CN107523562A - Fosmid 文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于瓜类枯萎病防治技术领域，公开了一种Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，包括；异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA；宏基因组Fosmid文库构建及质量检测；筛选宏基因组Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；萃取发酵液，获得较纯的活性层；获得纯化后的抗瓜类枯萎病活性物质；解析图谱，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；筛选和改造植物内生菌株，基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。本发明突破传统生防菌不能定植的瓶颈因素，大大加速抗瓜类枯萎病新药物的研制、开发和商品化进程。

Description

Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法
技术领域
本发明属于瓜类枯萎病防治技术领域，尤其涉及一种Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法。
背景技术
瓜类枯萎病又称蔓割病、萎凋病，是瓜类生产中主要的土传病害之一，尤以西瓜、黄瓜和甜瓜上的危害最为严重。该病遍及中国、美国、意大利、以色列、日本和印度等几十个国家和地区，我国南北方西瓜种植区都有不同程度发生。尤其是南方热带和亚热带地区，雨量充沛、气候温和，病原菌无越冬现象，造成病菌孢子在土壤中的大量累积，病害发生率极高，重茬地一般发病率在30％以上，严重地块达80％，甚至造成绝产。近年，瓜类枯萎病害频频发生，并有蔓延趋势，严重影响瓜类产量和品质，使农民遭受巨大的经济损失。该病的防治主要有农业防治、物理防治、化学防治、生物防治等，目前多以化学防治为主。但由于土传病害中的病原菌掩蔽性较强，化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高。同时化学药剂广泛使用所带来的环境污染等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制。因此，符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已显得十分重要和迫切。在生物防治中，生防资源虽然丰富，人们也通过室内生测，筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌(木霉属真菌)、细菌(假单胞菌等)和放线菌；但是，其温室和大田防效不明显，不能开发成商品化的生物防治药剂应用于大田生产。生防菌株不能在根围，甚至维管束部定植，而瓜类枯萎病是一类维管束寄生菌，在适宜的温、湿度下萌发出芽管，从根部、根尖或伤口侵入，进入维管束后阻塞导管，病菌产生大量菌丝和菌核，影响导管对水分和养分的运输，病菌分泌果胶酶和纤维素酶分解破坏细胞，使有毒物质堵塞导管，从而造成维管束变褐，植株萎焉。一旦枯萎病菌能够跨越传播、吸附、侵入的屏障，它将在维管束内大量繁殖，堵塞导管。因此，根据病菌的侵染特点，以植株内生菌作为表达株系，筛选和改造内生菌株，建立抗枯萎病天然活性产物的异源高效表达体系，是实现瓜类枯萎病生物防治的关键，其研究成果对于枯萎病的有效防控将做出重要的贡献。另外，在过去几十年，抗菌化合物的开发大多采用筛选环境微生物活性的传统方法，其研究流程包括微生物分离纯化、大量培养、培养物收集、目标物质抽提、鉴定及开发利用等步骤。沿着这样的程序，人们已经找到了许多活性物质但其重复发现率特别高，很难发现新的活性物质。因此，研究者们开始寻找新的途径来开发和筛选新的抗植物病原微生物活性物质。然分子微生物生态学研究表明环境中存在大量未能培养的微生物，据估计每克土壤含有约几千种不同的微生物，最高可达1010个微生物个体，利用传统的纯培养技术，仅有1％的微生物可被培养，而不能培养的微生物才是环境微生物多样性的主体。1998年，Handelsman J等提出了宏基因组文库的概念，其避开了传统的微生物分离培养的问题，直接提取环境中的总DNA转化克隆到可培养的宿主中，使文库即包含了环境中可培养的微生物基因又包含了未可培养的微生物基因，极大地扩展了微生物基因资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会。其过程是从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化到一个替代宿主细胞，形成重组DNA文库。获得的克隆子异源表达宿主细胞获得的外源DNA片断。根据其表达的新功能进行筛选，或是用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。最后，通过宏基因组文库筛选活性产物，对环境DNA片段大小和完整性、载体和宿主的选择都有严格的要求。这就对DNA的提取提出了更高的要求，原位裂解法直接提取宏基因组DNA，因其中的颗粒状物质对DNA片段有损伤，使其变成大量的小片段。而异位裂解法先将微生物细胞分离出来，然后进行提取，可以获得大片段的基因组DNA。小的插入片段的文库不能够检测出大的基因簇或者操纵子。假如环境样品中所有的物种在丰度上均匀地存在，为了包括整个宏基因组，超过107个5kb的插入片段是必须的。为了克服这个局限，大的插入片段的文库(如，cosmid DNA文库和fosmid DNA文库，平均插入片段40kb左右。)被用来开发宏基因组文库。另外，在构建宏基因组文库时，不能考虑潜在的宿主问题，谁也不保证异源DNA能在选择的宿主中表达，尤其是不清楚遗传信息的基础上使用PCR或杂交的方法鉴定克隆。因而，必须扩大宿主范围，以筛选和鉴定能在不同宿主中表达的活性物质。目前，宏基因组学的研究在美国、德国、法国和韩国等发达国家发展迅速，国内鲜见类似报道。迄今为止，国内外已报道的瓜类枯萎病菌尖孢镰刀菌有7个专化型，即西瓜、甜瓜、丝瓜、葫芦、黄瓜、苦瓜和冬瓜专化型，而以西瓜、黄瓜的危害最为严重。因此，以西瓜枯萎病为研究对象，依托海南岛热带雨林土壤蕴藏的丰富微生物基因资源，利用宏基因组技术从土壤未培养微生物群落中挖掘新的抗瓜类枯萎病基因资源及其异源活性产物的高效表达，并探索开发新的抗瓜类枯萎病药物，为瓜类枯萎病的生物防治研究提供新的技术手段，具有十分重要的科学价值和现实意义。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌(木霉属真菌)、细菌(假单胞菌等)和放线菌均是建立在传统的分离纯化、培养的基础上的，忽略了占绝大多数的不可培养微生物，尤其是热带雨林等极端环境下的微生物，越是极端环境，越有可能获得特殊性质的酶和其他活性物质，相应的微生物也越难培养。极大地限制了开发的广度和深度，忽视了新型非培养来源的微生物活性物质的开发和利用；此外，筛选出的活菌体，是基于实验室对峙培养的基础上，一旦用于温室和大田，由于复杂的环境条件影响，防治效果不明显，甚至无效果，不能开发成商品化的生物防治药剂应用于大田实际生产中。因此，本发明通过收集热带雨林极端环境样品，异位裂解提取大片段宏基因组DNA，选择适合大的插入片段的Fosmid载体和表达谱广的宿主细胞E.coli EPI300，构建和筛选宏基因组Fosmid文库，提纯并解析活性产物，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达的系统，为活性产物的开发提供了非培养来源的技术手段。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法。
本发明是这样实现的，一种Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，所述Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法包括：
(1)异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA；
(2)宏基因组Fosmid文库构建及质量检测；
(3)筛选宏基因组Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；
(4)萃取发酵液，获得较纯的活性层；获得纯化后的抗瓜类枯萎病活性物质；解析图谱，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；
(5)筛选和改造植物内生菌株，基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。
所述(2)进一步包括：低熔点琼脂糖脉冲电泳后，切取25kb-48kb之间的条带，溶胶酶法回收DNA，连接，包装，转导入EPI300宿主细胞中，涂到含氯霉素的平板上，保菌克隆，保存至少30000个以上的克隆；同时，随机抽取文库中的克隆进行插入片段大小检测、克隆稳定性检测和文库中包含的微生物物种多样性检测。
进一步，所述Fosmid文库构建方法包括以下步骤：
步骤一，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
步骤二，末端修复宏基因组DNA，胶回收23kb以上的片段，将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
步骤三，连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。
进一步，所述步骤三中过夜培养，产生了100板，40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
进一步，所述(3)Fosmid文库筛选，分离、纯化培养西瓜枯萎病菌株，结合形态学观察和分子生物学手段鉴定该菌株，并通过多次温室盆栽试验，进行抗性鉴定，以确保该菌株为强致病力菌株；通过抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，筛选Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆。
所述(3)进一步包括：抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析，提取Fosmid活性克隆DNA，构建亚克隆文库，并按照筛选活性Fosmid克隆的方法，获得有生物学活性的目的基因克隆并测序，并与Genbank中的序列进行比较，明确目的克隆基因的生物学地位。
进一步，所述Fosmid文库包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
进一步，所述Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
本发明的优点及积极效果为：针对现有技术的环境微生物不能在实验室条件下被培养，阻碍对环境微生物群落结构和生态功能的研究，以及微生物基因资源的挖掘和利用，采用宏基因组学的方法。本发明提取海南岛热带雨林土壤微生物基因组总DNA，构建宏基因组Fosmid表达文库，功能驱动筛选抗瓜类枯萎病天然活性产物，扩大筛选范围，提高筛选成功率，减少重复筛选的现象。
本发明结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)和四大光谱，鉴定宏基因组Fosmid文库中，通过功能驱动筛选获得的抗瓜类枯萎病天然活性产物，并明确其结构。针对大多数生防菌不能在根部，甚至在维管束部定植，因而大田应用效果不理想的瓶颈问题，并依据瓜类枯萎病侵染的特点，以植株内生菌作为表达株系，筛选和改造内生菌株，建立抗枯萎病天然活性产物的异源高效表达体系。为实现抗枯萎病药物的商品化奠定坚实的基础。利用分子生物学手段，首次构建海南岛热带雨林土壤微生物宏基因组组Fosmid文库，并功能驱动筛选抗瓜类枯萎病的微生物功能基因(簇)。突破了靠培养-筛选生防菌的局限，扩大筛选范围，提高筛选成功率，减少重复筛选的现象，为瓜类枯萎病的生物防治提供一个全新的研究手段；同时，构建的宏基因组Fosmid文库，库容大，插入片段长，有利于从中筛选其他活性产物。土壤类型独特。国内有人研究过青藏高原高寒草甸土壤、河(湖)底沉积土、盐碱土和堆肥等土壤类型，未见有关研究海南岛热带雨林土壤的报道。而海南岛常年高温高湿，土壤呈酸性，是耐高温、耐酸的极端微生物的“温床”，因而该土壤中的微生物更有利于从中找到有益的微生物基因资源。利用构建和筛选亚克隆的方法，来筛选编码活性产物的完整功能基因(簇)，美国、德国和韩国研究得较多，国内近年陆续有相关的研究报道。分离、筛选和改造植株内生菌作为表达株系，并建立从文库中筛选出来的有生物学活性的目的基因(簇)异源高效表达体系，突破传统生防菌种类、来源单一的问题(局限于实验室可纯培养的微生物)，将大大加速抗瓜类枯萎病新药物的研制、开发和商品化进程。
附图说明
图1是本发明实施例提供的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的Fosmid文库构建方法流程图。
图3是本发明实施提供的间接法(PVPP预处理)提取宏基因组DNA普通琼脂糖凝胶(A)和脉冲电泳(B)(M1:λhindⅢ；M2:Low Range PFG marker)。
图4是本发明实施提供的回收末端修复的宏基因组DNA(M:λDNA/HindⅢ1,2:Metagenomic DNA)示意图。
图5是本发明实施提供的Fosmid质粒DNA电泳(M＝λDNA/HindⅢ,1-18:Randomselective Fosmid DNA)示意图。
图6是本发明实施提供的Fosmid DNA经NotⅠ酶切后脉冲电泳图谱(M＝Low RangePFG Marke)示意图。
图7是本发明实施提供的Fosmid DNA经EcoRⅠ酶切后1％琼脂糖凝胶电泳图谱示意图；A-G分别代表7个不同的克隆；1和5分别代表第1d和第5d(M＝Trans15K)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明为解决传统筛选生防菌筛选的局限，同时，也为扩大筛选范围，从不可纯培养的微生物中筛选具有抗瓜类枯萎病的微生物基因资源。本发明从分子生物学的手段入手，通过构建和功能驱动筛选宏基因组Fosmid文库，找到抗瓜类枯萎病的新的活性物质，利用液相色谱和核磁共振的手段鉴定活性产物的结构；通过构建和筛选亚克隆，以及活性亚克隆序列测定和序列分析，获得编码活性物质的完整基因(簇)。同时，在瓜类枯萎病生防资源中，室内生物测定的结果较好。本发明将分离、筛选和改造植株内生菌作为表达株系，并建立从文库中筛选出来的有生物学活性的目的基因(簇)异源高效表达体系。为实现抗枯萎病药物的商品化奠定坚实的基础。
Fosmid是宏基因组文库构建载体，本发明中用的pCC1FOS，是一种商品化的载体，购买于美国EPI生物技术公司。宿主菌大肠杆菌E.coli EPI300为商品化菌株，购置于美国EPI生物技术公司。
从活性Fosmid克隆129C中筛选出的功能基因pepks核酸序列SEQ ID NO：1。
从活性Fosmid克隆129C中筛选出的功能基因pepks氨基酸序列SEQ ID NO：2。
从亚克隆文库es142E中筛选出活性功能基因unpks-5核酸序列SEQ ID NO：3。
从亚克隆文库es142E中筛选出活性功能基因unpks-5氨基酸序列SEQ ID NO：4。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法包括以下步骤：
S101：DNA样品的提取和纯化，异位裂解法提取的土壤微生物基因组DNA片段经低熔点琼脂糖电泳，溶胶酶法回收主带，脉冲场电泳检测DNA分子量大小；
S102：Fosmid文库的构建及检测，低熔点琼脂糖脉冲电泳后，切取25kb-48kb之间的条带，溶胶酶法回收DNA，连接，包装，转导入EPI300宿主细胞中，涂到含氯霉素的平板上，保菌克隆，保存至少30000个以上的克隆。同时，随机抽取文库中的克隆进行插入片段大小检测、克隆稳定性检测和文库中包含的微生物物种多样性检测；
S103：文库筛选，分离、纯化培养西瓜枯萎病菌株，结合形态学观察和分子生物学手段鉴定该菌株，并通过多次温室盆栽试验，进行抗性鉴定，以确保该菌株为强致病力菌株；通过抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，筛选Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；
S104：抗瓜类枯萎病活性物质的提纯和鉴定，发酵罐或大规模的摇培获得大量的活性克隆发酵液，经石油醚、氯仿和乙酸乙酯等萃取后，在旋转蒸发仪的作用下，去掉部分非活性层，获得较纯的活性层；活性层经正相柱层析、反相柱层析、凝胶层析、薄层层析和重结晶等手段，获得纯化后的抗瓜类枯萎病活性物质；用核磁共振、GC-MS、红外光谱、紫外光谱的手段解析图谱，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；
S105：抗瓜类枯萎病活性产物基因(簇)的克隆与序列分析，提取Fosmid活性克隆DNA，构建亚克隆文库，并按照筛选活性Fosmid克隆的方法，，获得有生物学活性的目的基因克隆并测序，并与Genbank中的序列进行比较，明确目的克隆基因的生物学地位；
S106：异源高效表达体系的构建，筛选和改造植物内生菌株，将该基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。
在步骤S103中构建了用于文库筛选的12合1、8合1文库和96合1文库，即二级池和超级池，大大地缩短了工作量，避免了单个克隆筛选的繁琐，将文库克隆全部平行转接一套筛选文库；再将筛选文库中每个96孔板中的8排、12列各混在一起，成为复筛库；再将板中每排、列各克隆混合，作为一个初筛库进行初筛。若96孔合一的初筛库有目标克隆则在复筛库中各排、列分别筛选，可直接获得目标菌位点。
通过功能驱动筛选(双琼脂层法)初步筛选出对西瓜枯萎病XGW-1菌丝生长有抑制作用的Fosmid克隆4个，编号分别为：129C、142E、142G和153G，并采用牛津杯法和对峙培养法反复验证Fosmid活性克隆129C、142E、142G和153G对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用。发现：129C和142E对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用最强、最稳定，在牛津杯法室内生物测定中，平均抑菌圈直径能达5.9mm和5.1mm。
盆栽试验设129C、142E、142G、153G发酵培养液和LB培养基对照，共5次处理，每处理4次重复，每次重复30株西瓜苗，共600株，每株用无菌土种于20×30mm营养钵中。待西瓜苗长到4-6叶期时，采用LB液体培养基，37℃，发酵3d后，与西瓜枯萎病菌孢子悬浮液一起灌根接种，3d后开始检查西瓜苗的发病情况，并记录7d、12d和15d的发病情况。用Duncan新复极差法对活性克隆处理的防效进行方差分析。结果各活性克隆发酵液处理的效果差异极显著。其中，129C和142E的防治效果均高于50％，分别为63.09％和53.28％，具有较大的生防应用潜力(表1)。
表1各活性克隆发酵液对西瓜枯萎病的防效
在步骤S104中萃取发酵液，获得较纯的活性层；获得纯化后的抗瓜类枯萎病活性物质；解析图谱，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；活性产物提纯与鉴定：对活性Fosmid克隆129C发酵液110L采用乙酸乙酯萃取后，获得38.5g浅黄色粗提物，取少量(约5mg)用甲醇配成浓度为10mg/mL的粗提物，采用含毒培养基法(倒平板前将适量初提物溶液加到PDA培养基中)对西瓜枯萎病菌进行室内生物测定，同时，设定只加甲醇溶液的PDA对照，每处理重复4次。28℃，培养7d后，采用十字交叉法测定处理和对照的菌丝生长直径。表2所示，甲醇对照的菌丝生长直径为60mm左右，而初提物处理的菌丝生长直径均不超过35mm。说明初提物中某种活性物质抑制了西瓜枯萎病菌丝的生长。
表2 129C初提物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性
经三次柱层析分离，分离得到1012个流分。取不同流分段(浓度为1mg/mL)采用抑菌圈法对西瓜枯萎病菌分别进行室内生物测定，仅S331～432流分有活性，合并活性流分共5.8g。其中，S331流分抑菌圈直径达到11.2mm，S432流分抑菌圈直径达到12.4mm，抑菌圈边缘菌丝生长受到明显抑制。
高效液相色谱(HPLC)分析：首先，分析型高效液相色谱(HPLC)上柱的基本条件：根据S331～432流分样品的甲醇溶液的紫外扫描吸收光谱显示，在波长为215nm处样品的吸收值最大，因此高效液相检测系统选用紫外检测器。
流动相为甲醇：水＝55：45，选择的进样体积30μL，流速1.0mL/min，保留时间为40分钟。当保留时间为11min和16min时，有较高的吸收峰，可能是活性峰。但两个吸收峰附近均有杂质峰，因此，应该采用制备型高效液相色谱进行分析。其次，制备型高效液相色谱分离化合物采用乙腈：水：乙酸＝40：50：0.6为流动相，制备柱型号:Prep MSC18Column 10um,7.8×300mm，柱温:34.5℃，流速:6mL/min，保留时间40min的制备液相条件进行样品制备，当保留时间为14-18min时，有较高的吸收峰，为活性峰，可以制备出纯化物。共制备出420mg单体化合物，供后续GC-MS气相色谱-质谱联用分析。
GC-MS及纯化物的生物活性测定：色谱条件：所选用的色谱柱为：DB-1701石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；柱温为：80℃，保留时间为：1min，以15℃/min升温至100℃，保留时间1min，再以10℃/min升温至220℃，最后以5℃/min升温至280℃，并保持15min；载气为惰性气体：氦气，其纯度≥99.999％，流速为0.5mL/min；采用脉冲不分流进样方式；脉冲压力为200kPa，脉冲时间为0.75min。进样口温度230℃，进样量为1.0μL。
质谱条件：采用EI离子源，电离电压70eV；扫描范围m/z：20～250amu；四级杆温度150℃；离子源温度250℃；电子倍增器电压2300V；GC/MS接口温度280℃；标准质谱图库NIST08.L。
单体化合物通过GC-MS分析鉴定，质荷比m/z：210(M+，25)，195([M-CH3]+，40)，177([M-H2O-CH3]+，100)，未见单乙酰化产物(m/z：168)和三乙酰化产物(m/z：252)及间苯三酚(m/z：126)的分子离子峰。因为对应于分子量为210的O-乙酰化产物的分子离子峰为m/z：210[M]+和m/z：168[M-CH3CO]+及126[M-2(CH3CO)]+的碎片离子峰。而C-乙酰化产物由于其乙酰基中的C＝O与苯环中的C＝C共轭，它的碎片离子峰应分别为m/z：195[M-CH3]+和177[M-H2O-CH3]+。
经与NIST 08.L标准质谱图库进行比对检索，并结合有关文献和人工解析，将该化合物鉴定为2,4,-二乙酰基间苯三酚(2,4-Diacetyl phloroglucinol)，分子式为C10H10O5，分子量为210.181。
纯化物2,4,-二乙酰基间苯三酚的生物活性测定：采用菌丝生长速率法，测定了2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌XGW-1的生物活性(表3)。2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌的毒力回归方程Y＝1.188X+3.3208，其EC50和EC95分别为25.91μg/mL和622.16μg/mL，与对照生物防治药剂农抗120抗菌素的效果(EC50和EC95分别为25.22μg/mL和682.02μg/mL)相当；比对照化学药剂50％多菌灵可湿性粉剂的防治效果(EC50和EC95分别为13.44μg/mL和330.22μg/mL)要差。然而，该化合物分离于环境微生物样品，与环境的兼容性较好，因而具有较好的生防潜力。
表3纯化物2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌的拮抗活性
在步骤S105中，筛选和改造植物内生菌株，基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。将Fosmid文库中筛选到的pepks、unpks基因以质粒的形式在枯草芽孢杆菌YA-1中表达，在这之前需要选择在大肠杆菌和芽孢杆菌中穿梭质粒载体载体pWB980作为表达载体，同时分离西瓜内生芽孢杆菌YA-1，制成感受态细胞(异源表达株系)，作为该基因表达的宿主菌。直接效果就是：该功能基因在宿主菌中表达后，编码分泌出的活性产物--2,4,-二乙酰基间苯三酚对瓜类枯萎病菌有很好的抑菌活性。宿主菌株的分离与改造：分离1-2个西瓜内生菌株，制备该菌的感受态细胞，改造成异源表达株系。从健康的西瓜植株分离出1株内生菌株YA-1，并对其进行了形态鉴定。在LB固体培养基表面菌落为椭圆形或柱形，表面粗糙不透明，污白色到浅黄色，30℃温箱中培养1d后，用牙签挑起，能看到粘稠状菌脓；培养3d后，菌落表面能看到大量褶皱。据其在LB培养基上的生长表型，可以初步将其判定为芽孢杆菌属的一种。
YA-1生理生化测定结果表明：该菌能利用甘油、蛋白质、淀粉，革兰氏反应呈阳性，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，不能利用甘露糖、阿拉伯糖和甘露醇，能在7％NaCl胰胨水中生长。进一步验证为芽孢杆菌。
此外，对其进行了16S鉴定和系统进化发育分析。在EzTaxon数据库中进行有效种的序列相似性搜索，发现菌株YA-1与芽孢杆菌的菌株高度相关。在NCBI中比对发现：与菌株YA-1相似性最高的芽孢杆菌的有效种为Bacillus subtilis strain IHBB 1516(登录号：KF475836，相似性为100％)，其次为Bacillus subtilis strain ZJ-1(登录号：KC146707，相似性为99％)，说明菌株YA-1为芽孢杆菌中的一员。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析也显示菌株YA-1与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain IHBB 1516同在一个进化分支上，并且与枯草芽孢杆菌中其他有效种聚在一起，并落在它们之间。显然，菌株YA-1属于枯草芽孢杆菌中的成员。
高效异源表达体系构建：利用分离到的内生菌株YA-1，分别表达从Fosmid文库中筛选到的pepks基因和亚克隆文库筛选到的3-oxoacyl-ACP synthase基因：unpks，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。本研究采用质粒的形式在枯草芽孢杆菌中表达外源基因，选择在大肠杆菌和芽孢杆菌中穿梭质粒载体载体pWB980作为表达载体，该载体在枯草芽孢杆菌细胞内拷贝数高，同时该载体采用枯草芽胞杆菌胞苷脱氢酶(Cdd)基因的启动子P43作为外援基因表达的启动子，该启动子属于重叠启动子，能被两种σ因子识别，是一种组成型启动子，具有高效表达的特点。Fosmid文库筛选到的pepks基因序列经带有HindⅢ和kpnⅠ酶切位点的引物扩增后，经HindⅢ和kpnⅠ酶切后连接到pWB980载体的HindⅢ和kpnⅠ酶切位点处，经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达pepks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达15.3mm。通过盆栽实验证实抗病性达到71.38％，通过高效表达体系的分析，证明pepks基因对枯萎病的抗性达到71.38％，比Fosmid表达克隆129C的抑菌活性(63.09％)提高了8.29％，比相应的对照药剂农抗120抗菌素防治效果稍高(70.49％)，差异不显著。说明pepks基因对枯萎病抗性较好(表4)。
而亚克隆文库筛选到的unpks基因序列经带有EcoRⅠ和SphⅠ酶切位点的引物扩增后，经EcoRⅠ和SphⅠ酶切后连接到pWB980载体的EcoRⅠ和SphⅠ酶切位点处，同样经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达unpks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达13.1mm。通过盆栽实验证实抗病性达到60.98％，通过高效表达体系的分析，证明unpks基因对枯萎病的抗性达到60.98％，比Fosmid表达克隆142E的抑菌活性(53.28％)提高了7.7％说明unpks基因对枯萎病具有抗性(表4)。本发明所建立的高效表达体系可应用于枯萎病防治。
表4异源表达工程菌对西瓜枯萎病菌的防效
如图2所示，本发明提供的Fosmid文库构建方法包括以下步骤：
S201：采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
S202：末端修复宏基因组DNA后，胶回收23kb以上的片段，先将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
S303：连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
1.热带雨林土壤宏基因组Fosmid文库构建与特征分析
采集海南岛热带雨林土壤样品30份(五指山和尖峰岭土壤样品各15份)，50目筛孔过筛，去除树枝残根和大颗粒的石块后，-80℃保存备用。
1.1热带雨林土壤宏基因组Fosmid文库构建
采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA。每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA(图3A)。经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb，最大达到150kb左右(图3B)，说明提取的基因组DNA在纯度(经PVPP洗涤去腐植酸)和片段大小上(基因组DNA完整性)，均适合构建大的插入片段的宏基因组Fosmid文库。
末端修复宏基因组DNA后，胶回收23kb以上的片段。如图4，为防止DNA片段在紫外下长期照射，影响后续实验，先将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，然后将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段。然后，使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上。连接反应在2h内完成，一般情况下，连接反应时间的延长并不影响连接效果。连接效率高低主要取决于回收DNA的质量，其中，DNA片段的完整性时关键，如果在回收过程中DNA片段有机械损伤，造成DNA片段化，那么将直接影响到与载体的连接。采用溶胶酶法，不通过过柱，回收DNA片段，很好地保证了片段的完整性。
连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。最终，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
1.2宏基因组Fosmid文库特征分析
1.2.1文库中克隆阳性率检测
随机挑取18个Fosmid克隆，经初摇和诱导多拷贝之后，按照Fosmid DNA提取和纯化试剂盒(FosmidMAXTMDNA Purification Kit)上的使用说明提质粒。如图5所示，除了11和12号克隆由于操作过程中人为的打翻，没有提出质粒外，其他16个克隆质粒都有清晰的条带，且片段大小大于23kb，说明插入片段正常，文库的阳性率较高。
1.2.2文库插入片段大小检测
随机挑取14个Fosmid克隆，提质粒，用NotⅠ酶切进行酶切。如图6所示，所有克隆在6.5-9.4kb之间有一条8.2kb的载体条带，而插入片段则被消化成大小不一的多个片段，这可能是由于土壤微生物基因组DNA的G+C含量较高，各种酶切位点较多所致。通过叠加各泳道中除了载体带以外的条带，各插入片段至少在30kb以上。这也正好印证了λ包装提取物只包装40kb左右的外源插入片段的理论。
1.2.3克隆的稳定性检测
随机挑取了7个Fosmid克隆，取1mL继代培养1d和培养5d后，分别提质粒，然后用EcoRⅠ37℃酶切4h，结果培养1d和培养5d的质粒酶切条带基本一致(图7)。因此，可以断定外源插入片段没有出现丢失或重排的现象，如E号克隆的第100代和第0代在1.5kb-5kb之间均有相同的酶切条带。说明所构建的Fosmid文库是稳定的。
1.2.4文库包含物种多样性检测
158个末端随机测序结果中，有7个分别比对上厌氧粘细菌、拜叶林克氏菌、慢生根瘤菌、假单胞菌、沼泽红假单胞菌、大豆根瘤菌和尚未确定分类地位的细菌，占4.07％。其中，2个比对上假单胞菌属。无同源序列的克隆共151个，占到87.79％。这表明该宏基因组文库覆盖的微生物多样性极其丰富。其次，7个比对上同源序列的都是细菌序列，这可能是有两方面的原因，其一，细菌是该环境样品的优势菌群，其物种丰度远远高于古菌、真菌以及其他微生物；其二，间接提取DNA的方法得到细菌比例更大一些。此外由测序结果分析出该文库的空载率低为1.7％，随机性为98.1％。检测结果见表5。
表5宏基因组文库末端测序分析物种多样性。
成功得到了一个包含30624个克隆的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库Hnsfba，平均插入片段为36.5kb左右，库容量超过1Gb微生物基因组信息。经验证两个宏基因组文库插入效率和克隆的稳定性都较为理想。末端测序结果(表1)表明文库的插入片段大多数来源于未培养微生物基因组，随机性良好。有利于从不可培养热带雨林土壤微生物中筛选出抗瓜类枯萎病基因资源。
本发明实施例提供的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法包括：
(1)热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库的构建
采集海南热带雨林土壤，选取合适的DNA提取方法提取土样中的DNA，经脉冲电泳，溶胶酶法胶回收25-48kb大小的DNA片段，构建土壤微生物的宏基因组Fosmid表达文库，并对所构建的Fosmid文库质量和克隆的稳定性进行评价。
(2)基于Fosmid表达文库的抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定
分离、纯化培养西瓜枯萎病菌株，结合形态学观察和分子生物学手段鉴定该菌株，并通过多次温室盆栽试验，进行抗性鉴定，以确保该菌株为强致病力菌株；同时，通过抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，筛选Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆，采用GC-MS和四大光筛选谱鉴定活性产物。
(3)抗瓜类枯萎病活性产物基因(簇)的克隆与序列分析
提取Fosmid活性克隆DNA，构建亚克隆文库，并按照筛选活性Fosmid克隆的方法，获得有生物学活性的目的基因克隆并测序，并与Genbank中的序列进行比较，明确目的克隆基因的生物学地位。
(4)抗瓜类枯萎病药物合成基因(簇)异源高效表达体系的构建
将目的基因克隆首先在大肠杆菌中表达，利用亲和层析分离纯化该活性产物，与内容(2)所确认的活性产物进行比较，进一步确认该目的基因；筛选和改造植物内生菌株，将该基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系并探讨其产业化前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 海南省农业科学院植物保护研究所
<120> Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法
<160> 4
<210> 1
<211> 1641
<212> DNA
<213>功能基因pepks
<400> 核苷酸序列
ATGGCTGGCAAGGCAAGCTTCAACTGGATCGATCCACTGCTGCTCGATCAACAGCTCACCGAAGAAGAGCGCATGGTGCGCGACAGTGCTGAGCAGTTCGCCCAGGACAAGTTGGCCCCGCGTGTGCTCGAAGCCTTTCGCCATGAAAAGACCGACCCTGCTATTTTTCGCGAGATGGGCGAGACCGGTTTGCTCGGTGCGATGATCCCTGAGCAGTACGGTGGCAGCGGCTTGAATTACGTCAGCTATGGGTTGATCGCGCGCGAAGTGGAGCGTGTCGACTCCGGCTATCGCTCGATGATGAGTGTGCAGTCGTCACTGGTCATGGTGCCGATCAACGAGTTCGGCACTGAGGCACAGAAACAGAAGTACCTGCCGAAGCTGGCTTCTGGCGAATGGATTGGTTGTTTCGGCTTGACTGAGCCCAATCATGGCTCCGATCCGGGTGCGATGATCACTCGTGCTCGCAAGGTCGAGGGGGGTTATAGCCTGACGGGCGCGAAGATGTGGATCACCAATAGCCCGATCGCGGATGTGTTTGTGGTCTGGGGTAAGGACGATGCTGGCGATATTCGTGGGTTTGTCCTGGAGAAAGGCTGGAAGGGCCTGAGCGCTCCGGCGATTCATGGCAAGGTCGGGCTGCGCGCCTCCATCACCGGTGAAATCGTCATGGATAACGTGTTTGTTCCGGAAGAGAACATCTTTCCGGATGTGCGCGGTTTGAAGGGGCCCTTCACCTGCCTTAACTCGGCACGCTATGGCATCTCCTGGGGGGCGTTGGGGGCCGCCGAGTTTTGCTGGCATACCGCCCGCCAATACACGCTTGATCGCCATCAATTCGGCCGCCCATTGGCGGCGACCCAGTTGATCCAGAAGAAGCTGGCCGATATGCAGACTGAGATCACCCTGGCCCTGCAAGGTTGCCTGCGTTTGGGGCGGATGAAGGACGAAGGTACGGCGGCGGTTGAAATCACGTCGATCATGAAGCGCAACTCGTGTGGCAAGTCCCTGGATATCGCACGCATGGCGCGTGACATGCTGGGTGGCAACGGTATTTCCGACGAGTTCGGGGTGGCACGTCATCTGGTCAACCTGGAGGTGGTGAATACCTATGAAGGTACTCATGACGTGCATGCGCTGATTCTGGGGCGTGCGCAAACCGGTCTTCAGGCGTTCTATTAAATGAAACCGCTGCAACCCGATACATTGATTCACAACCCAACTGGCATGCCGGTGGTGGCCTCTGTCGTGGTCAACTGCGAGGCCATGCGACTGTGGGGGGTGGTGGGTCACTTTGCAGGCTTTGATGCCTTTATTCCGGCCCTGTCGCACATCGAAATGACGGGGGACGGCGTGGGCGCTTTGCGCACCAAGTTTTTCCACGATGGTCATCGCGTCGTGGAGCAACTCAATAGCCGGGACGAAGATGCCATGAGCATGACCTGGACAACGATCTATAACACGCTGGGCGTAGCTCGATTGTGGGCGGCGATGCGCGTGGAAGCACTCGGTTCAAGCGGTTCAAGGGCGACCTGGACGCTGATCGGCGAGCCAGCAGAAATGGCGCAGGCGGAGTTTGAACAGTTTGTACAAACATTCGCCGACAACGCTTTGGGAAATGTGCGCCATATGCTGGGTTGA
<210> 2
<211> 546
<212> PRT
<213>功能基因pepks
<400> 氨基酸序列
MAGKASFNWIDPLLLDQQLTEEERMVRDSAEQFAQDKLAPRVLEAFRHEKTDPAIFREMGETGLLGAMIPEQYGGSGLNYVSYGLIAREVERVDSGYRSMMSVQSSLVMVPINEFGTEAQKQKYLPKLASGEWIGCFGLTEPNHGSDPGAMITRARKVEGGYSLTGAKMWITNSPIADVFVVWGKDDAGDIRGFVLEKGWKGLSAPAIHGKVGLRASITGEIVMDNVFVPEENIFPDVRGLKGPFTCLNSARYGISWGALGAAEFCWHTARQYTLDRHQFGRPLAATQLIQKKLADMQTEITLALQGCLRLGRMKDEGTAAVEITSIMKRNSCGKSLDIARMARDMLGGNGISDEFGVARHLVNLEVVNTYEGTHDVHALILGRAQTGLQAFYKMKPLQPDTLIHNPTGMPVVASVVVNCEAMRLWGVVGHFAGFDAFIPALSHIEMTGDGVGALRTKFFHDGHRVVEQLNSRDEDAMSMTWTTIYNTLGVARLWAAMRVEALGSSGSRATWTLIGEPAEMAQAEFEQFVQTFADNALGNVRHMLG
<210> 3
<211> 1494
<212>DNA
<213>功能基因unpks-5
<400>核苷酸序列
AGCGCTTCCCGTTCCTGCCCGCCGACTTCGACGAGCGCTACTTCCAGTCCGCGCCGGCCGACCAGTGGACCGACCATCTGCGCGGCGGCGAGGAGGTCCTGCTGCTCAACCTCACCGGCGAGGAGCGCGCGGCCTTCCGCGTGCCGCGCAGGGAGGTCCCGGTGACCTTCTTCCTGAAAAAGGGTGGCCACGAAACCGCGCAGGCACGGATCGATACCCTGCTGGTGGACTGCGACGCCCGTCGCGTGGAAGTCACCTGGCGCATTCGCCGGCTGAATGAGCCAGGCCCTGAGCATCGTCGCCTCCGGCATGGTCAGCGCGGTCGGTCTCAGCGCGCCGGCCAGCTGAGCGCCGTTCGGTTCAGCTCTGTTCTACTGCTCGGTTGCTCGAGACATCTTCCACTGCGTCGCACGTTTGCTTCGAGATAGAGCTCAGCTGGAGTCACGCTCACGCTGCTCACTCTGCTGCTCACGACGTCTGCGCTCGCTATCGAGAAGGCGTAGTCAGACTCGTCGGACCTCTCTTGTAAGGACCTGCTGCTGTTGCTGTGCGTATCGGATGCTGTCAGCGGCATACTCTGCGTGTCGTTCGATGATTCTCACGTGCGTCTCGTGACAGCCTGTCTTCCTCCACTCGGCGTCCTCACTTCTGCACACTTCTACTGTGTCAGTGTCTATCTCTGTGCGACTCAGATACTCTACCTCTCGCTCATCGAGAGCTCACTTCATCACGTGCTCTACGCAGGCGTCGACTCCTTCGCCTGTCTCGCGTCGCAGACTCGCAACAACACTCTCTCTACTCACTACTCTATCTGTTCTTCGACTGTCTCATCTCTGTGACTCTTCTTGTTCTACCACGCTCTGCCTCTCCGACTCTGTATCTTGTGCGATCTCGCACATCGTCTACTTCAGCTACGTCTTCGAGTTGCCGACTGTCTAACTCTATCACGTGTCATCATCATCCGTATCACTCATCGAGCTCTACATCTCTACGCTCACTCACTCTCACTGTCATCTGTCGTTCCTGTCCTATCTCTACTTCGTCCATCGCTGCTTCACGCATCTACGCTTCCGGAATTCGGCAATTCCTCACTGCTTCACGCTACGTTCACACTCTACATCACCTGCACTCTTGGCCTATCAGCATATCATCCACCTTCCACTTGCTCACGTCTCTGTACCTCTCCTTCAGCGTCTCCACTCGGAGCTCATCTGTACCTGTGCTACATCTCTACACCACTGTCTGCTCCGCTACGTTGCCGGCTAACGCGCCGCCGGTCTGCTCCCTCATCGACTACTCTGCGCTGCCTGAATGGCCAACGAGGTGTACGCCAACAACATGGAGATCTCCTGCAAGGCGGCGAACGGCAAGTCCATCGCGGCCTTCCCGGATGTCTGCTTCACCCCGCCGCAGGCGCCGCCGACGCCGTTGGGGGTACCGATCCCCTACCCCAATACCGGCCTGTCCAAGGACACCACCAAAGGCACCCGGACC
<210> 4
<211> 346
<212> PRT
<213>功能基因unpks-5
<400> 氨基酸序列
MSQALSIVASGMVSAVGLSAPASCAPFGSALFYCSVARDIFHCVARLLRDRAQLESRSRCSLCCSRRLRSLSRRRSQTRRTSLVRTCCCCCAYRMLSAAYSACRSMIDESFLRDLEGELGRRFHPSSHTRPVSIPVRLRYSTSRSSRAHQITCSTQHSTPSPTSHHPLATTRSLLTHLSALRLSHLCPSSQSTTLRAAAVLVAAPLHEEAPQLLCISQTTLSHTTPHSEDLPLSRSTLLRSLHHTRICRSCPISTMDYRLTDIPQSGTRPFLTASRYFKEASLTLSRNLRVLKPKFDLLTSLYLSFSVSTRHPQVPTLPHIRTCCHSTHAGERAAALLSYRYSALK

Claims (8)

1.一种Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法包括：
(1)异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA；
(2)宏基因组Fosmid文库构建及质量检测；
(3)筛选宏基因组Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；
(4)萃取发酵液，获得较纯的活性层；获得纯化后的抗瓜类枯萎病活性物质；解析图谱，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；
(5)筛选和改造植物内生菌株，基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。
2.如权利要求1所述的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述(2)进一步包括：低熔点琼脂糖脉冲电泳后，切取25kb-48kb之间的条带，溶胶酶法回收DNA，连接，包装，转导入EPI300宿主细胞中，涂到含氯霉素的平板上，保菌克隆，保存至少30000个以上的克隆；同时，随机抽取文库中的克隆进行插入片段大小检测、克隆稳定性检测和文库中包含的微生物物种多样性检测。
3.如权利要求1所述的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述Fosmid文库构建方法包括以下步骤：
步骤一，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
步骤二，末端修复宏基因组DNA，胶回收23kb以上的片段，将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
步骤三，连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。
4.如权利要求3所述的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述步骤三中过夜培养，产生了100板，40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
5.如权利要求2所述的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述(3)Fosmid文库筛选，分离、纯化培养西瓜枯萎病菌株，结合形态学观察和分子生物学手段鉴定该菌株，并通过多次温室盆栽试验，进行抗性鉴定，以确保该菌株为强致病力菌株；通过抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，筛选Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆。
6.如权利要求2所述的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述(3)进一步包括：抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析，提取Fosmid活性克隆DNA，构建亚克隆文库，并按照筛选活性Fosmid克隆的方法，获得有生物学活性的目的基因克隆并测序，并与Genbank中的序列进行比较，明确目的克隆基因的生物学地位。
7.如权利要求1所述的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述Fosmid文库包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
8.如权利要求1所述的Fosmid文库抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定方法，其特征在于，所述Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
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