CN102925581B - 一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用实时荧光定量PCR技术对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，属于环境微生物生态学领域。所述方法包括：沉积物样品DNA的提取和定量，肼氧化还原酶HZO基因特异性引物的PCR扩增，标准质粒的构建，荧光定量PCR扩增和标准曲线的制作。根据检测到的样品Ct值对照标准曲线计算样品中厌氧氨氧化细菌的数量，得到的初始模板基因拷贝数的对数值与Ct值有较好的线性关系，回归系数大于0.99。本发明使用肼氧化还原酶HZO基因对厌氧条件下的氨氧化细菌进行定量分析，克服了现有方法使用16S rRNA基因进行定量的特异性不强、覆盖率低、不准确等缺点，提供了一种高特异性、快速、准确的检测水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌数量的方法。

Description

一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法

技术领域

本发明涉及一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，属于环境微生物生态学技术领域。

背景技术

我国是第一水产养殖大国和水产品贸易大国，养殖水产品产量占全世界产量的70%。集约化、高密度养殖规模日益扩大，集中投饵造成养殖水体中积累大量的粪便、残饵和死亡的动植物尸体，导致水体中作为蛋白代谢终产物的氨氮和亚硝酸氮含量严重超标，养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，造成巨大的经济损失。同时，大量养殖含氮废水排放到沿海海域，造成了严重的环境污染，引发附近海域富营养化现象。氨氮污染已成为制约水产养殖成败和环境污染的主要胁迫因子，控制水体中的氨氮污染成为规模化养殖成功的关键之一。

氨氮的去除主要通过氨氧化作用进行，氨氧化微生物能够快速降解、吸收和转化水中的氮素污染物，并在形成优势菌群后抑制有害微生物的生长，在养殖水体修复、自净中发挥关键性作用。水产养殖环境的底泥（即沉积物）中有大量的微生物群落，它们参与氮、磷等多种营养素的生物地球化学循环，它们与水体中的微生物快速交换，对维持沉积物和水体的生态平衡有重要意义。长期以来，氨氧化被认为是一个好氧过程，由氨氧化细菌（AOB，ammoniaoxidizing bacteria）和氨氧化古菌（AOA，ammonia oxidizing archaea）参与。最近的研究发现，厌氧氨氧化（Anammox，anearobic ammonia oxidizing）过程能够在缺氧和厌氧条件下将氨氮和亚硝酸氮转化为氮气，广泛分布与海洋、淡水、土壤等生态系统。在缺氧的海洋沉积物中，厌氧氨氧化过程产生的氮气的比例占据到20-79%，是不可忽视的重要生物地球化学循环过程。水产养殖环境经常处于缺氧状态，厌氧氨氧化过程不但能够去除氨氮，同时还能够解除亚硝酸盐的毒性作用，对维持水产养殖环境中沉积物和水体的良好条件有重要意义。

厌氧氨氧化过程由隶属于浮霉菌门的厌氧氨氧化细菌执行。厌氧氨氧化细菌生长十分缓慢（平均传代时间10-12天），且与其它微生物之间存在复杂的竞争和共生关系，至今在世界范围内尚未得到厌氧氨氧化细菌的纯培养菌株。这极大地限制了传统的生理生化方法对厌氧氨氧化细菌的研究，迫切需要一种新的方法对厌氧氨氧化细菌的存在、种群、数量和生态学特点进行揭示。荧光定量PCR技术是最近发展出来的分子生物学手段，是在PCR技术的基础上发展而来的一种体外定量手段，已广泛应用于微生物学研究，可以不依赖于纯培养手段对微生物进行种类和数量的检测。

现有的厌氧氨氧化细菌的分子生物学研究多使用16S rRNA基因作为分子标识，如沈李东，胡宝兰等人对西湖底泥中厌氧氨氧化菌进行的分子生物学检测（沈李东，胡宝兰，郑平，钱轶超，陈婷婷，胡安辉，楼莉萍，《西湖底泥中厌氧氨氧化菌的分子生物学检测》，环境生物学报，2011:31（8）：1609-1615）以及叶磊，祝贵兵等人对北京某污水处理厂的活性污泥进行的分子生物学检测（叶磊，祝贵兵，伦中财，王朝旭，王衫允，冯晓娟，尹澄清，《应用分子生物学与同位素示踪技术研究厌氧氨氧化菌活性及功效》，环境科学学报，31（6）：1206-1211），上述检测都是针对厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因设计了特异性引物。但是，16SrRNA引物存在特异性不强、覆盖率不够、多样性偏低、有非目的基因扩增等缺点，不能够真实的反映环境中存在的厌氧氨氧化细菌的种类、多样性、分布和数量。本发明使用厌氧氨氧化细菌的特征酶HZO基因作为分子标识，设计HZO基因特异性引物，利用实时荧光定量PCR的方法对厌氧氨氧化细菌进行定量检测，能够克服已有技术的缺点，快速、灵敏、准确、真实地对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测。

发明内容

肼氧化还原酶HZO（Hydrazine oxydoreductase）负责催化厌氧氨氧化反应的关键步骤，目前仅仅在厌氧氨氧化细菌这一类群中发现HZO酶的存在，是厌氧氨氧化细菌的特征酶。本发明的发明人使用厌氧氨氧化细菌的特征酶HZO基因作为分子标识，设计HZO基因特异性引物，利用荧光定量PCR的方法对厌氧氨氧化细菌进行定量检测，可以克服已有16S rRNA基因测定特异性不高、多样性偏低、存在假阳性扩增的缺点，能够快速、灵敏、准确、真实地对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测。

本发明的目的是，克服厌氧氨氧化细菌无法纯化培养和16S rRNA基因定量不准确的缺陷，使用对应厌氧氨氧化关键功能酶HZO基因的特异性引物，利用实时荧光定量PCR技术，实现水产养殖沉积物中的厌氧氨氧化细菌快速、灵敏、准确、真实的定量研究。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，通过肼氧化还原酶HZO基因的荧光定量PCR反应，对厌氧氨氧化细菌进行定量，步骤为：

（1）样品DNA的提取和定量

取沉积物样品，加入裂解液，在核酸提取仪中进行裂解，裂解后的样品冷冻离心取上清液，调整盐离子浓度后加入硅胶颗粒，使DNA结合在硅胶颗粒上，结合DNA的硅胶颗粒悬浮液转移入纯化柱，清洗去除蛋白质等杂质，最后用洗脱缓冲液洗脱结合在硅胶颗粒上的宏基因组DNA，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验DNA的浓度和纯度；

（2）HZO基因标准质粒的制作

使用HZO基因特异性引物hzoF1和hzoR1对样品DNA进行PCR扩增，

PCR反应体系为：10×PCR Buffer1.25μl，2.5mM dNTP1.00μl，25mM MgCl20.75μl，10μg/μlBSA1.00μl，20μM上下游引物各0.25μl，沉积物总DNA1.00μl，TaqDNA聚合酶2.5U，双蒸水补足到25μl，

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，

合并多次反应得到的PCR产物，切胶回收后连接入pGMDT-19Simple Vector载体中，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，液体LB培养基过夜培养，提取质粒，测定浓度后将质粒10倍浓度梯度稀释，制作标准品，用荧光定量仪测定线性化质粒浓度，计算基因拷贝数；

（3）荧光定量PCR扩增

调整所有样品DNA的浓度至10ng/μl，对标准质粒和样品DNA在同一批次进行荧光定量PCR扩增，

反应体系包括：2×SYBR Green Premix7.5μl，10μM上下游引物各0.3μl，50×ROXReference Dye II0.3μl，模板DNA1.0μl，双蒸水补足到总体积12.5μl，

PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s，80℃延伸40s，循环40次，80℃读取荧光值，并加熔解曲线检测产物特异性；

（4）沉积物样品厌氧氨氧化细菌数量计算

根据标准质粒的初始拷贝数的对数值和Ct值制作标准曲线，得到回归曲线和公式，根据定量PCR反应得到的样品Ct值，计算出HZO基因的拷贝数。

本发明的创新点和有益效果：

（1）现有技术中的研究主要是关注好氧氨氧化过程，而水产养殖沉积物中往往是缺氧甚至局部厌氧的，本发明首次建立了对水产养殖环境厌氧条件下氨氧化微生物的定量研究；

（2）本发明克服了厌氧氨氧化细菌难以进行分离培养的缺点，建立了一种利用分子生物学手段对厌氧氨氧化细菌进行荧光定量研究的方法；

（3）现有技术中使用16S rRNA基因作为分子标识的荧光定量PCR方法，存在特异性不强、覆盖率不够、多样性偏低、有非目的基因扩增等缺点，不能够真实的反映环境中存在的厌氧氨氧化细菌的种类、多样性、分布和数量，本发明使用厌氧氨氧化细菌的特征酶HZO基因作为分子标识，能够快速、灵敏、准确、真实的对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测，并且由于对应厌氧氨氧化过程的关键功能基因，能够建立细菌数量与厌氧氨氧化活性之间的相关关系；

（4）本发明将所有样品DNA统一调整浓度，降低了不同样品之间存在的腐殖质等PCR抑制物对PCR反应的干扰，得到的标准曲线斜率为-3.02，回归系数大于0.99，体现了良好的扩增效率和回归关系。

附图说明

图1为厌氧氨氧化细菌荧光定量PCR标准曲线；

图2为厌氧氨氧化菌荧光定量PCR熔解曲线。

具体实施方式

1、DNA的提取和定量

采集水产养殖环境沉积物样品后，迅速混匀，立刻放入干冰中，转移到-80℃冰箱保存。使用MP Biomedicals公司的Fast Prep-24核酸提取仪及土壤DNA快速提取试剂盒（FastDNASpin kit for soil）进行沉积物DNA的提取。操作方法如下：向Lysing MatrixZ管中加入0.3g沉积物样品（勿超0.3g），加入1100μl裂解液。将上述离心管放入FastPrep-24核酸提取仪中，设定速度5，离心时间40s。将上述离心管在4℃条件下14000×g离心10min。小心将上清移入新的1.5ml离心管中加入250μlPPS，并轻柔颠倒10次将其混匀。将上述混合液以14000×g4℃离心5min，将上清移入新的离心管中，将Binding Matrix Suspension摇匀，悬浮，向上述上清中加入500μl的Binding Matrix Suspension。用手轻柔颠倒混匀2min，将管放置于管架上静置3min。管吸出600μl上清丢弃，使余下的上清与Binding Matrix混匀，将混合液移入纯化柱（spin fillter）中14000×g离心1min，倒掉收集管中的废液。向纯化柱中加入500μl已加入乙醇的SEWS-M，14000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，以14000×g离心2min。将纯化柱移入新的收集管中，室温下空气中干燥纯化柱5min。加入50μl DES，并且用枪头清搅滤膜或用手指轻弹使DNA溶解，静置1min（55℃水浴5min），以14000×g离心1min，使DNA转移到收集管中。再加40μl重复以上步骤。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA质量。保存于-80℃冰箱。

2、标准质粒的构建和线性化

通过厌氧氨氧化细菌的特征酶肼氧化还原酶HZO的保守序列设计引物对沉积物DNA进行PCR扩增。上游引物为hzoF1：5’-TGTGCATGGTCAATTGAAAG-3’，下游引物为hzoR1：5’-CAACCTCTTCWGCAGGTGCATG-3’。PCR反应在0.2ml薄壁管中进行，总体积为25μl，使用Fermentas的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增体系包含以下成分（见表1）：

表1

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。为保证产物的量，共进行10-20个25μl体积的PCR扩增反应，用1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。合并所有反应产物，用OMEGA胶回收试剂盒切胶纯化大小为1200bp的目的产物片段。纯化后的产物与pGMT-19Simple Vector在4度连接过夜，钙法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂带有IPTG和X-Gal和氨苄青霉素的LB平板37℃培养过夜。挑取白色的单克隆菌落，接种入含氨苄青霉素的5ml LB试管中，扩大培养。用OMEGA小量质粒提取试剂盒提取质粒，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。质粒在Modulus荧光定量仪上检测线性化质粒的浓度，根据公式计算质粒中含有hzo基因的拷贝数为2.70×10¹⁰copies/μl。对定量后的质粒进行10倍浓度稀释，制作2.70×10²-10⁷copies/μl浓度梯度的标准品，置于-20℃冰箱保存待用。

3、厌氧氨氧化细菌的实时荧光定量PCR扩增

在进行荧光定量PCR反应时，不同批次的反应会有扩增效率的差别，通常在扩增效率在0.9-1.1之间的PCR反应被认为是可以接受的和可以相互比较的。将标准质粒和样品DNA在同一批进行PCR的扩增和定量，能够减少不同批次PCR反应扩增效率不同而产生的误差，更加准确真实的定量厌氧氨氧化细菌的拷贝数。每个标准质粒DNA和样品DNA都设置三个平行，结果取平均值。由于沉积物中残留的腐殖质等会对PCR扩增产生不同程度的抑制作用，为了在不同样品之间获得更加接近的扩增效率，在进行定量PCR扩增之前，将所有样品DNA在荧光定量仪Modulus上进行浓度测定，并将所有样品DNA的浓度调整到10ng/μl，使不同样品之间的厌氧氨氧化细菌数量更加具有可比性。使用SYBR Green法进行荧光定量PCR的扩增，反应总体积为15μl，反应体系含有以下成份（见表2）：

表2

荧光定量PCR在美国应用生物AB公司的7500扩增仪上进行，PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s，80℃延伸40s，循环40次，80℃读取荧光值，并加熔解曲线检测产物特异性。

4、样品中厌氧氨氧化细菌数量的计算

反应结束后，扩增结果在仪器自带的软件上进行分析。以梯度稀释的标准质粒的拷贝数为横轴，以对应的Ct值为纵轴，建立标准曲线。得到的厌氧氨氧化细菌实时荧光定量PCR的标准曲线为见图1，显示初始模板数与荧光值有较好的线性关系，回归系数大于0.99，扩增效率高，斜率为-3.01。熔解曲线显示，荧光定量PCR产物无非特异性扩增（见图2）。根据样品的Ct值可以计算出该样品中厌氧氨氧化细菌hzo基因的拷贝数，实现对厌氧氨氧化细菌的定量。

Claims (1)

1.一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，其特征在于，通过肼氧化还原酶HZO基因的荧光定量PCR反应，对厌氧氨氧化细菌进行定量，步骤为：

（1）样品DNA的提取和定量

取沉积物样品，加入裂解液，在核酸提取仪中进行裂解，裂解后的样品冷冻离心取上清液，调整盐离子浓度后加入硅胶颗粒，使DNA结合在硅胶颗粒上，结合DNA的硅胶颗粒悬浮液转移入纯化柱，清洗去除蛋白质等杂质，最后用洗脱缓冲液洗脱结合在硅胶颗粒上的宏基因组DNA，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验DNA的浓度和纯度，用荧光定量仪测定宏基因组DNA浓度；

（2）HZO基因标准质粒的制作

使用HZO基因特异性引物hzoF1和hzoR1对样品DNA进行PCR扩增，

PCR反应体系为：10×PCR Buffer1.25μl，2.5mM dNTP1.00μl，25mM MgCl₂0.75μl，10μg/μlBSA1.00μl，20μM上下游引物各0.25μl，沉积物总DNA1.00μl，TaqDNA聚合酶2.5U，双蒸水补足到25μl，

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，

合并多次反应得到的PCR产物，切胶回收后连接入pGMT-19Simple Vector载体中，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，液体LB培养基过夜培养，提取质粒，测定浓度后将质粒10倍浓度梯度稀释，制作标准品，用荧光定量仪测定线性化质粒浓度，计算基因拷贝数；

（3）荧光定量PCR扩增

调整所有样品DNA的浓度至10ng/μl，对标准质粒和样品DNA在同一批次进行荧光定量PCR扩增，

反应体系包括：2×SYBR Green Premix7.5μl，10μM上下游引物各0.3μl，50×ROXReference Dye II0.3μl，模板DNA1.0μl，双蒸水补足到总体积12.5μl，

PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s，80℃延伸40s，循环40次，80℃读取荧光值，并加熔解曲线检测产物特异性；

（4）沉积物样品厌氧氨氧化细菌数量计算

根据标准质粒的初始拷贝数的对数值和Ct值制作标准曲线，得到回归曲线和公式，根据定量PCR反应得到的样品Ct值，计算出HZO基因的拷贝数。