CN100439509C - 一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组dna和总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，包括将海洋沉积物用变性溶液处理，加入沙子振荡，加入蛋白酶和溶菌酶进行裂解，再加入SDS和PVPP溶液进行进一步裂解，加入萃取剂进行处理，萃取液用异丙醇沉淀，最后用核酸吸附树脂进行纯化。该方法特别适用于从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA，同时也可应用于陆地土壤样品，陆地湖泊沉积物样品中微生物宏基因组DNA和总RNA的共提取。
Description
技术领域
本发明涉及一种能从海洋沉积物中同时提取出微生物宏基因组DNA和总RNA的方法。
背景技术
海洋，尤其是深海极端环境中微生物资源的研究开发中存在的一个关键问题就是样品中可以人工培养的微生物种类较少，直接影响了资源研究开发的范围。以核酸物质为基础的分子生物学技术的应用克服了培养技术的限制，为研究开发海洋，尤其是深海极端环境提供了强有力的手段。但是海洋，尤其是深海环境样品中的微生物含量很少，现有技术中的DNA提取方法在操作过程中由于黏土对核酸物质的吸附，抽提过程中的降解与损失，酶类、抑制剂等杂质的共提取及纯化效率的高低都影响着所得到的核酸物质的质量，从而限制了研究开发的进行，因此有必要建立一种方法用于高效地提取海洋环境中，尤其是深海沉积物中微生物中的核酸物质。
许多实验方法已经描述了如何从土壤或湖泊沉积物中提取微生物宏基因组DNA(Wilson et al，1997；Leff et al.1995；Miller et al，1999)，也有商业用途的试剂盒，例如美国MBIO公司的UltracleanTM试剂盒，但这些方法都是针对生物量多或样品量多的样品，获得的DNA在大小，纯度方面有很多的区别，并且不能同时提取出微生物的DNA和RNA。而海洋，尤其是深海沉积物中生物量少，抑制剂成分复杂，而且样品获取不易。
参考文献：
Wilson IG(1997)Inhibition and facilitation of nucleic acid amplication.Appl.Environ.Microbiol.63：3741-3751
Leff LG，Dana JR et al.(1995)Comparison of methods of DNAextraction from stream sediments.Appl.Environm.Microbiol.61，1141-1143
Miller DN，Bryant JE et al(1999)Evaluation and optimization of DNAextraction and purification procedures for soil and sediment samples.Appl.Environ.Microbiol.65(11)：4715-4724
发明内容
本发明提供一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法。
本发明的目的在于提供一种与现有技术相比较更经济、简便、易行的方法，以从海洋沉积物中同时提取出高纯度，分子大小在30kb以上的微生物宏基因组DNA和总RNA。该方法同时也可以应用于陆地土壤样品，陆地湖泊沉积物样品中微生物宏基因组DNA和总RNA的共提取。
为实现上述目的，本发明所采用的操作步骤为：
(1)用变性溶液和沙子处理沉积物样品；
(2)向上述步骤(1)处理后的样品中加入核酸提取缓冲液和酶进行裂解；
(3)向上述步骤(2)的样品中加入SDS和PVPP溶液进行处理并离心得到上清液；
(4)重复上述步骤(2)，(3)两次，收集三次离心得到的上清液；
(5)向上述步骤(4)中的上清液中加入萃取剂进行处理并离心得到上层水相溶液；
(6)向上述步骤(5)中的水相溶液中加入异丙醇沉淀并离心去除上清液，所得沉淀用水重新溶解，得到核酸物质粗提液；
(7)向上述步骤(6)中的核酸物质粗提液中加入吸附树脂；
(8)洗脱吸附于树脂上的核酸物质并离心得到含有核酸物质的滤液；
(9)沉淀滤液中的DNA和RNA。若需要DNA，则在纯化后的溶液中加入RNAase处理，若需要RNA，则在纯化后的溶液中加入DNAase酶处理。上述步骤中所有的试剂和容器均经DEPC浸泡处理，或180℃烘干3h。
上述步骤(1)是指海洋沉积物采集后立即进行操作或于-80℃以下的温度中冷冻保存后进行提取，在0.5-5g样品(湿重)中加入1.5mL变性溶液，混合均匀，加入高温烘烤过(150-200℃，2-3h)的沙子，水平激烈振荡10-20min，加入15mL核酸提取缓冲液、蛋白酶K、溶菌酶，混合均匀后在30-37℃的条件下振荡30-50min。此步骤中，样品最好为液氮保存，沙子的最佳处理方式为180℃烘烤3h；
上述步骤(1)中的变性溶液是由四种成分组成的混合溶剂，这四种成分及其终浓度分别是4-6M异硫氰酸胍，10mM pH.0-8.0的Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA和0.5％2-巯基乙醇。
上述步骤(2)中的核酸提取缓冲液是包含六种成分的混合溶剂，这六种成分及其终浓度分别为100mM pH7.5的磷酸钠缓冲液；100mM pH7.0-8.0的Tris-HCl缓冲液；100mM pH 8.0的EDTA；1-2mMNaCl；1％CTAB和5-15％蔗糖。
上述步骤(2)中的酶包括终浓度为50μg/mL的蛋白酶K和终浓度为3-4mg/mL的溶菌酶，这两种酶是同时加入的。
上述步骤(5)中的萃取剂是由三种成分组成的混合溶剂，这三种成分及其在混合溶剂中所占的体积比例分别是50％pH4.0-5.0的水饱和酚，48％的氯仿和2％的异戊醇。
上述步骤(8)中的洗脱液是由40mM pH8.0-8.5的Tris-醋酸溶液和2mM pH8.0的EDTA溶液组成的混合溶剂。
在步骤(1)中，变性溶液中的成分及其终浓度分别为：4-6M异硫氰酸胍，10mM pH7.0-8.0Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA，0.5％2-巯基乙醇；最优化的终浓度条件为：4M异硫氰酸胍，10mM pH7.5Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA，0.5％2-巯基乙醇。
在步骤(2)中，核酸提取缓冲液中的成分及其终浓度分别为：100mM pH 7.5磷酸钠缓冲液，100mM pH7.5Tris-HCl缓冲液，100mMpH8.0EDTA，1-2M NaCl，1％CTAB，5-15％蔗糖溶液。最优化的终浓度条件为：1.5M NaCl和10％蔗糖溶液。
在步骤(1)，(2)中，最优化的条件为：每5g样品对应于1.5mL的变性溶液和15mL核酸提取缓冲液，蛋白酶K的终浓度为50μg/mL，溶菌酶的终浓度为3mg/mL，振荡温度为37℃，时间为30min。
在步骤(3)中，最优化的条件为加入每5g样品加入1.5mL含20％SDS和2％PVPP的溶液，水浴温度为65℃。
在步骤(4)中的重复提取过程最优化条件为每5g原始样品加入5mL核酸提取缓冲液和1mL 20％SDS溶液
在步骤(5)中的使用的苯酚的最佳pH值为4.5，抽提液与上清液的最适体积比为1∶1。
本发明中的提取方法的特性及优点是：
1)在步骤(1)中，在样品中先加入变性溶液再进行提取有利于保护RNA，同时变性剂pH值采用7.5，而不是一般采用的7.0能大大提高后续的细菌裂解效率。
2)加入沙子进行水平剧烈振荡，简化了一般采取的液氮冻融研磨的步骤，同时又保证了相同的提取效率。
3)在步骤(2)，DNA抽提缓冲液中加入10％蔗糖溶液能减少提取过程中对DNA分子的剪切，加入溶菌酶能保证最大限度地裂解沉积物中的微生物。
4)在提取过程中加入PVPP将有效去除沉积物中的腐殖酸等抑制剂，对于小于0.5g的样品，可以不经纯化，直接将粗核酸物质溶液应用于分子生物学操作。
具体实施方式：
实施例一：
1.海洋沉积物采集后于-80℃以下的温度中冷冻保存后进行提取；
2.在5g样品中加入1.5mL变性溶液(成分及终浓度为：4M异硫氰酸胍，10mM pH7.5Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA，0.5％2-巯基乙醇)，混合均匀，加入180℃高温烘烤3h的沙子，水平250r/min振荡20min。
3.加入15mL核酸提取缓冲液(成分及终浓度为：100mM pH7.5磷酸钠缓冲液，100mM pH7.5Tris-HCl缓冲液，100mM pH8.0EDTA，1.5M NaCl，1％CTAB，10％蔗糖溶液)；50μg/mL蛋白酶K、3mg/mL溶菌酶，混合均匀后在30-37℃的条件下200r/min振荡30-50min。
4.加入1.5mL含20％SDS和2％PVPP的溶液，65℃水浴中温育1h，每15min轻微地颠倒混匀数次，离心，将上清转移入新管。
5.往沉淀中加入5mL核酸提取缓冲液和1mL SDS溶液，于65℃水浴中温育10-15min，离心，将上清转移入新管。
6.重复步骤5一次。
7.收集三次离心的上清，加入1倍体积的萃取剂，内含体积比为50％pH4.5的水饱和苯酚，48％的氯仿和2％的异戊醇，充分混合均匀后在15000g下离心15-20min，吸取上层水相转移入新管。
8.往水相中加入等体积的混合溶液，内含96％的氯仿和4％的异戊醇，混匀，用相同条件离心，重复此步骤直至抽提液中的杂蛋白消失。
9.在上清中加入1/10倍体积的3M pH4.8醋酸钠和等体积的预冷的异丙醇，混匀后冰浴1h，在4℃，18000g下离心20min，去上清，用70％乙醇冲洗数次，吹干，加入1mL DEPC处理过的双蒸水，保存于-70℃中，即得粗核酸物质溶液。
10.将提取的溶液用商品化的RNA纯化树脂和吸附柱进行纯化。
11.若需要DNA，则在纯化后的溶液中加入RNAase处理，若需要RNA，则在纯化后的溶液中加入DNAase酶处理。
上述实施例中所有的试剂和容器均经DEPC浸泡处理，或180℃烘干3h。
其它实施例：
基本步骤与实施例一相同，不同之处在于：
1.步骤2变性溶液中的异硫氰酸胍浓度也可以采用5-6M，Tris-HCl缓冲液的pH也可以采用7.0或8.0；
2.步骤3核酸提取缓冲液中蔗糖浓度也可以采用5％或15％；
3.步骤7中萃取剂与上清液的体积比也可以采用0.6∶1或0.8∶1；
4.步骤7中萃取剂的pH值也可以采用5.0-6.0。
5.若所用样品小于0.5g，可不经步骤10的纯化直接应用。
6.步骤1中海洋沉积物收集后也可立刻进行操作。
Claims (6)
1.一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)用变性溶液和沙子处理沉积物样品；
(2)向上述步骤(1)处理后的样品中加入核酸提取缓冲液和酶进行裂解；
(3)向上述步骤(2)的样品中加入SDS和PVPP溶液进行处理并离心得到上清液；
(4)重复上述步骤(2)，(3)两次，收集三次离心得到的上清液；
(5)向上述步骤(4)中的上清液中加入萃取剂进行处理并离心得到上层水相溶液；
(6)向上述步骤(5)中的水相溶液中加入异丙醇沉淀并离心去除上清液，所得沉淀用水重新溶解，得到核酸物质粗提液；
(7)向上述步骤(6)中的核酸物质粗提液中加入吸附树脂；
(8)洗脱吸附于树脂上的核酸物质并离心得到含有核酸物质的滤液；
(9)沉淀滤液中的DNA和RNA。
2.如权利要求1所述的一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，其特征在于：其中步骤(1)中的变性溶液是由四种成分组成的混合溶剂，这四种成分及其终浓度分别是4-6M异硫氰酸胍，10mM pH.0-8.0的Tris-HCl缓冲液，1mMEDTA和0.5％2-巯基乙醇。
3.如权利要求1所述的一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，其特征在于：其中步骤(2)中的核酸提取缓冲液是包含六种成分的混合溶剂，这六种成分及其终浓度分别为100mM pH7.5的磷酸钠缓冲液；100mM pH7.0-8.0的Tris-HCl缓冲液；100mM pH 8.0的EDTA；1-2mM NaCl；1％CTAB和5-15％蔗糖。
4.如权利要求1所述的一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，其特征在于：其中步骤(2)中所加入的酶包括终浓度为50μg/mL的蛋白酶K和终浓度为3-4mg/mL的溶菌酶，这两种酶是同时加入的。
5.如权利要求1所述的一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，其特征在于：其中步骤(5)中的萃取剂是由三种成分组成的混合溶剂，这三种成分及其在混合溶剂中所占的体积比例分别是50％pH4.0-5.0的水饱和酚，48％的氯仿和2％的异戊醇。
6.如权利要求1所述的一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，其特征在于：其中步骤(8)中的洗脱液是由40mM pH8.0-8.5的Tris-醋酸溶液和2mM pH8.0的EDTA溶液组成的混合溶剂。
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