嵌合的真菌18S rRNA基因序列。用DOTUR软件分析，把序列相似性≥97％的定义为同一个OTU。这样116条真菌序列归属为21个OTU。其中有10个OTU只有1个克隆，最多的3个OTU类型分别含有55、15和12个克隆。利用DOTUR软件生成的数据，绘制稀缺性曲线(图4B)，coverageC为91.4％。与ARDRA数据相比，OTU数(21:25)、最多的OTU类型包含的克隆数(55:69)、只包含1个克隆的OTU类型数(10:15)均无太大差异，表明了经ARDRA筛选出的克隆序列同样能代表文库中大多数真菌的多样性，且比盲目的克隆测序更为高效。
1.4系统进化发育分析
利用clustalx对116条18S rRNA基因序列进行全局比对，将产生的phylip文件，输入phylip软件中进行排序分析，产生相应的输出文件(outfile)，然后经DOTUR软件分析，把序列相似性大于97％的定义为一个真菌序列(Mccaig et al.,1999)，共得到21种不同类型的真菌。从每个OTU类型中选取1条序列和NCBI中下载的，与之相似性最高的序列一起，用Mega4.0软件邻近距离法，构建系统进化树(图5)。
系统进化发育分析表明，该文库涵盖了担子菌、接合菌、壶菌和子囊菌，反映出的物种丰度极其丰富。子囊菌最丰富，在分析的116条序列中，有75条子囊菌序列，占克隆文库的64.7％，其中盘菌的丰度最高，有55条序列，占克隆文库的47.4％；担子菌的丰度次之，有18条序列，占克隆文库的15.5％，其中伞菌是最丰富的类群，有12条序列，占克隆文库的10.4％；有13条序列属于半知菌，占克隆文库的11.2％，其中5条序列属于青霉菌；此外，各有5条序列分别属于接合菌和壶菌。从系统进化发育树上可以看出，担子菌、接合菌与子囊菌的亲缘关系较远，壶菌与子囊菌的亲缘关系较近。同时，担子菌是该基因克隆文库中较优势的真菌类群。
NCBI内比对分析，除ST4A2(JQ007580)、ST4B1(JQ007573)、ST3H12(JQ007571)和ST3B12(JQ007565)与数据库中的序列相似性较低外，其余112条序列与数据库中的序列相似性均高于97％。序列ST3H12与被孢霉属真菌Mortierella indohii 18S rRNA基因序列相似性为97％，序列ST4B1与Leucothecium emdenii 18S rRNA基因序列相似性为95％，序列ST4A2与Linocarpon elaeidis以及ST3B12与不可培养的Fabrella tsugae 18S rRNA基因序列相似性最低，仅为94％。此外，在所有116条序列中，大多数比对上不可纯培养的真菌克隆。
另外，每个OTU中代表序列在RDP中进行比对，有10个OTU属于子囊菌，4个OTU属于担子菌，3个OTU属于半知菌，各有2个OTU属于接合菌和壶菌。担子菌中有2条序列属于牛肝菌，即ST3B11(JQ007557)和ST3A9(JQ007540)。所有序列均在NCBI中登录，并获得核酸序列登录号：JQ007506－JQ007584。
总之，克隆文库包含多个OTUs，涵盖了子囊菌门、担子菌门、接合菌门和壶菌门的大多数真菌，多样性极为丰富。因此，了解其群落结构多样性，将有助于热带雨林真菌基因资源多样性分析和功能基因的挖掘与利用。
2.热带雨林土壤宏基因组Fosmid文库构建与特征分析
采集海南岛热带雨林土壤样品30份(五指山和尖峰岭土壤样品各15份)，50目筛孔过筛，去除树枝残根和大颗粒的石块后，-80℃保存备用。
2.1热带雨林土壤宏基因组Fosmid文库构建
采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA。每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA(图6A)。经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb，最大达到150kb左右(图6B)，说明提取的基因组DNA在纯度(经PVPP洗涤去腐植酸)和片段大小上(基因组DNA完整性)，均适合构建大的插入片段的宏基因组Fosmid文库。
末端修复宏基因组DNA后，胶回收23kb以上的片段。如图7，为防止DNA片段在紫外下长期照射，影响后续实验，先将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，然后将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段。然后，使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上。连接反应在2h内完成，一般情况下，连接反应时间的延长并不影响连接效果。连接效率高低主要取决于回收DNA的质量，其中，DNA片段的完整性时关键，如果在回收过程中DNA片段有机械损伤，造成DNA片段化，那么将直接影响到与载体的连接。采用溶胶酶法，不通过过柱，回收DNA片段，很好地保证了片段的完整性。
连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。最终，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
2.2宏基因组Fosmid文库特征分析
2.2.1文库中克隆阳性率检测
随机挑取18个Fosmid克隆，经初摇和诱导多拷贝之后，按照Fosmid DNA提取和纯化试剂盒(FosmidMAXTMDNA Purification Kit)上的使用说明提质粒。如图8所示，除了11和12号克隆由于操作过程中人为的打翻，没有提出质粒外，其他16个克隆质粒都有清晰的条带，且片段大小大于23kb，说明插入片段正常，文库的阳性率较高。
2.2.2文库插入片段大小检测
随机挑取14个Fosmid克隆，提质粒，用NotⅠ酶切进行酶切。如图9所示，所有克隆在6.5-9.4kb之间有一条8.2kb的载体条带，而插入片段则被消化成大小不一的多个片段，这可能是由于土壤微生物基因组DNA的G+C含量较高，各种酶切位点较多所致。通过叠加各泳道中除了载体带以外的条带，各插入片段至少在30kb以上。这也正好印证了λ包装提取物只包装40kb左右的外源插入片段的理论。
2.2.3克隆的稳定性检测
随机挑取了7个Fosmid克隆，取1mL继代培养1d和培养5d后，分别提质粒，然后用EcoRⅠ37℃酶切4h，结果培养1d和培养5d的质粒酶切条带基本一致(图10)。因此，可以断定外源插入片段没有出现丢失或重排的现象，如E号克隆的第100代和第0代在1.5kb-5kb之间均有相同的酶切条带。说明所构建的Fosmid文库是稳定的。
2.2.4文库包含物种多样性检测
158个末端随机测序结果中，有7个分别比对上厌氧粘细菌、拜叶林克氏菌、慢生根瘤菌、假单胞菌、沼泽红假单胞菌、大豆根瘤菌和尚未确定分类地位的细菌，占4.07％。其中，2个比对上假单胞菌属。无同源序列的克隆共151个，占到87.79％。这表明该宏基因组文库覆盖的微生物多样性极其丰富。其次，7个比对上同源序列的都是细菌序列，这可能是有两方面的原因，其一，细菌是该环境样品的优势菌群，其物种丰度远远高于古菌、真菌以及其他微生物；其二，间接提取DNA的方法得到细菌比例更大一些。此外由测序结果分析出该文库的空载率低为1.7％，随机性为98.1％。检测结果见表1。
表1宏基因组文库末端测序分析物种多样性。
成功得到了一个包含30624个克隆的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库Hnsfba，平均插入片段为36.5kb左右，库容量超过1Gb微生物基因组信息。经验证两个宏基因组文库插入效率和克隆的稳定性都较为理想。末端测序结果(表1)表明文库的插入片段大多数来源于未培养微生物基因组，随机性良好。有利于从不可培养热带雨林土壤微生物中筛选出抗瓜类枯萎病基因资源。
3宏基因组文库筛选
3.1二级池和超级池的构建
构建了用于文库筛选的12合1、8合1文库和96合1文库，即二级池和超级池，大大地缩短了工作量，避免了单个克隆筛选的麻烦，如下图(图11)所示，将文库克隆全部平行转接一套筛选文库；再将筛选文库中每个96孔板中的8排、12列各混在一起，成为复筛库；再将板中每排、列各克隆混合，作为一个初筛库进行初筛。若96孔合一的初筛库有目标克隆则在复筛库中各排、列分别进行筛选，可直接获得目标菌位点。
3.2西瓜枯萎病强致病力菌株的分离、纯化和保存
结合致病力测定、形态学鉴定和分子生物学鉴定等手段分离、纯化西瓜枯萎病强致病力菌株，命名XGW-1。筛选出PDA培养基为最适合该菌株菌丝生长和产孢的培养基，28℃，培养7d，能将整个平板覆盖。培养10d，能产生大量的分生孢子，用于后续牛津杯法测定Fosmid克隆发酵上清液对病菌的抑制作用。
3.3功能驱动筛选抗西瓜枯萎病活性克隆
通过功能驱动筛选(双琼脂层法)初步筛选出对西瓜枯萎病XGW-1菌丝生长有抑制作用的Fosmid克隆4个，编号分别为：129C、142E、142G和153G，并采用牛津杯法和对峙培养法反复验证Fosmid活性克隆129C、142E、142G和153G对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用。研究：129C和142E对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用最强、最稳定，在牛津杯法室内生物测定中，平均抑菌圈直径能达5.9mm和5.1mm。
3.4温室盆栽效果评价
盆栽试验设129C、142E、142G、153G发酵培养液和LB培养基对照，共5次处理，每处理4次重复，每次重复30株西瓜苗，共600株，每株用无菌土种于20×30mm营养钵中。待西瓜苗长到4-6叶期时，采用LB液体培养基，37℃，发酵3d后，与西瓜枯萎病菌孢子悬浮液一起灌根接种，3d后开始检查西瓜苗的发病情况，并记录7d、12d和15d的发病情况。用Duncan新复极差法对活性克隆处理的防效进行方差分析。结果各活性克隆发酵液处理的效果差异极显著。其中，129C和142E的防治效果均高于50％，分别为63.09％和53.28％，具有较大的生防应用潜力。
4亚克隆文库构建、筛选和序列分析
提取Fosmid克隆142G、142E和153G的DNA(图12)，经EcoRⅠ和SPhⅠ双酶切后，胶回收1.5—5kb大小的片段(图13)，连接到用相应的酶双酶切后的pUC19载体上，转化(用E.coliDH5α)后，涂板于LB固体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)上，37℃，12h后，挑取尽量多的亚克隆，37℃，摇菌培养12h，加终浓度为15％的甘油，-20℃冰箱中保存备用。构建了亚克隆表达文库es142E、es142G和es153G，各亚克隆文库库容均包含576个克隆。
功能驱动筛选：类似于Fosmid文库室内活性筛选，以西瓜枯萎病菌为靶标菌，采用双琼脂层法，根据是否产生透明圈的表型，从亚克隆文库es142E中，筛选出活性亚克隆unpks-5，其抑菌圈直径为4.5mm。未从另外两个亚克隆文库es142G和es153G筛选到对西瓜枯萎病菌具有拮抗活性的亚克隆。此外，随着测序技术的发展，测序成本、价格等方面降低，直接测通了温室盆栽防效最好的活性Fosmid克隆129C。
提取克隆隆unpks-5质粒，送北京华大基因研究中心测序。序列分析在生物学软件DNAman和DNAstar中进行。亚克隆中包含的基因数和核酸序列运用在线分析页面(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesb&group＝help&subgroup＝gfindb)中进行。同时，在CBS SignalP 4.1server界面(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)中分析其信号肽劈开位点，通过BDGP Neural network promoter prediction界面http://www.fruitXyorg/seq_tools/Promoter.html.预测其是否含有独立的启动子。
测序得到1496bp的DNA序列，ORF全长1035bp，编码345个蛋白质氨基酸，蛋白质分子量37,088Da，等电点10.31，G+C含量55.16％，包含起始密码子ATG和终止密码子TAG。在其5′非编码区无S-D序列(Shine-Dalgarno)，3′非编码区无反向串联重复序列(Tandeminverted repeat sequences)，无独立的启动子序列。在氨基酸序列中，22和23个氨基酸序列之间是其信号肽劈开位点。其氨基酸序列在NCBI中BLAST protein比对，与未培养来源的变形细菌Uncultured Proteobacterial(KJD32282.1)3-oxoacyl-ACP synthase基因相似性最高，为84.15％；与Pseudomonas(WP_010793585.1)相似性次之，为38.78％；此外，与链霉菌属Streptomyces(WP_038522268.1)、Streptomyces nodosus(AJE43586.1)氨基酸序列相似性较低，分别为12.96％和12.14％。从系统进化发育树上(图14)也能看出，其与未培养来源的变形细菌Uncultured Proteobacterial(KJD32282.1)3-oxoacyl-ACP synthase基因聚在同一分支上面，遗传距离较近；与链霉菌属Streptomyces遗传距离较远。因此，该基因及其所编码的活性物质极有可能是非培养细菌来源的。
表明：ACP synthase基因是编码酮基化合物形成的关键基因。因此，可以推断本发明中3-oxoacyl-ACP synthase基因是unpks-5抗西瓜枯萎病活性产物产生的关键基因。
5 129C序列分析和活性产物鉴定
5.1序列分析
提取和纯化Fosmid克隆129C的DNA序列，送华大基因测序和序列分析。去除载体序列后，得到39.145kb的完整序列，包含38个ORF。其中，8个ORF在同一转录单元，可能参与抗枯萎病活性产物基因的表达。经注释，其氨基酸序列包含乙酰辅酶A水解酶、酰基辅酶A脱氢酶、聚酮合成酶(polyketide synthetases,pks)、聚酮化合物环化酶(polyketidecyclase)、辅酶A转移酶等。其中，pks基因核酸序列全长1641bp，编码547个蛋白质氨基酸；蛋白质分子量59,782Da，等电点5.93，G+C含量57.83％，包含起始密码子ATG和终止密码子TAG。在其5′非编码区无S-D序列(Shine-Dalgarno)，3′非编码区无反向串联重复序列(Tandem inverted repeat sequences)，无独立的启动子序列。在氨基酸序列中，34和35个氨基酸序列之间是其信号肽劈开位点。
NCBI中蛋白比对(BLAST Pro)，其与荧光假单胞菌ABAC62(Pseudomonasfluorescens ABAC62)PKS关键基因氨基酸序列相似性最高，为95.14％；与Pseudomonasfuscovaginae的PKS关键基因氨基酸序列相似性次之，为87.96％；与Pseudomonastrivialis氨基酸序列相似性最低，为51.74％。从系统进化发育树(图15)上可以看出，其与已报道的荧光假单胞菌ABAC62(Pseudomonas fluorescens ABAC62)PKS基因聚在同一分支上，遗传距离近。因此，可以断定该pks基因(簇)来源于假单胞菌。
5.2活性产物提纯与鉴定
对活性Fosmid克隆129C发酵液110L采用乙酸乙酯萃取后，获得38.5g浅黄色粗提物，取少量(约5mg)用甲醇配成浓度为10mg/mL的粗提物，采用含毒培养基法(倒平板前将适量初提物溶液加到PDA培养基中)对西瓜枯萎病菌进行室内生物测定，同时，设定只加甲醇溶液的PDA对照，每处理重复4次。28℃，培养7d后，采用十字交叉法测定处理和对照的菌丝生长直径。如图20A/B/C/D，表2所示，甲醇对照的菌丝生长直径为60mm左右，而初提物处理的菌丝生长直径均不超过35mm。说明初提物中某种活性物质抑制了西瓜枯萎病菌丝的生长。
表2 129C初提物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性
经三次柱层析分离，分离得到1012个流分。取不同流分段(浓度为1mg/mL)采用抑菌圈法对西瓜枯萎病菌分别进行室内生物测定，仅S331～432流分有活性，合并活性流分共5.8g。其中，S331流分抑菌圈直径达到11.2mm，S432流分抑菌圈直径达到12.4mm，抑菌圈边缘菌丝生长受到明显抑制。
5.3高效液相色谱(HPLC)分析
首先，分析型高效液相色谱(HPLC)上柱的基本条件：根据S331～432流分样品的甲醇溶液的紫外扫描吸收光谱显示，在波长为215nm处样品的吸收值最大，因此高效液相检测系统选用紫外检测器。
流动相为甲醇：水＝55：45，选择的进样体积30μL，流速1.0mL/min，保留时间为40分钟。当保留时间为11min和16min时，有较高的吸收峰，可能是活性峰。但两个吸收峰附近均有杂质峰，因此，应该采用制备型高效液相色谱进行分析。
其次，制备型高效液相色谱分离化合物采用乙腈：水：乙酸＝40：50：0.6为流动相，制备柱型号:Prep MS C18Column 10um,7.8×300mm，柱温:34.5℃，流速:6mL/min，保留时间40min的制备液相条件进行样品制备，当保留时间为14-18min时，有较高的吸收峰，为活性峰，可以制备出纯化物(见图16所示)。共制备出420mg单体化合物，供后续GC-MS气相色谱-质谱联用分析。
5.4 GC-MS及纯化物的生物活性测定
色谱条件：所选用的色谱柱为：DB-1701石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；柱温为：80℃，保留时间为：1min，以15℃/min升温至100℃，保留时间1min，再以10℃/min升温至220℃，最后以5℃/min升温至280℃，并保持15min；载气为惰性气体：氦气，其纯度≥99.999％，流速为0.5mL/min；采用脉冲不分流进样方式；脉冲压力为200kPa，脉冲时间为0.75min。进样口温度230℃，进样量为1.0μL。
质谱条件：采用EI离子源，电离电压70eV；扫描范围m/z：20～250amu；四级杆温度150℃；离子源温度250℃；电子倍增器电压2300V；GC/MS接口温度280℃；标准质谱图库NIST08.L。
单体化合物通过GC-MS分析鉴定，总离子流图如图17。质荷比m/z：210(M+，25)，195([M-CH3]+，40)，177([M-H2O-CH3]+，100)，未见单乙酰化产物(m/z：168)和三乙酰化产物(m/z：252)及间苯三酚(m/z：126)的分子离子峰。因为对应于分子量为210的O-乙酰化产物的分子离子峰为m/z：210[M]+和m/z：168[M-CH3CO]+及126[M-2(CH3CO)]+的碎片离子峰。而C-乙酰化产物由于其乙酰基中的C＝O与苯环中的C＝C共轭，它的碎片离子峰应分别为m/z：195[M-CH3]+和177[M-H2O-CH3]+。
经与NIST 08.L标准质谱图库进行比对检索，并结合有关文献和人工解析，将该化合物鉴定为2,4,-二乙酰基间苯三酚(2,4-Diacetyl phloroglucinol)，分子式为C10H10O5，分子量为210.181(图18)。
5.5纯化物2,4,-二乙酰基间苯三酚的生物活性测定
采用菌丝生长速率法，测定了2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌XGW-1的生物活性(表3)。2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌的毒力回归方程Y＝1.188X+3.3208，其EC50和EC95分别为25.91μg/mL和622.16μg/mL，与对照生物防治药剂农抗120抗菌素的效果(EC50和EC95分别为25.22μg/mL和682.02μg/mL)相当；比对照化学药剂50％多菌灵可湿性粉剂的防治效果(EC50和EC95分别为13.44μg/mL和330.22μg/mL)要差。然而，该化合物分离于环境微生物样品，与环境的兼容性较好，因而具有较好的生防潜力。
表3纯化物2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌的拮抗活性
6异源表达
6.1宿主菌株的分离与改造
分离1-2个西瓜内生菌株，改造成异源表达株系。从健康的西瓜植株分离出1株内生菌株YA-1，并对其进行了形态鉴定。在LB固体培养基表面菌落为椭圆形或柱形，表面粗糙不透明，污白色到浅黄色，30℃温箱中培养1d后，用牙签挑起，能看到粘稠状菌脓；培养3d后，菌落表面能看到大量褶皱。据其在LB培养基上的生长表型，可以初步将其判定为芽孢杆菌属的一种。
YA-1生理生化测定结果表明：该菌能利用甘油、蛋白质、淀粉，革兰氏反应呈阳性，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，不能利用甘露糖、阿拉伯糖和甘露醇，能在7％NaCl胰胨水中生长。进一步验证为芽孢杆菌。
此外，对其进行了16S鉴定和系统进化发育分析。在EzTaxon数据库中进行有效种的序列相似性搜索，菌株YA-1与芽孢杆菌的菌株高度相关。在NCBI中比对：与菌株YA-1相似性最高的芽孢杆菌的有效种为Bacillus subtilis strain IHBB 1516(登录号：KF475836，相似性为100％)，其次为Bacillus subtilis strain ZJ-1(登录号：KC146707，相似性为99％)，说明菌株YA-1为芽孢杆菌中的一员。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析也显示菌株YA-1与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain IHBB 1516同在一个进化分支上，并且与枯草芽孢杆菌中其他有效种聚在一起，并落在它们之间(图19)。显然，菌株YA-1属于枯草芽孢杆菌中的成员。
6.2高效异源表达体系构建
利用分离到的内生菌株YA-1，分别表达从Fosmid文库中筛选到的pepks基因和亚克隆文库筛选到的3-oxoacyl-ACP synthase基因：unpks，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。本发明采用质粒的形式在枯草芽孢杆菌中表达外源基因，选择在大肠杆菌和芽孢杆菌中穿梭质粒载体载体pWB980作为表达载体(图20)，该载体在枯草芽孢杆菌细胞内拷贝数高，同时该载体采用枯草芽胞杆菌胞苷脱氢酶(Cdd)基因的启动子P43作为外援基因表达的启动子，该启动子属于重叠启动子，能被两种σ因子识别，是一种组成型启动子，具有高效表达的特点。Fosmid文库筛选到的pepks基因序列经带有HindⅢ和kpnⅠ酶切位点的引物扩增后，经HindⅢ和kpnⅠ酶切后连接到pWB980载体的HindⅢ和kpnⅠ酶切位点处，经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达pepks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达15.3mm。通过盆栽实验证实抗病性达到71.38％，通过高效表达体系的分析，证明pepks基因对枯萎病的抗性达到71.38％，比Fosmid表达克隆129C的抑菌活性(63.09％)提高了8.29％，比相应的对照药剂农抗120抗菌素防治效果稍高(70.49％)，差异不显著。说明pepks基因对枯萎病抗性较好(表4)。
而亚克隆文库筛选到的unpks基因序列经带有EcoRⅠ和SphⅠ酶切位点的引物扩增后，经EcoRⅠ和SphⅠ酶切后连接到pWB980载体的EcoRⅠ和SphⅠ酶切位点处，同样经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达unpks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达13.1mm。通过盆栽实验证实抗病性达到60.98％，通过高效表达体系的分析，证明unpks基因对枯萎病的抗性达到60.98％，比Fosmid表达克隆142E的抑菌活性(53.28％)提高了7.7％说明unpks基因对枯萎病具有抗性(表4)。本发明所建立的高效表达体系可应用于枯萎病防治。
表4异源表达工程菌对西瓜枯萎病菌的防效
本发明的结论具体如下：
1.真菌多样性分析：分析了雨林土壤真菌物种丰度、优势种群和进化关系等群落结构特征，以期为开发利用这一特殊环境中丰富微生物基因资源提供依据。文库包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
2.宏基因组文库构建和筛选：构建并特征分析热带雨林宏基因组Fosmid文库。库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
3.亚克隆构建、筛选：构建亚克隆表达文库es142E、es142G和es153G，库容均含576个克隆；从es142E中筛选出活性亚克隆unpks-5，与未培养细菌来源的3-oxoacyl-ACPsynthase基因氨基酸序列相似性为84.15％。
4. 129C序列分析和活性产物鉴定：序列全长39.145kb，含38个ORF，8个ORF在同一转录单元，可能参与抗枯萎病功能基因表达。包括乙酰辅酶A水解酶、酰基辅酶A脱氢酶、聚酮合成酶、聚酮化合物环化酶、辅酶A转移酶等。pks基因核酸全长1641bp，编码547个氨基酸；经萃取、柱纯化、HPLC和GC-MS将活性物质鉴定为2,4-二乙酰基间苯三酚。
5.异源表达体系构建：利用内生菌株YA-1，表达pepks、unpks基因，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。对枯萎病的抗性分别达71.38％和60.98％。本发明建立的高效表达体系可用于西瓜枯萎病防治。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，其特征在于，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法包括采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA；经琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测；末端修复宏基因组DNA，将marker和小样切下，使用连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。
2.如权利要求1所述的带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，其特征在于，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法具体包括以下步骤：
步骤一，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
步骤二，末端修复宏基因组DNA，胶回收23kb以上的片段，将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
步骤三，连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。
3.如权利要求2所述的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，其特征在于，所述步骤三中过夜培养，产生了100板，40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
4.一种由权利要求1所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法构建的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库，其特征在于，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库包含该极端环境下的细菌、真菌、古菌和病毒等微生物基因资源，既包含实验室可纯培养的，也包含不可纯培养的，其微生物及其基因资源极其丰富；以真菌为例，初步检测含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
5.如权利要求4所述的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库，其特征在于，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
6.一种由权利要求4所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建的亚克隆表达文库，其特征在于，所述亚克隆表达文库为es142E、es142G和es153G，库容含576个克隆；从es142E中筛选出活性亚克隆unpks-5，与未培养细菌来源的3-oxoacyl-ACP synthase基因氨基酸序列相似性为84.15％。
7.一种由权利要求4或5任意一项所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建的异源表达体系。
8.如权利要求7所述的异源表达体系，其特征在于，所述异源表达体系利用内生菌株YA-1，表达pepks、unpks基因，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。
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