CN115261492A - 贵州玛瑙红樱桃植原体的lamp快速检测方法 - Google Patents

贵州玛瑙红樱桃植原体的lamp快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种樱桃植原体病害的LAMP快速检测方法，本发明针对樱桃植原体16SrDNA基因保守序列的6个区域设计2对特异性引物，利用一种链置换DAN聚合酶在等温60℃条件下，可实现1小时内的核酸高效扩增，4条引物对靶基因6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高效性；LAMP无需模板的热变性及长时间温度的循环，只需在恒温条件下扩增，反应速度可大大的提高。该检测技术具有快速高效、操作简便、结果可视化、成本低，易在基层推广的特点，将在樱桃植原体的早期检测、田间诊断及樱桃种苗带菌检测发挥很大的作用，为樱桃植原体病原检测、科学防控等提供技术支撑和参考依据。

Description

贵州玛瑙红樱桃植原体的LAMP快速检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用环导等温扩增技术检测玛瑙红樱桃植原的技术领域。
背景技术
植原体是一类无细胞壁、不能人工培养、存在于植物筛管内的专性寄生菌，世界各地已报道植原体可引起1000余种各类植物系统性病害，涵盖农作物、园艺、花卉、果树和林木等。该病害传播性强、症状明显、危害较大，可不同程度引起植物生长发育异常或变异，甚至造成植株死亡。樱桃植原体病害就是其中一种，近年来该病害已经成为威胁樱桃产业发展最为重要的病害之一，主要引起樱桃花变叶（绿）及花器官、叶片、果实的生长发育异常和变异，并最终导致植株2~5a（年）内迅速死亡，对我国乃至世界樱桃产业造成了非常重大的损失。早期的检测，及时发现感病植株中植原体的存在，为进一步开展樱桃植原体病害研究与防控具有重要意义，因此建立和应用先进的病原检测技术至关重要。
目前广泛应用于植原体的分子检测技术主要是巢式PCR（Nested PCR）和实时荧光PCR（Real-time PCR）等，这些检测方法需要的仪器设备较昂贵，且检测时间较长、过程繁琐，对操作人员有较高的技术要求，限制了这些技术在基层单位、中小型企业的推广。换介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification, LAMP）是Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术（Notomi, 2002）。该技术具有特异性强、操作简单快捷、无需要昂贵和复杂的实验仪器、无须电泳及紫外观察，可直接通过肉眼观察检测结果等优点。除此之外，与PCR技术相比，该技术耗时短、灵敏度高，非常适合于基层及现场的使用。
LAMP方法被广泛的应用于植物病原菌的检测，近年来该技术也在一些植原体的检测中得到了应用。如以16S RNA基因作为靶基因建立了海南槟榔黄化植原体和枣疯病植原体的LAMP检测方法；韩剑等以tuf基因作为靶标建立新疆杏褪绿卷叶植原体了LAMP检测技术，王洁等以tuf基因为靶标建立的5种植原体的环介导恒温扩增技术。但目前，尚未见利用LAMP方法检测樱桃花变绿植原体病害的报道。
发明内容
在樱桃植原体病害的检测技术中专门利用LAMP技术检测的尚未见有报道，本发明目的在于为樱桃植原体病害提供一种快速，灵敏，简便的田间检测方法，为樱桃植原体的早期诊断和检测提供技术支撑。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案来实现。本发明首先根据樱桃植原体16SrDNA基因的保守序列，设计了樱桃植原体LAMP引物对，然后确定反应条件和各试剂浓度的优化，最后建立了樱桃植原体的LAMP快速检测体系，该方法在1h即可得到检测结果，具有高效、快速、简便、结果可视化的特点。
1、本发明建立的樱桃植原体的LAMP检测方法，步骤如下：
（1）设计了一套用于检测樱桃植原体的LAMP引物对，引物序列所示：
F3:5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’
B3:5’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’
FIP:5’-GCGTACGTACTACTCAGGCGGAGTACTAAGTGTCGGGGCAAC-3’
BI3:5’-CCGCACAAGCGGTGGATCATAGCTTCGCAGAGTATGTCAA-3’
（2）提供的樱桃植原体的LAMP检测方法，首先从待测样品中制备总DNA模板，并配置LAMP反应体系，然后通过LAMP反应体系对模板进行扩增。
（3）通过肉眼观察反应管中颜色变化或是通过琼脂糖凝胶电泳检测样品是否有植原体病害的存在。
2、本发明提供了一种樱桃植原体的检测方法，具体的步骤包括如下：
（1）设计一套用于樱桃植原体的LAMP引物，其设计方法为：在Genbank中搜集不同组的植原体16SrDNA基因核苷酸序列，利用DNAMan软件对上述序列进行比对、分析一致性，找出樱桃植原体与其他植原体的基因位点差异和高度保守区域，利用LAMP的引物在线软件Primer Explorer V5针对樱桃植原体16SrDNA基因保守序列的6个区域设计出1套特异性引物，分别为1对YT-F3、YT-B3外侧引物和1对YT-FIP、YT-BIP内侧引物，引物在上海生物工程公司合成。引物序列如下所示：
F3:5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’
B3:5’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’
FIP:5’-GCGTACGTACTACTCAGGCGGAGTACTAAGTGTCGGGGCAAC-3’
BI3:5’-CCGCACAAGCGGTGGATCATAGCTTCGCAGAGTATGTCAA-3’
（2）植物总DNA的制备，其方法是：根据植物基因组提取试剂盒具体步骤提取樱桃叶片的总DNA，放置于-20℃冰箱中备用。
（3）配置25µL的LAMP反应体系：8 U/µL Bst2 .0聚合酶为1.0 µL；10xIsothermalAmplificationBuffer缓冲液为2.5 µL；10 mM dNTPs为3.5 µL ；100 mM MgSO4为1.0 µL；20 µM内引物2.0 µL；10 µM外引物0.5 µL；模板DNA 1.0 µL;补足无菌超纯水至25µL。
（4）利用LAMP反应程序对模板进行扩增：将配置好的所有组分的混合物放置在恒温60℃的水浴锅中反应60 min，80℃灭活5 min。
（5）LAMP检测结果的判断方法
分析方法1：通过肉眼观察反应管中的颜色变化。如果反应管中扩增产物颜色变为翠绿色则判定为阳性，及样品有植原体的存在，若扩增产物颜色仍为橙色则为阴性
分析方法2：。反应产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳25分钟，凝胶成像系统拍摄观察。如果出现梯形条带，则为阳性，即表明样品感染植原体，反之则为阴性，表明无植原体感染。
本发明有益效果
（1）灵敏度高：对樱桃花变绿植原体检测的灵敏度比普通的PCR方法高100倍以上。
（2）检测的高效性：从DNA的提取，到检测完成所用时间约2小时，而常规PCR需4小时以上。
（3）经济实用、操作简便：不需要昂贵复杂的仪器，如PCR仪、成像系统,只需要水浴锅或金属浴锅就能完成检测反应。
（4）结果明显：检测结果可直接通过肉眼观察鉴定，阳性结果为翠绿色，阴性结果为橙色。
（5）安全性：避免了常规PCR检测过程中使用的溴化乙锭等有毒化学药品，对人和环境较为安全。
（6）总之，本发明将LAMP等温扩增技术应用于樱桃植原体的检测，对此类病害的早期诊断和检测具有重要意义，同时可以免除高昂的仪器投入，适合于基层推广使用。
附图说明
图1：玛瑙红樱桃花变绿植原体LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中M表示DL2000Marker，泳道1-2是樱桃花变绿植原体，泳道3-4为阴性对照和空白对照；
图2：玛瑙红樱桃花变绿植原体LAMP扩增产物的可视化检测结；
图中1-2为樱桃花变绿植原体，3-4为阴性对照和空白对照；
图3：LAMP 检测灵敏度的可视化结果。图中的1-8代表以10倍的梯度稀释的总DNA浓度，分别为：37.2ng/μL、3.72ng/μL、3.72X10-1ng/μL、3.72X10-2ng/μL、3.72X10-3ng/μL、3.72X10-4ng/μL、3.72X10-5ng/μL、3.72X10-6ng/μL；
图4：LAMP检测灵敏度的琼脂糖凝胶电泳结果；
图中M表示DL2000Marke，1-8代表以10倍的梯度稀释的总DNA浓度，分别为：37.2ng/μL、3.72ng/μL、3.72X10-1ng/μL、3.72X10-2ng/μL、3.72X10-3ng/μL、3.72X10-4ng/μL、3.72X10-5ng/μL、3.72X10-6ng/μL；
图5：PCR检测灵敏度的琼脂糖凝胶电泳结果；
图中M表示DL2000Marker，泳道1-7为以10倍的梯度稀释的总DNA浓度，分别是：37.2ng/μL、3.72ng/μL、3.72X10-1ng/μL、3.72X10-2ng/μL、3.72X10-3ng/μL、3.72X10-4ng/μL；
图6：田间樱桃植原体部分可视化检测结果；
图中1-7是来自大方的7份田间樱桃样品，8-18采自纳雍的11份樱桃样品，19-20分别是阴性对照和空白对照；
图7：田间樱桃植原体部分增琼脂糖凝胶电泳结果；
图中1-7是来自大方的7份田间樱桃样品，8-18采自纳雍的11份樱桃样品，19-20分别是阴性对照和空白对照；
图8：田间樱桃植原体的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果；
图中M表示DL2000Marker，1-4为来自大方的樱桃样品，5为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
1、实验试剂来源：植物基因组提取试剂盒购买于北京天根生化科技有限公司；Bst2 .0 DNA聚合酶购买于NEB（NewEenglandBiolabs）公司；SYBRGreenI染料购于上海瑞楚生物公司；dNTPs、MgSO4购于上海生工生物股份有限公司。
2、实验材料：以PCR检测到含有植原体的樱桃叶片总DNA为材料，健康的樱桃组培苗叶片总DNA和灭菌蒸馏水为阴性对照。
实施列1 LAMP引物的制备
1、引物的设计方法：在Genbank中搜集不同组的植原体16SrDNA基因核苷酸序列，利用DNAMan软件对上述序列进行比对分析一致性，找出樱桃植原体与其他植原体的基因位点差异和高度保守区域，利用LAMP的引物在线软件Primer Explorer V5针对樱桃植原体16SrDNA基因保守序列的6个区域设计出1套特异性引物，分别为1对YT-F3、YT-B3外侧引物和1对YT-FIP、YT-BIP内侧引物，引物在上海生物工程公司合成。引物序列如下：
YT-F3:5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’
YT-B3:5’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’
YT-FIP:5’-GCGTACGTACTACTCAGGCGGAGTACTAAGTGTCGGGGCAAC-3’
YT-BIP:5’-CCGCACAAGCGGTGGATCATAGCTTCGCAGAGTATGTCAA-3’
2、引物的准备：引物合成后，用灭过菌的超纯水分别将引物稀释成100 µmol/L，置于-20℃冰箱备用。
实施例2玛瑙红樱桃植原体环介导等温扩增快速检测方法的建立
1、植物总DNA的提取
采用植物基因组提取试剂盒提取待检测樱桃叶片总DNA，保存在-20℃的冰箱备用。
2、LAMP扩增体系建立及优化
根据已报道的LAMP实验条件和预实验初步建立樱桃植原体LAMP检测体系。进一步对反应体系中反应程序及dNTPs、MgSO4、Bst2.0DNA聚合酶、引物等影响因素进行优化，每个优化条件重复3次。10mM dNTPs（0.5μL、2.0μL、3.5μL、5.0μL、6.5μL、8.0μL、9.5μL)，100mMMgSO4（0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.0μL、3.0μL、3.5μL），8U/μLBst2.0DNA聚合酶（0.1μL、0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL），外侧引物和内侧引物的浓度比：1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，10xIsothermalAmplificationBuffer 2.5μL，反应模板DNA 1.0μL，ddH2O补足至25μL，充分混匀。扩增温度（54℃、57℃、60℃、63℃、66℃、69℃、72℃）；在最优的扩增温度的条件下，反应时间分别为：20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min。
每次的实验以无菌超纯水作空白对照、樱桃组培苗总DAN为阴性对照，在恒温的水浴锅中进行等温扩增。
LAMP反应结果的判断：如图1所示，通过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的拍摄查看是否有梯形条带，若出现梯形条带则为阳性，反之为阴性。或通过观察反应管中颜色的变化，如图2所示，如果扩增产物变为翠绿色则判定为阳性，即该样品感染植原体，若扩增产物仍然为橙色，则为阴性，无植原体。
通过对各反应条件的优化后，最终建立樱桃植原体LAMP最佳检测体系：总DNA模板：1.0 μL，各0.5 μL的10μMYT-F3/YT-B3外侧引物和各2.0 μL的20μMYT-FIP/YT-BIP内侧引物，3.5μL的10mMdNTPs，1.5μL的100mMMgSO4，1.0μL的8U/μLBst2.0DNA聚合酶，2.5 μL的10xIsothermalAmplificationBuffer，ddH2O补足至25 μL。
最佳反应条件为：60℃恒温扩增60min，80℃灭活5min。
实施例3 LAMP灵敏度检测
采用植物基因组提取试剂盒提取感染植原体的樱桃叶片总DNA作为模板，利用灭过菌的超纯水按照10倍的梯度对植物总DAN进行稀释，按照上述实施列2中建立的最佳反应体系进行环介导等温扩增，同时也进行常规PCR检测的灵敏度的检测。
结果如图3和图4所示，建立的LAMP方法可检测到的最小DNA浓度为：3.72x10-4ng/μL。
常规PCR检测：以10的倍梯度稀释的DNA为模板，用引物对R16mF2/R16mR2进行PCR扩增。20 µL的PCR扩增体系：样品总DNA 1.0 μL，2xTap PCR Master Mix 10μL，R16mF2/R16mR2(10μmol/L)各1.0 μL，添加ddH2O至体系为20μL。PCR扩增程序：94℃预变性94℃5min；94℃变性40sce，60℃退火温度1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
结果如图5所示，常规PCR扩增出预期片段约1.4kb，检测出最小的DNA浓度：3.7210-2ng/μL。
由此可知，本发明建立的环介导等温扩增检测方法的灵敏度比常规PCR高 100倍。
实施例4 LAMP检测体系的稳定性及应用
应用建立的LAMP检测体系及常规PCR检测体系，对采自贵州不同地区威宁、纳雍，福泉等不同地区的86份樱桃样品分别进行检测，比较两者检测方法的阳性检出率和符合率，确定建立的樱桃花变绿植原体LAMP检测体系的稳定性和可行性。
结果显示LAMP方法检测出30份阳性样品（如图6，图7），常规PCR检测出4份阳性样品（如图8），这两种方法的检出率分别为33.88 %和4.65%。以上结果表明常规PCR检测方法灵敏度较低，建立的LAMP方法比常规PCR方法更灵敏，可以稳定地实现对贵州樱桃植原体的田间检测。

Claims (3)

1.一种玛瑙红樱桃植原体环介导等温扩增检测方法，其方法的特征具体包括如下：
提供2对用于检测樱桃植原体的LAMP引物序列，长度分别为：17 bp、19bp、42bp和40bp寡聚核苷酸序列，分别命名为YT-F3/YT-B3、YT-FIP/YT-BIP；
（1）所得的两对LAMP引物的序列如下：
YT-F3：5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’
YT-B3：5’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’
YT-FIP：5’-GCGTACGTACTACTCAGGCGGAGTACTAAGTGTCGGGGCAAC-3’
YT-BIP：5’-CCGCACAAGCGGTGGATCATAGCTTCGCAGAGTATGTCAA-3’；
提供的玛瑙红樱桃植原体LAMP检测方法，首先从待测样品中制备DNA模板，并配置LAMP反应体系，然后对模板DNA扩增，最后直接观测反应管中的颜色变化，或通过琼脂糖凝胶电泳检测，判断樱桃是否携带植原体病原菌。
2.如权利要求1所述检测樱桃植原体的2对LAMP引物，其设计方法是：在Genbank中搜集不同组植原体16SrDNA基因核苷酸序列，利用DNAMan软件对上述序列比对分析一致性，找出樱桃植原体与其他植原体的基因位点差异和高度保守区域，利用LAMP引物在线软件PrimerExplorer V5针对樱桃植原体16SrDNA基因保守序列的6个区域设计出1套特异性引物，分别为1对外侧引物YT-F3/YT-B3和1对内侧引物YT-FIP/YT-BIP。
3.如权利要求1所述的检测方法，所述的樱桃植原体LAMP检测方法具体包括如下步骤：
（1）采用植物基因组提取试剂盒提取待测样品叶片总DNA作为模板；
（2）以提取的叶片总DNA为模板，以健康的组培苗作为阴性对照，无菌超纯水作为空白对照，利用权利要求1所述的引物对进行LAMP检测；
（3）所述的LAMP检测的反应体系为25µL：1.0 μL的8 U/µL Bst2 .0聚合酶；2.5 μL的10xIsothermalAmplificationBuffer缓冲液；1.0 μL的10 mM dNTPs；1.0 μL的100 mMMgSO4；各2.0 μL的20 mM YT-F3/YT-B3；各0.5 μL的10 mM YT-FIP/YT-BIP；1.0 μL的模板DNA；补足无菌超纯水至25µL；
（4）所述的环介导恒温扩增反应程序: 60℃恒温60 min，80℃灭活5min；
（5）LAMP检测的判断方法：方法1. 通过肉眼观察反应管中颜色的变化，若扩增产物为翠绿色则判定为阳性，即样品中感染有植原体，若扩增产物为橙色则判定为阴性；方法2.琼脂糖凝胶电泳，反应结果通过1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上成像，若出现梯形条带判定为阳性，反之为阴性。
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