CN114350763B - 一种鉴定硝化微生物的方法 - Google Patents
一种鉴定硝化微生物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114350763B CN114350763B CN202111460788.0A CN202111460788A CN114350763B CN 114350763 B CN114350763 B CN 114350763B CN 202111460788 A CN202111460788 A CN 202111460788A CN 114350763 B CN114350763 B CN 114350763B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- density
- nitrifying
- soil
- dna
- urea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 36
- 230000001546 nitrifying effect Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 25
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 101150083634 amoA gene Proteins 0.000 claims description 8
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims description 5
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000001448 refractive index detection Methods 0.000 claims description 3
- 101100490994 Aeromonas hydrophila amoA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100490996 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) amoA2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 5
- 230000014075 nitrogen utilization Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001948 isotopic labelling Methods 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 241001453382 Nitrosomonadales Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000003920 environmental process Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004172 nitrogen cycle Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N9/00—Investigating density or specific gravity of materials; Analysing materials by determining density or specific gravity
- G01N9/24—Investigating density or specific gravity of materials; Analysing materials by determining density or specific gravity by observing the transmission of wave or particle radiation through the material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W10/00—Technologies for wastewater treatment
- Y02W10/10—Biological treatment of water, waste water, or sewage
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鉴定硝化微生物的方法。本发明利用15N‑Urea和15N‑(NH4)2SO4同位素标记硝化种群，利用稳定同位素探针标记技术(15N‑DNA‑SIP)准确快速鉴定具有硝化活性的微生物。并可以结合同位素比值质谱仪或者硝化潜势评估各个硝化类群对硝化过程的相对贡献，为提高氮素利用效率，减少氮素损失和N2O的排放提供基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鉴定硝化微生物的方法。
背景技术
自基于DNA的稳定同位素探针(DNA-SIP)技术首次用于微生物生态研究(Radajewski et al.,2000)以来，近年来，它已被普遍用作将微生物的识别与特定环境过程联系起来的工具。除了少量纯培养实验外，大多数研究都是在复杂的生态系统中进行的，如土壤、沉积物、水和生物反应器。通常，在样品与这些底物一起孵育数小时至数周后(Jiang et al.,2015)，土壤微生物的DNA被提取并与CsCl和GB缓冲液混合。理想情况下，与相应的天然底物丰度相比，在等密度超速离心后，同化标记底物的微生物的DNA会以相对较重的密度分数出现。随后，标记的DNA被挑出并通过克隆文库或高通量测序进行分析，以确定代谢相关碳源的特定微生物群。
这些程序的关键步骤是在超浓缩后识别标记的分数。考虑到精度和灵敏度，Lueders等人(Lueders et al.,2004)选择了荧光测量和实时PCR来检测"重层"核酸。虽然该实验基于纯培养，但这种方法也广泛应用于土壤微生物研究。以往，13CO2标记和12CO2对照处理之间的成对比较用于评估硝化种群是否同化13CO2进行自养生长，并利用13CO2+C2H2和13CO2+C8H14处理评估13CO2同化对氨氧化微生物的化学自养依赖性，氨氧化可以被100pa的C2H2完全抑制。该方法鉴定硝化种群的依据是间接的，指向性不那么明确，能确定的只是硝化微生物的自养生长，而不是直接的鉴定硝化微生物利用氮底物生长。
现有的13C标记技术已广泛应用于土壤微生物研究，用于确定代谢相关碳源的特定微生物类群。但是对于确定代谢相关氮源的特定微生物类群尤其是氮循环所涉及的微生物仍有难度，并且由于土壤微生物群落结构和功能的复杂性，找到标记的组分并不容易。对于以氮为底物的特定微生物，DNA-SIP的应用更是由于氮价态的变化而增加难度。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用氮底物准确快速鉴定硝化微生物的方法。
本发明的上述目的通过如下方案方式实现：一种鉴定硝化微生物的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、对土壤进行预培养；
S2、取土壤分别加入14N-Urea、14N-(NH4)2SO4、15N-Urea和15N-(NH4)2SO4进行同位素微宇宙实验，分别孵育，然后分别提取土壤DNA；
S3、在DNA中加入CsCl溶液和GB溶液,调节折光率，然后进行超高速离心,然后进行分层纯化得到不同密度层级的DNA溶液；
S4、对DNA溶液每个密度层级进行折光率检测并计算浮力密度，经后处理再利用荧光定量PCR确定密度层级的amoA基因丰度；
S5、通过amoA基因丰度和浮力密度判断硝化微生物标记程度。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，步骤S1土壤预培养为在20-30℃下保持55-65％土壤田间最大持水量5-8天。对土壤进行预培养可以最大程度地恢复土壤中微生物的活性。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，步骤S2孵育过程土壤中含有90-110mg/kg的14N-Urea或14N-(NH4)2SO4或15N-Urea或15N-(NH4)2SO4。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，步骤S3调整折光率为1.4015±0.0002。本发明通过调整折光率为1.4015±0.0002可以确保大部分基因集中在密度梯度的中间部分。
作为优选，浮力密度计算公式为：
ρ＝-75.9318+99.2031x-31.2551x2，其中ρ表示浮力密度，x表示折光率。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，步骤S3超高速离心转速设置为44000-46000rpm，离心力为180000-190000g，离心时间为45-50h。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，步骤S3密度层级总层数为16层。在本发明中超高速离心管的总容积是5.1ml，为了确保每层的体积为300-330μl，将密度层级总层数设置为16层，层数过少会增加鉴定成本，层数过多则密度层级不易分开，误差较大。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，步骤S4后处理前每个密度层级需要加入PEG6000溶液进行静置处理。
作为优选，PEG6000溶液配置过程具体为：150gPEG6000和46.8gNaCl溶解于去离子水中并定容至500ml，然后用0.2微米滤膜过滤并灭菌。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，步骤S4后处理具体为：对每个密度层级进行离心去上清，然后清洗干燥，最后溶解于无核酸水中。
作为优选，步骤S4后处理具体为：对每个密度层级离心后去除上清液，然后加入70％乙醇清洗两次，室温放置挥发剩余的酒精，然后溶于无核酸水。
在上述的一种鉴定硝化微生物的方法中，荧光定量PCR中引物为：AOA的引物CamoA23F/616R、AOB的引物amoA1F/2R、comammox clade A的引物comA_244F/659R、comammoxclade B的引物comB_244F/659R。
作为优选，AOA的定量PCR条件为95℃5min，95℃15s，53℃45s，72℃45s，45个循环，在83℃收集荧光信号。
作为优选，AOB的定量PCR条件为95℃5min，95℃15s，54℃40s，72℃45s，40个循环，在84℃收集荧光信号。
作为优选，comammox的定量PCR条件为95℃5min，95℃15s，52℃45s，72℃1min，45个循环，在82℃收集荧光信号。
14N标记和15N标记它们的浮力密度是不同的，当利用了15N时，浮力密度与丰度的折线图会往重层偏移，通过14N标记和15N标记引起的偏移确定微生物是否利用了标记的N进行自养生长。偏移量越大说明标记的程度越高，微生物活性越强，利用的底物越多。
与现有技术相比，本发明利用15N-Urea和15N-(NH4)2SO4同位素标记硝化种群，利用稳定同位素探针标记技术(15N-DNA-SIP)准确快速鉴定具有硝化活性的微生物。并可以结合同位素比值质谱仪或者硝化潜势评估各个硝化类群对硝化过程的相对贡献，为提高氮素利用效率，减少氮素损失和N2O的排放提供基础。
附图说明
图1为实施例1中16层密度层级的amoA基因丰度和浮力密度关系图。
图2为实施例1中7-15层密度层级的amoA基因丰度和浮力密度关系图。
图3为实施例1分层后DNA的PCR电泳条带图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
S1、对土壤样品进行预处理：在20-30℃下保持55-65％土壤田间最大持水量5-8天。
S2、向120ml棕色血清瓶中分别加入14N-Urea、14N-(NH4)2SO4、15N-Urea和15N-(NH4)2SO4，分别在培养的第0、7、14、21天加入，含量为100mg/kg N每克干土；每隔3天进行换气和补充水分，并且分别在培养第0、1、3、7、14、21、28天破坏性取样；然后分别提取土壤样品DNA，其中提取土壤样品DNA利用MP土壤提取试剂盒(MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)提取DNA，提取后用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段长度和Nanodrop 2000测定DNA浓度和纯度。
表1：DNA浓度和加入体积
| ID | DNA浓度ng/μl | 加入体积μl |
| 14N-(NH4)2SO4-1 | 111.8 | 26.8 |
| 14N-(NH4)2SO4-2 | 105.5 | 28.4 |
| 14N-(NH4)2SO4-3 | 104.1 | 28.8 |
| 14N-Urea-1 | 120.0 | 25.0 |
| 14N-Urea-2 | 121.1 | 24.8 |
| 14N-Urea-3 | 121.8 | 24.6 |
| 15N-(NH4)2SO4-1 | 114.4 | 26.2 |
| 15N-(NH4)2SO4-2 | 111.9 | 26.8 |
| 15N-(NH4)2SO4-3 | 121.2 | 24.8 |
| 15N-Urea-1 | 111.8 | 26.8 |
| 15N-Urea-2 | 123.4 | 24.3 |
| 15N-Urea-3 | 138.3 | 21.7 |
S3、各取3μg DNA样品与4.4ml CsCl和1.1ml的GB溶液混合，并且调节折光率为1.4015，装入超高速离心管并封口，然后进行超高速离心,然后进行分层纯化得到不同密度层级的DNA溶液；超高速离心转速设置为45000rpm，离心力为184000g，离心时间为48h。
S4、离心完成后，取出超高速离心管。将样品分为16层，并且测定每一层的折光率，通过离心浓度的经验公式换算出每一层的浮力密度(ρ＝-75.9318+99.2031x-31.2551x2，ρ表示浮力密度，x表示折光率)。在每一层的溶液中加入550μl PEG6000溶液静置2小时，离心30min后去除上清液，然后加入500μl 70％乙醇清洗两次，每次离心15min。室温放置挥发剩余的酒精，然后溶于30μl无核酸水。
S5、对DNA溶液每个密度层级进行折光率检测并计算浮力密度，经后处理再利用荧光定量PCR确定密度层级的amoA基因丰度；荧光定量PCR引物分别为AOA的引物CamoA 23F/616R，AOB的引物amoA1F/2R，comammox clade A的引物comA_244F/659R，comammox clade B的引物comB_244F/659R,其中clade A和clade B的引物都是由六对简并引物的混合而成。
AOA和AOB的20μl定量体系为10μl的mix，上下游引物各0.5μl，2μl的DNA模板，其余的用水补足。AOA的定量PCR条件为95℃5min，95℃15s，53℃45s，72℃45s，45个循环，在83℃收集荧光信号。AOB的定量PCR条件为95℃5min，95℃15s，54℃40s，72℃45s，40个循环，在84℃收集荧光信号。comammox的20μl定量体系为10μl的mix，上下游引物各3μl，1μl的DNA模板，其余的用水补足。comammox的定量PCR条件为95℃5min，95℃15s，52℃45s，72℃1min，45个循环，在82℃收集荧光信号。
S6、通过amoA基因丰度和浮力密度判断硝化微生物标记程度。
表2：不同密度层级的浮力密度
图1-2分别为实施例1中16层、7-15层密度层级的amoA基因丰度和浮力密度关系图。在初始折光率设置为1.4015可以确保大部分基因集中在密度梯度的中间部分，微生物利用N作为底物，确定代谢相关氮源的特定微生物类群，直接证明了完全氨氧化菌能够利用15N进行自养生长。
图3为实施例1分层后DNA的PCR电泳条带图。可以看出目的基因片段长度为415bp。
综上所述，本发明利用15N-Urea和15N-(NH4)2SO4同位素标记硝化种群，利用稳定同位素探针标记技术(15N-DNA-SIP)准确快速鉴定具有硝化活性的微生物。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (2)
1.一种鉴定硝化微生物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、对土壤进行预培养；
S2、取土壤分别加入14N-Urea、14N-(NH4)2SO4、15N-Urea或15N-(NH4)2SO4进行同位素微宇宙实验，分别孵育，然后分别提取土壤DNA；
S3、在DNA中加入CsCl溶液和GB溶液,调节折光率，然后进行超高速离心,然后进行分层纯化得到不同密度层级的DNA溶液；
S4、对DNA溶液每个密度层级进行折光率检测并计算浮力密度，经后处理再利用荧光定量PCR确定密度层级的amoA基因丰度；
S5、通过amoA基因丰度和浮力密度判断硝化微生物标记程度；14N标记和15N标记的浮力密度是不同的，当微生物利用了15N时，浮力密度与amoA基因丰度的折线图会往重层偏移，通过14N标记和15N标记引起的偏移确定微生物是否利用了标记的N进行自养生长，偏移量越大说明标记的程度越高，微生物活性越强，利用的底物越多；
步骤S2孵育过程土壤中含有90-110mg/kg的14N-Urea或14N-(NH4)2SO4或15N-Urea或15N-(NH4)2SO4；
步骤S3调整折光率为1.4015±0.0002；
步骤S1土壤预培养为在20-30℃下保持55-65%土壤田间最大持水量5-8天；
步骤S3超高速离心转速设置为44000-46000rpm，离心力为180000-190000g，离心时间为45-50h；
步骤S4后处理前每个密度层级需要加入PEG6000溶液进行静置处理；
步骤S4后处理具体为：对每个密度层级进行离心去上清，然后清洗干燥，最后溶解于无核酸水中。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定硝化微生物的方法，其特征在于，步骤S3密度层级总层数为16层。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111460788.0A CN114350763B (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种鉴定硝化微生物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111460788.0A CN114350763B (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种鉴定硝化微生物的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114350763A CN114350763A (zh) | 2022-04-15 |
| CN114350763B true CN114350763B (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=81097043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111460788.0A Active CN114350763B (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种鉴定硝化微生物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114350763B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108300666A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-07-20 | 中国科学院宁波城市环境观测研究站 | 一种制备具有确定15n丰度的n2o及基于15n同位素示踪法测量氮循环的方法 |
| CN112608981A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-04-06 | 北京工业大学 | 一种基于dna稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法 |
-
2021
- 2021-12-03 CN CN202111460788.0A patent/CN114350763B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108300666A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-07-20 | 中国科学院宁波城市环境观测研究站 | 一种制备具有确定15n丰度的n2o及基于15n同位素示踪法测量氮循环的方法 |
| CN112608981A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-04-06 | 北京工业大学 | 一种基于dna稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Nitrification of archaeal ammonia oxidizers in acid soils is supported by hydrolysis of urea;Lu Lu等;ISME J;第6卷(第10期);第1978-1984页 * |
| Optimizing ultracentrifugation conditions for DNA-based stable isotope probing (DNA-SIP);Juan Wang等;J Microbiol Methods;第173卷;摘要、1引言第1段、2材料与方法、表1 * |
| 稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP原理与应用;贾仲君;微生物学报;第51卷(第12期);第20-29页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114350763A (zh) | 2022-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Briones et al. | Influence of different cultivars on populations of ammonia-oxidizing bacteria in the root environment of rice | |
| Zehr et al. | Experiments linking nitrogenase gene expression to nitrogen fixation in the North Pacific subtropical gyre | |
| CN102925581A (zh) | 一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法 | |
| CN111471794A (zh) | 禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN111057782A (zh) | 一种基于实时荧光定量pcr检测土壤细菌数量的方法 | |
| CN116004777A (zh) | 一种微生物抗生素抗性基因的高通量检测引物组、芯片、试剂盒及其检测方法 | |
| CN114350763B (zh) | 一种鉴定硝化微生物的方法 | |
| CN111471795A (zh) | 燕麦镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN111088395A (zh) | 小麦全蚀病菌禾顶囊壳lamp检测引物组及方法 | |
| McArthur et al. | Asking probing questions: can fluorescent in situ hybridization identify and localise aquatic hyphomycetes on leaf litter? | |
| CN110735003A (zh) | 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN109423456B (zh) | 一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用 | |
| CN108004334B (zh) | 检测饮用水中四种致病菌的四重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法 | |
| CN106957915B (zh) | 苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法 | |
| CN106636399B (zh) | 哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物 | |
| CN107058539A (zh) | 用于大麦基因表达研究的内参基因及其应用 | |
| CN112063759A (zh) | 一种同时检测香蕉多种病毒的rt-lamp引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN111996269A (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的荧光pcr检测方法 | |
| CN106011277A (zh) | 一种用于快速检测咖啡驼孢锈菌的引物对、试剂盒及检测方法 | |
| CN112608985A (zh) | 快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物和方法 | |
| CN112280905A (zh) | 一种利用多重dpo-rt-pcr检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的方法 | |
| CN112280906A (zh) | 一种用于南芥菜花叶病毒及菜豆荚斑驳病毒检测的dpo-pcr引物对及其应用 | |
| CN111471793A (zh) | 拟枝孢镰孢菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN115873977B (zh) | 一种灵芝优质菌株hmgim-m624的分子标记、特异性引物及鉴定方法 | |
| CN108823219A (zh) | 毛蚶过氧化氢酶--一种新型海洋生物污染检测标记物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |