CN102719431B - 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法 - Google Patents
一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法，引物序列包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：正向引物：GGCAGGAAGAATAGCCACTAA；反向引物：AGCGATCCCACCACCAG。检测污泥中四环素类抗性基因tetB的方法包括：(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录下达到荧光阈值时的循环数；(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetB质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetB的含量。本发明的引物序列及检测方法实现了污泥中四环素类抗性基因tetB的快速精确定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法。
背景技术
抗生素是人类20世纪最重要的医学发现之一，然而近年来，抗生素在人类医疗以及养殖业方面滥用情况越发严重，越来越多的抗生素进入环境已成为不争的事实。环境中抗生素的存在除了导致化学药物污染外，更诱导细菌产生的抗生素抗性基因污染，并由此可能引发的生态问题亦令人关注。因为抗生素在环境中的浓度增长所带来的抗生素选择性压力的加大，将加速抗生素耐药性细菌以及抗生素抗性基因在环境中的出现和传播。同时，也增加了人类致病菌获得抗生素抗性基因、对抗生素产生抗性的几率。因此，抗生素抗性基因的存在及传播将严重威胁人类的健康。
抗生素抗性基因可以在环境中长期残留，并且可以在不同环境介质中的迁移、转化。抗生素的大量使用，使水环境不仅成为耐药基因的储库，也成为耐药基因扩展和演化的媒介，因此需要特别加强水环境中抗生素抗性基因的环境行为研究。污水处理厂因为进水中包含重金属、抗生素、洗涤剂、季铵盐等物质，这些物质也可以协同或交叉引起微生物抗药性，且污水处理厂微生物分布密集，极易诱导微生物产生抗性基因；而污水处理厂出水被认为是受纳水体中抗生素抗性基因的主要来源。并且国外相关研究指出，污水处理厂污泥中可以检出多种四环素类抗性基因，抗性基因不仅种类丰富，相对含量也较高。
目前国内对于抗生素抗性基因的危害性还未给予应有的重视，有关抗生素抗性基因的研究大多集中于临床微生物中抗性基因的定性分析方面，近年来有一些研究利用普通PCR-DGGE等技术来对环境中的四环素抗性基因进行直接检测，也有许多关于微生物对四环素和其他类抗生素表型抗性的研究。
然而目前研究所采用的方法只能研究可培养微生物的抗性，但是这些检测手段缺少定量结果，对不可培养微生物的抗性基因也无法检测。
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因此使用荧光定量PCR技术可以从数量上更为直观地探讨环境中抗性基因的变化，而且由于这种方法不依赖于微生物培养，因此也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为全面和可信。因此采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitive PCR)技术作为研究手段，从数量上更为直观地探讨环境中抗性基因的变化，从而寻找有效措施阻止抗生素抗性基因的产生及其在环境中的广泛传播是一项十分紧迫的任务。
发明内容
本发明提供了一种测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法，实现污泥中四环素类抗性基因tetB的快速精确定量检测。
一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：
正向引物：GGCAGGAAGAATAGCCACTAA；
反向引物：AGCGATCCCACCACCAG。
本发明还提供了一种利用所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性基因tetB的方法，包括：
(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数；
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetB质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetB的含量。
所述的定量PCR的反应体积为15ul：2ul DNA溶液，7.5ul SYBRPremix Ex Taq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul浓度为10mM的正向引物，0.3ul浓度为10mM的反向引物，4.6ul ddH2O。
所述DNA的提取采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒，用Fast DNASpin Kit for soil试剂盒提取的DNA样品可以保存半年甚至多年，有利于将不同季节、不同地区污泥样品进行对比分析。将反应体系减少为15ul，大大节约了检测成本，使得高通量检测成为可能。
步骤(2)中所述标准曲线的标准品的制备方法为：利用所述的正向引物和反向引物做普通PCR扩增；扩增序列用商业化凝胶回收试剂盒纯化；纯化后的序列接入载体并转化入感受态细胞；将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12-16h，通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑，挑选白色阳性克隆子用LB培养液扩大培养；待菌液混浊后，取1ml菌液送公司测序插入基因片断，其余3-4ml菌液用来提取质粒；使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度，确保质粒DNA的A260/A280比值在1.8左右。符合要求的质粒作为标准品绘制标准曲线。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法不依赖于微生物培养，与传统微生物培养法相比，也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为全面和可信，并且用Fast DNA Spin Kit for soil试剂盒提取的DNA样品可以保存半年甚至多年，有利于将不同季节、不同地区污泥样品进行对比分析；
(2)通过普通PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性基因tetB的存在与否；通过荧光定量PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性基因tetB含量，为污泥处置提供技术指导；
(3)优化了定量PCR实验的反应液体系，对于反应孔壁上残留液，通过多次混匀离心以及添加ROX校准染料克服移液误差，将反应体系减少为15ul，而一般实验需要20ul甚至更多的反应液才能得出准确的数据，大大节约了检测成本，使得高通量检测成为可能。
附图说明
图1是本发明的引物序列对四环素类抗药基因tetB的PCR扩增结果图。
其中M为maker；C为阴性对照；1、2、3、4、5为5个污泥样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取DNA的步骤如下：
1)将0.1g冻干污泥样品放入Lysing Matrix E管中，加入978ulSodium Phosphate缓冲液和122ul MT缓冲液，震荡混匀；
2)将LYsing Matrix E管于14000g的离心力下离心10min，然后把上清液转移到2.0ml的离心管中，加入250ul PPS；并上下颠倒10次；
3)将2ml离心管于14000g的离心力下离心5min，将上清液转移至10ml的离心管中，并且重新悬浮Binding Matrix沉淀物，并取1ml加入到10ml离心管中。
4)静置3min后，去除500ul上清液，并重新悬浮沉淀物，然后转移600ul悬浊物到SPINTM Fliter中，于14000g的离心力下离心1min，然后将上层离心管置于新的2ml离心管中，继续加入悬浊液，重复离心操作。
5)SPINTM Fliter置于新的2ml离心管中，加入500ul SEWS-M，用枪头重新悬浊SPINTM Fliter内颗粒，然后于14000g的离心力下离心1min；
6)再次将SPINTM Fliter置于新的2ml离心管中，不加入任何溶液，然后于14000g的离心力下离心2min，离心后将SPINTM Fliter置于室温下5min；
7)将SPINTM Fliter置于新的1.5ml离心管中，加入100ul的DES溶液，静置1分钟，然后于14000g的离心力下离心1min，收集下层离心管中的溶液即为提取并纯化完成的DNA。
实施例1引物的设计
(1)从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网点的genbank中下载四环素类抗性基因tetB基因序列(accession no.FJ411063.1，FJ411076.1，FJ411074.1，FJ411068.1，FJ411062.1，GQ229181.1，GQ229183.1，GQ229175.1，GQ229177.1，GQ229173.1，GQ229169.1，GQ229165.1，GQ229182.1，GQ229178.1，GQ229174.1，GQ229170.1，GQ229166.1，GQ229177.1)；
(2)将(1)得到的引物序列导入MEGA5.0，使用alignment进行序列比对，去除差异性较高的片段，找到不同Accession No.的四环素类抗性基因tetB保守区；
(3)将(2)得到的保守区序列输入到Primer Premier 5.0，设计出满足定量PCR要求的引物，由于定量PCR要求扩增产物片段长度为75-200bp，经过筛选，确定一对扩增产物片段长度为151bp的引物，即：
正向引物tetB-F：5′-GGCAGGAAGAATAGCCACTAA-3′(SEQ IDNO：1)；
反向引物tetB-R：5′-AGCGATCCCACCACCAG-3′(SEQ ID NO：2)；
(4)引物特异性的验证：
软件验证：采用NCBI的引物设计和特异性检验工具Primer-BLAST验证引物的特异性，显示引物特异性很好；
实验验证：验证结果见实施例2和4。
实施例2定性检测
(1)FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取污泥样品中的DNA，用实施例1中设计的四环素类抗药基因tetB引物序列，对污泥样品提取的DNA进行普通PCR扩增，PCR产物与1/6体积6×loading buffer dye混匀，使用经EB染色的1.5％的琼脂糖凝胶，100bp marker，在100-110V电压下电泳35分钟，检测PCR产物存在性，结果如图1所示，结果显示有PCR产物存在。
(2)使用BioSpin胶回收试剂盒纯化PCR产物，接入pMD19-T载体并转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
(3)将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12-16h，通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑，挑选2个阳性克隆子用LB培养液扩大培养，待菌液混浊后，取1mL菌液送上海基康生物技术有限公司测序插入的基因片断。
测序得到2个DNA序列片段大小均为151bp，其碱基序列如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4。
(4)测序结果通过使用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的BLAST进行序列同源性检索比对。测序序列对核酸库的比对，直接比较核酸序列的同源性，同源性良好，证明本发明设计引物特异性高。
实施例3标准曲线的制作
(1)实施例2中LB培养液扩大培养后的混浊菌液，1ml送去测序，其余的2-4ml菌液使用QIAprepTM Spin Miniprep Kit(QIAGEN)提取质粒，使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度，确保质粒DNA的A260/A280比值在1.8左右，作为标准品。
(2)计算出质粒拷贝数，质粒拷贝数的计算公式为：拷贝数＝(质量÷分子量)×6.02×1023。
(3)计算得到四环素类抗性基因tetB的拷贝数，按10倍为稀释梯度稀释为标准曲线，并且使质粒拷贝数保持在108-103之间。
(4)标准曲线的反应体系为：2ul DNA溶液(标准品)，7.5ul SYBRPremix Ex Taq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul 10mM正向引物，0.3ul 10mM反向引物，4.6ul ddH2O。
每一次定量PCR反应都需要加入标准品进行实验，标准曲线中横坐标为四环素类抗性基因tetB质粒拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。
实施例4定量检测
用实施例1中设计的引物序列进行实时荧光定量PCR检测待测污泥中四环素类抗药基因tetB的含量。
(1)采集城市生活污水处理厂剩余污泥，使用冷冻干燥机冻干后作为待测样品；
(2)取待测样品0.1g，用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒按照标准步骤提取DNA，调节浓度至10ng/ul并保存待测；
(3)配制定量PCR反应的反应液体系：7.5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul浓度为10mM浓度的正向引物，0.3ul浓度为10mM浓度的反向引物，4.6ul ddH2O。每个样品做三次重复，使用10ul、50ul量程的排枪操作，降低移液枪枪头残留溶液的影响；
(4)将反应液体系转移至96孔反应板的反应孔中，将步骤(1)中提取的DNA取2ul，及2ul实施例3中的标准品加入对应的反应孔中通过StepOne Software v2.0点击开始实验。
反应条件为：95℃下热变性5分钟，然后进入40个循环的扩增阶段，95℃变性3秒，60℃扩增30秒，72℃延伸30秒，延伸的同时扫描荧光信号。
根据每一轮扩增扫描到的信号强弱对比标准品的信号强弱得出样品中四环素类抗药基因tetB的浓度。
实验结束后系统即自动生成标准曲线和待测样品的浓度，三个重复实验结果拷贝数分别为3.63×107 copies/ul、3.77×107 copies/ul l、3.51×107copies/ul，说明待测污泥样品中含有四环素类抗药基因tetB，说明利用实施例1中设计的引物序列进行定量PCR能有效检测待测污泥样品中的四环素类抗药基因tetB含量。
Claims (2)
1.一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：
正向引物：GGCAGGAAGAATAGCCACTAA；
反向引物：AGCGATCCCACCACCAG。
2.一种利用权利要求1所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性基因tetB的方法，其特征在于，包括：
（1）提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数；
（2）将步骤（1）中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetB质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetB的含量；
所述的定量PCR的反应体积为 15 μ l：2μl DNA溶液，7.5μ l SYBRPremix Ex Taq溶液，0.3μ l ROX Reference溶液，0.3μ l 浓度为10mM的正向引物,0.3μ l 浓度为10mM的反向引物，4.6μ l ddH2O。
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