CN112301110A - 一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法 - Google Patents

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汪光义
郭嘉懿
李佳倩
何艺科
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

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Abstract

本发明公开一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法，包括环境样品总DNA的提取；目的片段的扩增；标准质粒模板的构建；建立Q‑PCR定量标准曲线；环境样品抗性基因tetG的测定。与当下基于选择性培养检测方法相比，该方法有以下优点：首先，缩短了检测时间，由原方法的3‑4天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需2‑3个小时。其次，克服了原方法无法测定不可培养微生物所携带的抗性基因tetG的问题，提高了鉴别的准确度。

Description

一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法
技术领域
本发明涉及常见基因检测技术领域，特别涉及一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法。
背景技术
在沿海地区的发展过程中，流入海洋中的有毒化学物质对人类和生态系统构成了健康风险，抗生素抗性基因(ARGs)也被视为重要污染物。抗生素抗性基因(ARGs)是一类新兴的污染物，由于其潜在的生态毒理学风险和对公共健康的威胁而引起了人们的极大关注。其中四环素类抗性基因由于其用途广泛、高排泄率、高溶解性和环境中的高持久性而备受关注，研究发现其在内陆水域、沿海水域、水产养殖池塘、海洋沉积物等环境中都有存在，所以需要一种简单快速的方法来对四环素类抗性基因tetG进行快速准确的检测。
发明内容
本发明的目的在于解决如下问题：
1、解决目前基于培养法或测序法检测抗性基因tetG的耗时长，价格高昂的问题。
2、解决基于选择性培养方法检测抗性基因时无法准确定量海水中不可培养的抗性基因tetG的问题。
本发明的技术方案是一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法，包括如下步骤：
1)环境样品总DNA的提取
采用过滤系统将海水样品截留在孔径为0.22μm的微孔滤膜上，用E.N.Z.A.TMWater DNA Kit试剂盒(Omega,USA)对膜上的DNA进行提取，具体步骤参见试剂盒说明书。
2)目的片段的扩增
查阅相关文献，获得针对四环素类抗性基因tetG特有基因设计的引物，目的片段大小约133p，引物信息如下：
上游引物：TTATCGCCGCCGCCCTTCT
下游引物：TCATCCAGCCGTAACAGAAC
利用空白以及环境样品进行PCR实验，体系为：2×PCR Master Mix 12.5μL、ddH2O9.5μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、DNA 1μL。采用的PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，39个循环；72℃终延伸5min。对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将呈现的目的条带切胶回收，进行测序。
3)标准质粒模板的构建
(1)DNA片段经纯化后与PGM-18载体进行恒温连接。连接结束后，取5ul连接产物，加入置于含有50ul感受态细胞(H5α)的1.5ml的离心管中，混匀后，冰浴30min；(2)在42℃下热击60s，再冰浴2min。加入800ul LB液体培养基，37℃，170rpm下振荡培养1h；(3)吸取100μL涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，用封口膜封口后于37℃倒置培养过夜；(4)挑取单菌落在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体选择培养基中震荡培养12h；(5)用质粒小提试剂盒按照商家提供的说明书进行质粒的提取，提取后送公司测序。
4)建立Q-PCR定量标准曲线；
5)环境样品抗性基因tetG的测定
采用Q-PCR技术测定性tetG基因的DNA浓度；
反应体系为：2×SYBR Green QPCR Mix 5μL、ddH2O 3.5μL、上游引物(10μM)0.25μL、下游引物(10μM)0.25μL、DNA 1μL；Q-PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，39个循环。然后按照定量标准曲线将Ct值转换成拷贝数，从而定量环境样品中tetG基因的浓度。
有益效果
与当下基于选择性培养检测方法相比，该方法有以下优点：首先，缩短了检测时间，由原方法的3-4天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需2-3个小时。其次，克服了原方法无法测定不可培养微生物所携带的抗性基因tetG的问题，提高了鉴别的准确度。
附图说明
图1、琼脂糖凝胶电泳图，最左侧为空白对照，其余为环境样品。
图2、在2.61×101～2.61×105copies/μL范围内建立Q-PCR定量曲线。
图3、在2.61×101～2.61×105copies/μL范围内建立Q-PCR溶解曲线，其中溶解曲线呈现单峰，表明模板中扩增产物为单一产物，具有特异性。
图4、Q-PCR所得Ct值与log拷贝数之间的线性关系。
图5、2019年滦河口海域tetG基因四季丰度。
具体实施方式
本研究建立的方法适用于对海水样品中的抗性基因tetG进行定量，方法说明书如下：
1、在设定的采样点，用水样专门的样品采集器在水面下约0.5m处采集水样样本，装入容积为1L的无菌玻璃瓶中，编号后保存于冰盒中，所有样品采集完成后，立即将其4℃下低温运送回实验室处理，运回实验室后，对于部分水样用孔径为0.22μm的微孔滤膜进行过滤，每张滤膜过滤水样500mL，每个采样点过滤三张滤膜，在-80℃下保存直到后续DNA提取。
2、提取样品DNA，水样样品的DNA提取选用E.N.Z.A.TM Water DNA Kit试剂盒(Omega,USA)，为确保排除外界杂菌的污染干扰，以下操作需在超净工作台中进行，具体提取步骤见试剂盒说明书。
3、提取DNA后，按照如下体系进行Q-PCR实验：2×SYBR Green QPCR Mix 5μL、ddH2O 3.5μL、上游引物(10μM)0.25μL、下游引物(10μM)0.25μL、DNA 1μL。程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环。然后按照定量标准曲线将Ct值转换成拷贝数，从而定量环境样品中tetG基因的浓度。
4、运用该检测方法对2019年四季中秦皇岛滦河口扇贝养殖区及河口区域固定站位的tetG基因进行检测，并取得良好效果。

Claims (4)

1.一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)环境样品总DNA的提取；
2)目的片段的扩增
查阅相关文献，获得针对四环素类抗性基因tetG特有基因设计的引物，目的片段大小约133p，引物信息如下：
上游引物：TTATCGCCGCCGCCCTTCT；
下游引物：TCATCCAGCCGTAACAGAAC；
3)标准质粒模板的构建；
4)建立Q-PCR定量标准曲线
5)环境样品抗性基因tetG的测定
采用Q-PCR技术测定性tetG基因的DNA浓度。反应体系为：2×SYBR Green QPCR Mix 5μL、ddH2O 3.5μL、上游引物(10μM)0.25μL、下游引物(10μM)0.25μL、DNA 1μL；Q-PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，39个循环。然后按照定量标准曲线将Ct值转换成拷贝数，从而定量环境样品中tetG基因的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法，其特征在于，步骤1)采用过滤系统将海水样品截留在孔径为0.22μm的微孔滤膜上，用E.N.Z.A.TM Water DNAKit试剂盒(Omega,USA)对膜上的DNA进行提取。
3.根据权利要求1所述的一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法，其特征在于，步骤2)利用空白以及环境样品进行PCR实验，体系为：2×PCR Master Mix 12.5μL、ddH2O 9.5μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、DNA 1μL；
采用的PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，39个循环；72℃终延伸5min；
对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将呈现的目的条带切胶回收，进行测序。
4.根据权利要求1所述的一种近海海域中抗性基因tetG的检测方法，其特征在于，步骤4)提取完成后用
Figure FDA0002791654310000021
ND-1000UV-VisSpectrophotometer(Thermo FisherScientific,USA)核酸含量测定仪测出质粒的浓度，并用在线计算软件(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)计算出质粒模板的准确拷贝数；对其进行10倍梯度稀释，建立相应的定量标准曲线；Q-PCR的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，39个循环；
体系为：2×SYBR Green QPCR Mix 5μL、ddH2O 3.5μL、上游引物(10μM)0.25μL、下游引物(10μM)0.25μL、DNA模板1μL；
反应完成后以Ct值和log拷贝数建立标准曲线。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102732627A (zh) * 2012-06-20 2012-10-17 浙江大学 一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法
CN106011270A (zh) * 2016-07-08 2016-10-12 天津大学 一种近岸海水中副溶血性弧菌的检测方法

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Non-Patent Citations (1)

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Title
曹佳雯: "三沙湾海水养殖环境中抗生素抗性基因的时空分布特征研究", 《三沙湾海水养殖环境中抗生素抗性基因的时空分布特征研究》 *

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