CN103146814B

CN103146814B - 污水处理厂聚磷菌实时荧光定量pcr检测方法

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Publication number: CN103146814B
Application number: CN201310042881.9A
Authority: CN
Inventors: 曾薇; 李博晓; 张立东; 王向东; 彭永臻
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2013-02-03
Filing date: 2013-02-03
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2033-02-03
Also published as: CN103146814A

Abstract

一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域。本发明以实际生活污水富集的聚磷菌作为标准品来源，菌群进化分支丰富。采用针对聚磷菌的关键功能基因——聚合磷酸盐激酶基因的特异性引物，获得了Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5个主要进化分支的标准品，并采用通用性好、成本较低的SYBR Green荧光染料法建立了5个主要进化分支的实时荧光定量PCR标准曲线。5条标准曲线的相关系数分别为1.000，0.998，0.999，0.999，0.998。扩增效率在90%到110%之间。利用建立的标准曲线对某污水处理系统中聚磷菌的不同进化分支进行定量检测。本发明经济、简便、可靠。

Description

污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中聚磷菌的定量检测。

背景技术

磷是导致地表水体富营养化的关键营养元素，世界各国都对排入地表水体的磷浓度制定了严格的排放标准。生物除磷技术由于经济高效的特点已被广泛应用于各大城市污水处理厂。虽然生物除磷技术应用于污水处理已有几十年的历史，积累了大量的运行经验，但在污水处理厂运行过程中仍然时常出现不明原因的除磷效果恶化的现象，甚至不得不借助于化学除磷。产生这些问题的根本原因是由于对生物除磷过程主要功能微生物——聚磷菌的代谢活性和种群结构缺少清楚的认识和理解，从而无法建立有效的调控措施。污水生物处理系统内除磷微生物学研究是污水生物除磷最基本、最重要的内容，是生物除磷系统高效稳定运行的保障。

大量研究已经证明，无论是实验室规模还是生产规模的生物除磷系统中，聚磷菌都是占主导地位的除磷微生物。但是由于聚磷菌种群的复杂性和多样性，不同污水处理系统中的聚磷菌对环境的动态响应结果差异很大，因此只有对这一复杂菌群的菌群结构进行细化分类与精确定量，才能清楚的认识其细菌种类和密度随环境的变化情况、才能认识菌群的稳定性特征、才能明确聚磷菌在磷元素降解过程中的作用，对提高污水处理系统除磷效果具有重要意义。由于无法实现纯培养，因此不依赖于纯培养的分子生物学分析方法成为聚磷菌研究的主要手段。目前，研究者主要借助于荧光原位杂交（FISH）、限制性末端片段长度多态性分析（T-RFLP）、PCR-基因测序等方法识别并定量分析活性污泥样品中的聚磷菌。上述方法多数采用16S rRNA作为基因标记物，但由于16S rRNA的高度保守性使其无法区分聚磷菌的各进化分支，因此上述方法都无法实现对聚磷菌不同进化分支的区分与定量。与相对保守的16S rRNA相比，功能基因具有更多的序列变化，利用功能基因可以区分生态功能不同但亲缘相近的微生物种群。聚合磷酸盐激酶是聚磷菌细胞内催化合成聚合磷酸盐的关键酶，直接影响聚磷菌的除磷效果。由于聚合磷酸盐激酶基因的高系统分辨率和清晰的树结构，因此在揭示聚磷菌种群结构上，较16S RNA是更好的遗传标记。因此本专利采用编码聚合磷酸盐激酶的功能基因作为遗传标记解析污水处理系统中聚磷菌的代谢活性和菌群结构，从微观角度揭示聚磷菌各进化枝对环境条件的动态响应，为污水生物除磷系统的稳定运行奠定微生物学理论基础。

实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点，在微生物生态学中逐渐得到广泛的应用。以聚合磷酸盐激酶基因作为标记物的实时荧光定量PCR，使我们不仅可以定性，也可以定量研究污水处理系统中聚磷菌的不同进化分支的结构组成及数量变化，从而深入探索聚磷菌群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程。

本发明采用实时荧光定量PCR技术对污水处理厂中的聚磷菌进行定量检测。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面：

（1）标准品DNA的来源。目前聚磷菌无法实现纯培养，因此标准品只能来自聚磷菌的富集培养系统，从富集聚磷菌的活性污泥中提取DNA作为标准品来源。但是目前对聚磷菌的富集，主要集中在人工配水系统，由于人工配水的碳源主要选择乙酸或丙酸，使聚磷菌的种群单一，以ⅡA分支为主，其次为I分支，并导致后基因组学研究也主要集中在ⅡA和I分支。这样就无法实现获得聚磷菌所有分支或主要分支的标准品。本专利采用的标准品全部来源于处理实际生活污水的反应器，运行过程中，工艺条件和废水成分都接近实际生产情况，并且反应器取得了良好的除磷效果，出水磷浓度优于《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）规定的一级A排放标准。由于富集系统运行条件和废水成分的复杂性，使得聚磷菌菌群分支丰富，获得了主要的5个进化分支的标准品，分别为I、ⅡA-D。

（2）基因标记物的选择。不同研究者的试验系统存在不同的聚磷菌分支，根本原因在于基因型的不同。因此，只有找到一种能够区分聚磷菌各进化分支的基因标记物，才能阐明聚磷菌菌群的生态生理学特性和分析产生争议的原因。16S rRNA是广泛采用的基因标记物，但由于16S rRNA的高度保守性使其无法区分聚磷菌的各进化分支。聚合磷酸盐激酶是聚磷菌细胞内催化合成聚合磷酸盐的关键酶，好氧吸磷速率与聚合磷酸盐激酶活性呈线性关系。而聚合磷酸盐激酶基因是编码合成这种酶的功能基因，该基因的表达过程直接影响聚磷菌的代谢活性和吸磷效果。聚磷菌细胞内的聚合磷酸盐激酶基因是单拷贝基因，其进化速度是16S rRNA的5倍，是研究聚磷菌各进化分支的很好的基因标记物。因此，本申请选择聚合磷酸盐激酶功能基因作为遗传标记，不仅可以进一步明确聚磷菌的各进化枝，而且可以建立聚合磷酸盐激酶基因表达对生物除磷系统环境条件变化的动态响应机制。

（3）实验方法的选择及实验条件的优化。①目前根据荧光定量途径的不同，实时荧光定量PCR测定主要包括两种方法：SYBR Green荧光定量法和Taqman探针法。Taqman探针法在常规PCR扩增过程中，用探针对产物进行检测，可获得较高的检出精度。但Taqman荧光探针合成费用较高，大规模应用时经济效益低。而SYBR Green荧光定量法实验方法简单（仅需2个引物，不需要设计探针），无需设计多个探针即可检测多个基因，通用性好、成本低。因此SYBR Green荧光定量法更适合种群复杂、分支众多的聚磷菌菌群。由于SYBR Green与所有的双链DNA都可以结合，因此引物二聚体、单链二级结构以及错误扩增产物的出现会增加荧光值，从而影响定量的精确性。因此本申请首先通过熔融曲线分析目标产物的均一性，如果存在非特异性扩增产物，就采取四步法消除非特异性扩增对于某些分支的影响。四步法即在通用的三步法的延伸步骤之后，增加一个短暂的恒温和荧光检测步骤（84℃，5s），使这个步骤的温度高于引物二聚体的溶解温度（T_m），但低于目标产物的T_m。在本申请中，非特异性扩增对Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC分支没有影响，因此采用通用的三步法。但非特异性扩增对IID分支影响显著，采用四步法。定量结果表明，四步法有效消除了非特异性扩增产物对目标产物定量带来的影响。②用Real-Time PCR进行环境样品的特定菌群密度定量过程中，样品预处理方法和参数的选择对于测定结果有较大的影响。将实时荧光定量PCR应用于污水处理厂主要功能微生物聚磷菌的检测，待测样品为污水处理系统中的活性污泥，样品本身具有极强的特殊性。由于聚磷菌以污水为生存基质，污水中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂质等，对DNA的提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此本申请对分析难度较大的聚磷菌不同进化分支的实验条件进行了探索和优化，并获得了较好的扩增效果和定量结果。

故本发明从实际生活污水富集培养的聚磷菌中提取基因组DNA，以聚合磷酸盐激酶功能基因作为遗传标记，针对聚磷菌不同的分支采用不同的特异性引物，建立检测聚磷菌5个主要分支的实时荧光定量PCR标准曲线。利用建立的标准曲线对污水全程脱氮除磷和短程脱氮除磷系统中的聚磷菌进行定量检测，通过运行条件的改变建立聚磷菌的种群结构和聚合磷酸盐激酶基因表达对实际污水脱氮除磷系统环境条件变化的动态响应机制，未见相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经济、可靠的污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，以聚合磷酸盐激酶基因作为标记物，成功区分聚磷菌不同进化分支，利用SYBR Green荧光染料法，无需设计多个探针即可检测多个基因，通用性好、成本低，并且可同时进行大批量的样本分析。可用于污水处理厂聚磷菌菌群数量的监控和鉴定，具有很好的应用前景。

本发明的技术方案：

一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：提取实际生活污水富集的聚磷菌的基因组DNA，采用聚磷菌5个分支的聚合磷酸盐激酶基因引物，先采用温度梯度PCR后进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定不同进化分支的复性温度；再采用常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验后，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得I、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5个分支的扩增片段；将5个分支的扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培养12-16h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证；提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线；利用建立的标准曲线对污水处理厂中聚磷菌进行定量检测；

上述温度梯度PCR和常规PCR扩增体系及反应条件如下：

常规PCR扩增程序如下：95℃变性10min；25-35个循环反应，每个循环包括95℃ 40s，A℃ 1min，72℃ 2min；最后72℃延伸5min；其中复性温度A由梯度PCR确定，不同分支的最佳复性温度如下：

温度梯度PCR仅一次实验就能确定特定体系相应的最佳复性温度。从而可在短时间内对PCR实验进行优化，对于分支众多的聚磷菌菌群，大大提高了PCR效率。

上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为2%，电泳电压为120V，电泳时间为60min；

上述实时荧光定量PCR扩增反应体系及反应条件为：

聚磷菌分支Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC的实时荧光定量PCR反应采用三步法，在复性和延伸阶段检测和报告荧光，扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃ 30s，A℃ 45s；最后72℃延伸30s；复性温度A℃与常规PCR复性温度相同；分支IID的扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃ 30s，63℃ 45s，72℃ 30s，84℃ 5s；其中荧光信号检测温度为84℃。

本发明的有益效果：

生物除磷技术是经济高效的降低污水出水磷浓度，从而有效缓解水体富营养化的污水处理工艺。对污水处理系统中参与磷代谢的主要微生物聚磷菌进行定性与定量分析，是维持除磷系统稳定运行的关键。聚磷菌具有菌群结构复杂性和多样性的特点，使得必须对其不同进化分支进行单独定量分析，并考察不同进化分支对环境的响应情况，才能清楚的了解其在工艺运行中起的作用，才能使人为调控成为可能。本发明以聚磷菌的关键功能基因——聚合磷酸盐激酶基因作为标记物，提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂中聚磷菌5个主要进化分支的实时荧光定量PCR检测方法，既可用于城市污水处理厂日常运行的微生物监控，保证生物除磷效果；又可用于实验室有关聚磷菌的定量分析、代谢机制、基因表达解析的研究，具有较强的实用性。

本发明通过提取实际污水处理系统中富集的聚磷菌的基因组DNA，采用针对聚磷菌功能基因——聚合磷酸盐激酶基因的特异性PCR引物，经常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验后，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得5个主要进化分支的PCR产物。将纯化产物经质粒转化和克隆培养后，提取包含目的片段的质粒DNA作为实时荧光定量PCR检测聚磷菌的标准品。在实时荧光定量PCR仪上进行检测，建立标准曲线。5条实时荧光定量PCR标准曲线均呈现良好的线性关系，相关系数、斜率与扩增效率如表1所示。上述指标表明，该方法符合精确定量的要求。同时，熔融曲线分析保证了扩增产物的特异性。可以利用建立的标准曲线对未知样品中聚磷菌各个分支的菌群数量进行定量检测。本发明成功的建立了聚磷菌5个主要进化分支的实时荧光定量PCR标准曲线，使单独研究不同分支对环境的动态响应成为可能。而且利用SYBR Green荧光染料法，检测成本降低，便于推广应用。

表15个分支聚磷菌实时荧光定量PCR标准曲线的相关系数、斜率与扩增效率

本发明的创新点：

（1）本发明提取实际生活污水处理系统中富集的聚磷菌的基因组DNA作为标准品DNA的来源，获得了5个主要进化分支的标准品。与人工配水系统相比，菌群分支更丰富，对监测污水处理厂聚磷菌菌群动态变化具有更强的适用性。

（2）本发明采用与聚磷菌相关的关键功能基因——聚合磷酸盐激酶基因作为标记物，成功实现对5个进化分支的区分定量。获得的实时荧光定量PCR标准曲线，线性良好，扩增效率高，符合精确定量的要求。熔融曲线分析保证了扩增产物的特异性。利用SYBR Green荧光染料法，通用性好，检测成本低。四步法巧妙的解决了引物二聚体等非特异性扩增对聚磷菌IID分支定量带来的影响。

（3）本发明为污水处理厂中主要功能微生物“聚磷菌”不同进化分支的定量检测提供了一种经济、简便、可靠的分析方法，可用于所有除磷系统中聚磷菌的定量检测，为污水处理厂的长期稳定运行提供有力保障。

附图说明

图1聚磷菌5个主要进化分支实时荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线。

图1a是分支I的扩增曲线；图1b是分支I的标准曲线；

图1c是分支IIA的扩增曲线；图1d是分支IIA的标准曲线;

图1e是分支IIB的扩增曲线；图1f是分支IIB的标准曲线;

图1g是分支IIC的扩增曲线；图1h是分支IIC的标准曲线;

图1i是分支IID的扩增曲线；图1j是分支IID的标准曲线;

图2聚磷菌5个主要进化分支的实时荧光定量PCR检测结果。

图2a是分支I的实时荧光定量PCR检测结果；

图2b是分支IIA的实时荧光定量PCR检测结果；

图2c是分支IIB的实时荧光定量PCR检测结果；

图2d是分支IIC的实时荧光定量PCR检测结果；

图2e是分支IID的实时荧光定量PCR检测结果；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

1.PCR引物

以聚合磷酸盐激酶基因为标记物，选择聚磷菌5个进化分支的PCR引物。引物名称、引物序列，以及扩增子长度如表2所示。

表2常规PCR扩增采用的引物序列

2.标准品的来源

本发明采用的标准品来源均为处理实际生活污水的反应器。反应器厌氧区进水有两部分，试验原水和缺氧一区回流液，两部分进水中NO₂ ^--N和NO₃ ^--N含量都较低，消除了NO₂ ^--N和NO₃ ^--N对厌氧释磷反应的影响，使得聚磷菌可以充分吸收进水中的VFA进行厌氧释磷反应。良好的工艺条件，为反应器中聚磷菌的富集培养提供了可能。其次，研究表明，聚磷菌的分支种类与电子受体的种类密切相关，实验污水在厌氧区后立即进入缺氧区，缺氧区含有丰富的NO₂ ^--N和NO₃ ^--N。随着工艺条件的改变，反应器经历两次全程硝化和短程硝化的更替，电子受体类型和比例的变化为不同分支的生存提供了良好的环境，不同时期的污泥样品富集了不同分支的聚磷菌。因此本发明以不同运行条件下的污泥样品作为聚磷菌不同分支的标准品来源。

3.实时荧光定量PCR标准曲线的建立

3.1总DNA的提取

采用美国MP Biomedicals公司生产的DNA提取试剂盒（Fast DNA Spin kitfor soil，BIO 101 system，USA）提取富集聚磷菌的基因组DNA。操作严格按照说明书进行。

3.2温度梯度PCR和常规PCR

1）分装定制的引物，最终浓度为10pmol/ml；

2）为了防止抑制物对常规PCR扩增的影响，将提取的DNA用超纯水稀释10倍；

3）利用常规PCR扩增试剂盒（GoTaq GreenMaster Mix，Promega，American）配制反应体系，将DNA模板分装到0.2ml的PCR管中；在冰上将除DNA模板之外的试剂按顺序加入0.6ml的PCR管中，手指弹管壁混匀，低速离心，然后移至装有DNA模板的PCR管中，手指弹管壁混匀，低速离心。采用25ul的反应体系，体系内容如表3所示。

表3常规PCR反应体系

4）常规PCR的扩增程序为：95℃变性10min，然后进行25-35个循环（95℃ 40s，A℃ 1min，72℃ 2min），最后进行72℃延伸5min。

5）温度梯度PCR与常规PCR反应体系相同，用来确定不同分支的最佳复性温度A。不同分支的梯度温度和梯度宽度如表4所示，PCR反应结束后，经质量百分比浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，产生目标条带的温度列即为最佳复性温度A。

表4PCR复性温度的确定

3.3琼脂糖凝胶电泳

（1）质量百分比浓度为2%的琼脂糖凝胶的制备

称取1.4g琼脂糖于250ml的锥形瓶中，加入70ml的l×TAE缓冲液，震荡锥形瓶，使琼脂糖悬浮。在微波炉中加热至无颗粒和气泡的透明液体。加热过程中用50ml的烧杯盖在锥形瓶口，以减少水汽的蒸发。可设置液位线，如果蒸发较多，可以补充水至刻线。胶完全溶解后加入天根生化科技有限公司生产的GeneGreen核酸染料7μl，使其终溶度为1倍，轻轻摇匀。将锥形瓶放入水浴锅内使琼脂糖凝胶冷却到60℃。然后将凝胶倒入装好梳子的电泳胶板中，冷却静止30min左右待胶完全凝固，拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中；然后向电泳槽中倒入l×TAE缓冲液，液体没过胶块2~3mm，准备上样。

（2）琼脂糖凝胶电泳

取8μl3.2步骤中的常规PCR扩增产物进行上样。采用天根公司的600bp DNAMarker在120V电压下进行琼脂糖凝胶电泳60min。

3.4PCR产物纯化

电泳完毕后，在紫外灯下快速切下含目标片段的条带，用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒对目的DNA片段进行纯化回收（Agarose Gel DNA Fragment RecoveryKit Ver.2.0，TaKaRa，Japan）。操作严格按照说明书进行。

3.5克隆转化与质粒提取

将切胶纯化后的目的片段与pGM-T载体进行连接（pGM-T连接试剂盒，天根生化科技有限公司，北京），然后将连接好的载体导入DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选。经过12-16h的培养，挑取白斑进行重组菌落PCR验证，包含目的片段的菌液用质粒提取试剂盒进行质粒提取和纯化（MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.3.0，TaKaRa，Japan）。

3.6标准曲线的建立：

用NanoDrop ND-1000（Thermo，American）分光光度计测定回收质粒的浓度。据公式（1）计算得出DNA拷贝数。

式中：公式（1）

M：1拷贝DNA分子的碱基对数，bp/copy；

W：1个碱基对的道尔顿数，660Daltons/bp；

Daltons：道尔顿，质量单位，1克约为6×1023Daltons；

CDNA：DNA浓度，ng/l。

将纯化后的质粒以10倍的浓度梯度稀释用作实时定量PCR标准品，采用试剂成本较低的SYBR Green荧光染料法。反应在Mx3005P实时定量PCR扩增仪（Agilent Technologies，American）上进行，采用25μl反应体系（Brilliant II SYBRGreen QPCR Master Mix，Agilent Technologies，American）。反应体系如表5所示。每个浓度的标准品均设3个平行样，结果取平均值。

表5实时荧光定量PCR反应体系

聚磷菌分支Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC的实时荧光定量PCR反应采用三步法，在复性和延伸阶段检测和报告荧光，扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃ 30s，A℃ 45s；最后72℃延伸30s；复性温度A℃与常规PCR复性温度相同；分支IID的扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃ 30s，63℃ 45s，72℃ 30s，84℃ 5s；其中荧光信号检测温度为84℃。所有分支的反应最后都增加一个熔融曲线分析。反应体系从55℃升温到95℃，在整个过程都收集和检测荧光强度。熔融曲线分析保证目标产物的均一性。

建立的C_t值与DNA浓度对应关系的实时荧光定量PCR标准曲线如附图1所示。表6给出了各个分支的标准曲线，以及各条曲线的相关系数和扩增效率。上述指标表明，该方法符合精确定量的要求。

表6各个分支的实时荧光定量PCR标准曲线

其中x为DNA的浓度（copies），y为Ct值。

4污水处理系统中聚磷菌的定量分析

该系统处理实际城市生活污水，水质条件为：COD浓度89~310mg/L，氨氮浓度52~96mg/L，正磷酸盐浓度2~8mg/L，需要生物脱氮除磷。从反应器稳定运行开始的42d到411d，反应器共经历两次短程的建立与破坏。第一次短程建立并维持运行35d(第III阶段)，平均亚硝酸盐积累率约为60%。第二次短程维持的时间为第VII、VIII、IX、X阶段，共153d。这一过程中维持了很高的亚硝酸积累率，平均NAR大于94%。在系统运行的第43、82、119、131、160、234、255、302和第339天分别取系统好氧区2ml的活性污泥，并测定该格室MLSS，用1×PBS清洗污泥样品2次，14000×g离心2min，去除上清液。按上述3.1的方法提取基因组DNA。在-20℃下保存。将提取的样品DNA在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，每个浓度的污泥样品均设3个平行，结果取平均值。实时荧光定量PCR扩增体系、扩增条件与“3.6标准曲线的建立”方法相同。聚磷菌细胞内的聚合磷酸盐激酶基因是单拷贝基因，因此，实时荧光定量PCR检测的DNA拷贝数就是聚磷菌某分支的细胞数。

利用实时荧光定量PCR技术对上述污泥中聚磷菌不同分支进行定量分析，考察硝化类型转变导致的电子受体类型NO₂ ^--N或NO₃ ^--N和比例变化对各个分支产生的影响。定量结果如附图2所示。

从图中可以清楚的看出，各个进化分支随NO₂ ^--N和NO₃ ^--N比例变化产生的动态响应。从图2（a）可以看出，Ⅰ分支是以硝态氮为电子受体进行反硝化吸磷的，Ⅰ分支对亚硝酸盐氮特别敏感，当亚硝酸盐存在时，很小比例的亚硝变化，也会引起Ⅰ型聚磷菌比例的剧烈波动（见阶段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。图2（b）显示ⅡA与亚硝酸盐的浓度变化呈良好的正相关，并对硝酸盐氮不敏感。由图2（c）可知，ⅡB丰度较小，且随两种电子供体浓度和比例变化不大，当硝酸盐存在时，丰度极低，在几乎只有亚硝酸存在时，菌群丰度随亚硝酸盐浓度的增加而增加。图2（d）显示，ⅡC与亚硝酸盐的变化趋势呈正相关，所以ⅡC是以亚硝态氮作为电子受体。由图2（e）可知，ⅡD丰度最大，对系统除磷的稳定性起到了至关重要的作用。而且，所有的分支丰度变化都表明，高浓度的亚硝酸盐对菌群产生了强烈的抑制作用，当NO₂ ^--N高达17mg/L时，所有分支的菌群丰度都出现了显著下降。

该定量方法的应用为污水处理厂聚磷菌的菌群随工艺条件的变化提供了及时准确的数据信息，可用于指导水厂运行。

Claims

1.一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：提取实际生活污水富集的聚磷菌的基因组DNA，采用聚磷菌5个分支的聚合磷酸盐激酶基因引物，先采用温度梯度PCR后进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定不同进化分支的复性温度；再采用常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验后，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得I、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5个分支的扩增片段；将5个分支的扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培养12-16h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证；提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线；利用建立的标准曲线对污水处理厂中聚磷菌进行定量检测；

上述温度梯度PCR和常规PCR扩增体系及反应条件如下：

以聚合磷酸盐激酶基因为标记物，选择聚磷菌5个进化分支的PCR引物；引物名称、引物序列，以及扩增子长度如下：

标准品的来源

常规PCR扩增程序如下：95℃变性10min；25-35个循环反应，每个循环包括95℃40s，A℃1min，72℃2min；最后72℃延伸5min；其中复性温度A由梯度PCR确定，不同分支的复性温度如下：

上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为2％，电泳电压为120V，电泳时间为60min；

上述实时荧光定量PCR扩增反应体系及反应条件为：

聚磷菌分支Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC的实时荧光定量PCR反应采用三步法，在复性和延伸阶段检测和报告荧光，扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃30s，A℃45s；最后72℃延伸30s；复性温度A℃与常规PCR复性温度相同；分支IID的实时荧光定量PCR反应采用四步法，扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃30s，63℃45s，72℃30s，84℃5s；其中荧光信号检测温度为84℃。