CN102161987B - 海水养殖池塘底泥微生物基因组dna的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA的提取方法，依次按照如下步骤进行：取底泥样品于离心管中，加入800～1000μl预处理缓冲液，涡旋；用NaOH调a步骤所得溶液的pH至8，离心取沉淀；向所得沉淀中加入溶菌酶涡旋混匀，再加入SDS、蛋白酶K，涡旋混匀；加入NaCl涡旋混匀，加入65℃预热的CTAB-NaCl，涡旋混匀，65℃作用20min后离心取上清；在上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，涡旋混匀，离心取上清；加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋混匀，离心取上清，重复一次；将上清移至离心管，加入异丙醇、NaCl，室温过夜，离心弃上清，向沉淀中加入预冷70％乙醇重悬、洗涤；离心后弃除上清，干燥沉淀，加入30～50μl 1×TE，4℃溶解至少4h。

Description

海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA的提取方法
技术领域：
本发明涉及分子生态学领域，尤其是一种操作方法简单，在一般实验室即可快速、方便地得到大片段微生物基因组总DNA样品的海水养殖池塘中底泥微生物基因组DNA的提取方法。
背景技术：
底泥微生物是养殖池塘生态系统中的重要组成部分，直接影响池塘中养殖动物尤其是底栖生活习性动物的生长，其组成结构可为指导健康养殖及衡量养殖环境优劣提供科学依据。然而，由于底泥微生物中仅有1％的可培养菌，因此必需获得高质量、多样性程度高、具有代表性的底泥微生物DNA，才能分析出养殖环境的菌群组成结构。目前，在对自然生境中的土壤、污泥中的微生物多样性研究中，已尝试采用溶菌酶、超声波法及玻璃珠等DNA提取方法，并在提取过程中应用PVPP、CTAB等去除腐植酸、粘粒等严重影响后续分子操作的物质。然而，因海水养殖池塘地处潮间带的特殊环境，加之有饵料碎屑、养殖动物粪便等沉积，使底泥的组成比自然生境的土壤、污泥更为复杂，迄今为止，还没有关于海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA提取方法的相关报道。
发明内容：
本发明的目的是为了提供一种操作方法简单，在一般实验室即可快速、方便地得到大片段微生物基因组总DNA样品的海水养殖池塘中底泥微生物基因组DNA的提取方法。
本发明的技术解决方案是：
一种海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA的提取方法，依次按照如下步骤进行：
a.取0.3～0.5g底泥样品于离心管中，加入800～1000μl预处理缓冲液，涡旋混匀；所述预处理缓冲液为100μl pH 5.5的1M Tris-HCl buffer、700μl超纯水以及200μl 0.2M Al2(SO4)3的混合溶液；
b.用4M NaOH调a步骤所得溶液的pH至8，3500g×2min离心弃上清，取沉淀；
c.向所得沉淀中加入300～400μl浓度为5mg/ml的溶菌酶涡旋混匀，再加入100～120μl浓度为10％的SDS、15～25ul 25mg/ml蛋白酶K，涡旋混匀；
d.加入200～400μl 5M NaCl涡旋混匀，加入180～280μl 65℃预热的CTAB-NaCl，涡旋混匀，65℃作用20min后11,000g×1min离心取上清；
e.在上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，涡旋混匀，11,000g×15min离心取上清，酚/氯仿/异戊醇的体积比为25∶24∶1；
f.加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋混匀，氯仿/异戊醇的体积比为24∶1，11,000g×15min离心取上清；
g.重复步骤f一次；
h.将上清移至1.5ml离心管，加入0.7倍体积异丙醇、0.1倍体积5MNaCl，室温过夜，18,000g×30min离心弃上清，向沉淀中加入1ml预冷70％乙醇重悬、洗涤；
i.18,000g×30min离心后弃除上清，干燥沉淀，加入30～50μl 1×TE，4℃溶解至少4h。
本发明可在一般实验室快速、方便地得到大片段的池塘底泥微生物群落的总DNA样品，获得的底泥基因组DNA纯度大于1.6(OD260/OD280)，片断大于20Kb，适合作为DGGE(变性梯度凝胶电泳)指纹分析池塘底泥微生物种群结构与多样性的16S rDNA-PCR扩增的高质量模板，同时也适合作为基因文库构建的样品DNA，为指导海水池塘健康养殖及衡量养殖环境优劣提供科学依据。
附图说明：
图1为本发明实施例1、2所提取的海水养殖池塘底泥微生物总DNA模板的琼脂糖凝胶图。
图2为以本发明实施例1、2所提取的海水养殖池塘底泥微生物总DNA为模板16S rDNA-PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测图。
图3为以本发明实施例1、2所提取的海水养殖池塘底泥微生物总DNA为模板16S rDNA-PCR扩增产物的DGGE图谱。
具体实施方式：
实施例1：
a.使用灭菌药匙刮除大连黑石礁养殖池塘表面底泥后，采集深2～3cm处底泥约20g放入灭菌广口玻璃瓶，使用灭菌药匙于无菌操作台内充分搅拌、混合底泥，取0.3g样品于离心管中，加入800μl预处理缓冲液，涡旋混匀3min，预处理缓冲液为100μl pH 5.5的1M Tris-HCl buffer、700μl超纯水以及200μl 0.2MAl2(SO4)3的混合溶液；
b.用4M NaOH调a步骤所得溶液的pH至8，3500g×2min离心弃上清，取沉淀；
c.向沉淀中加入300μl浓度为5mg/ml的溶菌酶(BBI公司生产)，37℃，225r/min，作用1h涡旋混匀后，再加入100μl 10％(W/V)SDS、15ul 25mg/ml蛋白酶K，50℃，225r/min，作用1h涡旋混匀；
d.加入200μl 5M NaCl涡旋混匀，加入180μl 65℃预热的CTAB-NaCl，涡旋混匀，65℃作用20min后离心(11,000g×1min)，取上清；
e.在上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，涡旋混匀3～5min，11,000g×15min离心取上清，酚/氯仿/异戊醇的体积比为25∶24∶1；
f.加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋混匀，氯仿/异戊醇的体积比为24∶1，11,000g×15min离心取上清；
g.重复步骤f一次；
e.将上清移至1.5ml离心管，加入0.7倍体积异丙醇、0.1倍体积5M NaCl，室温过夜，18,000g×30min离心弃上清，向沉淀中加入1ml预冷70％乙醇重悬、洗涤；
i.18,000g×30min离心后弃除上清，将离心管倒置于超净台内通风干燥0.5h后，再正放通风干燥0.5h，加入30～50μl 1×TE，轻弹离心管，4℃溶解至少4h后冷冻保存。
检验：使用紫外分光光度计及琼脂糖电泳检测获得的DNA；以获取DNA为模板，进行细菌16S rDNA特异片段的PCR扩增及扩增片段的变性凝胶电泳以检测DNA提取效果。
DNA提取效果：经紫外分光光度计检测，所获得DNA的OD260/OD280为1.76；琼脂糖电泳显示，所获得的DNA条带清晰，片段大于20Kb(见图1中的1)，以其为模板获得样品中细菌16S rDNA的特异性扩增片段，大小为230bp(见图2中的1)，扩增产物在变性凝胶电泳图中出现近30个不同的扩增条带，反映了丰富的基因信息，表明该池塘底泥中的菌种多样性较高(见图3中的1)。
实施例2：
a.将底泥采样器投入大连庄河某刺参养殖池塘塘底，采集底泥后放入灭菌铝制饭盒，放置于冰盒中运送至实验室，取0.5g样品于离心管中，加入1000μl预处理缓冲液，涡旋混匀3min，预处理缓冲液为100μl pH 5.5的1M Tris-HClbuffer、700μl超纯水以及200μl 0.2MAl2(SO4)3的混合溶液；
b.用4M NaOH调a步骤所得溶液的pH至8，3500g×2min离心弃上清，取沉淀；
c.向沉淀中加入400μl浓度为5mg/ml的溶菌酶(sigma公司生产)，37℃，225r/min，作用1h涡旋混匀后，再加入120μl 10％(W/V)SDS、25ul 25mg/ml蛋白酶K，50℃，225r/min，作用1h涡旋混匀；
f.加入400μl 5MNaCl涡旋混匀，加入280μl 65℃预热的CTAB-NaCl，涡旋混匀，65℃作用20min后离心(11,000g×1min)，取上清；
e.在上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，涡旋混匀3～5min，11,000g×15min离心取上清，酚/氯仿/异戊醇的体积比为25∶24∶1；
f.加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋混匀，氯仿/异戊醇的体积比为24∶1，11,000g×15min离心取上清；
g.重复步骤f一次；
h.将上清移至1.5ml离心管，加入0.7倍体积异丙醇、0.1倍体积5MNaCl，室温过夜，18,000g×30min离心弃上清，向沉淀中加入1ml预冷70％乙醇重悬、洗涤；
i.18,000g×30min离心后弃除上清，将离心管倒置于超净台内通风干燥0.5h后，再正放通风干燥0.5h，加入30～50μl 1×TE，轻弹离心管，4℃溶解至少4h后冷冻保存。
检验：使用紫外分光光度计及琼脂糖电泳检测获得的DNA；以获取DNA为模板，进行细菌16S rDNA特异片段的PCR扩增及扩增片段的变性凝胶电泳以检测DNA提取效果。
DNA提取效果：经紫外分光光度计检测，所获得DNA的OD260/OD280为1.71；琼脂糖电泳显示，所获得的DNA条带清晰，片段大于20Kb(见图1中的2)，以其为模板获得样品中细菌16S rDNA的特异性扩增片段，大小为230bp(见图2中的2)，扩增产物在变性凝胶电泳图中出现近30个不同的扩增条带，反映了丰富的基因信息，表明该池塘底泥中的菌种多样性较高(见图3中的2)。
此方法也适用于对海岸滩涂和浅海底泥微生物基因组DNA的提取。

Claims (1)

1.一种海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA的提取方法，依次按照如下步骤进行：
a.取0.3～0.5g底泥样品于离心管中，加入800～1000μl预处理缓冲液，涡旋混匀；所述预处理缓冲液为100μl pH 5.5的1M Tris-HCl buffer、700μl超纯水以及200μl 0.2M Al2(SO4)3的混合溶液；
b.用4M NaOH调a步骤所得溶液的pH至8，3500g离心2min弃上清，取沉淀；
c.向所得沉淀中加入300～400μl浓度为5mg/ml的溶菌酶，37℃，作用1小时，涡旋混匀，再加入100～120μl浓度为10％的SDS、15～25μl 25mg/ml蛋白酶K，50℃，作用1小时，涡旋混匀；
d.加入200～400μl 5M NaCl涡旋混匀，加入180～280μl 65℃预热的CTAB/NaCl，涡旋混匀，65℃作用20min后11000g离心1min取上清；
e.在上清液中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，涡旋混匀，11000g离心15min取上清，酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；
f.加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，涡旋混匀，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，11000g离心15min取上清；
g.重复步骤f一次；
h.将上清移至1.5ml离心管，加入0.7倍体积异丙醇、0.1倍体积5MNaCl，室温过夜，18000g离心30min弃上清，向沉淀中加入1ml预冷70％乙醇重悬、洗涤；
i.18000g离心30min后弃除上清，干燥沉淀，加入30～50μl 1×TE buffer，4℃溶解至少4h。
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