CN103555831B - 污水处理厂亚硝酸盐氧化菌荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域。本发明可以对污水处理厂中两个属的亚硝酸盐氧化菌，即硝化菌属和硝化螺菌属进行检测，不仅可以分析总的亚硝酸盐氧化菌，而且可以分析各个属的动态变化。采用通用性好、成本较低的SYBR Green荧光染料法建立了亚硝酸盐氧化菌2个属的实时荧光定量PCR标准曲线。2条标准曲线的相关系数分别为0.998和0.997，扩增效率在100%到110%之间。利用建立的标准曲线对某污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌进行监控和鉴定。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法。

Description

污水处理厂亚硝酸盐氧化菌荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中亚硝酸盐氧化菌的定量检测。

背景技术

污水生物脱氮技术由于经济、高效的特点而广泛应用于污水处理领域。传统污水生物脱氮的原理是指氨氮被氨氧化菌氧化成亚硝态氮（亚硝化阶段），再由亚硝酸盐氧化菌氧化成硝态氮（硝化过程）；之后硝态氮和亚硝态氮被反硝化成氮气（反硝化过程），从而实现污水中氮的去除。对于传统生物脱氮技术而言，亚硝酸盐氧化菌作为硝化过程的主要功能微生物之一，在污水生物处理系统内的生物活性和菌群分布的稳定性，是保证污水生物脱氮系统稳定运行的关键因素。污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，有的污水处理系统中只含有其中的一个属，而有的污水处理系统中含有两个属。为了全面了解系统中的亚硝酸盐氧化菌的分布情况，需要分别定量检测这两个属的微生物数量，二者数量之和是亚硝酸盐氧化菌的总量。近年来，在传统生物脱氮理论的基础上产生了短程脱氮新理论，即将硝化过程控制在亚硝态氮，然后直接进入反硝化，从而使生化反应大大缩短，被称之为短程硝化反硝化。相比于传统方法，短程脱氮理论上减少25%硝化需氧量、40%反硝化碳源，更具实用价值。实现短程脱氮的关键是将硝化产物控制为亚硝酸盐，即去除亚硝酸盐氧化为硝酸盐的过程。从微生物学的观点来看，就是抑制或淘汰亚硝酸盐氧化菌。对于短程脱氮技术而言，准确监测并定量亚硝酸盐氧化菌的动态变化是实现短程脱氮并保证其稳定运行的关键。分子生物技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物研究提供了新的分析方法和手段。因此，采用分子生物技术对不同工艺、水质条件下的亚硝酸盐氧化菌菌群结构、活性等进行研究分析，能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障。

实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点，逐渐应用于污水生物处理系统中特定菌群的定量分析。已有的实时定量PCR技术应用于污水短程生物脱氮的研究，主要是对氨氧化菌的定量。但实现短程脱氮的关键在于亚硝酸盐氧化菌是否被抑制或淘汰。对于亚硝酸盐氧化菌，往往通过亚硝酸盐积累率达到较高的水平（>80%）逆推出亚硝酸盐氧化菌被成功淘洗的结论。这种逆推显然不够严谨，因为它无法揭示亚硝酸盐氧化菌是活性受到抑制还是已被彻底淘洗出系统，这两种情况将会产生两种不同的运行效果。如果是亚硝酸盐氧化菌的活性受到抑制，当环境条件的变化有利于生长时亚硝酸盐氧化菌将恢复活性，导致短程脱氮运行不稳定甚至完全破坏。如果是亚硝酸盐氧化菌已被彻底淘洗出系统，则更加有助于短程脱氮的稳定运行，短期的环境条件的变化不会对短程脱氮产生影响。由于缺少对污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌的检测，对于不同运行条件下系统中亚硝酸盐氧化菌的群落结构及其动态变化不清楚，进而无法准确阐述短程脱氮的形成机制。

本发明采用实时荧光定量PCR技术对污水处理厂中的亚硝酸盐氧化菌进行定量检测。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面：

（1）标准品DNA的来源。现有技术主要是从纯培养或人工配水富集的目标菌中提取基因组DNA，或是化学合成DNA片段作为标准品。目标菌的纯培养需要较长的时间、费用较高。更难以解决的是亚硝酸盐氧化菌中的硝化螺菌属目前还无法实现纯培养。人工配水富集的目标菌的菌群单一，无法获得实际污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌的所有优势属的标准品。化学合成DNA片段作为标准品首先要通过基因测序知道目标基因序列，否则无法合成。而本发明采用的标准品全部来源于处理实际生活污水的反应器，无需目标菌的纯培养、人工配水富集目标菌和目标基因序列。

（2）定量检测的环境样品及目标微生物。①目前，实时荧光定量PCR主要应用于生命科学、医学等领域对病毒、致病菌的检测分析。而本发明的待测样品为污水处理系统中的活性污泥，样品本身具有极强的特殊性。由于活性污泥受废水污染，其中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂质等，还有其它与亚硝酸盐氧化菌共存于活性污泥中的菌胶团，对DNA的提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此，活性污泥微生物基因组DNA的提取方法、PCR扩增体系及反应条件需要特殊确定，难度较大。②本发明定量检测的目标微生物是亚硝酸盐氧化菌，已有研究证实污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括两个属，即硝化菌属和硝化螺菌属。由于本发明的标准品来自于实际污水处理系统，运行条件和废水成分的复杂性使得亚硝酸盐氧化菌菌群丰富，获得两个主要属的标准品，因此能够对污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌进行全面的定量分析。

（3）实验条件的优化。采用实时荧光定量PCR方法对环境样品的特定菌群密度进行定量过程中，样品预处理方法和参数的选择对于测定结果有较大的影响。将实时荧光定量PCR应用于污水处理厂主要功能微生物亚硝酸盐氧化菌的检测，待测样品为污水处理系统中的活性污泥。由于亚硝酸盐氧化菌以污水为生存基质，污水中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂质等，对DNA的提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此本申请对分析难度较大的亚硝酸盐氧化菌不同属的实验条件进行了探索和优化，并获得了较好的扩增效果和定量结果。

故本发明提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA，采用硝化菌属和硝化螺菌属16S rDNA引物，建立检测亚硝酸盐氧化菌两个属的实时荧光定量PCR标准曲线。利用建立的标准曲线对污水全程脱氮除磷和短程脱氮除磷系统中的亚硝酸盐氧化菌进行定量检测，分析运行条件变化过程中亚硝酸盐氧化菌群落的动态变化与系统运行的相关性，揭示亚硝酸盐氧化菌被淘洗的过程和形成短程硝化的机制，未见相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经济、可靠的污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，对污水处理厂中两个属的亚硝酸盐氧化菌，即硝化菌属和硝化螺菌属进行检测，不仅可以分析总的亚硝酸盐氧化菌，而且可以分析各个属的动态变化。利用SYBR Green荧光染料法，无需设计多个探针即可检测多个基因，通用性好、成本低，并且可同时进行大批量的样本分析。可用于污水处理厂亚硝酸盐氧化菌菌群数量的监控和鉴定，具有很好的应用前景。

本发明的技术方案：

一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，分别定量检测这两个属的微生物数量，二者数量之和是亚硝酸盐氧化菌的总量；提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA；采用硝化菌属和硝化螺菌属16S rDNA引物进行常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得硝化菌属和硝化螺菌属的扩增片段；将两个属的纯化回收的DNA扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培养15-18h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证；提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线；利用建立的标准曲线对污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌进行定量检测；

上述常规PCR扩增体系如下：

上述实时荧光定量PCR扩增反应体系如下：

当检测硝化菌属时采用硝化菌属的正向引物为TGCGACCGGTCATGG，反向引物为GGGCGGWGTGTACAAGGC；当检测硝化螺菌属时采用硝化螺菌属的正向引物为CCTGCTTTCAGTTGCTACCG，反向引物为GTTTGCAGCGCTTTGTACCG；

上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为2%，电泳电压为120V，电泳时间为60min；

上述硝化菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，62℃1min，72℃2min；硝化螺菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，60℃1min，72℃2min。

本发明的有益效果：

从控制点源污染入手，严格限制排放到地表水体的污水中的氮、磷浓度是减轻水体富营养化的根本措施。污水生物脱氮，无论是全程脱氮方式还是短程脱氮方式，亚硝酸盐氧化菌的监测都是保证处理系统稳定运行的关键。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌2个属的实时荧光定量PCR检测方法，能够从属的水平对污水生物脱氮系统中亚硝酸盐氧化菌的动态变化进行分析，既可用于城市污水处理厂日常运行的微生物监控，保证生物脱氮效果；又可用于实验室有关亚硝酸盐氧化菌的定量分析、代谢机制、基因表达解析的研究，具有较强的实用性。

本发明通过提取实际污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA，采用亚硝酸盐氧化菌的2个属，即硝化菌属和硝化螺菌属的16S rDNA引物进行常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得2个属的PCR产物。将纯化产物经质粒转化和克隆培养后，提取包含目的片段的质粒DNA作为实时荧光定量PCR检测硝化菌属和硝化螺菌属的标准品。在实时荧光定量PCR仪上进行检测，建立标准曲线。2条实时荧光定量PCR标准曲线均呈现良好的线性关系，相关系数、斜率与扩增效率如表1所示，该方法符合精确定量的要求。可以利用建立的标准曲线对未知样品中亚硝酸盐氧化菌2个属的菌群数量进行定量检测。本发明成功建立了亚硝酸盐氧化菌2个属的实时荧光定量PCR标准曲线，使单独研究不同属对环境的动态响应成为可能。而且利用SYBRGreen荧光染料法，检测成本降低，便于推广应用。

表1硝化菌属和硝化螺菌属定量PCR标准曲线的相关系数、斜率与扩增效率

本发明的创新点：

（1）本发明提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA作为标准品DNA的来源，同时获得了亚硝酸盐氧化菌2个属的标准品。与人工配水系统相比，菌群更为丰富。标准品的制备无需目标菌的纯培养和人工富集，操作简单、成本降低。

（2）本发明的定量方法不仅可以对总的亚硝酸盐氧化菌进行定量分析，还可以对2个属，即硝化菌属和硝化螺菌属分别定量，对监测污水处理厂亚硝酸盐氧化菌菌群动态变化具有更强的适用性，为污水处理厂的长期稳定运行提供有力保障。获得的实时荧光定量PCR标准曲线，线性良好，扩增效率高，符合精确定量的要求。利用SYBR Green荧光染料法，通用性好，检测成本低。

附图说明

图1硝化螺菌属的实时荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线。

图1a是硝化螺菌属的扩增曲线；图1b是硝化螺菌属的标准曲线；

图2硝化菌属的实时荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线。

图2a是硝化菌属的扩增曲线；图1b是硝化菌属的标准曲线；

图3亚硝酸盐氧化菌的实时荧光定量PCR检测结果。

图3a是硝化螺菌属的实时荧光定量PCR检测结果；图3b是硝化菌属的实时荧光定量PCR检测结果；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

1.实时荧光定量PCR标准曲线的建立

1.1PCR引物

亚硝酸盐氧化菌2个属，即硝化菌属和硝化螺菌属的引物序列、扩增子长度如表2所示。

表2PCR扩增采用的引物序列

1.2总DNA的提取

从处理实际生活污水的连续流反应器的好氧区取活性污泥，采用美国MPBiomedicals公司生产的DNA提取试剂盒（Fast DNA Spin kit for soil，BIO101system，USA）提取活性污泥微生物的基因组DNA。操作严格按照说明书进行。1.3常规PCR

硝化菌属和硝化螺菌属的常规PCR采用的引物如表2所示。利用常规PCR扩增试剂盒（GoTaq GreenMaster Mix，Promega，American）配制反应体系，将DNA模板分装到0.2ml的PCR管中；在冰上将除DNA模板之外的试剂按顺序加入0.6ml的PCR管中，手指弹管壁混匀，低速离心，然后移至装有DNA模板的PCR管中，手指弹管壁混匀，低速离心。采用25ul的反应体系，如表3所示。

表3常规PCR反应体系

硝化菌属常规PCR扩增程序如下：95℃变性10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，62℃1min，72℃2min；硝化螺菌属常规PCR扩增程序如下：95℃变性10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，60℃1min，72℃2min。

1.4琼脂糖凝胶电泳

（1）质量百分比浓度为2%的琼脂糖凝胶的制备

称取1.4g琼脂糖于250ml的锥形瓶中，加入70ml的l×TAE缓冲液，震荡锥形瓶，使琼脂糖悬浮。在微波炉中加热至无颗粒和气泡的透明液体。加热过程中用50ml的烧杯盖在锥形瓶口，以减少水汽的蒸发。可设置液位线，如果蒸发较多，可以补充水至刻线。胶完全溶解后加入天根生化科技有限公司生产的GeneGreen核酸染料7μl，使其终溶度为1倍，轻轻摇匀。将锥形瓶放入水浴锅内使琼脂糖凝胶冷却到60℃。然后将凝胶倒入装好梳子的电泳胶板中，冷却静止30min左右待胶完全凝固，拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中；然后向电泳槽中倒入1×TAE缓冲液，液体没过胶块2～3mm，准备上样。

（2）琼脂糖凝胶电泳

取8μl1.3步骤中常规PCR扩增产物进行上样。采用天根公司的600bp DNAMarker在120V电压下进行琼脂糖凝胶电泳60min。

1.5PCR产物纯化

电泳完毕后，在紫外灯下快速切下含目标片段的条带，用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒对目的DNA片段进行纯化回收（Agarose Gel DNA Fragment RecoveryKit Ver.2.0，TaKaRa，Japan），操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6克隆转化与质粒提取

将切胶纯化后的目的片段与QIAGEN pDrive克隆载体进行连接（QIAGENPCR Cloning Kit，Germany），操作严格按照试剂盒说明书进行。然后将连接好的载体导入DH5α感受态细胞（天根生化科技有限公司，北京），培养程序为0℃30min，42℃60s，0℃2min，然后涂布于LB固体培养基上于37℃下培养15～18h后进行蓝白斑筛选。挑取阳性克隆（白斑）进行重组菌落PCR验证，包含目的片段的菌液用质粒提取试剂盒进行质粒提取和纯化（TaKaRa plasmidpurification Kit，TaKaRa，Japan）。

1.7标准曲线的建立：

用NanoDrop ND-1000（Thermo，American）分光光度计测定回收质粒的浓度。据公式（1）计算得出DNA拷贝数。

DNA拷贝数 $(\mathrm{copies}/\mathrm{\μl})=\frac{{6\×10}^{23}\×C_{\mathrm{DNA}}\×{10}^{-9}}{\mathrm{MW}}$    公式（1）

式中：

M：1拷贝DNA分子的碱基对数，bp/copy；

W：1个碱基对的道尔顿数，660Daltons/bp；

Daltons：道尔顿，质量单位，1克约为6×1023Daltons；

C_DNA：DNA浓度，ng/l。

将纯化后的质粒以10倍的浓度梯度稀释用作实时定量PCR标准品，采用试剂成本较低的SYBR Green荧光染料法。反应在Mx3005P实时定量PCR扩增仪（Agilent Technologies，American）上进行，采用25μl反应体系（TaKaRa SYBRPremix Ex Taq，TaKaRa，Japan）。反应体系如表4所示。每个浓度的标准品均设3个平行样，结果取平均值。

表4实时荧光定量PCR反应体系

硝化菌属实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃变性10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，62℃1min，72℃2min；硝化螺菌属实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃变性10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，60℃1min，72℃2min。

建立的C_t值与DNA浓度对应关系的实时荧光定量PCR标准曲线如附图1、图2所示。表5给出了硝化菌属或硝化螺菌的标准曲线，以及曲线的相关系数和扩增效率。上述指标表明，该方法符合精确定量的要求。

表5硝化菌属或硝化螺菌的实时荧光定量PCR标准曲线

其中x为DNA的浓度（copies），y为C_t值。

2污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌的定量分析

该连续流系统处理实际城市生活污水，水质条件为：COD浓度85～270mg/L，氨氮浓度50～103mg/L，需要生物脱氮处理。反应器共运行120d。1d～20d是短程硝化的建立阶段，该阶段亚硝酸盐积累持续上升，第20天时的亚硝酸盐积累率达到70%。21d～100d是短程硝化的稳定运行阶段期，该阶段的亚硝酸盐积累率维持在80%～90%。101d～120d是短程硝化的破坏阶段，该阶段亚硝酸盐积累率开始下降，达到80%以下。在系统运行期间每隔10天从系统好氧区取2ml的活性污泥，并测定该格室MLSS，用1×PBS清洗污泥样品2次，14000×g离心2min，去除上清液。按上述1.2的方法提取基因组DNA。在-20℃下保存。将提取的样品DNA在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，每个浓度的污泥样品均设3个平行，结果取平均值。实时荧光定量PCR扩增体系、扩增条件与“1.7标准曲线的建立”方法相同。亚硝酸盐氧化菌（包括硝化菌属和硝化螺菌属）细胞内只含有1个拷贝的16S rDNA，因此，实时荧光定量PCR检测的DNA拷贝数就是亚硝酸盐氧化菌的细胞数。

利用实时荧光定量PCR技术对上述污泥中亚硝酸盐氧化菌进行定量分析，考察短程硝化运行过程中亚硝酸盐氧化菌两个属的动态变化，进而揭示短程硝化的建立机制，定量结果如附图3所示。

如图3所示硝化螺菌属数量范围从6.38×10⁶到1.81×10⁹cells/gVSS，硝化菌属数量范围从7.66×10⁴到5.18×10⁶cells/gVSS。硝化螺菌属是亚硝酸盐氧化菌中的优势菌群，其数量是硝化菌属的228倍。当污泥投加到反应器内后，仅仅过了10天，硝化菌属数量就下降了95%，之后一直维持在很低的水平。造成这种现象的原因有以下两点：（1）硝化菌属为球菌，不附着在其他菌群上，单独悬浮于污水中生长，当水力停留时间较短时，很容易被淘洗出系统；（2）硝化菌属在种泥中的含量很少，对外界不利的生长条件抵抗能力差，从而未出现明显的被抑制的现象就直接被淘洗掉了。种泥为全程污泥，刚投加到反应器后，硝化螺菌属经历了短暂的小幅度的波动上升，从1.18×10⁹cells/gVSS上升到1.81×10⁹cells/gVSS，之后在试验过程中数量不断下降。在20d左右时，硝化螺菌属数量和种泥中相近，数量为1.29×10⁹cells/gVSS，占全菌的百分比为13.25%。但此时亚硝酸盐积累率已经达到了90%，成功实现短程。这说明短程的建立并非来自于硝化螺菌属被淘洗出系统，而是硝化螺菌属的活性被抑制。较短的水力停留时间使亚硝酸盐氧化为硝酸盐无法进行，从而成功抑制硝化螺菌属活性。该阶段溶解氧浓度（DO）控制在2.0mg/L，供氧充足，说明DO浓度不是实现短程的决定因素。之后无论对DO进行如何调节，硝化螺菌属的数量都持续下降，进一步说明了在本研究中DO浓度对实现短程没有影响。在短程硝化建立的过程中首先是硝化螺菌属的活性受到抑制，然后从系统中淘洗出去。硝化螺菌属的动态变化证实了在处理实际城市污水的连续流工艺中，单纯依靠短水力停留时间能够成功抑制并淘洗硝化螺菌属，不受DO浓度的影响。

该定量方法的应用为污水处理厂亚硝酸盐氧化菌的菌群随工艺条件的变化提供了及时准确的数据信息，可用于指导水厂运行。

Claims (1)

1.一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，分别定量检测这两个属的微生物数量，二者数量之和是亚硝酸盐氧化菌的总量；提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA；采用硝化菌属和硝化螺菌属16S rDNA引物进行常规PCR扩增；将两个属的纯化回收的DNA扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培养15-18h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证；提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线；利用建立的标准曲线对污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌进行定量检测；

上述常规PCR扩增体系如下：

上述实时荧光定量PCR扩增反应体系如下：

当检测硝化菌属时采用硝化菌属的正向引物为TGCGACCGGTCATGG，反向引物为GGGCGGWGTGTACAAGGC；当检测硝化螺菌属时采用硝化螺菌属的正向引物为CCTGCTTTCAGTTGCTACCG，反向引物为GTTTGCAGCGCTTTGTACCG；

上述硝化菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，62℃1min，72℃2min；硝化螺菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，60℃1min，72℃2min。