CN114350823B

CN114350823B - 一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法

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Publication number: CN114350823B
Application number: CN202210077014.8A
Authority: CN
Inventors: 李凡; 陈翠霞; 李慧; 马元庆; 苏海霞; 杨艳艳; 张孝民; 周兴
Original assignee: China University of Petroleum East China; Shandong Marine Resource and Environment Research Institute
Current assignee: China University of Petroleum East China; Shandong Marine Resource and Environment Research Institute
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114350823A

Abstract

本发明公开了一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，属于三疣梭子蟹资源量分析技术领域。本发明的方法是采用被检测海域的柱状沉积物样品，提取柱状沉积物样品中的DNA，并以不同深度柱状沉积物样品的DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对，进行荧光定量PCR扩增；根据扩增曲线获得不同样品DNA扩增后的Ct值；然后对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线，获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数；最后根据测得的不同深度柱状沉积物样品的同位素年代，获得疣梭子蟹资源量动态变化结果。该方法真实可信，具有较高的检出率，为分析影响三疣梭子蟹资源量动态变化的因素奠定基础。

Description

一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法

技术领域

本发明属于三疣梭子蟹资源量分析技术领域，具体涉及一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法。

背景技术

近年来，随着人类活动，特别是过度捕捞和环境污染对海洋渔业资源干扰越来越频繁，三疣梭子蟹资源已大幅衰退，为恢复三疣梭子蟹资源量，多地开始实施大规模资源放流工作，取得了良好的经济效益、社会效益，随着投入资金和放流数量的不断增加，三疣梭子蟹产量并未线性增加，并且存在年间波动剧烈、生长缓慢等现象。同时，由于统计产量不准、资源评估方法单一等问题，导致科学准确的进行三疣梭子蟹资源量的评价体系一直未能建立。因此，现阶段亟需一种能够准确检测三疣梭子蟹种群结构的分析方法及资源量动态变化的方法，该方法能够准确地检测三疣梭子蟹的含量，而不受其他物种的干扰，并且检测的结果不受到人为主观因素的影响。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，步骤如下：

(1)采集被检测海域的柱状沉积物样品，柱状沉积物采集时，以1-2cm为一个采集深度，采集若干个不同深度的柱状沉积物，记为A1、A2、A3、A4…An；样品采集后低温保存；

(2)提取采集的不同深度柱状沉积物样品中的DNA；

(3)以不同深度柱状沉积物样品的DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对，进行荧光定量PCR扩增；根据扩增曲线获得不同样品DNA扩增后的Ct值；

(4)将获得的不同样品DNA扩增后的Ct值对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线，获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数；

(5)测定柱状沉积物A1、A2、A3、A4…An的同位素年代，并根据年代绘制不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数与年代的关系图，即得三疣梭子蟹资源量动态变化结果。

在一个具体的实施例中，所述步骤(4)中三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线由以下方法获得：

提取三疣梭子蟹基因组DNA作为模板，利用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增，检测扩增产物中COI基因的浓度并计算COI基因的拷贝数；根据扩增产物中COI基因的拷贝数将扩增产物稀释成不同拷贝数梯度的溶液作为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对，进行荧光定量PCR扩增；根据扩增曲线获得不同拷贝数梯度的溶液扩增后的Ct值，以Ct值为横坐标，用已知起始拷贝数的对数为纵坐标，绘制三疣梭子蟹COI基因的标准曲线。

在一个具体的实施例中，所述三疣梭子蟹COI基因的引物对如下：

正向序列COI for为：5’-TCGTGCTGAATTAGGACAACC-3’；

反向序列COI rev为：5’-AAGGAGAGAATATAACAGGCCGAC-3’。

在一个具体的实施例中，以三疣梭子蟹基因组DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性50s，52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃复延伸10min；4℃保存并结束程序。

在一个具体的实施例中，以三疣梭子蟹基因组DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR反应体系为25μL反应体系，具体包括：2×GC buffer I 12.5μL，2.5mM dNTP Mixture 4μL，5U/μL TaKaRa LA Taq 0.25μL，模板DNA 1μL，10mM上、下游引物各1μL，无菌去离子水5.25μL。

在一个具体的实施例中，所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对如下：

正向序列COI-qRTPCR for为：5’-GGGAGCAGTCTTTGGCATCT-3’；

反向序列COI-qRTPCR rev为：5’-GCCTCAGGTAGTATAAGCGTCT-3’。

在一个具体的实施例中，所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，57℃退火30s，72℃延伸32s，40个循环。

在一个具体的实施例中，所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR反应体系为20μL反应体系，其中包括Premix ExTaq^TM10μL，10μM上、下游引物各0.4μL，模板2μL，ROXII 0.4μL，水6.8μL。

在一个具体的实施例中，所述步骤(2)在提取采集的不同深度柱状沉积物样品中的DNA前，将采集的每个柱状沉积物分为相等的两份，每份设置9个均布的采样点，在9个采样点分别取1g样品，之后将9个样品混匀，再将混匀后的样品分成3份，分别进行沉积物样品DNA提取。

在一个具体的实施例中，所述步骤(3)以提取的不同深度沉积物样品中的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增时；根据DNA扩增曲线，获得的同一个深度沉积物样品的不同DNA模板扩增后的Ct值取平均值，采用得到的Ct_平均对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线，获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数。

本发明技术方案的优点：

本发明采用的是一种基于eDNA(古环境DNA)的柱状沉积物的样品处理和三疣梭子蟹COI基因拷贝数定量来进行三疣梭子蟹资源量动态变化检测的方法。该方法相比于传统方法的优势在于：(1)传统对三疣梭子蟹种群资源进行定量检测多用水样进行，考虑柱状沉积物本身的珍贵性及eDNA分布的不均匀特性，对柱状沉积物采用多点取样混匀后多次设置3个重复样品的样品处理方式，相比于传统的将土样全部混匀或单点取样的方式而言，该方法在节省土样的基础上，可以较为真实地代表土样平均eDNA含量。(2)设计三疣梭子蟹特异性的荧光定量PCR引物，采用荧光定量PCR的方法建立基于eDNA的三疣梭子蟹快速检测方法，该方法不需要采集三疣梭子蟹标本，对不同环境、不同年代的三疣梭子蟹的丰富度可以进行定量分析，能够快速且准确地对三疣梭子蟹的时空分布与种群动态变化进行检测，并且灵敏度高，不受种群密度与生活史特征的影响，具有较高的检出率。(3)建立沉积物对应的年份与三疣梭子蟹资源丰富度的关系，结合年代的环境变化因素，为寻找可能影响三疣梭子蟹种群含量的影响因素奠定基础。

附图说明

图1柱状沉积物样品处理方式示意图；

图2COI基因PCR凝胶电泳图(模板分别为：1：三疣梭子蟹基因组；2-8分别为深度为7-8cm、8-9cm、9-10cm、10-11cm、13-14cm、22-24cm对应的柱状沉积物环境DNA)；

图3Cytb基因PCR凝胶电泳图(模板分别为：深度为7-8cm、8-9cm、9-10cm、10-11cm、13-14cm、22-24cm对应的柱状沉积物环境DNA)；

图4三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线；

图5不同柱样沉积物中COI基因拷贝数分析；

图6不同柱样沉积物中COI基因的荧光定量PCR扩增凝胶电泳图(1-7分别对应的柱状沉积物模板为：0-1cm、7-8cm、8-9cm、9-10cm、10-11cm、13-14cm、22-24cm，8是三疣梭子蟹基因组对照)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

(1)样品的采集

柱状沉积物样品采集自渤海湾，标号为0～1cm，7～8cm，8～9cm，9～10cm，10～11cm，13～14cm，22～24cm；样品运送过程中，用生物冰块保存，收到样品后，保存于-80℃冰箱里备用。

(2)eDNA的提取

在提取eDNA之前，将柱状沉积物从中间平均分成两份，每份设置9个采样点(如图1所示)，将9个采样点分别取1g样品后混匀，再将混匀后的样品平均分成3份，采用Fast DNASpin Kit for Soil试剂盒提取沉积物样品eDNA。

分别采用琼脂糖凝胶电泳和NANODrop2000超微量分光光度计测沉积物样品中eDNA浓度。结果显示，不同深度的柱状沉积物均可以提取得到不同浓度的eDNA，其浓度分别为37.2、28、14.5、13、22.3、4.8、7.7ng/μL，证明该方法可行。

(3)三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线的构建

提取的三疣梭子蟹(购买自青岛慧鹏海水养殖公司(青岛海清)大小为0.5kg/只)肌肉组织DNA，提取方法如下：取0.5×0.5×0.5体积大小的三疣梭子蟹肌肉组织样品，剪碎，加入550μL DNA裂解液(0.5M Tris-HCl，0.1M EDTA，5M NaCl，10％SDS，1g RNA酶)，混匀后，加入20μL蛋白酶K，置于56℃水浴锅中水浴消化2-3h至溶液透明，采用苯酚提取法提取三疣梭子蟹基因组DNA。

随后，以提取的基因组DNA为模板，利用引物对进行COI基因和Cytb基因扩增，引物序列如下：

正向序列COI for为：5’-TCGTGCTGAATTAGGACAACC-3’(SEQ ID NO:1)；

反向序列COI rev为：5’-AAGGAGAGAATATAACAGGCCGAC-3’(SEQ ID NO:2)。

正向序列Cytb for为：5’-CATTTTCTAGAGTAGCGCATATTTGCCGAGA-3’(SEQ ID NO:3)；

反向序列Cytb rev为：5’-GCAACTGATGCTACTAGTGCAATAACAC-3’(SEQ ID NO:4)；

普通PCR的反应体系为：25μL反应体系，2×GC buffer I 12.5μL，dNTP Mixture(2.5mM)4μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.25μL，模板DNA 1μL，引物(10mM)各1μL，无菌去离子水5.25μL。

普通PCR的扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性50s，52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃复延伸10min；4℃保存并结束程序。

扩增完成后采用凝胶电泳检测COI基因和Cytb基因扩增的扩增情况，结果如图2和图3所示，其中未对深度为0-1cm的柱状沉积物样品进行凝胶电泳检测；细胞色素B基因Cytb与COI基因进行对比，结果显示Cytb基因扩增效率较低，且有较多杂带，特异性不高，三疣梭子蟹的COI基因是蛋白质编码基因之一，其基因产物是细胞色素氧化酶亚基I，虽然有研究证明三疣梭子蟹的COI基因比Cytb具有更高的变异率，但是在本方法中，COI基因扩增条带清晰，特异性强，具有比Cytb基因更好的效果。

将COI基因扩增片段回收后采用NANODrop2000超微量分光光度计测该基因片段浓度。

最后，将扩增得到的COI基因片段梯度稀释至一定浓度后作为模板，进行荧光定量PCR扩增，使用的荧光定量PCR的引物序列如下：

正向序列COI-qRTPCR for为：5’-GGGAGCAGTCTTTGGCATCT-3’(SEQ ID NO:5)；

反向序列COI-qRTPCR rev为：5’-GCCTCAGGTAGTATAAGCGTCT-3’(SEQ ID NO:6)。

实时荧光定量PCR的反应体系为：20μL反应体系，其中包括PremixExTaq^TM10μL，0.4μL上、下游引物(10μM)，eDNA模板2μL，ROXII 0.4μL，水6.8μL。

实时荧光定量PCR的扩增反应程序为3步法：95℃预变性5min；95℃变性5s，57℃退火30s，72℃延伸32s，40个循环。

根据扩增曲线得到样品Ct值，并以Ct值为横坐标，用已知的基因起始拷贝数的对数为纵坐标，绘制三疣梭子蟹COI基因的标准曲线。结果如图4所示，三疣梭子蟹的COI基因与其基因拷贝数的对数之间的线性关系非常好，R²＝0.9923，拟合方程为Y＝10.183-0.2655X，说明该基因可作为环境中三疣梭子蟹基因组DNA含量测定的一个标准方程。

(4)测定不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数

以步骤(2)提取的柱状沉积物样品中的DNA为模板，以三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对荧光定量PCR，根据DNA扩增曲线，获得不同柱状沉积物中DNA模板扩增后的Ct值，同一个深度沉积物样品的不同DNA模板扩增后的Ct值取平均值，采用得到的Ct_平均对照步骤(3)获得的三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线，获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数，确定三疣梭子蟹COI基因在不同柱状沉积物中的分布与资源量变化。

结果如图5所示，在所选取的不同深度的沉积物样品中，0-1cm，9-10cm，10-11cm以及22-24cm的沉积物样品中可以检测到相似的COI基因拷贝数，而8-9cm的柱状沉积物中检测到较高的COI基因拷贝数，13-14cm的样品中三疣梭子蟹的COI基因拷贝数比较少。

(5)三疣梭子蟹资源量随年份的动态变化

根据海洋沉积物同位素年代测定结果，0-1cm、7-8cm、8-9cm、9-10cm、10-11cm、13-14cm、22-24cm沉积物对应年代分别为2019-2020年、2012-2013年、2011-2012年、2010-2011年、2009-2010年、2006-2007年、1994-1996年。1994-1996年海洋渔业资源调查结果显示，此阶段莱州湾生物多样性指数都在1.5-3.5的正常范围内，但是，随后几年，由于莱州湾环境陆源污染逐渐增加，无机氮含量逐渐增高，在2006年-2007年时，无机氮达到了轻度污染至中度污染水平，同时，该时期无机磷含量总体水平较低，这一时期氮磷比含量超过100：1，导致莱州湾渔业资源量显著下降，因此，在1994-1996年和2006-2007年两个沉积物中检测到的三疣梭子蟹种群含量呈现显著下降趋势，但是，自2006年以来，由于减少捕捞、生态环境改善及政府干预(如有计划的增殖放流等措施)，导致三疣梭子蟹的含量逐年上升。

此外，将荧光定量PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示，对COI基因基因的扩增结果均为单一条带，表明该引物对具有较高的特异性，检测结果可信。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 山东省海洋资源与环境研究院（山东省海洋环境监测中心、山东省水产品质量检验中心）中国石油大学（华东）

<120> 一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgtgctgaa ttaggacaac c 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggagagaa tataacaggc cgac 24

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cattttctag agtagcgcat atttgccgag a 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaactgatg ctactagtgc aataacac 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggagcagtc tttggcatct 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcctcaggta gtataagcgt ct 22

Claims

1.一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）采集被检测海域的柱状沉积物样品，柱状沉积物采集时，以1-2 cm为一个采集深度，采集若干个不同深度的柱状沉积物，记为A1、A2、A3、A4…An；样品采集后低温保存；

（2）提取采集的不同深度柱状沉积物样品中的DNA；

（3）以不同深度柱状沉积物样品的DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对，进行荧光定量PCR扩增；根据扩增曲线获得不同样品DNA扩增后的Ct值；

（4）将获得的不同样品DNA扩增后的Ct值对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线，获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数；

（5）测定柱状沉积物A1、A2、A3、A4…An的同位素年代，并根据年代绘制不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数与年代的关系图，即得三疣梭子蟹资源量动态变化结果；

所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对如下：

正向序列COI-qRTPCR for为：5’-GGGAGCAGTCTTTGGCATCT-3’；

反向序列COI-qRTPCR rev为：5’-GCCTCAGGTAGTATAAGCGTCT-3’；

所述步骤（4）中三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线由以下方法获得：

2.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述三疣梭子蟹COI基因的引物对如下：

正向序列COI for为：5’-TCGTGCTGAATTAGGACAACC-3’；

反向序列COI rev为：5’-AAGGAGAGAATATAACAGGCCGAC-3’。

3.根据权利要求2所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，以三疣梭子蟹基因组DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s，52 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃复延伸10 min；4℃保存并结束程序。

4.根据权利要求2所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，以三疣梭子蟹基因组DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR反应体系为25 μL反应体系，具体包括：2×GC buffer I 12.5 μL，2.5mM dNTP Mixture 4 μL，5U/μLTaKaRa LA Taq 0.25 μL，模板DNA 1 μL，10mM上、下游引物各1 μL，无菌去离子水5.25 μL。

5.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃ 变性5 s，57℃退火30 s，72℃延伸32 s，40个循环。

6.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR反应体系为20 μL反应体系，其中包括SYBR® PremixExTaq™ 10 μL，10 μM上、下游引物各0.4 μL，模板 2 μL，ROXII 0.4 μL，水6.8 μL。

7.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述步骤（2）在提取采集的不同深度柱状沉积物样品中的DNA前，将采集的每个柱状沉积物分为相等的两份，每份设置9个均布的采样点，在9个采样点分别取1 g样品，之后将9个样品混匀，再将混匀后的样品分成3份，分别进行沉积物样品DNA提取。

8.根据权利要求7所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述步骤（3）以提取的不同深度沉积物样品中的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增时；根据DNA扩增曲线，获得的同一个深度沉积物样品的不同DNA模板扩增后的Ct值取平均值，采用得到的Ct_平均对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线，获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数。