CN104975001A

CN104975001A - 一种无损伤提取脉红螺基因组dna的方法

Info

Publication number: CN104975001A
Application number: CN201510414754.6A
Authority: CN
Inventors: 于红; 杨智鹏; 李琪; 于瑞海; 李浩浩
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2015-10-14

Abstract

本发明公开了一种无损伤提取脉红螺基因组DNA的方法，首先用浸有75%酒精的棉球擦拭脉红螺的壳口和腹足用于消毒；将脉红螺放于盐度为50ppt的海水中5-8分钟后，再将其放入盐度为29-31ppt的海水中15-20分钟，待脉红螺腹足伸出时将其从海水中取出，用物理刺激的方法令脉红螺产生粘液；用1.5mL离心管沿壳口收集300-500μL粘液；收集到的脉红螺粘液采用常规的苯酚氯仿法提取DNA。实验证明，本发明具有对脉红螺个体无损伤、低成本、操作简单、提取的基因组DNA质量高等特点。脉红螺无损伤DNA提取不仅可以为脉红螺种质资源保护提供有利的辅助手段，而且可为脉红螺的分子辅助育种等研究提供有力的技术支持。

Description

一种无损伤提取脉红螺基因组DNA的方法

技术领域

本发明属于贝类育种技术领域，具体涉及一种脉红螺基因组DNA的提取方法。

背景技术

脉红螺（Rapana venosa），俗称海螺、红螺，成体壳高约11 cm，为大型海洋底栖贝类，广泛分布于我国渤海、黄海、东海和朝鲜、日本沿海。脉红螺足部肥大、肉味鲜美，是我国重要的经济贝类，深受广大消费者喜爱。近年来，随着我国脉红螺种质资源的衰退和市场需求的不断扩大，脉红螺已成为我国重要的养殖开发品种，相关的苗种繁育等工作已经开始实施，分子生物学技术也已广泛地应用于脉红螺种质资源遗传多样性分析、系谱分析、分子标记辅助育种等研究中。基因组DNA提取是开展分子生物学相关研究获取实验材料的主要方法。目前已开展的脉红螺遗传多样性分析、家系亲权鉴定等研究采用的基因组DNA提取方法均为伤害性取样，该方法通过杀死脉红螺而获得新鲜的组织样品提取基因组DNA。这种伤害性取样方法既增加了研究成本，也不利于脉红螺种质资源的保护。

发明内容

为了克服伤害性取样方法存在的不足，本发明的目的是提供一种脉红螺无损伤提取高质量基因组DNA的方法，有助于降低成本、保护脉红螺种质资源，对开展脉红螺遗传学、分子标记辅助育种等研究具有重要的应用价值。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

一种脉红螺无损伤提取基因组DNA的方法，包括如下步骤：

a. 首先用浸有75%酒精的棉球擦拭脉红螺的壳口和腹足，对其进行消毒；

b. 将脉红螺放入盐度为50ppt的海水中5-8分钟；

c. 将脉红螺从50ppt的海水中取出，然后放入盐度为29-31ppt的海水中15-20分钟，待脉红螺腹足伸出时将其从海水中取出，用物理刺激的方法使脉红螺产生粘液；

d. 收集脉红螺产生的粘液；

e. 在收集到的脉红螺粘液加入抽提缓冲液400μL，蛋白酶K10μL，混匀之后，于37℃消化10-12 h，最后采用常规的苯酚氯仿法提取脉红螺基因组DNA。

所述的物理刺激的方法为：掰住脉红螺的厣，用已消毒的小木棒、塑料或金属棒轻轻碰触脉红螺的腹足，以刺激脉红螺分泌粘液。

所述收集脉红螺粘液的方法为：用1.5 mL离心管沿壳口收集300-500μL粘液。

所述抽提缓冲液的配方为：6 mol/L 尿素，10 mmol/L Tris-HCl，125 mmol/L NaCl，1% SDS，10 mmol/L Na₂EDTA·2H₂O，pH为 7.5。

本发明通过盐度和物理刺激的方法使脉红螺产生粘液，刺激后脉红螺并不会出现死亡现象，保护了取样个体的组织完整性，没有造成任何机械性损伤，通过较短时间的恢复期，脉红螺个体即可从应激状态中恢复过来，可以长期多次取样，真正实现了无损伤性基因组DNA提取，是一种科学有效的基因组DNA提取方法；通过75%的酒精消毒，起到了消毒杀菌和减少外源基因组DNA干扰的作用，有利于获得高质量的基因组DNA。该方法具有对脉红螺个体无损伤、低成本、操作简单、基因组DNA提取质量高等优点，可应用于脉红螺种质资源保护、家系亲权鉴定分析、分子辅助育种等。

附图说明

图1是本发明实施例1和对比例1提取的脉红螺基因组DNA的凝胶电泳图。

图2是本发明实施例1和对比例1提取的脉红螺基因组DNA的微卫星位点扩增图谱。

图3是本发明实施例1和对比例1提取的脉红螺基因组DNA的COI扩增图谱。

其中，1-3：对比例1，M：标准marker，4-9：实施例1。

具体实施方式

以下结合附图并通过具体实施例对本发明作详细描述。

实施例1：

从养殖池中随机选取6个脉红螺，采用本发明的方法提取基因组DNA，具体步骤如下：首先用浸有75%酒精的棉球擦拭脉红螺的壳口和腹足用于消毒，将脉红螺放于盐度为50ppt的海水中5分钟，然后将脉红螺从50ppt的海水中取出，放入盐度为30ppt的海水中20分钟，待脉红螺腹足伸出时将其从海水中取出，掰住脉红螺的厣，用已消毒的小木棒轻轻碰触脉红螺的腹足，刺激脉红螺分泌粘液；然后用1.5 mL离心管沿脉红螺壳口收集300-500 μL粘液；收集到的脉红螺粘液加入抽提缓冲液400 μL（6 mol/L 尿素，10 mmol/L Tris-HCl，125 mmol/L NaCl，1% SDS，10 mmol/L Na₂EDTA·2H₂O，pH 7.5），蛋白酶K10 μL，混匀之后，37℃消化12 h，采用常规的苯酚氯仿法提取脉红螺基因组DNA。

对比例1：

从养殖池中随机选取3个脉红螺，采用常规伤害性取样方法提取基因组DNA，具体步骤如下：将脉红螺杀死取腹足肌，保存在95%的酒精中备用。取冰冻的脉红螺腹足肌50-100 mg，放于称量纸上，用经过75%酒精及灼烧消毒的解剖刀将组织切成细末，放入1.5 ml灭菌离心管中，加入抽提缓冲液400 μL（6 mol/L 尿素，10 mmol/L Tris-HCl，125 mmol/L NaCl，1% SDS，10 mmol/L Na₂EDTA·2H₂O，pH 7.5），蛋白酶K10 μL，混匀之后，37℃消化12 h。同样采用常规的苯酚氯仿法提取脉红螺基因组DNA。

使用NanoDrop紫外分光光度计对两种方法提取的基因组DNA进行质量及浓度检测，结果显示260/280值均大于1.8，表示没有蛋白质污染；如图１所示，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示提取的基因组DNA没有明显的断裂现象，4-9与1-3相比效果相近，表明本发明采取提取的基因组DNA质量较高，能够达到与常规伤害性取样方法提取基因组DNA同样的效果，证明本发明DNA采集的可取性。将基因组DNA浓度稀释至50 ng/μL，作模板，使用脉红螺微卫星标记引物扩增脉红螺微卫星位点，如图２所示，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示9个个体均可获得清晰的目的片段，说明所提取的基因组DNA可以很好的应用于脉红螺核苷酸分子标记分析，4-9与1-3相比效果相近，同样表明本发明提取的基因组DNA质量能够达到与常规伤害性取样方法提取基因组DNA同样的效果。将基因组DNA浓度稀释至50 ng/μL，作模板，使用脉红螺线粒体COI基因通用引物扩增脉红螺线粒体COI基因片段，如图３所示，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示9个个体均可获得清晰的目的片段，说明所提取的基因组DNA可以很好的应用于脉红螺线粒体分子标记分析，4-9与1-3相比效果相近，表明本发明提取的基因组DNA质量较高，并且能够达到与常规伤害性取样方法提取基因组DNA同样的效果，证明了本发明的可靠性。

以上对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属技术领域中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内，进行多样的变换。

Claims

1.一种无损伤提取脉红螺基因组DNA的方法，其特征在于包括如下步骤：

a. 首先用浸有75%酒精的棉球擦拭脉红螺的壳口和腹足用于消毒；

b. 将脉红螺放于盐度为50ppt的海水中5-8分钟；

c. 将脉红螺从50ppt的海水中取出，放入盐度为29-31ppt的海水中15-20分钟，待脉红螺腹足伸出时将其从海水中取出，用物理刺激的方法使脉红螺产生粘液；

d. 收集脉红螺产生的粘液；

e. 在收集到的脉红螺粘液加入抽提缓冲液400 μL，蛋白酶K10 μL，混匀之后，37℃消化10-12 h，采用常规的苯酚氯仿法即可提取到脉红螺基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的无损伤提取脉红螺基因组DNA的方法，其特征在于所述的物理刺激的方法为：掰住脉红螺的厣，用已消毒的小木棒、塑料或金属棒轻轻碰触脉红螺的腹足，以刺激脉红螺分泌粘液。

3.根据权利要求1所述的无损伤提取脉红螺基因组DNA的方法，其特征在于所述收集脉红螺粘液的方法为：用1.5 mL离心管沿壳口收集300-500μL粘液。

4.根据权利要求1所述的无损伤提取脉红螺基因组DNA的方法，其特征在于所述抽提缓冲液的配方为：6 mol/L 尿素，10 mmol/L Tris-HCl，125 mmol/L NaCl，1% SDS，10 mmol/L Na₂EDTA·2H₂O，pH为 7.5。