CN104762296B - 提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物dna的方法及其成套试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的方法及其成套试剂。本发明所提供的方法，包括下述步骤S1)和S2)：S1)用洗脱液洗下物料上的微生物，得到微生物洗脱液，除去所述微生物洗脱液中的杂质，得到所述微生物；S2)提取所述微生物的DNA得到所述微生物DNA；所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为9.0g/L氯化钠、0.12g/L氯化钾、0.24g/L氯化钙、0.2g/L碳酸氢钠和0.15g/L磷酸二氢钾。实验证明，本发明的提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的方法及其成套试剂可以用来提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA。

Description

提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的方法及其成套 试剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域中提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的方法及其成套试剂。

背景技术

厌氧发酵产甲烷过程的本质是由多个微生物群协同作用将复杂的木质纤维素不断分解直至生产甲烷和二氧化碳。近年来，随着天然气能源短缺和雾霾污染的日益加剧，生物天然气(甲烷含量大于95％的沼气)的低成本、清洁环保、可持续性等优点逐渐显现，木质纤维素物料产甲烷工艺开始向规模化、产业化和工业化方向发展。定性和定量认识厌氧发酵过程中各功能微生物群的多样性和生长繁殖规律对于优化发酵工艺、提高产甲烷效率具有重要意义。DGGE、Q-PCR、高通量测序等分子生物学技术为准确获知发酵物料中各类微生物群的生长动态提供了理想途径，而发酵物料微生物群落总DNA的提取质量会直接关系到后续分子生物学技术分析结果的客观性和准确性。

目前厌氧发酵物料中微生物总DNA提取方法有SDS(十二烷基磺酸钠)法、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS-CTAB结合法以及各生物技术公司推出的功能性试剂盒法。传统的SDS法、CTAB法和SDS-CTAB结合法尽管所提取的总DNA质量和纯度均较高，但难以有效获取吸附在木质纤维素表面的微生物DNA，导致部分关键微生物群信息的缺失，且一次性提取的样本数量少。土壤、淤泥、粪便等功能性试剂盒法由于专一性强、快速便捷、一次提取样本量大等优点，但对于腐殖酸和杂蛋白含量较高的木质纤维素厌氧发酵物料而言，该方法的除杂能力有限，所提取的微生物总DNA纯度较差；另外，该方法一次提取总DNA所需的样品质量很少(0.3-0.5g)，所提取的微生物总DNA浓度也较低。目前大多数方法都难以针对木质纤维素物料获得纯度和浓度均较高的微生物总DNA，急需一种针对木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA提取的成熟方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了提取发酵物料中的微生物DNA的方法。

本发明所提供的提取发酵物料中的微生物DNA的方法，包括下述步骤S1)和S2)：

S1)用洗脱液洗下物料上的微生物，得到微生物洗脱液，除去所述微生物洗脱液中的杂质，得到所述微生物；

S2)提取所述微生物的DNA得到所述微生物DNA；

所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为8-10g/L氯化钠、0.1g-0.2/L氯化钾、0.2-0.3g/L氯化钙、0.1g-0.3/L碳酸氢钠和0.1-0.2g/L磷酸二氢钾。所述8-10g/L氯化钠具体可为9.0g/L氯化钠。所述0.1g-0.2/L氯化钾具体可为0.12g/L氯化钾。所述0.2-0.3g/L氯化钙具体可为0.24g/L氯化钙。所述0.1g-0.3/L碳酸氢钠具体可为0.2g/L碳酸氢钠。所述0.1-0.2g/L磷酸二氢钾具体可为0.15g/L磷酸二氢钾。

上述方法中，所述洗脱液的体积为所述物料体积的2-3倍。所述2-3倍具体可为3倍。

上述方法中，所述除去所述微生物洗脱液中的杂质包括以下步骤：将所述微生物洗脱液进行离心，使微生物进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀命名为沉淀A1；向所述沉淀A1中加入稳定剂，得到微生物-稳定剂混合液；除去所述微生物-稳定剂混合液中的杂质，得到所述微生物；

所述稳定剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为5-7mMTris-HCl和2-4mM乙二胺四乙酸，所述稳定剂的pH为7.5-8.5。所述5-7mM Tris-HCl具体可为6mM Tris-HCl。所述2-4mM乙二胺四乙酸具体可为3mM乙二胺四乙酸。所述pH具体可为8.0。

上述方法中，所述稳定剂的体积为所述沉淀A1体积的2-3倍。所述2-3倍具体可为3倍。

上述方法中，所述除去所述微生物-稳定剂混合液中的杂质包括以下步骤：将所述微生物-稳定剂混合液进行离心，使微生物进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀命名为沉淀A2；向所述沉淀A2中加入洗涤液，得到微生物-洗涤液混合液；除去所述微生物-洗涤液混合液中的杂质，得到所述微生物；

所述洗涤液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为50-70mMTris-HCl、10-20mM EDTA、5.5-6.0g/L NaCl和10-20g/L PVP-40，所述洗涤液的pH为7.5-8.5。所述50-70mM Tris-HCl具体可为60mM Tris-HCl。所述10-20mM EDTA具体可为15mMEDTA。所述5.5-6.0g/L NaCl具体可为5.8g/L NaCl。所述10-20g/LPVP-40具体可为15g/LPVP-40。所述pH具体可为8.0。

上述方法中，所述洗涤液的体积为所述沉淀A2体积的2-3倍。所述2-3倍具体可为3倍。

上述方法中，所述S2)包括向所述微生物中加入成套裂解试剂，得到微生物裂解液；除去所述微生物裂解液中的杂质，得到所述微生物DNA；

所述成套裂解试剂由SDS裂解液、蛋白酶K、溶菌酶、纤维素酶、木聚糖酶和GuSCN溶液组成；所述SDS裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度分别为90-110mM Tris-HCl、30-50mM EDTA、7-7.5g/500mL NaCl、15-25g/500mL SDS和5-15g/500mL PVP-40，所述SDS裂解液的pH为7.5-8.5；所述GuSCN溶液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度分别为90-110mMTris-HCl和55-65g/100mL异硫氰酸胍，所述GuSCN溶液的pH为6.0-6.5。

所述90-110mM Tris-HCl具体可为100mM Tris-HCl。所述30-50mM EDTA具体可为40mM EDTA。所述7-7.5g/500mL NaCl具体可为7.305g/500mL NaCl。所述15-25g/500mL SDS具体可为20g/500mL SDS。所述5-15g/500mL PVP-40具体可为10g/500mL PVP-40。所述55-65g/100mL异硫氰酸胍具体可为59.08g/100mL异硫氰酸胍。所述SDS裂解液的pH具体可为8.0。所述GuSCN溶液的pH具体可为6.2-6.4，如6.3。

上述方法中，所述SDS裂解液的体积为所述微生物体积的1-2倍。所述1-2倍具体可为2倍。所述成套裂解试剂中，所述蛋白酶K、所述溶菌酶、所述纤维素酶、所述木聚糖酶和所述GuSCN溶液的比例可为3U:5mg:0.045U:0.0375U:200μL。

上述方法中，所述稳定剂、所述洗涤液、所述SDS裂解液和所述GuSCN溶液均为无菌溶液。

为解决上述技术问题，本发明还提供了提取微生物DNA的成套试剂。

本发明所提供的提取微生物DNA的成套试剂，包括所述成套裂解试剂、所述洗脱液、所述稳定剂和所述洗涤液这四种试剂中的四种、任三种或任两种。

上述成套试剂中，所述稳定剂、所述洗涤液、所述SDS裂解液和所述GuSCN溶液均为无菌溶液。

上述成套试剂中，所述洗脱液、所述稳定剂、所述洗涤液和所述成套裂解试剂是在提取微生物DNA的不同步骤中使用的。

上述成套试剂中，所述成套试剂可只由所述洗脱液、所述稳定剂、所述洗涤液和所述成套裂解试剂构成。所述成套试剂还可包括3M醋酸钠无菌溶液、10％(质量百分比浓度)的PEG8000无菌溶液、CTAB裂解液、溶液A和70％(体积百分比浓度)乙醇水溶液这五种溶液中的五种、任四种、任三种、任两种或任一种。

所述3M醋酸钠无菌溶液的配制方法为：将123.045g醋酸钠溶于450mL去离子水后，再加入25mL冰醋酸，混匀后定容至500mL，121℃灭菌15min，得到所述3M醋酸钠无菌溶液；

所述10％(质量百分比浓度)的PEG8000无菌溶液的配制方法为：将50g PEG8000和70.128g NaCl充分溶于去离子水后，定容至1L，121℃灭菌15min，得到所述10％的PEG8000无菌溶液；

所述CTAB裂解液的配制方法为：向400mL去离子水中加入50mL 1M Tris-HCl(pH为8.0)、20mL 0.5M EDTA(pH为8.0)、40.908g NaCl、10g CTAB和10g PVP-40，充分溶解后，定容至500mL，121℃灭菌15min，得到所述CTAB裂解液；

所述溶液A由氯仿和异戊醇组成，所述溶液A中所述氯仿和所述异戊醇的体积比为24:1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套裂解试剂或所述洗脱液。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1或X2的应用：

X1、所述成套试剂、所述成套裂解试剂、所述洗脱液、所述稳定剂或所述洗涤液在提取发酵物料中的微生物DNA中的应用；

X2、所述方法在提取发酵物料中的微生物DNA中的应用。

本发明中，所述所述微生物为吸附在发酵物料上的微生物。

本发明中，所述发酵物料为含木质纤维素的物质经过发酵得到的发酵产物；所述木质纤维素为木质素和/或纤维素和/或半纤维素。所述发酵可为厌氧发酵。

本发明中，所述发酵物料具体可为食草动物的粪便和/或植物全株和/或植物的茎秆经过发酵得到的发酵物。

所述发酵物料的腐殖酸含量可为0.5％-2％(质量百分含量)。所述0.5％-2％具体可为1.6％(质量百分含量)。所述发酵物料的蛋白质含量可为10％-15％(质量百分含量)。所述10％-15％具体可为13％(质量百分含量)。

在本发明的一个实施例中，所述发酵物料为木质纤维素厌氧发酵物料①、木质纤维素厌氧发酵物料②和木质纤维素厌氧发酵物料③。

所述木质纤维素厌氧发酵物料①为将牛粪和玉米秸秆混合后进行厌氧发酵得到的物料。其中，所述牛粪和玉米秸秆可按照任意的质量比混合，如1:1。所述木质纤维素厌氧发酵物料①的制备方法可为将牛粪和玉米秸秆按照1:1的质量比混合得到厌氧发酵原料①，向该厌氧发酵原料①中加水将其含水量调至85％，在带有硅胶塞和出气口的厌氧发酵瓶中温度为30-35℃的环境中静置发酵30天，得到木质纤维素厌氧发酵物料①。

所述木质纤维素厌氧发酵物料②为将玉米秸秆进行厌氧发酵得到的物料。所述木质纤维素厌氧发酵物料②的制备方法可为向玉米秸秆(即厌氧发酵原料②)中加水将其含水量调至90％，在带有硅胶塞和出气口的厌氧发酵瓶中温度为30-35℃的环境中静置发酵15天，得到木质纤维素厌氧发酵物料②。

所述木质纤维素厌氧发酵物料③为将柳枝稷茎秆进行厌氧发酵得到的物料。所述木质纤维素厌氧发酵物料③的制备方法可为向柳枝稷茎秆(即厌氧发酵原料③)中加水将其含水量调至94％，在带有硅胶塞和出气口的厌氧发酵瓶中装料温度为30-35℃的环境中静置发酵10天，得到木质纤维素厌氧发酵物料③。

本发明中，所述离心均在4℃进行。

本发明中，所述蛋白酶K具体可为Sigma-Aldrich产品，产品目录号为V900887；所述溶菌酶具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为RT401；所述纤维素酶具体可为Sigma-Aldrich产品，产品目录号为C1184；所述木聚糖酶具体可为Sigma-Aldrich产品，产品目录号为X2753。

实验证明，本发明的提取发酵物料中的微生物DNA的方法(提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA方法，LCEW法)和提取微生物DNA的成套试剂提取得到的木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA浓度高，纯度高，质量好且稳定，并且可以用来进行进一步的分析：本发明的LCEW法和提取微生物DNA的成套试剂得到的DNA的电泳条带单一干净，无弥散和拖尾现象，浓度可达170±25ng/μL，A260/A280可达1.8±0.2，A260/A230可达1.7±0.1，并可用作PCR的模板。

实验证明，本发明的提取发酵物料中的微生物DNA的方法(提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA方法，LCEW法)和提取微生物DNA的成套试剂可以提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA的电泳条带均单一明亮、干净、无拖尾和弥散现象，浓度和纯度均较好，浓度可达160±40ng/μL，A260/A280可达1.8±0.2，A260/A230可达1.7±0.1，且不同物料的微生物DNA之间的差异不大，稳定性好，且均可用来进行下一步的分析。

实验证明，本发明的提取发酵物料中的微生物DNA的方法(提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA方法，LCEW法)和提取微生物DNA的成套试剂可以用来提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA。

附图说明

图1为不同方法提取的DNA的检测结果。其中，图a为琼脂糖凝胶电泳定性检测不同方法提取的DNA，1为CTAB法得到的DNA，2为SDS-CTAB法得到的DNA，3为粪便试剂盒法得到的DNA，4为LCEW法得到的DNA；图b为分别以不同方法提取的DNA为模板扩增细菌16S rRNA基因的琼脂糖电泳检测结果，1为CTAB法得到的DNA，2为SDS-CTAB法得到的DNA，3为粪便试剂盒法得到的DNA，M为DNA分子量Marker，4为LCEW法得到的DNA。

图2为LCEW法得到的不同物料微生物DNA的检测结果。其中，图a为琼脂糖凝胶电泳定性检测LCEW法得到的不同物料微生物DNA，1为发酵30d、含固率为15％的牛粪和玉米秸秆混合发酵物(即物料①)，2为发酵15d、含固率为10％的玉米秸秆发酵物(即物料②)，3为发酵10d、含固率为6％的柳枝稷发酵物(即物料③)；图b为分别以LCEW法得到的不同物料微生物DNA为模板扩增细菌16S rRNA基因的琼脂糖电泳检测结果，1为发酵30d、含固率为15％的牛粪和玉米秸秆混合发酵物(即物料①)，2为发酵15d、含固率为10％的玉米秸秆发酵物(即物料②)，3为发酵10d、含固率为6％的柳枝稷发酵物(即物料③)，M为DNA分子量Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的蛋白酶K为Sigma-Aldrich产品，产品目录号为V900887，酶活≥30U/mg；溶菌酶为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为RT401，浓度为50mg/mL；纤维素酶为Sigma-Aldrich产品，产品目录号为C1184，酶活为0.3U/mg；木聚糖酶为Sigma-Aldrich产品，产品目录号为X2753，酶活为0.25U/mg。

下述实施例中的3M醋酸钠无菌溶液的配制方法为：将123.045g醋酸钠溶于450mL去离子水后，再加入25mL冰醋酸，混匀后定容至500mL，121℃灭菌15min，得到3M醋酸钠无菌溶液。

下述实施例中的10％(质量百分比浓度)的PEG8000无菌溶液的配制方法为：将50gPEG8000和70.128g NaCl充分溶于去离子水后，定容至1L，121℃灭菌15min，得到10％的PEG8000无菌溶液。

下述实施例中的CTAB裂解液的配制方法为：向400mL去离子水中加入50mL 1MTris-HCl(pH为8.0)、20mL 0.5M EDTA(pH为8.0)、40.908g NaCl、10g CTAB和10g PVP-40，充分溶解后，定容至500mL，121℃灭菌15min，得到CTAB裂解液。

下述实施例中的离心均在4℃进行。

下述实施例中的发酵物料有以下三种：

1、木质纤维素厌氧发酵物料①(以下简称物料①)，其制备方法为将牛粪和玉米秸秆按照1:1的质量比混合得到厌氧发酵原料①，向该厌氧发酵原料①中加水将其含水量调至85％，将380g厌氧发酵原料①在500mL带有硅胶塞和出气口的厌氧发酵瓶中在温度为30-35℃的环境中静置发酵30天，得到木质纤维素厌氧发酵物料①。木质纤维素厌氧发酵物料①的腐殖酸含量为0.5％(质量百分含量)，蛋白质含量为15％(质量百分含量)。

2、木质纤维素厌氧发酵物料②(以下简称物料②)，其制备方法为向玉米秸秆(即厌氧发酵原料②)中加水将其含水量调至90％，将380g厌氧发酵原料②在500mL带有硅胶塞和出气口的厌氧发酵瓶中在温度为30-35℃的环境中静置发酵30天，得到木质纤维素厌氧发酵物料②。木质纤维素厌氧发酵物料②的腐殖酸含量为2％(质量百分含量)，蛋白质含量为10％(质量百分含量)。

3、木质纤维素厌氧发酵物料③(以下简称物料③)，其制备方法为向柳枝稷茎秆(即厌氧发酵原料③)中加水将其含水量调至94％，将380g厌氧发酵原料③在500mL带有硅胶塞和出气口的厌氧发酵瓶中在温度为30-35℃的环境中静置发酵30天，得到木质纤维素厌氧发酵物料③。木质纤维素厌氧发酵物料③的腐殖酸含量为1.6％(质量百分含量)，蛋白质含量为13％(质量百分含量)。

实施例1、木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的提取

本实施例中用到的提取微生物DNA的成套试剂，由洗脱液、稳定剂、洗涤液和成套裂解试剂构成：

洗脱液为由水和溶质组成的溶液，溶质及其浓度分别为9.0g/L氯化钠、0.12g/L氯化钾、0.24g/L氯化钙、0.2g/L碳酸氢钠和0.15g/L磷酸二氢钾；

稳定剂为由水和溶质组成的无菌溶液，溶质及其浓度分别为6mM Tris-HCl和3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，稳定剂的pH为8.0；

洗涤液为由水和溶质组成的无菌溶液，溶质及其浓度为60mM Tris-HCl、15mMEDTA、5.8g/L NaCl和15g/L PVP-40，洗涤液的pH为8.0；

成套裂解试剂由SDS裂解液、蛋白酶K、溶菌酶、纤维素酶、木聚糖酶和GuSCN溶液组成；SDS裂解液为由水和溶质组成的无菌溶液，溶质及其浓度分别为100mM Tris-HCl、40mMEDTA、7.305g/500mL NaCl、20g/500mL SDS和10g/500mL PVP-40，SDS裂解液的pH为8.0；GuSCN溶液为由水和溶质组成的无菌溶液，溶质及其浓度分别为100mM Tris-HCl和59.08g/100mL异硫氰酸胍，GuSCN溶液的pH为6.3(正确)。

1、提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA

实验重复三次，每次提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA方法(以下简称LCEW法)的具体操作步骤如下：

1)木质纤维素厌氧发酵物料微生物的洗脱

微生物的洗脱步骤如下：①取物料①于10mL无菌离心管中5000rpm下离心5min，弃上清液，得到发酵物料沉淀；②向2g发酵物料沉淀中加入是发酵物料沉淀3倍体积的洗脱液后置于摇床上，于200rpm下震荡10min，得到物料-洗脱液混合物；将该物料-洗脱液混合物于5000rpm下离心5min，弃上清液和长度较长的木质纤维素物料，得到沉淀；③重复步骤②2次，得到沉淀，将该沉淀命名为沉淀A1；④向沉淀A1中加入是沉淀A13倍体积的稳定剂，轻弹混均后得到微生物-稳定剂混合液。

2)微生物-稳定剂混合液中杂质的去除

①将步骤1)得到的微生物-稳定剂混合液于5000rpm下离心10min，弃上清液，得到沉淀，将该沉淀命名为沉淀A2；②向该沉淀A2中加入是该沉淀A23倍体积的洗涤液，涡旋混匀，得到微生物-洗涤液；将该微生物-洗涤液于5000rpm离心下10min，弃上清液，得到沉淀；③重复步骤②，直至上清液清澈透明，弃上清液，得到木质纤维素厌氧发酵物料微生物。

3)木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的提取

向步骤2)得到的木质纤维素厌氧发酵物料微生物中加入是木质纤维素厌氧发酵物料微生物2倍体积的SDS裂解液、100μL的蛋白酶K溶液(该蛋白酶K溶液是将蛋白酶K溶于水得到的液体，蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度为1mg/mL)、100μL的溶菌酶溶液(该溶菌酶溶液的浓度为50mg/mL)、150μL复合纤维素酶溶液(该复合纤维素酶是将纤维素酶和木聚糖酶溶于水得到的液体，复合纤维素酶溶液中纤维素酶和木聚糖酶的浓度均为1mg/mL)和200μL的GuSCN溶液，涡旋混匀后，65℃水浴45min，得到微生物裂解液。

将微生物裂解液于5000rpm下离心10min，弃沉淀，得到上清液，将该上清液命名为上清液a1；向上清液a1中加入是上清液a10.2倍体积的3M醋酸钠无菌溶液及与上清液a1相同体积的10％(质量百分比浓度)的PEG8000无菌溶液，得到提取液，将该提取液命名为提取液b1；将该提取液b1于-20℃下静置30min后，于5000prm下离心10min，弃上清液，得到沉淀，将该沉淀命名为沉淀a2。

向沉淀a2中加入是沉淀a21倍体积的CTAB裂解液后，于65℃下水浴12min，得到提取液，将该提取液命名为提取液b2；向该提取液b2中加入是提取液b2相同体积的溶液A(溶液A由氯仿和异戊醇组成，其中溶液A中氯仿和异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒，轻轻混匀，得到提取液，将该提取液命名为提取液b3；将该提取液b3于5000rpm下离心10min，弃沉淀，得到上清液，将该上清液命名为上清液a3；向该上清液a3中加入与上清液a3等体积的10％(质量百分比浓度)的PEG8000无菌溶液，混匀后于4℃下孵育8h，得到提取液，将该提取液命名为提取液b4；将该提取液b4于12000rpm下离心10min，弃上清液，得到沉淀，向该沉淀中加入500μL预冷的70％(体积百分比浓度)乙醇水溶液，而后于12000rpm下离心10min，弃上清液，得到沉淀，将该沉淀在超净工作台中晾干后，得到物料①微生物DNA。向物料①微生物DNA中加入100μL无菌超纯水，得到物料①微生物DNA溶液。

2、木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的提取方法与常规方法的比较

分别采用CTAB法、SDS-CTAB法和粪便试剂盒法提取步骤1的物料①的微生物DNA，物料的量均为2g，得到的DNA分别用100μL无菌超纯水溶解，分别得到CTAB法得到的DNA溶液、SDS-CTAB法得到的DNA溶液和粪便试剂盒法得到的DNA溶液，每种方法重复三次。

CTAB法按照文献(沙红,王燕飞,曲延英等.一种适于甜菜RAPD分析的DNA快速提取方法[J].新疆农业科学,2005,42(3):162-164.)的方法进行，SDS-CTAB法按照文献(刘云浩,蓝江林,刘波等.微生物发酵床垫料微生物总DNA提取方法的研究[J].福建农业科学学报,2011,26(2):153-158.)的方法进行，粪便试剂盒法采用北京百泰克生物技术有限公司生产的粪便总DNA提取试剂盒(货号为DP4611)，按照试剂盒说明书提取DNA的步骤。

不同方法提取的DNA的定性检测：用1.2％的琼脂糖凝胶分别电泳检测步骤1的物料①微生物DNA溶液、CTAB法得到的DNA溶液、SDS-CTAB法得到的DNA溶液和粪便试剂盒法得到的DNA溶液，不同DNA溶液的检测量均为5μL，电泳缓冲液为1×TAE，电泳时间为30min，100V电压，溴化乙锭(EB)染色15min，超纯水脱色，在凝胶成像仪(Alpha Innotech 2200,USA)中于302nm紫外线下检测(图1中a)。结果显示，CTAB法、SDS-CTAB法和粪便试剂盒法得到的DNA在电泳时均有不同程度的拖尾和弥散(图1中a中1、2和3)，而LCEW法得到的DNA(物料①微生物DNA)的电泳条带(图1中a中4)单一干净，表明，LCEW法得到的DNA质量好。

不同方法提取的DNA的定量检测：在UV分光光度计(UVmini-1240,SHIMADZU,Japan)下分别检测步骤1的物料①微生物DNA(物料①微生物DNA)溶液、CTAB法得到的DNA溶液、SDS-CTAB法得到的DNA溶液和粪便试剂盒法得到的DNA溶液，记录各DNA溶液的A260/A280、A260/A230和DNA浓度(表1)。

表1、不同提取方法获得的DNA的纯度和浓度

结果显示，尽管SDS-CTAB法和SDS法提得到的DNA浓度均很高，但这两种方法得到的DNA纯度却均不如LCEW法得到的DNA(物料①微生物DNA)的纯度好。粪便试剂盒法得到的DNA纯度接近LCEW法得到的DNA(物料①微生物DNA)的纯度，但粪便试剂盒法得到的DNA浓度远低于LCEW法得到的DNA(物料①微生物DNA)的浓度。结果表明，LCEW法得到的DNA(物料①微生物DNA)浓度和纯度均较好。

通过细菌16S rRNA基因的PCR扩增检测不同方法得到的DNA的质量，具体方法如下：分别以步骤1的物料①微生物DNA(物料①微生物DNA)溶液、CTAB法得到的DNA溶液、SDS-CTAB法得到的DNA溶液和粪便试剂盒法得到的DNA溶液中的DNA为模板，用北京六合通公司用PAGE法合成的引物357F-GC和517R(引物序列见参考文献“Muyzer G,De Waal E C,Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturinggradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplifiedgenes coding for 16S rRNA[J].Applied and environmental microbiology,1993,59(3):695-700.”)在PCR扩增仪(S1000TM Thermal Cycler,Bio-RAD,USA)中扩增细菌16SrRNA基因，扩增方法和程序见参考文献“Ren J,Yuan X,Li J,et al.Performance andmicrobial community dynamics in a two-phase anaerobic co-digestion systemusing cassava dregs and pig manure[J].Bioresource technology,2014,152:342-351.”。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测(图1中b)，结果显示，以CTAB法、SDS-CTAB法和粪便试剂盒法得到的DNA为模板时，均没有检测到目的条带(图1中b中1、2和3)，以LCEW法得到的DNA(物料①微生物DNA)为模板时，得到了目的条带(图1中b中4)，结果表明，LCEW法得到的DNA(物料①微生物DNA)质量好，可以用来作为扩增目的条带的模板。

实施例2、LCEW法提取不同物料微生物DNA

利用实施例1步骤1的LCEW法分别提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA，用到的物料为物料①、物料②和物料③。实验重复三次，每次重复实验分别将实施例1步骤1的新鲜的原始木质纤维素厌氧发酵物料(该物料为发酵30d、含固率为15％的牛粪和玉米秸秆混合发酵物)分别替换为上述物料①-③，其他步骤均不变，分别得到物料①-③的微生物DNA。

物料①-③的微生物DNA的定性检测，检测方法参见实施例1步骤2的“不同方法提取的DNA的定性检测”，结果如图2中a所示。结果显示，LCEW法提取得到的物料①-③的微生物DNA的电泳条带均单一明亮、干净、无拖尾和弥散现象。

物料①-③的微生物DNA的定量检测，检测方法参见实施例1步骤2的“不同方法提取的DNA的定量检测”，结果如表2所示。结果显示，LCEW法提取得到的物料①-③的微生物DNA的浓度和纯度均较好，且不同物料的微生物DNA之间的差异不大，表明LCEW法提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA的质量均较好，且得到的微生物DNA浓度和纯度稳定。

表2、LCEW法得到的不同物料微生物DNA的纯度和浓度

通过细菌16S rRNA基因的PCR扩增检测不同物料微生物DNA的质量，具体方法参见实施例1步骤2的“通过细菌16S rRNA基因的PCR扩增检测不同方法得到的DNA的质量”，结果如图2中b所示。结果显示，分别以LCEW法提取得到的物料①-③的微生物DNA为模板，均能检测到目的条带，表明，LCEW法提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA的质量均较好。

上述实验结果表明，本发明的LCEW法和提取微生物DNA的成套试剂均可用来提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA。

Claims (6)

1.提取发酵物料中的微生物DNA的方法，包括下述步骤S1)和S2)：

S1)用洗脱液洗下物料上的微生物，得到微生物洗脱液，除去所述微生物洗脱液中的杂质，得到所述微生物；

S2)提取所述微生物的DNA得到所述微生物DNA；

所述发酵物料为含木质纤维素的物质经过发酵得到的发酵产物；

所述发酵为厌氧发酵；

所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为8-10g/L氯化钠、0.1-0.2g/L氯化钾、0.2-0.3g/L氯化钙、0.1-0.3g/L碳酸氢钠和0.1-0.2g/L磷酸二氢钾；

所述除去所述微生物洗脱液中的杂质包括以下步骤：将所述微生物洗脱液进行离心，使微生物进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀命名为沉淀A1；向所述沉淀A1中加入稳定剂，得到微生物-稳定剂混合液；除去所述微生物-稳定剂混合液中的杂质，得到所述微生物；

所述稳定剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为5-7mM Tris-HCl和2-4mM乙二胺四乙酸，所述稳定剂的pH为7.5-8.5；

所述除去所述微生物-稳定剂混合液中的杂质包括以下步骤：将所述微生物-稳定剂混合液进行离心，使微生物进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀命名为沉淀A2；向所述沉淀A2中加入洗涤液，得到微生物-洗涤液混合液；除去所述微生物-洗涤液混合液中的杂质，得到所述微生物；

所述洗涤液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为50-70mMTris-HCl、10-20mM EDTA、5.5-6.0g/L NaCl和10-20g/L PVP-40，所述洗涤液的pH为7.5-8.5；

所述所述微生物为吸附在发酵物料上的微生物；

所述S2)包括向所述微生物中加入成套裂解试剂，得到微生物裂解液；除去所述微生物裂解液中的杂质，得到所述微生物DNA；

所述成套裂解试剂由SDS裂解液、蛋白酶K、溶菌酶、纤维素酶、木聚糖酶和GuSCN溶液组成；所述SDS裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度分别为90-110mM Tris-HCl、30-50mM EDTA、7-7.5g/500mL NaCl、15-25g/500mL SDS和5-15g/500mL PVP-40，所述SDS裂解液的pH为7.5-8.5；所述GuSCN溶液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度分别为90-110mMTris-HCl和55-65g/100mL异硫氰酸胍，所述GuSCN溶液的pH为6.0-6.5。

2.根据权利要求1所述的方法，所述木质纤维素为木质素和/或纤维素和/或半纤维素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵物料为食草动物的粪便和/或植物全株和/或植物的茎秆经过发酵得到的发酵物。

4.权利要求1-3任一所述方法在提取发酵物料中的微生物DNA中的应用；所述发酵物料为含木质纤维素的物质经过发酵得到的发酵产物；

所述发酵为厌氧发酵；

所述微生物为吸附在发酵物料上的微生物。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述木质纤维素为木质素和/或纤维素和/或半纤维素。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵物料为食草动物的粪便和/或植物全株和/或植物的茎秆经过发酵得到的发酵物。