CN112280905A - 一种利用多重dpo-rt-pcr检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的方法 - Google Patents

一种利用多重dpo-rt-pcr检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种利用多重DPO‑RT‑PCR检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的方法。本发明建立的SBMV及TRSV的一步法双重DPO‑RT‑PCR检测方法具有特异性强、适用范围广的优点，可用于南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的快速筛检，也为植物病毒的多重检测方法提供了一种新思路，具有较强的实用价值。本发明建立的SBMV及TRSV双重DPO‑PCR检测方法，为口岸实验室对其的快速筛查提供参考。

Description

一种利用多重DPO-RT-PCR检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑 病毒的方法
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种利用多重DPO-RT-PCR检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的方法。
背景技术
我国是大豆主要进口国，具海关数据显示，2019年全年共进口大豆8551.1 万吨，创历史第二高峰。随着大豆大量进口，其中携带的有害生物存在侵入我国的风险。南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)及烟草环斑病毒(Tobacco ring spotvirus，TRSV)属于我国进境植物检疫性有害生物，均存在通过侵染大豆传入我国的风险。目前口岸主要使用DAS-ELISA和RT-PCR 方法对两种病毒进行检测，时间长，通量低，因此建立高通量的病毒检测方法对提高口岸检测效率有重要意义。
双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide，DPO)是一种新型PCR 引物设计方法，具有特异性高，引物自身及引物间难形成二级结构，引物设计简单等优点。目前已经广泛的应用于如大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、向日葵白锈病菌、向日葵黑茎病菌、油菜茎基溃疡病菌、番茄斑萎病毒等植物病害的检测中。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用多重DPO-RT-PCR 检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种利用多重 DPO-RT-PCR检测南方菜豆花叶病毒和/或烟草环斑病毒的试剂盒，所述试剂盒包括DPO-PCR引物对，所述DPO-PCR引物对的序列如下：
SBMV-DPOf：GTAGTGGTGCGTGTGCCAAIIIIIGTGTGGTCCAA；
SBMV-DPOr：CAAGGGCCTTGACCCTGCCGCIIIIIGGTAGTTTAAAG；
或
TRSV-DPOf：GTTACGTTGTTCTTTTACTCTCIIIIIATTTTAATTG；
TRSV-DPOr：ATACCGAACAACTTCATGTTCAGTIIIIITTAAAACGTCCA C；
其中，“I”表示次黄嘌呤。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述DPO-PCR引物对在体系中的浓度为0.1～0.6μmol/L。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述DPO-PCR引物对在体系中的浓度为0.2μmol/L。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，还包括阳性标准品、阴性对照品、 PCR预混液和无核酸酶水。
本发明还提供所述的试剂盒在检测南方菜豆花叶病毒和/或烟草环斑病毒中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测过程中退火温度为 45～65℃。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测反应条件为42℃30min； 95℃3min；94℃30s，60℃45s，72℃1min，35个循环；72℃5min。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测包括将PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中成像分析的步骤。
本发明的有益效果：
(1)相对于昆虫、杂草等有害生物，植物病毒隐蔽性强，截获难度大，植物疫情的检测是一个大范围筛查的过程。传统的DAS-ELISA、RT-PCR检测方法通量低，较难直接应用于大规模的筛查检测中。本发明建立的SBMV及TRSV 的一步法双重DPO-RT-PCR检测方法具有特异性强、适用范围广的优点，可用于南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的快速筛检，也为植物病毒的多重检测方法提供了一种新思路，具有较强的实用价值。
(2)虽然DPO引物间以及引物本身较少形成二级结构，结合其对退火温度的不敏感的优势，使得DPO引物设计更为简便，降低了多重PCR引物设计难度。但在引物筛选时应注意到，病毒来源多，变异快，而DPO引物相对普通PCR 引物更长，一般可达24～37个碱基，因此应尽量多的收集目标基因序列，以确保所设计引物兼具种间特异性与种内通用性。
附图说明
图1：一步法DPO-RT-PCR扩增结果图；注：M.Marker II DNA Marker； 1.TRSV；2.SBMV；3.TRSV+SBMV；4.空白对照。
图2：DPO-PCR特异性实验结果图；注：M.Marker II DNA Marker；1. SBMV+TRSV；2.SBMV；3.TRSV；4.ArMV；5.ToRSV；6.BPMV；7.PSV； 8.SMV；9.MCMV；10.WSMV；11.MDMV。
图3：DPO-PCR灵敏度评价结果图；注：M.Marker II DNA Marker；1～5. DNA模板量依次为0.002、0.02、0.2、2、20ng/μL。
图4：DPO-PCR退火温度敏感性试验结果图；注：M.Marker II DNA Marker， 1～5退火温度分别为45、50、55、60、65℃。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1材料与方法
1.1材料及设备
检测试剂：植物总RNA提取试剂盒(DP432)、FastKing一步法RT-PCR试剂盒(KR123)、Marker II DNA Marker(MD102)购自TIANGEN公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；实验样品来源详见表1。
主要设备：Veriti PCR仪、Nanodrop 2000核酸蛋白分析仪，美国Thermofisher 公司；电泳仪、Geldoc XR+凝胶成像系统，美国Bio-rad公司。
表1样品来源
Figure BDA0002815749640000041
1.2实验方法
1.2.1总RNA的提取
按照植物总RNA提取试剂盒DP432的要求对表1中样品进行总RNA提取，置于超低温冰箱中备用。
1.2.2引物设计
参考DPO引物设计方法和要求，根据SBMV及TRSV保守序列分别设计 DPO-PCR引物(引物序列中的I代表次黄嘌呤)(表2)。
表2引物序列
Figure BDA0002815749640000051
1.2.3一步法双重DPO-RT-PCR反应体系优化
参照FastKing一步法RT-PCR试剂盒(KR123)说明书建立反应体系。 2×FastKingOne Step RT-PCR MasterMix溶液25μL、25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL、引物(10μM)各1.25μL、RNA模板各2μL，RNase-Free ddH2O调节最终体积至50μL。
反应条件为42℃30min；95℃3min；94℃30s，60℃45s，72℃1min， 35个循环；72℃5min。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中成像分析。
1.2.4一步法双重DPO-RT-PCR特异性评价
按照1.2.3中一步法DPO-RT-PCR反应体系，以1.2.1中提取的8个非目标样品总RNA为模板，以SBMV及TRSV总RNA为模板做阳性对照，以水为模板做阴性对照，对所建立的一步法DPO-RT-PCR反应体系的特异性进行评价。
1.2.5一步法双重DPO-RT-PCR灵敏度评价
以1.2.1方法提取的SBMV及TRSV总RNA，分别用核酸蛋白分析仪标定浓度为20ng/μL，再按10倍梯度稀释为2ng/μL、0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002 ng/μL的模板浓度，共4个模板浓度，分别取1μL作为模板按照1.2.3的方法进行灵敏度实验。
1.2.6一步法双重DPO-RT-PCR体系退火温度敏感性实验
按照1.2.3中DPO-RT-PCR反应体系，将反应条件中的退火温度设定为 45℃～65℃，5℃为1个梯度共5个梯度，进行DPO-RT-PCR扩增实验，产物经 2％琼脂糖凝胶电泳后在成像系统中成像分析。
1.2.7一步法双重DPO-RT-PCR体系对模拟样品的检测
为验证样品基质对所建立的方法是否存在影响，利用本发明建立方法对10 份实际样品及10份模拟样品进行检测，并与相应国家标准中RT-PCR检测方法进行比对，其中SBMV的RT-PCR检测选择SN/T 3438-2012附录C引物按 Tiangen FastKing一步法RT-PCR试剂盒要求进行、TRSV的RT-PCR检测选择 GB/T 28081-2011附录C引物按Tiangen FastKing一步法RT-PCR试剂盒要求进行。
模拟样品的制备：将1瓶SBMV及TRSV阳性对照掺入2g已粉碎的阴性大豆样品中，充分混匀，取0.1g作为模拟样品。
实际样本选择皱缩的或带病斑的大豆种子，经粉碎均匀后取0.1g作为待测样品。
实施例2结果分析
2.1一步法双重DPO-RT-PCR检测方法建立
通过调整优化一步法DPO-RT-PCR反应体系，确定引物终浓度为0.2μmol/L 的时候扩增效果最佳，结果如图1所示，经琼脂糖凝胶电泳检测在609bp及1060 bp处有特异性条带，与目的条带一致，表明本发明建立的一步法双重 DPO-RT-PCR可以运用于SBMV及TRSV两种病毒的检测。
2.2一步法双重DPO-RT-PCR特异性评价
如图2，仅含SBMV及TRSV的样品扩增获得目的条带，其余8个样品及空白对照未发生特异性扩增，表明所建立的一步法双重DPO-RT-PCR检测方法具有良好的特异性，可用于SBMV及TRSV两种病毒的检测。
2.3一步法双重DPO-RT-PCR灵敏度评价
如图3所示，当DNA模板量在0.02ng/μL以上时，能得到较好的扩增效果，当DNA模板量在0.002ng/μL时虽有扩增条带但是条带十分微弱，几近于无，肉眼很难观察。表明本发明建立的一步法双重DPO-RT-PCR灵敏度可达0.02 ng/μL。
2.4一步法双重DPO-RT-PCR退火温度敏感性试验
由图4可知，在本发明DPO-RT-PCR退火温度敏感性实验中，退火温度设定在45～65℃五个梯度，利用一步法双重DPO-RT-PCR检测体系均能高效扩增出目的基因，退火温度对扩增结果影响不明显。表明所建立的一步法双重 DPO-RT-PCR检测方法退火温度范围较宽并且对退火温度不敏感。
2.5一步法双重DPO-RT-PCR对模拟样品检测结果
如表3所示，分别利用一步法双重DPO-RT-PCR及RT-PCR对10份模拟样品及10份实际样品进行检测，两者检测结果一致，表明本发明建立的检测方法可以应用于实际样品的检测中。
表3实际样品及模拟样品检测结果
Figure BDA0002815749640000071
Figure BDA0002815749640000081
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湛江海关技术中心
<120> 一种利用多重DPO-RT-PCR检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒的方法
<130> 20201203
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(24)
<223> n is i
<400> 1
gtagtggtgc gtgtgccaan nnnngtgtgg tccaa 35
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n is i
<400> 2
caagggcctt gaccctgccg cnnnnnggta gtttaaag 38
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(27)
<223> n is i
<400> 3
gttacgttgt tcttttactc tcnnnnnatt ttaattg 37
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(29)
<223> n is i
<400> 4
ataccgaaca acttcatgtt cagtnnnnnt taaaacgtcc ac 42

Claims (8)

1.一种利用多重DPO-RT-PCR检测南方菜豆花叶病毒和/或烟草环斑病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DPO-PCR引物对，所述DPO-PCR引物对的序列如下：
SBMV-DPOf：GTAGTGGTGCGTGTGCCAAIIIIIGTGTGGTCCAA；
SBMV-DPOr：CAAGGGCCTTGACCCTGCCGCIIIIIGGTAGTTTAAAG；
或
TRSV-DPOf：GTTACGTTGTTCTTTTACTCTCIIIIIATTTTAATTG；
TRSV-DPOr：ATACCGAACAACTTCATGTTCAGTIIIIITTAAAACGTCCAC；
其中，“I”表示次黄嘌呤。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DPO-PCR引物对在体系中的浓度为0.1～0.6μmol/L。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DPO-PCR引物对在体系中的浓度为0.2μmol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性标准品、阴性对照品、PCR预混液和无核酸酶水。
5.权利要求1所述的试剂盒在检测南方菜豆花叶病毒和/或烟草环斑病毒中的应用。
6.根据权利5所述的应用，其特征在于，所述检测过程中退火温度为45～65℃。
7.根据权利5所述的应用，其特征在于，所述检测反应条件为42℃30min；95℃3min；94℃30s，60℃45s，72℃1min，35个循环；72℃5min。
8.根据权利5所述的应用，其特征在于，所述检测包括将PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中成像分析的步骤。
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