CN101591651A

CN101591651A - 棉粕发酵样品微生物总dna的提取方法

Info

Publication number: CN101591651A
Application number: CNA2009100995381A
Authority: CN
Inventors: 王新; 汤江武; 姚晓红; 吴逸飞
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-06-18
Filing date: 2009-06-18
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2029-06-18
Also published as: CN101591651B

Abstract

本发明公开了棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法，属于生物基因工程技术领域。该方法针对棉粕及其发酵产物中所含蛋白类、多糖类和酚类物质，在对微生物总DNA提取过程中及其后续分子操作中产生的不利影响，提出以脱色除酚类和反复抽提除蛋白质、多糖类物质，及微生物细胞温和破壁等关键技术组成的高质量提取微生物总DNA的方法。具有针对性强，简单易行，提取成本较低等特点，所获DNA可直接用于PCR扩增和酶切反应，为用分子生态学方法研究微生物发酵棉粕脱毒奠定了基础。本发明可用于有关棉粕综合开发技术研究单位或领域。

Description

棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及棉粕发酵样品中微生物总DNA的提取方法。

背景技术

棉粕是提取棉籽油后的副产品，一般含有33％～42％的粗蛋白质，是产量仅次于豆粕的植物蛋白质资源，但因棉粕含有对动物机体有毒害的游离棉酚，其利用价值和使用量就受到了极大的限制。采用微生物发酵的方法不仅可以对棉粕进行脱毒，还可以提高棉粕的蛋白质含量和营养价值，因而成为目前一项重要的技术。其中，发酵菌株的筛选和发酵条件的优化是微生物发酵棉粕脱毒技术中两个十分重要的方面。为消除棉粕中原位微生物的影响，目前大多在实验研究中采用将原棉粕进行高压灭菌的前处理，但高温前处理往往会大大降低棉粕中棉酚的含量；进而影响对高效菌株的筛选和对实际发酵效果的判断；并且在实际生产中，将会大大增加能耗。因此，无论在研究中或者在生产中，都希望原棉粕在进行微生物发酵前不经过高温处理，但在这种条件下的微生物发酵棉粕是包括棉粕中原位微生物在内的多种微生物共同作用的过程。由于微生物的多样性以及不可培养微生物的存在，研究棉粕发酵过程中微生物的作用过程和机制，微生物群落结构多样性及其演替规律，常规的培养方法显然已不能满足需要，新方法的介入是该领域研究的必然趋势。目前受到广泛应用的分子生态学技术可以很好的应用到微生物发酵棉粕的相关研究中，并解决当前面临的难题。

大多数用于微生物群落结构和多样性分析的分子生态学技术基于16S rDNA基因序列的多样性，所有技术关键的第一步在于从样品中提取足量的DNA，然后再进行后续的分析。对于环境样品来说，在DNA提取过程中为减少可能的微生物多样性的损失，目前多采用原位裂解微生物提取DNA的方法。由于环境样品的复杂性，不同的DNA提取方法获得的DNA质量差异很大，因而衍生了诸多的环境样品DNA的提取方法。棉粕及其发酵产物是一种特殊的样品，含有大量的蛋白类、多糖类和酚类等物质，使得对其中的微生物总DNA的提取极其困难，尤其是棉粕中含有的酚类物质对提取获得的DNA的后续分子操作有着严重的影响，然而目前国内外尚未有针对该类样品微生物总DNA提取的研究和方法。

发明内容

本发明目的是，针对棉粕及其发酵产物中所含有的蛋白类、多糖类和酚类物质在对微生物总DNA的提取过程中，以及尤其是酚类物质在对提取获得DNA的后续分子操作中所产生的不利影响，提出一种能简单、高质量提取棉粕发酵产物中微生物的总DNA，和该微生物总DNA不经纯化即可用于后续分子操作，以用于微生物发酵棉粕相关研究中的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法，该方法按以下步骤进行：

(1)称取棉粕发酵样品0.5-2g置于灭菌的10mL eppendoff管中，加入3-5mL^-1棉粕脱色缓冲液，在涡旋混合器上混合2-3min，37-45℃水浴10min，再涡旋混合2-3min，6000-9000×g离心10-15min，用移液枪吸弃去上清液；重复上述步骤2-5次直至上层液体颜色由褐色转为淡黄色；

(2)在步骤(1)的沉淀物中加入1-3mL棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液，再加入溶菌酶使其在提取混合物中的浓度为2-4mg·mL^-1，混匀后37℃水浴1.5-2h；随后加入十六烷基三甲基溴化胺(SDS)使其在提取混合物中的浓度为1％-2％，混匀后加入蛋白酶K，使其在提取混合物中的浓度为0.2-0.4mg·mL^-1，混匀后55℃水浴1-2h；水浴后在提取混合物中加入5mol·L^-1的NaCl溶液使其在提取混合物中的浓度为0.7-0.9mol·L^-1；

(3)在提取混合物中按体积比加入15％65℃预热的CTAB-NaCl溶液，混匀后65℃水浴20-30min；在混合物中再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后10000-14000×g离心10-15min，将上清液移入新的eppendoff管中；重复上述步骤2-3次，至离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；

(4)在装有上清液的eppendoff管中按体积比加入β-巯基乙醇使其浓度为2％；混匀后加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后10000-14000×g离心10-15min，将上清液移入新的eppendoff管中；在该管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后10000-14000×g离心10-15min，将上清液移入新的eppendoff管中，重复上述步骤2-3次，使离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；

(5)在步骤(4)上清液中加入0.6-0.8倍体积的4℃预冷的异丙醇，混匀后在4℃下放置0.5-1h，以10000-14000×g离心15-20min，弃去上清液；用70％的乙醇洗涤沉淀物2-3次后，用无菌风吹干，加入50-100μL含有1μg·mL^-1RNase的TE缓冲液溶解DNA，37℃水浴20-30min后移入1.5mLeppendoff管中，-20℃保存。

所述的棉粕脱色缓冲液配方用去离子水配制，成份为：50-100mmol·L^-1Tris-Cl，20-50mmol·L^-1 EDTA，100-300mmol·L^-1 NaCl，0.01-0.03g·mL^-1PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，0.01-0.03g·mL^-1 Na₂CO₃，此缓冲液的pH调为9.5-10.5。

所述的棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液配方用去离子水配制，成份为：50-100mmol·L^-1 Tris-Cl，20-50mmol·L^-1 EDTA，100-300mmol·L^-1 NaCl，0.01-0.02g·mL^-1 PVP，1-3％CTAB，此缓冲液的pH调为8.0。

所述的CTAB-NaCl溶液成份为：CTAB 10mg·mL^-1，NaCl 0.7mol·L^-1。

所述氯仿-异戊醇混合液的体积比为24∶1。

所述酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为25∶24∶1。

所述的异丙醇、氯仿、异戊醇质量分数均＞99％。

本发明的有益效果是：

在本发明中，根据棉粕发酵产物的成份和样品性质，设计出了先前处理脱色除去大部分酚类杂质，再进行微生物细胞温和破壁的提取，对于样品中大量含有的蛋白质类、多糖类物质，采用反复抽提进行处理的提取技术路线。因此，本发明具有以下几个明显的优点和积极效果：

(1)简单易行：本发明所述的DNA提取方法不需要较为昂贵、复杂的设备，仅需常规生物化学或微生物学实验室用具就能完成，涉及的试剂均为常规分析、分子生物学试剂，从相应的试剂公司即可以购得；

(2)针对性强：本发明提出的方法是针对棉粕及其发酵产物建立的，是专门用于棉粕及棉粕发酵产物中微生物总DNA提取的一种方法，而国内外尚未见有相关的报道；

(3)所获DNA可直接用于PCR扩增和酶切反应：本发明所述方法获得的微生物总DNA，A260/A230在1.5左右，A260/A280在1.4左右，提取获得的DNA不经纯化即可用于PCR扩增和酶切反应等后续的分子操作(见实施例4)。

综上所述，本发明提供了一种简单易行、经济的专用于提取棉粕及其发酵样品中微生物总DNA的方法，为用分子生态学方法研究微生物发酵棉粕脱毒奠定了基础。

附图说明

图1提取获得的棉粕发酵样品中微生物总DNA的琼脂糖凝胶电泳图

其中M为Lambda DNA/HindIII Marker，上样量6μL；1-7为不同量棉粕发酵样品提取的微生物总DNA，上样量5μL；数字为DNA的片段大小，单位为bp。

图2：以提取获得的棉粕发酵样品微生物总DNA为模版扩增获得细菌16S rDNA产物(所用引物为27F，1492R)的琼脂糖凝胶电泳图

其中M为DNA Marker-F，上样量5μL；1-5为BioReady rTaq扩增的16SrDNA产物，6-10为Takara EXTaq扩增的16S rDNA产物；11为E.coli阳性对照；12为阴性对照，上样量5μL；数字为DNA的片段大小，单位为bp。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但应该理解本发明并不受以下内容所限制。

Tris饱和酚：购自上海生工生物工程技术服务有限公司；

异丙醇、氯仿、异戊醇：均购自国药集团化学试剂有限公司，质量分数＞99％。

实施例1：(棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法1)

(1)称取棉粕发酵样品0.5g置于灭菌的10mL eppendoff管中，加入3mL^-1棉粕脱色缓冲液，在涡旋混合器上混合2min，37℃水浴10min，再涡旋混合2min，9000×g离心10min，用移液枪吸去上清液；重复上述步骤3次直至上层液体颜色由褐色转为淡黄色为止，弃去上层液体，保留沉淀物；

所述的棉粕脱色缓冲液用去离子水配制，成份为：50mmol·L^-1 Tris-Cl，50mmol·L^-1 EDTA，300mmol·L^-1 NaCl，0.01g·mL^-1 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，0.01g·mL^-1Na₂CO₃，并调pH为9.5。

(2)在步骤(1)的沉淀物中加入1mL棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液，再加入40μL浓度为50mg·mL^-1的溶菌酶，使其在提取混合物中的浓度为2mg·mL^-1，混匀后37℃水浴1.5h；随后加入100μL10％(w/v)的十六烷基三甲基溴化胺(SDS)溶液，使其在提取混合物中的浓度为1％，混匀后加入10μL浓度为20mg·mL^-1的蛋白酶K，使其在提取混合物中的浓度为0.2mg·mL^-1，混匀后55℃水浴1h；水浴后在提取混合物中加入150μL浓度为5mol·L^-1的NaCl溶液，使其在提取混合物中的浓度为0.7mol.L^-1；

所述的棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液用去离子水配制，成份为：50mmol·L^-1 Tris-Cl，50mmol·L^-1 EDTA，300mmol·L^-1 NaCl，0.01g·mL^-1 PVP，1％CTAB，并调pH为8.0。

(3)在提取混合物中加入15％(v/v)65℃预热的CTAB-NaCl溶液，混匀后65℃水浴20min；在提取混合物中再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后14000×g离心10min，将上清液移入新的eppendoff管中；重复上述步骤2次，使离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；

本例中所述的CTAB-NaCl溶液成份为：CTAB 10mg·mL^-1，NaCl 0.7mol·L^-1；

本例中所述的氯仿-异戊醇混合液的体积比为24∶1；

(4)在装有上清液的新的eppendoff管中按体积加入20μL β-巯基乙醇，使其浓度为2％；混匀后加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后14000×g离心10min，将上清液移入新的eppendoff管中；在该管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后放置3min，14000×g离心10min，将上清液移入新的eppendoff管中；重复上述步骤2次，使离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；

本例中所述酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为25∶24∶1；

(5)在上述上清液中加入0.6倍体积的4℃预冷的异丙醇，混匀后在4℃下放置1h，以14000×g离心20min，弃去上清液，保留沉淀的DNA；用70％的乙醇洗涤沉淀物2次，将沉淀物在洁净工作台用无菌风吹干，加入50μL含有1μg·mL^-1RNase的TE缓冲液溶解DNA，37℃水浴20min后移入1.5mL eppendoff管中，-20℃保存。

上述DNA提取结果用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如图1中泳道1-2所示，获得了在23kbp左右的微生物基因组DNA。

实施例2：(棉粕发酵样品微生物DNA的提取方法2)

(1)称取棉粕发酵样品1g置于灭菌的10mL eppendoff管中，加入4mL^-1棉粕脱色缓冲液，在涡旋混合器上混合3min，40℃水浴10min，再涡旋混合2min，8000×g离心15min，用移液枪吸去上清液；重复上述步骤2次直至上层液体颜色由褐色转为淡黄色为止，离心后弃去上层液体，保留沉淀物；

所述的棉粕脱色缓冲液用去离子水配制，成份为：75mmol·L^-1 Tris-Cl，35mmol·L^-1 EDTA，200mmol·L^-1 NaCl，0.02g·mL^-1PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，0.02g·mL^-1Na₂CO₃，并调pH为10。

(2)在eppendoff管中加入2mL棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液，然后加入80μL浓度为50mg·mL^-1的溶菌酶，使管中溶菌酶的浓度为2mg·mL^-1，在涡旋混合器上混合2min，然后在37℃水浴1.5h；水浴完成后向管中加入300μL10％(w/v)的十六烷基三甲基溴化胺(SDS)溶液，使其在管中的浓度为1.5％(w/v)，晃动离心管混合均匀，然后加入30μL浓度为20mg·mL^-1的蛋白酶K，使其在管中的浓度为0.3mg·mL^-1，在涡旋混合器上混合1min后在55℃水浴1h；水浴完成后在管中加入350μL浓度为5mol·L^-1的NaCl溶液，使管中NaCl的浓度约为0.8mol·L^-1。

所述的棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液用去离子水配制，成份为：75mmol·L^-1 Tris-Cl，35mmol·L^-1EDTA，200mmol·L^-1 NaCl，0.015g·mL^-1PVP，2％CTAB，并调pH为8。

(3)在提取混合物中加入15％(v/v)预热的CTAB-NaCl溶液，混合均匀后在65℃水浴25min，随后在管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀后12000×g离心10min，将上层液移入新的灭菌的eppendoff管中；重复上述步骤2次，离心后eppendoff管中液相和有机相之间已没有可见的沉淀物；

本例中所述的CTAB-NaCl溶液成份为：CTAB 10mg·mL^-1，NaCl 0.7mol·L^-1。

本例中所述的氯仿-异戊醇混合液的体积比为24∶1。

(4)向装有上清液的新的eppendoff管中加入40μLβ-巯基乙醇使其在管中的浓度约2％(v/v)，混合均匀后加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混合后12000×g离心10min，将上层液移入新的灭菌的eppendoff管中，并加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀后放置3min，以12000×g离心10min，将上清液移入新的eppendoff管中，重复上述步骤2次，离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；

本例中所述酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为25∶24∶1。

(5)向eppendoff管中加入0.7倍体积的4℃预冷的异丙醇，混合均匀后在4℃放置0.7h，随后在4℃，12000×g下离心15min，弃去上清液，保留沉淀的DNA；用70％的乙醇洗涤沉淀物2次，将沉淀物在洁净工作台用无菌风吹干，加入80μL含有1μg·mL^-1RNase的TE缓冲液，待DNA溶解后在37℃水浴20min后移入1.5mL eppendoff管中，-20℃保存。

DNA提取结果用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如图1中泳道4-5所示，获得了在23kbp左右的微生物基因组DNA。

实施例3：(棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法3)

(1)称取棉粕发酵样品2g于灭菌的10mL eppendoff管，加入5mL棉粕脱色缓冲液，在涡旋混合器上混合3min，置于45℃水浴15min，再用涡旋混合器上混合2min，6000×g离心15min，用移液枪吸去上层液体，重复上述步骤5次后上清液颜色变较淡，离心后弃去上层液体，保留沉淀；

棉粕脱色缓冲液用去离子水配制，成份为为：100mmol·L^-1 Tris-Cl，20mmol·L^-1 EDTA，100mmol·L^-1 NaCl，0.03g·mL^-1 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，0.03g·mL^-1Na₂CO₃，并调pH为10.5。

(2)在eppendoff管中加入2mL棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液，然后加入80μL浓度为50mg·mL^-1的溶菌酶，使管中溶菌酶的浓度为2mg·mL^-1，在涡旋混合器上混合3min，然后在37℃水浴1.5h，再向管中加入400μL 10％(w/v)的十六烷基三甲基溴化胺(SDS)溶液，使其在管中的浓度为2％(w/v)，混合均匀后加入35μL浓度为20mg·mL^-1的蛋白酶K，使其在管中的浓度为0.4mg·mL^-1，在涡旋混合器上混合2min后，55℃水浴1h，在管中加入450μL浓度为5mol·L^-1的NaCl溶液，使管中NaCl的浓度为0.9mol·L^-1。

所述的棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液用去离子水配制，成份为：100mmol·L^-1 Tris-Cl，20mmol·L^-1 EDTA，100mmol·L^-1 NaCl，0.02g·mL^-1 PVP，3％CTAB，并调pH为8.0。

(3)在提取混合物中加入15％(v/v)预热的CTAB-NaCl溶液，混合均匀后在65℃水浴30min，在管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀后10000×g离心15min，将上层液移入新的灭菌的eppendoff管中；重复上述步骤3次，离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有可见的沉淀物；

本例中所述的氯仿-异戊醇混合液的体积比为24∶1。

(4)向装有上清液的新的eppendoff管中加入45μL β-巯基乙醇使其在管中的浓度为2％(v/v)，混匀后加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后10000×g离心15min，将上层液移入新的灭菌的eppendoff管中，并加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后放置3min，以10000×g离心15min，将上清液移入新的eppendoff管中，重复上述步骤3次，离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；

本例中所述酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为25∶24∶1。

(5)向eppendoff管中加入0.8倍体积的4℃预冷的异丙醇，混合均匀后在4℃放置0.5h，随后在4℃，10000×g下离心15min，弃去上清夜，保留沉淀的DNA；用70％的乙醇洗涤沉淀物2次，将沉淀物在洁净工作台用无菌风吹干，加入100μL含有1μg·mL^-1RNase的TE缓冲液，待DNA溶解后在37℃水浴30min后移入1.5mL eppendoff管中，-20℃保存。

DNA提取结果用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如图1中泳道3，6-7所示，获得了在23kbp左右的微生物基因组DNA。

实施例4：(棉粕发酵样品微生物总DNA的16S rDNA的PCR扩增)

为检测获得的DNA样品中杂质对PCR扩增的影响，采用细菌的16S rDNA的特异性引物，分别用BioReady rTaq DNA聚合酶(博士德公司)和Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)进行PCR扩增。16S rDNA的引物27F序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(E.coli bases 8to 27)，引物1492R序列为：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(E.coli bases1507to 1492)。PCR扩增体系为25μL，包括：10×缓冲液2.5μL(含有15mmol·L^-1的Mg2⁺)；dNTP(10mmol·L^-1)0.5μL；引物27F、1492R(10μmol·L^-1)各0.4μL；BSA(牛血清白蛋白)(1mg·mL^-1)1μL；DNA模板约30ng，为实施例1-3中提取获得的DNA，对应电泳图1中的1-5号样品；BioReady rTaq DNA聚合酶1U或Ex TaqDNA聚合酶0.75U；用ddH2O补至25μl。反应条件：95℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸8min。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示，泳道1-5为BioReadyrTaq扩增的16S rDNA产物，6-10为Takara EXTaq扩增的16S rDNA产物；11为E.coli阳性对照；12为阴性对照，上样量为5μL；均获得了1500bp的目的片段。

Claims

1、棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)称取棉粕发酵样品0.5-2g置于灭菌的10mL eppendoff管中，加入3-5mL^-1棉粕脱色缓冲液，在涡旋混合器上混合2-3min，37-45℃水浴10min，再涡旋混合2-3min，6000-9000×g离心10-15min，用移液枪吸去上清液；重复上述步骤2-5次直至上层液体颜色由褐色转为淡黄色；

(2)在步骤(1)的沉淀物中加入1-3mL棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液，再加入溶菌酶使其在提取混合物中的浓度为2-4mg·mL^-1，混匀后37℃水浴1.5-2h；随后加入十六烷基三甲基溴化胺使其在提取混合物中的浓度为1％-2％，混匀后加入蛋白酶K，使其在提取混合物中的浓度为0.2-0.4mg·mL^-1，混匀后55℃水浴1-2h；水浴后在提取混合物中加入5mol·L^-1的NaCl溶液使其在提取混合物中的浓度为0.7-0.9mol·L^-1；

2、按权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的棉粕脱色缓冲液用去离子水配制，成份为：50-100mmol·L^-1 Tris-Cl，20-50mmol·L^-1 EDTA，100-300mmol·L^-1 NaCl，0.01-0.03g·mL^-1 PVP，0.01-0.03g·mL^-1 Na₂CO₃，此缓冲液的pH调为9.5-10.5。

3、按权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液用去离子水配制，成份为：50-100mmol·L^-1 Tris-Cl，20-50mmol·L^-1 EDTA，100-300mmol·L^-1 NaCl，0.01-0.02g·mL^-1 PVP，1-3％CTAB，此缓冲液的pH调为8.0。