CN102732627B - 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法 - Google Patents

一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102732627B
CN102732627B CN 201210210985 CN201210210985A CN102732627B CN 102732627 B CN102732627 B CN 102732627B CN 201210210985 CN201210210985 CN 201210210985 CN 201210210985 A CN201210210985 A CN 201210210985A CN 102732627 B CN102732627 B CN 102732627B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tetg
primer
resistant gene
dna
quantitative pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN 201210210985
Other languages
English (en)
Other versions
CN102732627A (zh
Inventor
陈红
张明美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN 201210210985 priority Critical patent/CN102732627B/zh
Publication of CN102732627A publication Critical patent/CN102732627A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102732627B publication Critical patent/CN102732627B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法,引物序列包括正向引物和反向引物,其碱基序列为:正向引物:TTATCGCCGCCGCCCTTCT;反向引物:TCATCCAGCCGTAACAGAAC。检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法包括:(1)提取待测污泥样品中的DNA,以提取的DNA为模板,用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数;(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG质粒标准品的标准曲线,得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量。本发明的引物序列和方法实现了污泥样品中四环素类抗性基因tetG的快速精确定量检测。

Description

一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体涉及一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法。
背景技术
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一,长期以来,抗生素在医疗领域的广泛应用,对控制人类感染性疾病发挥了巨大的作用。同时,由于兽药抗生素能够预防动物疾病和一定程度上促进生长的双重功效,因此,常以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中,出现在养殖业和畜牧业中。由于抗生素在畜牧业和养殖业中的长期滥用,在养殖动物肠道内诱导出抗性菌株,这些编码抗生素抗性基因的菌株是环境中抗生素抗性基因最重要的来源,携带抗性基因的抗性细菌如果在全球传播,可能导致大范围的对环境生物、人类健康和社会经济的潜在不利影响。环境中的抗生素抗性基因的污染越来越被人们视为一种生态性问题。
相关研究表明,污水处理厂因为进水中包含重金属、抗生素、洗涤剂、季铵盐等物质,这些物质也可以协同或交叉引起微生物抗药性,且污水处理厂微生物分布密集,极易诱导微生物产生抗性基因;而污水处理厂出水被认为是受纳水体中抗生素抗性基因的主要来源。并且也有相关研究指出,污水处理厂污泥中可以检出多种四环素类抗性基因,抗性基因不仅种类丰富,相对含量也较高。
近些年来,我国污水处理工作也在高速发展中,污水处理厂在解决我国水污染问题方面起到了巨大的作用,然而,污水处理厂的高速发展,产生的污泥问题也日益突出,因此对于污泥中抗性基因进行精确定量意义重大。
近年来有许多关于微生物对四环素和其他类抗生素表型抗性的研究,然而目前研究所采用的方法只能研究可培养微生物的抗性,而对不可培养微生物的抗性及微生物体内导致这些抗性的特定基因无法检测。因此近年来越来越多的研究采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitive PCR)技术作为研究手段,从数量上更为直观地探讨环境中抗性基因的变化,而且由于这种方法不依赖于微生物培养,因此也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因,使最终得到的量化结果更为全面和可信。
目前国外对环境中四环素抗性基因的定量研究主要集中于水环境,国内关于环境中抗生素抗性基因的研究才刚刚起步,而污水处理厂经常被认为是抗性基因的重要储存库,因此对于污泥中四环素类抗药基因为精确定量是十分必要的。
发明内容
本发明提供了一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法,能对城市污水处理厂污泥中四环素类抗药基因tetG进行快速精确定量。
一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列,包括正向引物和反向引物,其碱基序列为:
正向引物:TTATCGCCGCCGCCCTTCT;
反向引物:TCATCCAGCCGTAACAGAAC。
本发明还提供了一种利用所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法,包括:
(1)提取待测污泥样品中的DNA,以提取的DNA为模板,用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数;
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG质粒标准品的标准曲线,得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量。
所述定量PCR的反应体系为:2ul DNA溶液,7.5ul SYBR Premix ExTaq溶液,0.3ul ROX Reference溶液,0.3ul浓度为10mM的正向引物,0.3ul浓度为10mM的反向引物,4.6ul ddH2O。
步骤(2)中所述标准曲线的标准品的制备方法为:利用所述的正向引物和反向引物做普通PCR扩增;扩增序列用商业化凝胶回收试剂盒纯化;纯化后测量DNA含量、纯度并调节至合适浓度;接入载体并转化入感受态细胞;将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12-16h,通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑,挑选白色阳性克隆子用LB培养液扩大培养;待菌液混浊后,取1ml菌液送公司测序插入的基因片断,其余3-4ml菌液用来提取质粒;使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度,确保质粒DNA的A260/A280比值在1.8左右,符合要求的质粒作为标准品绘制标准曲线。
所述DNA的提取方法为:用FastDNA Spin Kit for soil试剂盒提取。采用该方法提取DNA具有以下优点:(1)节约时间,只需要2个小时即可提取到样品的DNA,与传统的有机溶剂抽提法相比可以减少预处理的时间;(2)DNA提取效率稳定,且不易发生DNA降解,提取结果具有很好的重复性;(3)避免使用三氯甲烷等有机溶剂,保障实验操作人员的工作环境。
本发明的有益效果:
(1)本发明的方法不依赖于微生物培养,与传统微生物培养法相比,也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因,使最终得到的量化结果更为全面和可信,并且用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取的DNA样品可以保存半年甚至多年,有利于将不同季节、不同地区污泥样品进行对比分析;
(2)通过普通PCR反应,可以确定污泥中四环素类抗性基因tetG的存在与否;通过实时荧光定量PCR反应,可以确定污泥中四环素类抗性基因tetG含量,为污泥处置提供技术指导;
(3)优化了定量PCR实验的反应液体系,对于反应孔壁上残留液,通过多次混匀离心以及添加ROX校准染料克服移液误差,将反应体系减少为15ul,而一般实验需要20ul甚至更多的反应液才能得出准确的数据,大大节约了检测成本,使得高通量检测成为可能。
附图说明
图1是本发明引物序列对四环素类抗药基因tetG的PCR扩增结果图。
其中M为maker;C为阴性对照;1、2、3为3个污泥样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外,在阅读了本发明的内容之后,本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取DNA的步骤如下:
1)将0.1g冻干污泥样品放入Lysing Matrix E管中,加入978ul SodiumPhosphate缓冲液和122ul MT缓冲液,震荡混匀;
2)将Lysing Matrix E管于14000g的离心力下离心10min,然后把上清液转移到2.0ml的离心管中,加入250ul PPS;并上下颠倒10次;
3)将2ml离心管于14000g的离心力下离心5min,将上清液转移至10ml的离心管中,并且重新悬浮Binding Matrix沉淀物,并取1ml加入到10ml离心管中。
4)静置3min后,去除500ul上清液,并重新悬浮沉淀物,然后转移600ul悬浊物到SPINTM Fliter中,于14000g的离心力下离心1min,然后将上层离心管置于新的2ml离心管中,继续加入悬浊液,重复离心操作。
5)SPINTM Fliter置于新的2ml离心管中,加入500ul SEWS-M,用枪头重新悬浊SPINTM Fliter内颗粒,然后于14000g的离心力下离心1min;
6)再次将SPINTM Fliter置于新的2ml离心管中,不加入任何溶液,然后于14000g的离心力下离心2min,离心后将SPINTM Fliter置于室温下5min;
7)将SPINTM Fliter置于新的1.5ml离心管中,加入100ul的DES溶液,静置1分钟,然后于14000g的离心力下离心1分钟,收集下层离心管中的溶液即为提取并纯化完成的DNA。
实施例1 引物的设计
(1)从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网点的genbank中下载四环素类抗性基因tetG基因序列(accession no.FJ411061.1、FJ411063.1、FJ411065.1、FJ411068.1FJ411072.1、FJ411074.1、FJ411076.1、FJ416863.1、FJ950705.1、GQ229171.1、GQ229173.1、GQ229175.1、GQ229177.1、GQ229179.1、GQ229181.1、GQ229183.1、GU324768.1、HQ399656.1、HQ333262.1);
(2)将(1)得到的引物序列导入MEGA5.0,使用alignment进行序列比对,去除差异性较高的片段,找到不同Accession No.的四环素类抗性基因tetG保守区;
(3)将(2)得到的保守区序列输入到Primer Premier 5.0,设计出满足定量PCR要求的引物,由于定量PCR要求扩增产物片段长度为75-200bp,经过筛选,确定一对扩增产物片段长度为133bp的引物,即:正向引物tetGF:5′-TTATCGCCGCCGCCCTTCT-3′(SEQ ID NO:1);反向引物tetGR:5′-TCATCCAGCCGTAACAGAAC-5′(SEQ ID NO:2)。
(4)引物特异性的验证:
软件验证:采用NCBI的引物设计和特异性检验工具Primer-BLAST验证引物的特异性,显示引物特异性很好;
实验验证:验证结果见实施例2和实施例4。
实施例2 定性检测
(1)用FastDNA Spin Kit forsoil试剂盒提取污泥中的DNA,使用实施例1中的引物序列进行普通PCR扩增,PCR产物与1/6体积6×loadingbuffer dye混匀,使用经EB染色的1.5%的琼脂糖凝胶,100bp marker,在100-110V电压下电泳35分钟,检测PCR产物,结果如图1所示,结果显示有PCR产物存在。
(2)PCR扩增得到的序列以BioSpin胶回收试剂盒纯化后,测量DNA含量、纯度并调节至合适浓度(即vector DNA和insert DNA摩尔比为1∶2~10)后,接入pMD19-T载体并转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
(3)将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12-16h,通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑,挑选阳性克隆子用LB培养液扩大培养,待菌液混浊后,取1mL菌液送上海基康生物技术有限公司测序插入的基因片断,剩余的2-4ml用于提取质粒制备标准品。
测序得到4个DNA序列,序列片段大小均为133bp,其碱基序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
(4)测序结果通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的BLAST进行序列同源性检索比对。测序序列对核酸库的比对,直接比较核酸序列的同源性,同源性良好,证明本发明设计的引物特异性高。
实施例3 标准品的准备
(1)实施例2中LB培养液扩大培养后的混浊菌液,1ml送去测序,其余的2-4ml菌液使用QIAprepTM Spin Miniprep Kit(QIAGEN)提取质粒,使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度,确保质粒DNA的A260/A280比值在1.8左右,作为标准品。
(2)计算出质粒拷贝数,质粒拷贝数的计算公式为:拷贝数=(质量÷分子量)×6.02×1023
(3)计算得到四环素类抗性基因tetG的拷贝数,按10倍为稀释梯度稀释为标准曲线,并且使质粒拷贝数保持在108-103之间。
(4)标准曲线的反应体系为:2ul DNA溶液(标准品),7.5ul SYBRPremix Ex Taq溶液,0.3ul ROX Reference溶液,0.3ul 10mM正向引物,0.3ul 10mM反向引物,4.6ul ddH2O。
每一次定量PCR反应都需要加入标准品进行实验,标准曲线中横坐标为四环素类抗性基因tetG质粒拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。
实施例4 定量检测
用实施例1中设计的引物序列进行实时荧光定量PCR检测待测污泥中四环素类抗药基因tetG含量
(1)采集城市生活污水处理厂剩余污泥,使用冷冻干燥机冻干后作为待测样品;
(2)取待测样品0.1g,用FastDNA Spin Kit for Soil按照标准步骤提取DNA,调节浓度至10ng/ul并保存待测;
(3)配制定量PCR反应的反应液体系:7.5ul SYBR Premix Ex Taq溶液,0.3ul ROX Reference溶液,0.3ul的10mM浓度的正反引物对,4.6ulddH2O。每个样品做三次重复,使用10ul、50ul量程的排枪操作,降低移液枪枪头残留溶液的影响;
(4)将反应液体系转移至96孔反应板的反应孔中,将步骤(1)中提取的DNA取2ul,及2ul实施例2中的标准品加入对应的反应孔中通过StepOne Software v2.0点击开始实验。
反应条件为:95℃下热变性5分钟,然后进入40个循环的扩增阶段,95℃变性3秒,55℃扩增30秒,72℃延伸30秒,延伸的同时扫描荧光信号,根据每一轮扩增扫描到的信号强弱对比标准品的信号强弱得出样品中四环素类抗药基因tetG的浓度。
实验结束后系统即自动生成标准曲线和待测样品的浓度,三个重复实验结果拷贝数分别为9.17×106copies/ul、9.83×106copies/ul l、9.38×106copies/ul,说明待测污泥样品中含有四环素类抗药基因tetG,证明利用实施例1中设计的引物序列进行定量PCR能有效检测待测污泥样品中的四环素类抗药基因tetG的含量。
Figure IDA00001791967000011
Figure IDA00001791967000021
Figure IDA00001791967000031

Claims (1)

1.一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法,其特征在于,包括:
(1)提取待测污泥样品中的DNA,以提取的DNA为模板,用以下正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数,
其中,正向引物和反向引物的碱基序列为:
正向引物:TTATCGCCGCCGCCCTTCT;
反向引物:TCATCCAGCCGTAACAGAAC;
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG质粒标准品的标准曲线,得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量;
所述定量PCR的反应体系为:2ul DNA溶液,7.5ul SYBR Premix ExTaq溶液,0.3ul ROX Reference溶液,0.3ul浓度为10mM的正向引物,0.3ul浓度为10mM的反向引物,4.6ul ddH2O。
CN 201210210985 2012-06-20 2012-06-20 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法 Expired - Fee Related CN102732627B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201210210985 CN102732627B (zh) 2012-06-20 2012-06-20 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201210210985 CN102732627B (zh) 2012-06-20 2012-06-20 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102732627A CN102732627A (zh) 2012-10-17
CN102732627B true CN102732627B (zh) 2013-06-19

Family

ID=46988922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201210210985 Expired - Fee Related CN102732627B (zh) 2012-06-20 2012-06-20 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102732627B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018636B (zh) * 2015-08-24 2018-05-22 济南大学 ermC基因在检测土壤抗生素抗性污染水平中的应用与方法
CN110592203A (zh) * 2019-08-28 2019-12-20 华东师范大学 一种环境中抗生素抗性基因的快速定量试剂盒及其检测方法
CN112301110A (zh) * 2020-11-23 2021-02-02 天津大学 一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100412206C (zh) * 2006-10-20 2008-08-20 四川大学 一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重pcr检测技术
CN101560552A (zh) * 2008-12-31 2009-10-21 云南大学 猪源大肠杆菌中抗四环素基因tet(B)的PCR检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102732627A (zh) 2012-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104946762B (zh) 检测肺炎克雷伯氏菌的试剂盒
CN103642910B (zh) 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用
CN102443629B (zh) 一种沙门氏菌荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN102925581B (zh) 一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法
CN103898108A (zh) 对河流弧菌o2,o4,o13,o15和o18特异的核苷酸及其应用
CN101429539B (zh) 实时荧光定量pcr检测绿脓杆菌的试剂盒
CN102732627B (zh) 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法
CN102363815A (zh) 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法
CN102676664B (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN104059975A (zh) 对普罗威登斯菌o3,o4,o8,o12,o13和o20特异的核苷酸及其应用
CN102719431B (zh) 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法
CN101333557B (zh) 一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法
CN103667271B (zh) 定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用
CN101492741A (zh) 一种定量检测猪肺炎支原体的方法
CN1286988C (zh) 一种定量pcr检测试剂盒及用于检测副溶血性弧菌的方法
CN108103152B (zh) 一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法
CN109811073A (zh) 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
CN104531860A (zh) 一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用
CN103571950A (zh) 一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及其检测方法
CN103305629B (zh) 一种环境水体中cva16病毒的检测方法
Pang et al. A new method for quantitative detection of Lactobacillus casei based on casx gene and its application
CN104531861A (zh) 一种阪崎肠杆菌的分子检测方法及其应用
CN108546743A (zh) 一种哈维氏弧菌快速检测方法
CN105256028A (zh) 对柠檬酸杆菌017和o39特异的核苷酸及其应用
Xu et al. Single-tube Multiplex Nested PCR System for Efficient Detection of Pathogenic Microorganisms in SPF Rodents

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130619

Termination date: 20160620

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee